Summary
Le cellule staminali neurali (NSC) si riferiscono alle cellule che possono auto-rinnovarsi e di differenziarsi in tre linee neurali. Qui, descriviamo un protocollo per determinare la frequenza NSC in una data popolazione di cellule utilizzando neurosfere formazione e la differenziazione in condizioni clonali.
Abstract
Le cellule staminali neurali (NSC) hanno la capacità di auto-rinnovarsi e di generare i tre principali linee neurali - astrociti, oligodendrociti e neuroni. NSC e progenitori neurali (NP) sono comunemente coltivate in vitro come neurosfere. Questo protocollo descrive in dettaglio come determinare la frequenza NSC in una data popolazione di cellule in condizioni clonali. Il protocollo inizia con la semina delle cellule ad una densità che consente la generazione di neurosfere clonali. Le neurosfere sono poi trasferiti a lamelle a camera e differenziati in condizioni clonali in mezzo condizionato, che massimizza il potenziale di differenziazione delle neurosfere. Infine, la frequenza NSC viene calcolata sulla base di capacità di formazione e di multipotenza neurosfere. Utilità di questo protocollo includono la valutazione dei candidati marcatori NSC, purificazione del NSC, e la capacità di distinguere NSC da NP. Questo metodo richiede 13 giorni per eseguire, che è molto sHorter rispetto ai metodi attuali per enumerare frequenza NSC.
Introduction
Le cellule staminali neurali (NSC) sono cellule del sistema nervoso centrale (SNC) che possono auto-rinnovare e sono multipotenti. NSC sono prima specificati durante lo sviluppo del prosencefalo embrionale e continuano a persistere nel cervello adulto in regioni specifiche, come la zona subventricolare (SVZ) dei ventricoli laterali e il giro dentato (DG) dell'ippocampo. Un certo numero di linee di NSC vengono utilizzati negli studi clinici per il trattamento di ictus e altre malattie neurologiche come il morbo di Batten 1.
NSC e progenitori neurali (NP) sono propagate nella cultura come strutture galleggianti sferoidali 3-dimensionale chiamati neurosfere. Il sistema di coltura neurosfere è stato sviluppato da Reynolds e Weiss nei primi anni 1990, quando hanno scoperto che le cellule corticali embrionali e adulte potrebbero suddividere in presenza del fattore di crescita epidermico (EGF) e di base del fattore di crescita dei fibroblasti (bFGF) 2-4. Neurosfere costituiti da una miscela eterogenea di cells composto di sottoclassi in diversi stadi di sviluppo 5. E 'difficile da studiare specificatamente NSC utilizzando i dati ottenuti da neurosfere a causa della presenza di NP. Quindi, è fondamentale per arricchire NSC da neurosfere. Attualmente, quattro principali metodi sono stati utilizzati per arricchire per NSC in vitro. Il primo è l'uso di marcatori di superficie cellulare. Lewis-X (LEX) e CD133 (noto anche come Prominin1) sono la superficie cellulare più prominente NSC marcatori 6-9. Syndecan-1, Notch-1 e integrina-beta1 sono altre proteine di superficie che arricchiscono per NSC 10. Secondo la esclusione del colorante. E 'stato dimostrato che le cellule laterale di popolazione, che hanno la capacità unica di pompare fuori l'fluorescente DNA-binding colorante Hoechst 33342, sono arricchiti per NSC 11. Terzo è l'uso di selezione morfologica. È stato dimostrato che le cellule con aumento delle dimensioni delle cellule e granularità porto più NSC delle loro controparti 5,12,13. Quarto è l'aggiunta di NSC sufattori rvival al mezzo di coltura. E 'stato dimostrato che l'aggiunta di condroitina solfato proteoglicani e apolipoproteina E migliora NSC sopravvivenza e quindi aumenta la frequenza NSC 14,15. Anche se molti indicatori tra cui fattori di trascrizione sono stati associati con NSC 16,17, nessuno di questi marcatori sono in grado di arricchire NSC alla purezza. A causa della mancanza di marcatori definitivi NSC, rimane una sfida per quantificare NSC e di distinguerli da NP in vitro.
