Summary
Las células madre neurales (NSC) se refieren a células que pueden auto-renovarse y diferenciarse en los tres linajes neuronales. A continuación, se describe un protocolo para determinar la frecuencia NSC en una población celular dada usando neurosphere formación y diferenciación en condiciones clonales.
Abstract
Las células madre neurales (NSC) tienen la capacidad de auto-renovación y generar los tres principales linajes neuronales - astrocitos, neuronas y oligodendrocitos. NSC y progenitores neurales (NPS) son comúnmente cultivadas in vitro como neuroesferas. Este protocolo describe en detalle la forma de determinar la frecuencia de NSC en una población celular dada en condiciones clonales. El protocolo comienza con la siembra de las células a una densidad que permite la generación de neuroesferas clonales. Las neuroesferas se transfieren entonces a cubreobjetos septadas y diferenciadas en condiciones clonales en medio condicionado, que maximiza el potencial de diferenciación de las neuroesferas. Por último, la frecuencia NSC se calcula sobre la base de las capacidades de formación múltiple y capacidad de neuroesferas. Utilidades de este protocolo incluyen la evaluación de los candidatos marcadores NSC, la purificación de células madre neurales, y la capacidad de distinguir células madre neurales de los PN. Este método tarda 13 días para llevar a cabo, que es mucho sHorter que los métodos actuales para enumerar frecuencia NSC.
Introduction
Las células madre neurales (NSC) son células del sistema nervioso central (SNC) que puede auto-renovación y son multipotentes. NSC se especifican por primera vez durante el desarrollo embrionario del cerebro anterior y persisten en el cerebro adulto en regiones específicas, tales como la zona subventricular (SVZ) de los ventrículos laterales y el giro dentado (DG) del hipocampo. Un número de líneas NSC se están utilizando en ensayos clínicos para el tratamiento de apoplejía y otras enfermedades neurológicas como la enfermedad de Batten 1.
NSC y progenitores neurales (NPS) se propagan en la cultura como estructuras flotantes esferoide 3-dimensionales llamadas neuroesferas. El sistema de cultivo neurosphere fue desarrollado por Reynolds y Weiss en la década de 1990, cuando se encontraron que las células corticales embrionarias y adultas podrían dividir en presencia de factor de crecimiento epidérmico (EGF) y factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF) 2-4. Las neuroesferas se componen de una mezcla heterogénea de cells que comprenden de subclases en diferentes etapas de desarrollo 5. Es un reto para estudiar específicamente células madre neurales a partir de datos obtenidos a partir de neuroesferas debido a la presencia de los PN. Por lo tanto, es crucial para enriquecer NSCs de neuroesferas. En la actualidad, cuatro métodos principales se han utilizado para enriquecer en células madre neurales in vitro. En primer lugar es el uso de marcadores de superficie celular. Lewis-X (LEX) y CD133 (también conocido como Prominin1) son la superficie de la célula más prominente NSC marcadores 6-9. Syndecan-1, Notch-1 y la integrina-beta1 son otras proteínas de superficie que enriquecen para NSC 10. En segundo lugar es la exclusión del colorante. Se ha demostrado que las células lado en la población, que tienen la capacidad única de bombear el fluorescente de unión a ADN de colorante Hoechst 33342, se enriquecen de NSCs 11. En tercer lugar es el uso de la selección morfológica. Se ha demostrado que las células con el aumento del tamaño celular y granularidad puerto Más NSCs que sus contrapartes 5,12,13. En cuarto lugar está la adición de NSC Dofactores rvival al medio de cultivo. Se ha demostrado que la adición de condroitina proteoglicano sulfato y apolipoproteína E aumenta la supervivencia NSC y por lo tanto aumenta la frecuencia NSC 14,15. Aunque muchos marcadores incluyendo factores de transcripción se han asociado con NSCs 16,17, ninguno de estos marcadores son capaces de enriquecer NSCs a la pureza. Debido a la falta de marcadores NSC definitivas, sigue siendo un desafío para cuantificar NSC y distinguirlos de los NP in vitro.
Los estudios iniciales utilizaron el ensayo de formación de neuroesferas (NFA) para cuantificar NSC 7,11,13. En este ensayo, las células disociadas se cultivan para formar neuroesferas y el número de neuroesferas generadas por cada 100 células cultivadas en placas se determina. Este valor se denomina como la unidad de formación de neuroesferas (NFU). La NFU es igual a la frecuencia NSC si surgen todas las neuroesferas a partir de células madre neurales. Sin embargo, se demostró que el NFU sobreestima la frecuencia NSC como neuroesferas se forman por ambas NSCs y principios de los PN 5. Por lo tanto, es inexacto para enumerar NSC exclusivamente sobre la base de la formación de neuroesferas. Podría ser posible cuantificar NSC base a su capacidad de auto-renovación, proliferan extensamente y generan neuroesferas multipotentes.