Gli studi iniziali hanno utilizzato il test di formazione neurosfere (NFA) per quantificare NSC 7,11,13. In questo saggio, cellule dissociate sono coltivate per formare neurosfere e il numero di neurosfere generati per ogni 100 cellule piastrate è determinata. Questo valore viene definito come l'Unità di Formazione neurosfere (NFU). La NFU è uguale alla frequenza di NSC se tutte le neurosfere nascono dalla NSC. Tuttavia, è stato dimostrato che la NFU sovrastima la frequenza NSC come neurosfere sono formati da entrambi NSCs e l'inizio NP 5. Così, si è imprecisa enumerare NSC esclusivamente sulla base di formazione neurosfere. Potrebbe essere possibile quantificare NSC in base alla loro capacità di auto-rinnovarsi, proliferano molto e generare neurosfere multipotenti.
NSC, che sono EGF e bFGF reattivo, di solito sopravvivono per almeno dieci passaggi e visualizzare così ampia capacità di auto-rinnovamento nella cultura 4,18-20. NP, che sono EGF e bFGF reattivo così, potrebbe anche generare neurosfere per un paio di passaggi, ma non per un periodo di tempo prolungato. Quindi, è stato ampiamente accettato che bona fide NSC possono essere enumerati con fiera precisione basato sulla formazione neurosfere per almeno dieci passaggi. Nella maggior parte degli studi, tuttavia, auto-rinnovamento è di solito misurato sulla base di formazione neurosfere secondaria o terziaria a causa del lungo tempo sperimentale richiesto per dieci passaggi. Quindi, il NFA secondario può essere utilizzato per confrontare in linea di massima la capacità di auto-rinnovamento scommessapopolazioni Ween, ma non possono essere utilizzati per enumerare accuratamente frequenza NSC.
NSC hanno una maggiore capacità proliferativa rispetto a NP. Questa struttura di NSC è stato utilizzato da Louis et al. per sviluppare un test per l'enumerazione NSC - il dosaggio neurale formanti colonia di cellule (NCFCA) 21,22. In questo saggio, cellule singole sono coltivate per 3 settimane in una matrice di collagene semisolido contenente. In queste condizioni di coltura, è stato dimostrato che le cellule che formano neurosfere sopra i 2 mm di diametro sono tripotent e possono auto-rinnovarsi per il lungo termine. Queste cellule sono definiti come NSC. Pertanto, le NSC sono effettivamente distinti da NP.
NSC hanno la capacità di differenziarsi in astrociti, oligodendrociti e neuroni. Per la differenziazione di neurosfere, fattori di crescita vengono rimossi e siero viene aggiunto al mezzo di coltura. Se tutte e tre le linee neurali sono osservati in un neurosfere, allora la cellula che ha avviato che neurosfere is un NSC. Tuttavia, il saggio differenziazione ha alcune limitazioni. Innanzitutto, le condizioni di coltura utilizzati per la differenziazione potrebbero non essere ottimale per la generazione di tutte le tre linee neurali. Infatti, in un unico processo di differenziazione neurosfere, si verifica la morte delle cellule significativo e per lo più si verifica generazione astrociti (Tham M e Ahmed S, inedito). In secondo luogo, c'è la questione della clonalità. Per precisa enumerazione di NSC, la formazione e la differenziazione delle neurosfere dovrà essere effettuata in condizioni clonali, dove ogni neurosfere nasce da una singola cellula. In colture in sospensione di massa, l'aggregazione avviene sia a livello cellulare e neurosfere 23-25. Quindi, è possibile per ogni neurosfere sorgere da più celle o neurosfere, che complica conteggio neurosfere e valutazione di multipotenza. Dati recenti indicano che l'aggregazione delle cellule non si verifica a bassa densità di placcatura di 0,5 cellule / ml o al di sotto, e quando piastre di coltura non vengono spostati durante neuformazione rosphere 15. Così coltura di cellule a così bassa densità garantirebbe clonality.
Attualmente, il NCFCA è il metodo più comunemente utilizzato per distinguere NSCs da NP ed enumerare la frequenza NSC. Il NCFCA, tuttavia, richiede un tempo relativamente lungo di tre settimane. Qui, descriviamo un protocollo per enumerare frequenza NSC basata sulla capacità di NSC di formare neurosfere multipotenti. Questo protocollo richiede solo 13 giorni di tempo per eseguire. Il NCFCA assicura clonalità come la matrice di collagene impedisce il movimento delle neurosfere. Le condizioni di coltura utilizzate in questo protocollo permette anche clonalità essere mantenuto per tutto. Per esempio, l'uso di 50-well coprioggetti camerata assicura che le neurosfere si differenziano senza contatto tra loro. Inoltre, utilizziamo condizionati mezzo che fornisce fattori neurotrofici durante la differenziazione per massimizzare il potenziale di differenziazione delle neurosfere (Figura 1).
Protocol
Il trattamento degli animali è stata effettuata in conformità con le linee guida IACUC e NACLAR e approvato dal dipartimento animale ((http://www.brc.astar.edu.sg/index.php?sectionID-11).
NOTA: culture neurosfere sono stati preparati dal prosencefalo di embrionale (E14) C57BL / 6 topi come precedentemente descritto 5.
1. Cultura della Neurosfere campione clonali (1 ° giorno)
- Preparare mezzo di crescita NSC combinando Modified F-12 (/ F12 DMEM) mezzo di Eagle Medium / nutrienti Dulbecco con supplemento B27 (concentrazione finale: 1x), EGF (concentrazione finale: 20 ng / mL), bFGF (concentrazione finale: 10 ng / mL) e la penicillina / streptomicina (concentrazione finale: 1x).
- Dissociarsi neurosfere E14.5 il mouse in 1 ml di terreno di crescita NSC e 1 ml 0,05 N idrossido di sodio per 7 minuti a temperatura ambiente. cellule Pipetta su e giù di tanto in tanto per mantenere le cellule in sospensione. Aggiungere 1 ml di 0.05 N Acido cloridrico in folleize l'alcali.
NOTA: cellule neurosfere sono seminate a 20.000 cellule / ml in un piatto di coltura da 10 cm sono coltivate per 5 d a 37 ° C, 5% CO 2. Il rendimento atteso dopo è di circa 10 milioni di cellule per 10 centimetri piatto. Queste cellule vengono quindi dissociate e seminate ad una densità clonale come descritto nelle fasi rispettivamente 1.2 e 1.3,.- Eseguire la conta delle cellule utilizzando Trypan Blue colorazione e un emocitometro.
- singole cellule E14.5 il mouse neurosfere di semi ad una densità di 50 cellule / ml o inferiore a 100 ml terreno di crescita NSC in un piatto a 96 pozzetti. Incubare le cellule a 37 ° C, 5% CO 2 per 1 w per generare neurosfere clonali.
NOTA: clonalità è assicurata durante neurosfere formazione a questa densità come le cellule non in contatto tra di loro.
2. Cultura della Neurosfere per mezzo condizionato (3 ° giorno)
- Dissociarsi E14.5 neurosfere del mouse come descritto al punto 1.2.
- singole cellule seme da E14.5 neurospheres topo con una densità di 20.000 cellule / ml in un mezzo di crescita 10 ml NSC in un piatto di coltura 10 cm. Incubare le cellule a 37 ° C, 5% CO 2 per 5 d generare neurosfere coltivate rinfusa.
3. Preparazione di neurosfere condizionata Media (Giorno 8)
- Preparare la soluzione di rivestimento mescolando 700 ml di 0,01% Poli-L-lisina (PLL), 70 ml di 1 mg / mL laminina e 6.230 ml di tampone fosfato (PBS).
- Coat un piatto cultura 10 centimetri con 7 ml di soluzione PLL / laminina per 2 ore a 37 ° C.
- Usando una pipetta sierologica 10 ml, trasferire tutti i neurosfere in coltura di massa ad un tubo da 15 ml centrifuga. Centrifugare le neurosfere a 171 xg per 1 minuto a temperatura ambiente e rimuovere completamente il surnatante.
- Preparare mezzo di differenziazione NSC combinando DMEM medio / F12 con B27 (concentrazione finale: 1x) e siero fetale bovino (FBS) (concentrazione finale: 0,5%) annunciod 10 ml di NSC medio differenziazione di neurosfere. Pipetta su e giù un paio di volte per risospendere le neurosfere.
- Aspirare PLL / laminina dal piatto cultura 10 cm di lunghezza e lavare una volta con 10 ml di PBS. Trasferire tutte le neurosfere al PLL / laminina rivestite 10 centimetri piatto di coltura. Incubare O / N a 37 ° C, 5% CO 2 per le neurosfere di aderire al piatto.
4. Determinazione della NFU del Campione Neurosfere (Giorno 8)
- Contare il numero di neurosfere (seminate al giorno 1; sezione 1) formata in ciascun pozzetto sotto un microscopio.
NOTA: Determinare il numero di neurosfere formate per 100 cellule placcati, che dà la NFU.
5. Trasferimento di Neurosfere campione a 50-bene Chambered Coverslip (Giorno 8)
- Coat ciascun pozzetto di un coprioggetto 50 pozzetti chambered con 10 ml di soluzione di rivestimento PLL / laminina per 2 ore a 37 ° C.