NSC, que son EGF y bFGF sensible, por lo general sobreviven durante al menos diez pasajes y por tanto, tienen amplia capacidad de auto-renovación en la cultura 4,18-20. NPs, que son EGF y bFGF sensible, así, también podría generar neuroesferas para unos pocos pasajes, pero no durante un período prolongado de tiempo. Por lo tanto, se ha aceptado ampliamente que los comités directivos nacionales de buena fe se pueden enumerar con exactitud razonable, basado en la formación de neuroesferas durante al menos diez pasajes. En la mayoría de estudios, sin embargo, la auto-renovación se mide generalmente basado en la formación de neuroesferas secundario o terciario debido al tiempo experimental largo requerido para diez pasajes. Por lo tanto, el NFA secundario puede ser utilizado para comparar ampliamente la apuesta capacidad de auto-renovaciónpoblaciones ween, pero no pueden ser utilizados para enumerar con precisión la frecuencia NSC.
NSC tienen una mayor capacidad proliferativa en comparación con los PN. Esta propiedad de la NSC fue utilizado por Louis et al. para desarrollar un ensayo para NSC enumeración - el ensayo neural de formación de colonias de células (NCFCA) 21,22. En este ensayo, las células individuales se cultivan durante 3 semanas en una matriz semisólida que contiene colágeno. Bajo estas condiciones de cultivo, se demostró que las células que forman neuroesferas mayores de 2 mm de diámetro son tripotent y pueden auto-renovarse para el largo plazo. Estas células se definen como NSCs. Por lo tanto, los NSCs se distinguen efectivamente de NPS.
NSCs tienen la capacidad de diferenciarse en astrocitos, oligodendrocitos y neuronas. Para la diferenciación de neuroesferas, factores de crecimiento se eliminan y se añade suero al medio de cultivo. Si se observan los tres linajes neuronales en un neurosphere, a continuación, la celda que inició que neurosphere iEs un NSC. Sin embargo, el ensayo de diferenciación tiene algunas limitaciones. En primer lugar, las condiciones de cultivo utilizados para la diferenciación no pueden ser óptimas para la generación de los tres linajes neuronales. De hecho, en un único proceso de diferenciación de neuroesferas, se produce la muerte celular significativa y en su mayoría se produce la generación de astrocitos (Tham M y Ahmed S, no publicado). En segundo lugar, está la cuestión de la clonalidad. Para la enumeración precisa de NSCs, la formación y diferenciación de las neuroesferas que llevarse a cabo en condiciones de clones, donde surge cada neurosphere de una sola célula. En cultivos en suspensión a granel, la agregación se produce tanto a nivel celular y neurosphere 23-25. Por lo tanto, es posible para cada neurosphere que surja a partir de múltiples células o neuroesferas, lo que complica el recuento y evaluación de multipotencia neurosphere. La evidencia reciente muestra que la agregación de las células no se produce a baja densidad de siembra de 0,5 células / l o por debajo, y cuando las placas de cultivo no se mueven durante neuformación rosphere 15. Por lo tanto el cultivo de células en dicha baja densidad aseguraría clonalidad.
En la actualidad, la NCFCA es el método más comúnmente utilizado para distinguir células madre neurales de los PN y enumerar frecuencia NSC. El NCFCA, sin embargo, requiere un tiempo relativamente largo de tres semanas. A continuación, se describe un protocolo para enumerar frecuencia NSC basado en la capacidad de las células madre neurales para formar neuroesferas multipotentes. Este protocolo tiene sólo 13 días para realizarse. El NCFCA asegura clonalidad como la matriz de colágeno impide el movimiento de las neuroesferas. Las condiciones de cultivo utilizadas en este protocolo también permite clonalidad que se mantiene a lo largo. Por ejemplo, el uso de 50 pocillos cubreobjetos con cámaras asegura que las neuroesferas se diferenciarán sin ponerse en contacto entre sí. Además, usamos medio que suministra factores neurotróficos durante la diferenciación de maximizar el potencial de diferenciación de las neuroesferas (Figura 1) condicionados.
Protocol
El tratamiento de los animales se realizó de acuerdo con las directrices del IACUC y NACLAR y aprobado por el departamento de animales ((http://www.brc.astar.edu.sg/index.php?sectionID-11).
NOTA: Los cultivos Neurosphere se prepararon a partir del cerebro anterior de embriones (E14) C57BL / 6 ratones como se describió previamente 5.
1. Cultura de neuroesferas de ejemplo clonales (Día 1)
- Preparar medio de crecimiento NSC mediante la combinación de F-12 (DMEM / F12) medio de Eagle Medium / Nutrient Modificado de Dulbecco con suplemento B27 (concentración final: 1 x), EGF (concentración final: 20 ng / ml), bFGF (concentración final: 10 ng / ml) y penicilina / estreptomicina (concentración final: 1 x).
- Disociar neuroesferas E14.5 de ratón en 1 ml de medio de crecimiento NSC y 1 ml 0,05 N de hidróxido de sodio durante 7 min a TA. Las células de la pipeta hacia arriba y abajo de vez en cuando para mantener las células en suspensión. Añadir 1 ml de ácido clorhídrico 0,05 N a la posición neutralize el álcali.
Nota: las Neurosphere se siembran a 20.000 células / ml en una placa de cultivo de 10 cm y se cultivan durante 5 d a 37 ° C, 5% de CO 2. El rendimiento esperado después es de unos 10 millones de células por placa de 10 cm. Estas células se disocian y se sembraron a una densidad clonal, como se describe en los pasos 1.2 y 1.3, respectivamente.- Realizar el recuento de células mediante la tinción de azul de tripano y un hemocitómetro.