NOTA: Preparare la soluzione di rivestimento, come descritto nellastep 3.1. - Preparare 3 x 50 provette coniche centrifuga ml contenente 30 ml di PBS ciascuna. Utilizzando pinze sterili, rimuovere il vetrino rivestito 50-bene incamerata. Immergere il vetrino incamerata nel primo tubo di PBS, seguito dal secondo e poi il terzo tubo di PBS, per lavare via la soluzione di rivestimento.
- Aspirare il liquido in eccesso dai pozzetti del vetrino incamerata.
- pipettare delicatamente tutte di medie e neurosfere da ciascun pozzetto del piatto a 96 pozzetti e trasferirlo ad un solo 10 centimetri piatto di coltura.
- Sotto un microscopio, scegliere un neurosfere campione utilizzando una micropipetta P10 dotato di una punta della pipetta 10 microlitri. Assicurarsi che solo un singolo neurosfere viene prelevato ogni volta impostando la colonna pipetta a 2 ml. Utilizzare un nuovo puntale per ogni neurosfere.
- Trasferire il neurosfere sul centro di un pozzo della rivestito coprioggetto 50 pozzetti incamerata.
- Ripetere i punti 5.5 e 5.6 fino a quando ciascun pozzetto della conta vetrino Chamberedins un neurosfere.
NOTA: Le neurosfere possono essere ritirati al microscopio posta in una cappa a flusso laminare o su un banco. - Aggiungere 10 ml di NSC medio differenziazione in ciascun pozzetto del vetrino camerata. Posizionare il coprioggetto camerata in un piatto di coltura da 10 cm pipetta PBS lungo i bordi del piatto per evitare l'essiccazione del terreno di differenziamento NSC. Posizionare fino a due vetrini camerata in un piatto di 10 centimetri cultura. Incubare il vetrino a camera (contenuto nella cultura piatto 10 cm) notte a 37 ° C, 5% CO 2.
6. Differenziazione delle Neurosfere campione (9 ° giorno)
- Trasferire il mezzo di differenziazione dalle neurosfere in coltura di massa (dalla sezione 3) ad un tubo da 15 ml centrifuga. Assicurarsi che 2-3 ml di mezzo differenziazione rimane nella cultura piatto per evitare che le cellule aderito da staccare. Usando una siringa sterile da 20 ml, passare il mezzo di differenziazione attraverso un 0,2 μFiltro m per rimuovere tutte le cellule o detriti.
- Trasferire il mezzo di differenziazione filtrato di nuovo al piatto cultura 10 centimetri contenente le cellule aderito.
- Utilizzando pinze sterili, posizionare delicatamente il vetrino camerata sul supporto di differenziazione in un modo invertito tale che le neurosfere campione sono rivolti verso il basso. Incubare il vetrino a camera con il mezzo di differenziazione per 3 d a 37 ° C, 5% CO 2.
NOTA: Le neurosfere esempio sono a contatto con il terreno di differenziamento ma non in contatto con le cellule differenzianti sotto.
7. Fissaggio del differenziata Neurosfere (Giorno 12)
- Rimuovere delicatamente il vetrino camerata dal piatto cultura 10 centimetri con pinza sterile. immergere delicatamente il vetrino in PBS per lavare via il mezzo condizionato.
- Staccare la guarnizione dal vetrino. Eseguire questa delicatamente e lentamente per evitare di rompere il vetrino. Prendere nota del lato dove esimoe differenziati neurosfere sono rispettate.
- Pipettare 1 mL di 4% paraformaldeide (PFA) su un pezzo di taglio parafilm alle dimensioni del vetrino. posizionare delicatamente il coprioggetto sulla pellicola paraffina con le neurosfere rivolti verso il basso in contatto con la PFA. Fissare le neurosfere per 20 minuti a temperatura ambiente.
Attenzione: PFA è tossico sia in forma liquida e vapore ed è combustibile. Evitare l'inalazione di vapori e il contatto con la pelle e gli occhi. Maneggiare sempre PFA in una cappa aspirante ventilato. - Pipettare 1 ml di PBS su un pezzo di pellicola di paraffina. Lavare le neurosfere posizionando delicatamente il coprioggetto con le neurosfere rivolta verso il basso in contatto con PBS per 10 minuti a temperatura ambiente.
- Ripetere il punto 7.4 altre due volte.
8. O4 colorazione di differenziata Neurosfere (Giorno 12)
- Preparare 3% di albumina di siero bovino (BSA) in PBS. Pipettare 1 ml di BSA 3% su un pezzo di pellicola di paraffina. Bloccare le neurosfere da mise en delicatamenteg coprioggetto (con le neurosfere verso il basso) in contatto con la BSA per 30 minuti a RT.
- Pipettare 1 mL di topo O4 anti-IgM (1: 300 diluizione nel BSA 3%) su un pezzo di parafilm e posizionare il vetrino sul film paraffina con le neurosfere rivolti verso il basso in contatto con l'anticorpo. Lasciare O4 colorazione avvenga per 2 ore a RT.
- Lavare il vetrino due volte con PBS come descritto al punto 7.4.
- Pipettare 1 mL di colorante fluorescente anticorpi verde coniugato anti-topo IgM secondario (diluizione 1: 500 in BSA 3%) su un pezzo di parafilm e posizionare il vetrino sul film paraffina con le neurosfere rivolti verso il basso in contatto con l'anticorpo . Lasciare per 1 ora a RT al buio.
NOTA: Eseguire immunostaining in un ambiente buio da questo punto in poi. - Lavare il vetrino due volte con PBS come descritto al punto 7.4.
9. TUJ1 e fibrillare gliale acida Proteine (GFAP) Colorazionedi differenziata Neurosfere (Giorno 12)
- Preparare permeabilizzante soluzione aggiungendo Triton-X 100 (concentrazione finale: 0,5%) alla BSA 3%. Pipettare 1 mL di soluzione permeabilizzante su un pezzo di pellicola di paraffina. Posizionare coprioggetto sulla pellicola paraffina con le neurosfere rivolti verso il basso in contatto con la soluzione permeabilizzante per 20 minuti a RT.
- Lavare il vetrino due volte con PBS come descritto al punto 7.4.
- Pipettare 1 mL di topo anti TUJ1-IgG 2a (diluizione 1: 500 in BSA 3%) anticorpi e coniglio anti-GFAP IgG (1: 1000 diluizione nel BSA 3%) su un pezzo di parafilm e posto coprioggetto il film paraffina con le neurosfere rivolti verso il basso in contatto con gli anticorpi. Consentire TUJ1 e GFAP colorazione a verificarsi per 2 ore a temperatura ambiente.
NOTA: Entrambi gli anticorpi possono essere preparati come una singola soluzione. - Lavare il vetrino due volte con PBS come descritto al punto 7.4.
- Pipettare 1 ml di colorante fluorescente rossoanti topo coniugato-2a IgG (diluizione 1: 500 in BSA 3%) e lontano IgG rosso colorante fluorescente coniugato anti-coniglio (diluizione 1: 500 in BSA 3%) anticorpi secondari su un pezzo di parafilm e posto coprivetrino sulla pellicola paraffina con le neurosfere rivolti verso il basso in contatto con gli anticorpi. Lasciare riposare per 1 ora a temperatura ambiente.
NOTA: Entrambi gli anticorpi possono essere preparati come una singola soluzione. - Lavare il vetrino due volte con PBS come descritto al punto 7.4.
- Diluire la soluzione 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) stock di 300 Nm in PBS. Pipettare 1 ml di DAPI su un pezzo di pellicola di paraffina e luogo vetrino sul film di paraffina con le neurosfere rivolti verso il basso a contatto con DAPI per 2 minuti a temperatura ambiente per la colorazione dei nuclei.
- Lavare il vetrino una volta con PBS e due volte con acqua deionizzata come descritto al punto 7.4. Montare il vetrino su un vetrino utilizzando un mezzo di montaggio adatto e lasciare asciugare O / N a temperatura ambiente.
10. ImaGing di differenziata Neurosfere (Giorno 13)
- neurosfere Immagine al microscopio confocale utilizzando un 40X. Utilizzare i laser a 488 nm, 594 nm e 647 nm per rivelare oligodendrociti, neuroni e astrociti, rispettivamente.
- Determinare la percentuale di unipotenti, bipotente e tripotent neurosfere.
NOTA: Potenza è determinata dalla capacità del neurosfere di differenziarsi in tre linee neurali - oligodendrociti, neuroni e astrociti 5,14,15,26. Oligodendrociti sono identificati da una colorazione positiva per O4 (sezione 8). I neuroni sono identificati da una colorazione positiva per TUJ1 (sezione 9). Gli astrociti sono identificati da una colorazione positiva per GFAP (sezione 9). Un neurosfere unipotenti differenzia in solo uno di lignaggio e dovrebbe macchiare positivamente sia per O4, GFAP o TUJ1. Un neurosfere bipotente differenzia in tutte le due linee e dovrebbe macchiare positivamente per O4 e GFAP o O4 e TUJ1 o GFAP e TUJ1. Un neurosfere tripotent diversoIates in tutte e tre le linee e dovrebbe macchiare positivamente per O4, GFAP e TUJ1. - Determinare la frequenza NSC nella popolazione di interesse utilizzando la seguente formula:
frequenza NSC = (NFU x% di neurosfere tripotent) / 100%.