- Seed células neuroesferas E14.5 ratón individuales a una densidad de 50 células / ml o por debajo de 100 en medio de crecimiento l NSC en una placa de 96 pocillos. Se incuban las células a 37 ° C, 5% de CO2 durante 1 w para generar neuroesferas clonales.
NOTA: La clonalidad se garantiza durante neurosphere formación a esta densidad que las células no están en contacto entre sí.
2. Cultura de neuroesferas de medio condicionado (día 3)
- Disociar neuroesferas de ratón E14.5 como se describe en el paso 1.2.
- células individuales de semillas de E14.5 neuroesferas de ratón a una densidad de 20.000 células / ml en un ml NSC medio 10 crecimiento en una placa de cultivo de 10 cm. Se incuban las células a 37 ° C, 5% de CO2 durante 5 d para generar neuroesferas cultivadas a granel.
3. Preparación de Neurosphere medio condicionado (día 8)
- Preparar la solución de recubrimiento mediante la mezcla de 700 l de 0,01% de poli-L-lisina (PLL), 70 l de 1 mg / ml de laminina y 6.230 l de salina tamponada con fosfato (PBS).
- Escudo una placa de cultivo de 10 cm con 7 ml de solución de PLL / laminina durante 2 horas a 37 ° C.
- Con una pipeta serológica de 10 ml, transferir todas las neuroesferas cultivadas a granel a un tubo de 15 ml de centrífuga cónico. Centrifugar las neuroesferas a 171 xg durante 1 min a TA y eliminar el sobrenadante por completo.
- Preparar medio de diferenciación NSC mediante la combinación de medio DMEM / F12 con B27 (concentración final: 1 x) y suero bovino fetal (FBS) (concentración final: 0,5%) Add 10 ml de NSC medio de diferenciación de neuroesferas. Pipetear arriba y abajo varias veces para volver a suspender las neuroesferas.
- Aspirar PLL / laminina de la placa de cultivo de 10 cm y se lava una vez con 10 ml de PBS. Transferir todas las neuroesferas a la placa de cultivo de 10 cm recubierto de laminina-PLL /. Incubar O / N a 37 ° C, 5% de CO 2 para las neuroesferas para adherirse al plato.
4. Determinación de NFU de la Muestra neuroesferas (día 8)
- Contar el número de neuroesferas (sembradas en día 1, la sección 1) formado en cada pocillo con un microscopio.
NOTA: Determinar el número de neuroesferas formadas por 100 células sembradas, lo que da la NFU.
5. Transferencia de neuroesferas de ejemplo de 50 pocillos Septadas Cubreobjetos (día 8)
- Escudo cada pocillo de un cubreobjetos de 50 pocillos cámaras con 10 l de solución de recubrimiento de PLL / laminina durante 2 horas a 37 ° C.
NOTA: Se prepara una solución de recubrimiento como se describe enpaso 3.1. - Preparar 3 x 50 tubos cónicos de centrífuga de 30 ml que contenían ml de PBS cada una. El uso de pinzas estériles, quitar el cubreobjetos recubiertos 50 pocillos cámaras. Sumergir el cubreobjetos cámaras en el primer tubo de PBS, seguido de la segunda y luego la tercera tubo de PBS, para lavar la solución de revestimiento.
- Aspirar el líquido sobrante de los pocillos de cubreobjetos cámaras.
- pipeta suavemente todo medio y neuroesferas de cada pocillo de la placa de 96 pocillos y transferirlo a un solo plato de cultivo de 10 cm.
- Bajo el microscopio, escoger un neurosphere muestra usando una micropipeta P10 equipado con una punta de pipeta de 10 mL. Asegúrese de que sólo un único neurosphere es recogido cada vez mediante el establecimiento de la columna de la pipeta para 2 l. Utilizar una punta de pipeta para cada neurosphere.
- Transferir el neurosphere en el centro de un pocillo de la recubierto cubreobjetos 50 pocillos cámaras.
- Repita los pasos 5.5 y 5.6 hasta que cada pocillo de la conta cubreobjetos de cámarains una neuroesfera.
NOTA: Las neuroesferas se pueden recoger con un microscopio colocado en una campana de flujo laminar o en un banco de trabajo. - Añadir 10 l de NSC medio de diferenciación a cada pocillo de la cubreobjetos de cámara. Coloque el cubreobjetos cámaras en un 10 cm placa de cultivo y la pipeta PBS a lo largo de los bordes de la placa para evitar el secado del medio de diferenciación NSC. Colocar hasta dos cubreobjetos con cámaras en una placa de cultivo de 10 cm. Incubar el cubreobjetos cámaras (contenida en la placa de cultivo 10 cm) durante la noche a 37 ° C, 5% de CO 2.
6. Diferenciación de neuroesferas ejemplo (día 9)
- Transferir el medio de diferenciación de las neuroesferas cultivadas a granel (de la sección 3) a un tubo de 15 ml de centrífuga cónico. Asegúrese de que 2-3 ml de medio de diferenciación se mantiene en la placa de cultivo para evitar que las células adheridas se desprendan. Usando una jeringa estéril de 20 ml, pasar el medio de diferenciación a través de un 0,2 μm filtro para eliminar las células o restos.