Representative Results
Abbiamo usato questo protocollo per valutare la capacità della lex, un noto superficie cellulare NSC marcatore 7, per arricchire per NSC. I dati provenienti da questo studio verranno utilizzati per illustrare come NSC vengono enumerati utilizzando i saggi clonali nel protocollo. le cellule di topo neurosfere E14.5 sono state incubate con l'anticorpo anti-Lex. Successivamente, le cellule che esprimono Lex (LeX +) e le cellule che non esprimono Lex (- LEX) sono state seminate a 50 cellule / ml da Cell Fluorescence-Activated ordinamento (FACS) e lasciato a generare neurosfere clonali per 1 sett. Time-lapse imaging mostra che le neurosfere generate a 50 cellule / ml sono clonale (Figura 2). La NFU per Lex + e Lex - cellule è stata determinata. E 'dimostrato che le cellule Lex + hanno una significativamente più alta capacità di formazione neurosfere rispetto a Lex - cellule (Figura 3G). Le neurosfere generati sono stati poi differenziatiin condizioni clonali, successivamente immunostained e ripreso (Figura 3a-e). Cellule Lex + generano significativamente più neurosfere tripotent di LEX - cellule (Figura 3f). La frequenza NSC è stato quindi calcolato sulla base della NFU e la% di neurosfere tripotent (Figura 3G). Selezione basata su LeX, arricchisce la frequenza NSC di oltre il 14 volte, convalida LeX come marcatore NSC. Abbiamo inoltre determinato la frequenza NSC di E14.5 neurosfere di topo usando questo protocollo 27 e 28 NCFCA. Entrambi i metodi riportano frequenza NSC comparabile di circa il 2% in E14.5 neurosfere mouse.
Figura 1. Protocollo per neurosfere differenziazione sotto clonali condizioni. Neurosfere campione coltivate in condizioni clonali sono posti singolarmente in ogni PLL / laminina-coated bene di un vetrino 50-bene a camera, e ha permesso di aderire O / N. Lo stesso giorno, neurosfere in coltura di massa sono placcati in media di differenziazione in un PLL / laminina rivestite 10 centimetri piatto, e ha permesso di aderire O / N. Il giorno dopo, mezzo condizionato dalle neurosfere in coltura di massa viene filtrata e rimessa in 10 centimetri piatto. Le neurosfere campione sono quindi invertiti sul terreno condizionato e ha permesso di differenziare per 3-4 giorni 28. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Crescita di un Clonal neurosfere. Le cellule derivate da neurosfere E14.5 erano dissociate e seminate a 50 cellule / ml in 96 pozzetti piatto. Le singole celle sono stati monitorati per 6 d dal time-lapse imaging. Immagini di Oè mostrato ne quali cellule in crescita in un neurosfere. Si noti che il neurosfere mantiene clonalità. (A) 0 giorni; (B) 1.19.45; (C) 2.95.37; (D) 3.32.76; (E) 4.46.53; (F) 5.61.44; dove il primo numero si riferisce al giorno, secondo numero si riferisce alla frazione del giorno, e il terzo numero si riferisce alla frazione di h. ingrandimento 10X. Barra della scala, 100 micron. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. Differenziazione delle clonale Neurosfere e la numerazione di NSC frequenza. Neurosfere singoli sono stati raccolti e differenziati in vetrino 50 e camerata per 3 d. Una immagine rappresentativa di una STA tripotent neurosfereinato con (a) e DAPI immunostained per (b) GFAP, (c) TUJ1 e (d) O4. (E) mostra la sovrapposizione di (a) - (d). barra della scala, 65 micron. (F) La% di unipotenti, bipotente e tripotent neurosfere generati da Lex + e Lex - cellule (media ± SEM; n = 3). (G) la frequenza NSC in LeX + e Lex -. Celle calcolate come il prodotto di NFU e% di neurosfere tripotent Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Discussion
Descriviamo hee l'enumerazione di NSC in condizioni clonali. Passaggi critici includono l'uso di crescita e differenziazione medio NSC fresco, e anche l'uso della soluzione PLL / laminina appena preparato per rivestire i coprioggetti camerata, così come le piastre di coltura. Ciò assicura condizioni di crescita e differenziazione ottimali dei neurosfere. L'uso di anticorpi di buona qualità per rilevare efficacemente i neuroni e glia, nonché la raccolta selettiva di neurosfere clonali che non sono in contatto con altri neurosfere, sono critici. Inoltre, è importante assicurare le neurosfere raccolte non seccare. Si raccomanda di aggiungere 10 ml di media differenziazione per ogni pozzetto dopo aver raccolto ogni 10 neurosfere. È importante utilizzare un coprioggetto camerata in un piatto 10 centimetri per campione per evitare diafonia tra neurospheres da campioni differenti. Se due coprioggetto (ciascuna contenente neurosfere da campioni diversi) vengono inseriti nellastesso 10 centimetri piatto, neurosfere da un vetrino potrebbe rilasciare fattori che possono alterare la propensione del neurosfere nell'altro coprioggetto di differenziarsi in linee specifiche. Due coprioggetto nello stesso piatto 10 centimetri possono anche provocare confusione tra i campioni.
Nel caso in cui la NFU o la frequenza NSC è inferiore al previsto, in modo che basso numero di passaggio neurosfere sono utilizzati. E 'anche importante che sani neurosfere passaggio basso sono utilizzati per generare mezzo condizionato. Quindi, se le neurosfere sono coltivate in pozzetti di piccolo diametro, ad esempio in 96 pozzetti piatto, allora sarà difficile da manovrare e scegliere neurospheres utilizzando una micropipetta. In questo caso, trasferire i neurosfere ad un grande piatto di coltura, ad esempio un piatto 6 pozzetti, prima della raccolta. Alcune delle neurosfere raccolti possono sollevare dal vetrino a camera durante la coltura e immunocolorazione. Minimizzare il movimento del vetrino a camera durante la coltura, e meno lavaggio intensivoing durante immunostaining, aiuterebbe ad evitare il distacco di neurosfere.
Gli studi iniziali quantificati NSC utilizzando solo la NFA 7,11,13. Tuttavia, la NFA sovrastima la frequenza NSC sia come NSC e primi NP generano neurosfere 5. Louis et al. Sviluppato un altro metodo per quantificare NSC conosciuto come il NCFCA 21,22. Il NCFCA comporta coltura di cellule singole in una matrice a base di collagene per assicurare clonalità, ed è stato dimostrato che neurosfere sopra i 2 mm di diametro sono formate da solo NSC. Simile al NCFCA, clonalità è garantita nel corso di questo protocollo. Ciò si ottiene mediante la generazione di neurosfere a densità clonale e differenziando le neurosfere in coprioggetti incamerata. L'uso di coprioggetto a camera conferisce una serie di vantaggi. Il vetrino camerata permette ad ogni neurosfere campione di differenziare senza avere un contatto fisico con altri neurosfere di esempio, in tal modo assicurando clonalità durante la differenziazione.Il vetrino camerata può essere posizionato in sospensione sul mezzo di differenziazione per consentire le neurosfere campione da continuamente condizionati e per garantire la massima differenziazione. In assenza di mezzo condizionato e siero durante il differenziamento, la sopravvivenza delle neurosfere diminuisce e le neurosfere principalmente generare astrociti (Tham M e S Ahmed, non pubblicati). Inoltre, le neurosfere immunostained possono essere convenientemente conservati per lunghi periodi di tempo e le coprioggetti camerata possono essere montati direttamente sui vetrini da microscopio. Inoltre, l'imaging delle neurosfere immunostained è facile come si può individuare rapidamente il neurosfere nel piccolo camerata bene, scattare una foto, e passare a quello successivo bene.
Abbiamo determinato la frequenza NSC in E14.5 cultura del mouse neurosfere utilizzando sia il protocollo descritto in questo manoscritto 27 e 28 NCFCA. La frequenza NSC in E14.5 neurosfere topo determinata sia da methods sono paragonabili. Il NCFCA enumera NSC che sono multipotenti e hanno la capacità di auto-rinnovamento a lungo termine. Poiché la frequenza NSC dal nostro metodo è paragonabile a quella da NCFCA, la lettura dei protocolli non sembra sovrastimare la frequenza NSC. Il NCFCA richiede tre settimane per essere completato e coinvolge principalmente la placcatura delle cellule e medie rifornimento. Il protocollo qui descritto richiede 13 giorni per eseguire e comporta una serie di passi, ad esempio, raccolta neurosfere e immunocolorazione. Questo protocollo potrebbe servire come metodo alternativo per enumerare NSC. I ricercatori possono utilizzare sia NCFCA e questo protocollo per verificare la frequenza NSC nei loro campioni.