- Transferir el medio de diferenciación se filtra de nuevo a la placa de cultivo de 10 cm que contiene las células adheridas.
- El uso de pinzas estériles, coloque suavemente el cubreobjetos cámaras en el medio de la diferenciación de una forma invertida de tal manera que las neuroesferas de muestra están hacia abajo. Incubar el cubreobjetos cámaras con el medio de diferenciación para 3 d a 37 ° C, 5% de CO 2.
NOTA: Las neuroesferas muestras están en contacto con el medio de diferenciación, pero no en contacto con las células que se diferencian por debajo.
7. Fijación de neuroesferas Diferenciada (Día 12)
- Retire con cuidado el cubreobjetos cámaras de la placa de cultivo de 10 cm usando pinzas estériles. sumergir suavemente el portaobjetos en PBS para lavar el medio condicionado.
- Despegar la junta de silicona del cubreobjetos. Realice esto con cuidado y lentamente para evitar que se rompa el cubreobjetos. Tomar nota del lado donde THe diferenciado neuroesferas se cumplen.
- Pipetear 1 ml de 4% de paraformaldehído (PFA) en una pieza de corte de película de parafina para el tamaño del cubreobjetos. Coloque con cuidado el cubreobjetos sobre la película de parafina con las neuroesferas mirando hacia abajo en contacto con la PFA. Fijar las neuroesferas para 20 min a TA.
Precaución: PFA es tóxico tanto en forma líquida y de vapor y es combustible. Evitar la inhalación de vapores y el contacto con la piel y los ojos. Siempre maneje PFA en una campana ventilada. - Pipeta de 1 ml de PBS en un trozo de lámina de parafina. Lavar las neuroesferas colocando suavemente el cubreobjetos con las neuroesferas hacia abajo en contacto con PBS durante 10 min a temperatura ambiente.
- Repita el paso 7.4 dos veces más.
8. O4 La tinción de neuroesferas Diferenciada (Día 12)
- Preparar 3% de albúmina de suero bovino (BSA) en PBS. Pipetear 1 ml de la BSA 3% en un trozo de película de parafina. Bloquear las neuroesferas por Placin suavementeg el cubreobjetos (con las neuroesferas hacia abajo) en contacto con la BSA durante 30 min a RT.
- Pipetear 1 ml de anti-O4 anticuerpo IgM de ratón (dilución 1: 300 en el BSA 3%) sobre un trozo de película de parafina y colocar el cubreobjetos sobre la película de parafina con las neuroesferas mirando hacia abajo en contacto con el anticuerpo. Permitir O4 tinción que se produzca durante 2 h a TA.
- Lavar el cubreobjetos dos veces con PBS como se describe en el paso 7.4.
- Pipetear 1 ml de colorante fluorescente anti-conjugado-ratón anticuerpo secundario verde IgM (1: 500 dilución en el BSA 3%) sobre un trozo de película de parafina y colocar el cubreobjetos sobre la película de parafina con las neuroesferas mirando hacia abajo en contacto con el anticuerpo . Dejar durante 1 hora a temperatura ambiente en la oscuridad.
NOTA: Realice la inmunotinción en un ambiente oscuro de este paso adelante. - Lavar el cubreobjetos dos veces con PBS como se describe en el paso 7.4.
9. Tuj1 y glial fibrilar ácida de la proteína (GFA) tinciónDiferenciado de neuroesferas (Día 12)
- Preparar la solución de permeabilización mediante la adición de Triton X-100 (concentración final: 0,5%) a la BSA 3%. Pipetear 1 ml de solución permeabilizante sobre un trozo de película de parafina. Coloque el cubreobjetos sobre la película de parafina con las neuroesferas mirando hacia abajo en contacto con la solución permeabilizante de 20 min a TA.
- Lavar el cubreobjetos dos veces con PBS como se describe en el paso 7.4.
- Pipetear 1 ml de ratón anti Tuj1-anticuerpo 2a IgG (1: 500 dilución en el BSA 3%) y de conejo anti-GFAP anticuerpo IgG (1: 1000 dilución en el BSA 3%) sobre un trozo de película de parafina y el cubreobjetos en la película de parafina con las neuroesferas mirando hacia abajo en contacto con los anticuerpos. Permitir Tuj1 y tinción GFAP que se produzca durante 2 h a TA.
NOTA: Los dos anticuerpos se pueden preparar como una solución única. - Lavar el cubreobjetos dos veces con PBS como se describe en el paso 7.4.
- Pipeta de 1 ml de colorante fluorescente rojaconjugado anti-ratón IgG 2a (1: 500 dilución en el BSA 3%) y mucho IgG rojo colorante fluorescente conjugado anti-conejo (dilución 1: 500 en el BSA 3%) anticuerpos secundarios en un trozo de película de parafina y lugar cubreobjetos sobre la película de parafina con las neuroesferas mirando hacia abajo en contacto con los anticuerpos. Dejar durante 1 hora a temperatura ambiente.
NOTA: Los dos anticuerpos se pueden preparar como una solución única. - Lavar el cubreobjetos dos veces con PBS como se describe en el paso 7.4.
- Diluir solución 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) stock a 300 nM en PBS. Pipetear 1 ml de DAPI en un trozo de película de parafina y el cubreobjetos sobre la película de parafina con las neuroesferas mirando hacia abajo en contacto con DAPI durante 2 min a RT para la tinción de los núcleos.
- Lavar el portaobjetos una vez con PBS y dos veces con agua desionizada como se describe en el paso 7.4. Montar el cubreobjetos sobre un portaobjetos de vidrio utilizando un medio de montaje adecuado y dejar secar O / N a temperatura ambiente.
10. Imaging de neuroesferas Diferenciada (Día 13)
- neuroesferas imagen bajo un microscopio confocal utilizando un 40X. Utilizar el láser a 488 nm, 594 nm y 647 nm para detectar oligodendrocitos y astrocitos, neuronas, respectivamente.
- Determinar el porcentaje de unipotentes, bipotentes y tripotent neuroesferas.
NOTA: La potencia se determina por la capacidad de la neurosphere de diferenciarse en los tres linajes neuronales - oligodendrocitos, neuronas y astrocitos 5,14,15,26. Los oligodendrocitos se identifican mediante tinción positiva para O4 (sección 8). Las neuronas se identifican mediante tinción positiva para Tuj1 (sección 9). Los astrocitos son identificados por tinción positiva para GFAP (sección 9). Un neurosphere unipotente se diferencia en sólo una de linaje y debe manchar positivamente, ya sea para O4, GFAP o Tuj1. Un neurosphere bipotent se diferencia en cualquiera de los dos linajes y debe tinción positiva ante la O4 y GFAP u O4 y Tuj1 o GFAP y Tuj1. A neurosphere tripotent diferenteiates en los tres linajes y debe tinción positiva ante la O4, GFAP y Tuj1. - Determinar la frecuencia de NSC en la población de interés mediante el uso de la siguiente fórmula:
Frecuencia = NSC (NFU x% de neuroesferas tripotent) / 100%.
Representative Results
Hemos utilizado este protocolo para evaluar la capacidad de LeX, una superficie celular conocido NSC marcador de 7, para enriquecer en células madre neurales. Los datos de este estudio se utilizarán para ilustrar cómo NSCs se enumeran usando los ensayos clonales en el protocolo. células de neuroesferas de ratón E14.5 se incubaron con anticuerpo anti-Lex. Posteriormente, las células que expresan LeX (LEX +) y las células que no expresan LeX (LEX -) se sembraron a 50 células / ml de células activadas por-por fluorescencia (FACS) y se dejan generar neuroesferas clonales para 1 sem. Time-lapse muestra que las neuroesferas generadas en 50 células / ml son clonal (Figura 2). La NFU para LeX + y - LEX se determinó células. Se demostrado que las células LeX + tienen una capacidad significativamente mayor formación de neuroesferas en comparación con LEX - células (Figura 3G). Las neuroesferas generadas se diferencian entoncesen condiciones clonales, posteriormente inmunoteñidas y la imagen (Figura 3a-e). Células LeX + generan significativamente más neuroesferas tripotent que LEX - células (Figura 3F). Entonces la frecuencia NSC se calculó sobre la base de la NFU y% de neuroesferas tripotent (Figura 3G). La selección basada en LeX, enriquece la frecuencia NSC en más de 14 veces, validando LeX como marcador NSC. También hemos determinado la frecuencia de NSC E14.5 neuroesferas de ratón utilizando este protocolo 27 y 28 NCFCA. Ambos métodos Informe de frecuencia NSC comparable de aproximadamente 2% en E14.5 neuroesferas de ratón.
Figura 1. Protocolo para Neurosphere Diferenciación bajo condiciones clonales. Neuroesferas de ejemplo que crecen bajo condiciones clonales se colocan individualmente en cada uno de PLL / laminina-coated bien de un cubreobjetos de 50 pocillos cámaras, y se dejaron adherir O / N. En el mismo día, neuroesferas cultivadas a granel se colocaron en placas en medio de diferenciación en un plato de 10 cm PLL / laminina recubierto, y permite que se adhieran O / N. El día siguiente, el medio acondicionado de las neuroesferas en cultivo a granel se filtra y se coloca de nuevo en la placa de 10 cm. Las neuroesferas muestra se invierte entonces en el medio condicionado y se dejaron diferenciar durante 3-4 días 28. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Crecimiento de una Clonal Neurosphere. Las células derivadas de neuroesferas E14.5 se disociaron y se sembraron a 50 células / ml en el plato de 96 pocillos. Las células individuales fueron rastreados durante 6 días por time-lapse. Imágenes de Ose muestra ne tal célula que crece en un neurosphere. Tenga en cuenta que la neurosphere mantiene clonalidad. (A) 0 días; (B) 01.19.45; (C) 2.95.37; (D) 3.32.76; (E) 4.46.53; (F) 5.61.44; donde el primer número se refiere al día, segundo número se refiere a la fracción de la día, y tercero número se refiere a la fracción de la h. aumento de 10X. Barra de escala, 100 micras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Diferenciación de neuroesferas clonal y recuento de NSC frecuencia. Neuroesferas individuales se seleccionaron y se diferencian en cubreobjetos de 50 pocillos cámaras durante 3 d. Una imagen representativa de una sta tripotent neurosphereined con (a) y DAPI inmunotinción para (b) GFAP, (c) Tuj1 y (d) O4. (E) muestra la superposición de (a) - (d). Barra de escala, 65 micras. (F) El% de unipotentes, bipotentes y tripotent neuroesferas generadas por Lex + y - LEX células (media ± SEM, n = 3). (G) la frecuencia de NSC en LeX + y - LEX. Celdas calculadas como el producto de NFU y% de neuroesferas tripotent Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Discussion