Una limitazione di questo protocollo è che una serie di passi importanti devono essere tutte eseguite il giorno 8. La preparazione del mezzo condizionato, la determinazione di NFU di neurosfere campione, e il trasferimento di neurosfere di esempio sul vetrino 50-bene a camera deve essere eseguita su day 8. Si potrebbe prendere tempo per completare la procedura. Inoltre, si richiede pratica per eseguire queste operazioni in modo efficiente.
Neurosfere sono stati ampiamente utilizzati per studiare la funzione e il comportamento NSC. Tuttavia, neurosfere sono costituiti da entrambe le NSC e NP. Quindi, è importante per arricchire NSC da neurosfere per studiare la biologia NSC. Attualmente, marcatori di superficie delle cellule, di proprietà esclusione del colorante nonché le dimensioni delle cellule e la granularità sono stati utilizzati per arricchire per NSC 6,7,9-13,29,30. Questo protocollo potrebbe essere utilizzato per quantificare l'arricchimento di NSC da potenziali marcatori NSC, e per facilitare la ricerca di un marcatore definitiva NSC. Quattro studi recenti hanno utilizzato questo protocollo per enumerare frequenza NSC 5,14,15,26.
Acknowledgments
Ringraziamo l'Agenzia per la Scienza, Tecnologia e Ricerca (A * STAR), Singapore per il finanziamento di questa ricerca.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL conical centrifuge tubes | BD | 352096 | |
| 50 mL conical centrifuge tubes | BD | 352070 | |
| 20 mL sterile syringe | BD | 300141 | |
| 50 mL sterile syringe | BD | 300144 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Biowest | S1810 | |
| Mouse anti-Tuj1 IgG2a antibody | Covance | MMS-435P-100 | |
| Rabbit anti-GFAP IgG antibody | Dako | Z033401 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 3100 | |
| Microscope fitted to laminar flow hood | Leica | MZ6 | |
| Glass slides | Marienfeld-superior | 1000200 | |
| Mouse anti-O4 IgM antibody | Merck Millipore | MAB345 | |
| Hydromount | National Diagnostics | HS-106 | |
| Microscope | Nikon Eclipse | TS100-F | |
| Laminar flow hood | NuAire | NU-543 | |
| 96-well culture dishes | NUNC | 167008 | |
| 10-cm culture dishes | NUNC | 150350 | |
| Paraffin film | Parafilm | PM999 | |
| Human Epidermal Growth Factor (EGF) | Peprotech | AF-100-15 | |
| Recombinant human basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) | Peprotech | 100-18B | |
| 0.2 µm filter | Sartorius Stedim | 16534-K | |
| 0.45 µm filter | Sartorius Stedim | 16555-K | |
| 1.0 N Sodium Hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich | S2770 | |
| 1.0 N Hydrochloric acid (HCl) | Sigma-Aldrich | H9892 | |
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| Poly-L-Lysine (PLL) | Sigma-Aldrich | P8920 | |
| Paraformaldehyde (PFA) powder | Sigma-Aldrich | P6148 | Toxic |
| Bovine Serum Albumin (BSA) powder | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| 50-well chambered coverslips | Sigma-Aldrich | C7735 | |
| Stir plate with heat function | Stuart | UC152 | |
| DMEM/F12 medium | Thermo Fisher Scientific | 11320-033 | |
| B27 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| Laminin | Thermo Fisher Scientific | 23017-015 | |
| 1x Phosphate Buffered Saline without Ca2+ and Mg2+ (DPBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190144 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgM antibody | Thermo Fisher Scientific | A21042 | |
| Alexa Fluor 594 goat anti-mouse IgG2a antibody | Thermo Fisher Scientific | A21135 | |
| Alexa Fluor 647 goat anti-rabbit IgG antibody | Thermo Fisher Scientific | A31573 | |
| 4’,6’-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | D3571 | |
| Cell-culture centrifuge | Thermo Fisher Scientific | RT1 75002383 | |
| Pasteur pipettes | Thermo Fisher Scientific | 10006021 | |
| CO2 incubator | |||
| Ventilated fume-hood | |||
| Aspirator | |||
| Confocal microscope | |||
| Micropipettes | |||
| Micropipette tips | |||
| Plastic pipettes | |||
| Multichannel pipettes | |||
| Glass beaker | |||
| Sterile forceps | |||
| pH meter |
References
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