Describimos ji la enumeración de células madre neurales en condiciones clonales. Los pasos críticos incluyen el uso de crecimiento y diferenciación medio NSC fresco, y también el uso de la solución de PLL / laminina recién preparada para recubrir los cubreobjetos con cámaras, así como las placas de cultivo. Esto asegura de crecimiento y diferenciación condiciones óptimas de las neuroesferas. El uso de anticuerpos de buena calidad para detectar eficazmente las neuronas y células gliales, así como la recogida selectiva de neuroesferas clonales que no están en contacto con otras neuroesferas, son críticos. Por otra parte, es importante asegurar las neuroesferas escogidas no se secan. Se recomienda añadir 10 l de medio de diferenciación a cada pocillo después de recoger cada 10 neuroesferas. Es importante utilizar un cubreobjetos cámaras en un plato de 10 cm por muestra para evitar la diafonía entre neuroesferas a partir de diferentes muestras. Si dos cubreobjetos (cada uno con neuroesferas a partir de diferentes muestras) se colocan en elmisma placa de 10 cm, neuroesferas de un cubreobjetos pueden liberar factores que pueden alterar la propensión de las neuroesferas en el otro cubreobjetos de diferenciarse en linajes específicos. Dos cubreobjetos en la misma placa de 10 cm también pueden dar lugar a confusión entre las muestras.
En el caso de la NFU o la frecuencia NSC es más bajo de lo esperado, aseguran que se utilizan bajo número de pasos neuroesferas. También es importante que neuroesferas sanas bajas de paso se utilizan para la generación de medio condicionado. A continuación, si las neuroesferas se cultivan en pozos con diámetro pequeño, como en el plato de 96 pocillos, entonces será difícil de maniobrar y recoger neuroesferas utilizando una micropipeta. En este caso, la transferencia de las neuroesferas a una placa de cultivo más grande, tal como un plato de 6 pocillos, antes de recoger. Algunas de las neuroesferas escogidas pueden despegará desde el portaobjetos de cámara durante el cultivo y la inmunotinción. Minimizar el movimiento de la cubreobjetos de cámara durante el cultivo, y menos lavado intensivoing durante la inmunotinción, ayudaría a evitar el desprendimiento de neuroesferas.
Los estudios iniciales NSC cuantificaron utilizando sólo la NFA 7,11,13. Sin embargo, la NFA sobrestima la frecuencia NSC ya que ambos NSC y principios de los PN generan neuroesferas 5. Louis et al. Desarrolló otro método para cuantificar NSCs conocido como el NCFCA 21,22. El NCFCA implica cultivar células individuales en una matriz a base de colágeno para asegurar la clonalidad, y se demostró que neuroesferas mayores de 2 mm de diámetro se forman por sólo NSCs. Al igual que en el NCFCA, clonalidad se garantiza a través de este protocolo. Esto se logra mediante la generación de neuroesferas en densidad clonal y la diferenciación de las neuroesferas en cubreobjetos con cámaras. El uso de cubreobjetos septadas confiere una serie de ventajas. El cubreobjetos cámaras permite que cada neurosphere muestra de diferenciar sin tener contacto físico con otras neuroesferas la muestra, lo que se garantiza la clonalidad durante la diferenciación.El cubreobjetos cámaras se puede colocar en suspensión en el medio de diferenciación para permitir que las neuroesferas muestra para ser acondicionadas de forma continua y para garantizar la máxima diferenciación. En ausencia de medio acondicionado y suero durante la diferenciación, la supervivencia de las neuroesferas disminuye y las neuroesferas sobre todo generar astrocitos (Tham M y Ahmed S, no publicados). Además, las neuroesferas immunostained se pueden almacenar convenientemente por un largo período de tiempo y los cubreobjetos con cámaras se pueden montar directamente sobre los portaobjetos de vidrio de microscopio. Además, las imágenes de las neuroesferas immunostained es fácil como uno puede localizar rápidamente el neurosphere en la pequeña recámara así, capturar una imagen, y pasar a la siguiente también.
Hemos determinado la frecuencia de NSC en E14.5 cultura neurosphere ratón utilizando tanto el protocolo descrito en este manuscrito 27 y 28 NCFCA. La frecuencia NSC en E14.5 neuroesferas de ratón determina tanto por míthods son comparables. El NCFCA enumera NSC que son multipotentes y tienen la capacidad de auto-renovación a largo plazo. Dado que la frecuencia NSC de nuestro método es comparable a la de NCFCA, no parece que la lectura de nuestro protocolo a sobreestimar la frecuencia NSC. El NCFCA requiere tres semanas para ser completado y afecta principalmente chapado celular y la reposición medio. El protocolo descrito aquí requiere 13 días para realizar e implica una serie de pasos diferente, por ejemplo, la recolección de neurosphere y inmunotinción. Este protocolo podría servir como un método alternativo para enumerar NSCs. Los investigadores pueden utilizar tanto NCFCA y este protocolo para verificar la frecuencia NSC en sus muestras.
Una limitación de este protocolo es que una serie de pasos importantes tienen todos a llevarse a cabo el día 8. La preparación del medio acondicionado, determinación de NFU de neuroesferas de la muestra, y la transferencia de neuroesferas de muestra para el cubreobjetos 50 pocillos de cámara tiene que ser realizado sobre el day 8. Uno podría tomar tiempo para completar estos pasos. Además, se requiere práctica para llevar a cabo estos pasos de una manera eficiente.
Las neuroesferas se han utilizado ampliamente para estudiar la función y el comportamiento NSC. Sin embargo, neuroesferas consisten tanto en células madre neurales y PN. Por lo tanto, es importante para enriquecer NSCs de neuroesferas para estudiar la biología NSC. Actualmente, los marcadores de superficie celular, de propiedad exclusión de colorante, así como el tamaño celular y granularidad se han utilizado para enriquecer en NSCs 6,7,9-13,29,30. Este protocolo se podría utilizar para cuantificar el enriquecimiento de células madre neurales por los posibles marcadores NSC, y para facilitar la búsqueda de un marcador NSC definitiva. Cuatro estudios recientes han utilizado este protocolo para enumerar frecuencia NSC 5,14,15,26.
Acknowledgments
Agradecemos a la Agencia para la Ciencia, Tecnología e Investigación (A * STAR), Singapur por financiar esta investigación.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL conical centrifuge tubes | BD | 352096 | |
| 50 mL conical centrifuge tubes | BD | 352070 | |
| 20 mL sterile syringe | BD | 300141 | |
| 50 mL sterile syringe | BD | 300144 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Biowest | S1810 | |
| Mouse anti-Tuj1 IgG2a antibody | Covance | MMS-435P-100 | |
| Rabbit anti-GFAP IgG antibody | Dako | Z033401 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 3100 | |
| Microscope fitted to laminar flow hood | Leica | MZ6 | |
| Glass slides | Marienfeld-superior | 1000200 | |
| Mouse anti-O4 IgM antibody | Merck Millipore | MAB345 | |
| Hydromount | National Diagnostics | HS-106 | |
| Microscope | Nikon Eclipse | TS100-F | |
| Laminar flow hood | NuAire | NU-543 | |
| 96-well culture dishes | NUNC | 167008 | |
| 10-cm culture dishes | NUNC | 150350 | |
| Paraffin film | Parafilm | PM999 | |
| Human Epidermal Growth Factor (EGF) | Peprotech | AF-100-15 | |
| Recombinant human basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) | Peprotech | 100-18B | |
| 0.2 µm filter | Sartorius Stedim | 16534-K | |
| 0.45 µm filter | Sartorius Stedim | 16555-K | |
| 1.0 N Sodium Hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich | S2770 | |
| 1.0 N Hydrochloric acid (HCl) | Sigma-Aldrich | H9892 | |
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| Poly-L-Lysine (PLL) | Sigma-Aldrich | P8920 | |
| Paraformaldehyde (PFA) powder | Sigma-Aldrich | P6148 | Toxic |
| Bovine Serum Albumin (BSA) powder | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| 50-well chambered coverslips | Sigma-Aldrich | C7735 | |
| Stir plate with heat function | Stuart | UC152 | |
| DMEM/F12 medium | Thermo Fisher Scientific | 11320-033 | |
| B27 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| Laminin | Thermo Fisher Scientific | 23017-015 | |
| 1x Phosphate Buffered Saline without Ca2+ and Mg2+ (DPBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190144 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgM antibody | Thermo Fisher Scientific | A21042 | |
| Alexa Fluor 594 goat anti-mouse IgG2a antibody | Thermo Fisher Scientific | A21135 | |
| Alexa Fluor 647 goat anti-rabbit IgG antibody | Thermo Fisher Scientific | A31573 | |
| 4’,6’-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | D3571 | |
| Cell-culture centrifuge | Thermo Fisher Scientific | RT1 75002383 | |
| Pasteur pipettes | Thermo Fisher Scientific | 10006021 | |
| CO2 incubator | |||
| Ventilated fume-hood | |||
| Aspirator | |||
| Confocal microscope | |||
| Micropipettes | |||
| Micropipette tips | |||
| Plastic pipettes | |||
| Multichannel pipettes | |||
| Glass beaker | |||
| Sterile forceps | |||
| pH meter |
References
- Ahmed, S. The culture of neural stem cells. J. Cell. Biochem. 106 (1), 1-6 (2009).
- Reynolds, B. A., Tetzlaff, W., Weiss, S. A multipotent EGF-responsive striatal embryonic progenitor cell produces neurons and astrocytes. J. Neurosci. 12 (11), 4565-4574 (1992).
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255 (5052), 1707-1710 (1992).
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Clonal and Population Analyses Demonstrate That an EGF-Responsive Mammalian Embryonic CNS Precursor Is a Stem Cell. Dev. Biol. 175 (1), 1-13 (1996).
- Narayanan, G., et al. Single-Cell mRNA Profiling Identifies Progenitor Subclasses in Neurospheres. Stem Cells and Dev. 21 (18), 3351-3362 (2012).
- Uchida, N., et al. Direct isolation of human central nervous system stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. 97 (26), 14720-14725 (2000).
- Capela, A., Temple, S. LeX/ssea-1 Is Expressed by Adult Mouse CNS Stem Cells, Identifying Them as Nonependymal. Neuron. 35 (5), 865-875 (2002).
- Capela, A., Temple, S. LeX is expressed by principle progenitor cells in the embryonic nervous system, is secreted into their environment and binds Wnt-1. Dev. Biol. 291 (2), 300-313 (2006).
- Corti, S., et al. Isolation and characterization of murine neural stem/progenitor cells based on Prominin-1 expression. Exp. Neurol. 205 (2), 547-562 (2007).
- Nagato, M., et al. Prospective characterization of neural stem cells by flow cytometry analysis using a combination of surface markers. J. Neurosci. Res. 80 (4), 456-466 (2005).
- Kim, M., Morshead, C. M. Distinct Populations of Forebrain Neural Stem and Progenitor Cells Can Be Isolated Using Side-Population Analysis. J. Neurosci. 23 (33), 10703-10709 (2003).
- Murayama, A., Matsuzaki, Y., Kawaguchi, A., Shimazaki, T., Okano, H. Flow cytometric analysis of neural stem cells in the developing and adult mouse brain. J. Neurosci. Res. 69 (6), 837-847 (2002).
- Rietze, R. L., Valcanis, H., Brooker, G. F., Thomas, T., Voss, A. K., Bartlett, P. F. Purification of a pluripotent neural stem cell from the adult mouse brain. Nature. 412 (6848), 736-739 (2001).
- Tham, M., et al. CSPG Is a Secreted Factor that Stimulates Neural Stem Cell Survival Possibly by Enhanced EGFR Signaling. PLoS ONE. 5 (12), e15341 (2010).
- Gan, H. T., Tham, M., Hariharan, S., Ramasamy, S., Yu, Y. H., Ahmed, S. Identification of ApoE as an autocrine/paracrine factor that stimulates neural stem cell survival via MAPK/ERK signaling pathway. J. Neurochem. 117 (3), 565-578 (2011).
- Ramasamy, S., Narayanan, G., Sankaran, S., Yu, Y. H., Ahmed, S. Neural stem cell survival factors. Arch. Biochem. Biophys. 534 (1-2), 71-87 (2013).
- Ahmed, S., et al. Transcription factors and neural stem cell self-renewal, growth and differentiation. Cell Adh. Migr. 3 (4), 1-12 (2009).
- Gritti, A., et al. Multipotent Neural Stem Cells Reside into the Rostral Extension and Olfactory Bulb of Adult Rodents. J. Neurosci. 22 (2), 437-445 (2002).
- Gritti, A., et al. Epidermal and Fibroblast Growth Factors Behave as Mitogenic Regulators for a Single Multipotent Stem Cell-Like Population from the Subventricular Region of the Adult Mouse Forebrain. J. Neurosci. 19 (9), 3287-3297 (1999).
- Vescovi, A. L., et al. Isolation and cloning of multipotential stem cells from the embryonic human CNS and establishment of transplantable human neural stem cell lines by epigenetic stimulation. Exp. Neurol. 156 (1), 71-83 (1999).
- Azari, H., Louis, S. A., Sharififar, S., Vedam-Mai, V., Reynolds, B. A. Neural-Colony Forming Cell Assay: An Assay To Discriminate Bona Fide Neural Stem Cells from Neural Progenitor Cells. J. Vis. Exp. (49), e2639 (2011).
- Louis, S. A., et al. Enumeration of Neural Stem and Progenitor Cells in the Neural Colony-Forming Cell Assay. Stem Cells. 26 (4), 988-996 (2008).
- Coles-Takabe, B. L., et al. Don't look: growing clonal versus nonclonal neural stem cell colonies. Stem Cells. 26 (11), 2938-2944 (2008).
- Mori, H., Fujitani, T., Kanemura, Y., Kino-Oka, M., Taya, M. Observational examination of aggregation and migration during early phase of neurosphere culture of mouse neural stem cells. J. Biosci. Bioeng. 104 (3), 231-234 (2007).
- Singec, I., et al. Defining the actual sensitivity and specificity of the neurosphere assay in stem cell biology. Nat. Methods. 3 (10), 801-806 (2006).
- Yu, Y. H., et al. Purification, Visualization, and Molecular Signature of Neural Stem Cells. Stem Cells and Dev. 25 (2), 189-201 (2016).
- Yu, Y. H. C1qR1 is comparable with LeX and Prom1 as a neural stem cell marker. Identification of mouse embryonic neural stem cell surface markers. , Chapter 3.5, Figure 3.17 (2012).
- Tham, M. Neural colony-forming cell assay. A role for chondroitin sulfate proteoglycan in regulating the survival and growth of neural stem cells. , Chapter 3.6.3, Figure 3.22A (2009).
- Yuan, S. H., et al. Cell-Surface Marker Signatures for the Isolation of Neural Stem Cells, Glia and Neurons Derived from Human Pluripotent Stem Cells. PLoS ONE. 6 (3), e17540 (2011).
- Hall, P. E., Lathia, J. D., Miller, N. G. A., Caldwell, M. A., Ffrench-Constant, C. Integrins Are Markers of Human Neural Stem Cells. Stem Cells. 24 (9), 2078-2084 (2006).
