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Bioengineering

Mikrostrukturierung und Montage von 3D-Micro-Ader

Published: September 9, 2016 doi: 10.3791/54457
Automatic Translation
*1, *1, 2, 1,2
1Department of Bioengineering, University of Washington, 2Center for Cardiovascular Biology, Institute for Stem Cell and Regenerative Medicine, University of Washington
* These authors contributed equally

Summary

Dieses Manuskript stellt ein Spritzgussverfahren microvessels zu entwickeln, die physiologischen Eigenschaften des Endothels rekapitulieren. Die Mikrofluidik-basierten Prozess erstellt Patent 3D Gefäßnetze mit tailor Bedingungen, wie Durchfluss, zelluläre Zusammensetzung, Geometrie und biochemische Steigungen. Das Herstellungsverfahren und Beispiele für mögliche Anwendungen beschrieben.

Abstract

In - vitro - Plattformen Endothelzellen und Gefäßbiologie zu studieren , um 2D - endothelialen Zellkultur, Strömungskammern mit Polymer oder Glas basierenden Substraten und Hydrogel-basierte Rohrbildungstests weitgehend begrenzt sind. Diese Tests, während informativ, nicht rekapitulieren nicht Lumen Geometrie, richtige extrazellulären Matrix und mehrzelligen Nähe, die bei der Modulation der Gefäßfunktion eine Schlüsselrolle spielen. Dieses Manuskript beschreibt ein Spritzgussverfahren Engineered Gefäße mit einem Durchmesser in der Größenordnung von 100 & mgr; m zu erzeugen. Microvessels werden durch Impfen Endothelzellen in einem mikrofluidischen Kanal innerhalb einer nativen Typ-I-Kollagen-Hydrogel eingebettet hergestellt. Durch die Integration von Bildung Parenchymzellen in der Kollagenmatrix vor dem Kanal können spezifische Gewebe-Mikroumgebungen modelliert und untersucht werden. Zusätzliche Modulationen der hydrodynamischen Eigenschaften und Medienzusammensetzung ermöglichen Steuerung von komplexen Gefäßfunktion innerhalb des gewünschten Mikro.Diese Plattform ermöglicht die Studie von perivaskulären Zellrekrutierung, Blut-Endothel-Interaktionen, Flussantwort und Gewebe-mikrovaskulären Wechselwirkungen. Ausgeführt microvessels bieten die Möglichkeit, den Einfluss von einzelnen Komponenten eines vaskulären Nische zu isolieren und zu steuern, genau seine chemischen, mechanischen und biologischen Eigenschaften der Gefäßbiologie sowohl in Gesundheit und Krankheit zu studieren.

Introduction

Die Mikrovaskulatur in jedem Organ hilft , die Gewebemikroumgebung definieren, Gewebe - Homöostase und Entzündung regulieren, Permeabilität, Thrombose und Fibrinolyse 1,2 aufrechtzuerhalten. Mikrovaskulären Endothel, insbesondere ist die Schnittstelle zwischen der Blutströmung und dem umgebenden Gewebe und somit eine kritische Rolle spielt Gefäß- und Organfunktion in Reaktion auf Reize wie hydrodynamischen Kräfte in Modulieren und zirkulierende Cytokine und Hormone 3 bis 5. Das Verständnis der detaillierten Wechselwirkungen zwischen dem Endothel, Blut, und das umgebende Gewebe Mikroumgebung ist für die Untersuchung der Gefäßbiologie und Fortschreiten der Krankheit wichtig. Allerdings sind die Fortschritte , diese Interaktionen in das Studium wurde durch in - vitro - Tools beschränkt behindert , die in vivo mikrovaskulären Struktur rekapitulieren nicht und Funktion 6,7. Als Ergebnis hat sich das Feld und therapeutischen Fortschritt stark auf kostspielige und zeit verlassenraubend Tiermodelle , die oft nicht zum Erfolg beim Menschen 8 zu übersetzen - 10. Während in vivo - Modellen bei der Untersuchung von Krankheitsmechanismen und vaskuläre Funktionen sind von unschätzbarem Wert, sind sie komplex und fehlt oft eine genaue Kontrolle der einzelnen zellulären, biochemischen und biophysikalischen Signale.

Gefäßsystem im ganzen Körper verfügt über eine breite hierarchische Struktur in Verbindung mit expansive kapillaren Betten, optimierte Perfusion und Nährstofftransport gleichzeitig 11 bereitstellt. Zunächst Gefäßformen als primitive Plexus , die 12,13 während der frühen Entwicklung zu einem hierarchisch verzweigten Netzwerk reorganisiert. Obwohl viele der in diesen Prozessen beteiligt sind Signale gut 14 verstanden werden - 16, bleibt es schwer , wie solche Gefäßmuster 15 bestimmt wird. Im Gegenzug diesen Prozess in vitro zu rekapitulieren organisierten Gefäßnetze zu konstruieren hat Bienen schwierig. Viele existierende in vitro Plattformen Vaskulatur, wie zweidimensionale Endothelzellkulturen zu modellieren, fehlen wichtige Eigenschaften wie mehrzelligen Nähe dreidimensionale luminalen Geometrie, Durchfluss- und extrazellulären Matrix. Rohrbildungstests in 3D Hydrogele (Collagen oder Fibrin) 17-19 oder Invasionsassays 20,21 verwendet wurden 23 Endothelfunktion in 3D und ihre Wechselwirkungen mit anderen vaskulären 17,22 oder Gewebezelltypen zu untersuchen. Allerdings montiert Lumen in diesen Tests fehlt Verbunds, der hämodynamischen Strömungs und entsprechende Perfusion. Darüber hinaus verhindert die Neigung zur Gefäß Regression in diesen Rohrbildungstests 24 Langzeitkultur und Reifung , die den Grad der funktionellen Studien begrenzt, die durchgeführt werden können. Somit gibt es einen wachsenden Bedarf in vitro Plattformen der mikrovaskulären Netzwerke zu konstruieren , die in geeigneter Weise modellieren endothelial Eigenschaften und sind in der Lage Langzeitkultur.

Eine Vielzahl von vaskulären Engineering-Techniken haben in den letzten Jahren für medizinische Anwendungen entstanden bei Patienten mit Gefäßerkrankung zu ersetzen oder zu umgehen betroffenen Schiffe. Mit großem Durchmesser Gefäße aus synthetischen Materialien, wie Polyethylenterephthalat (PET), und Polytetrafluorethylen (ePTFE) , haben erhebliche therapeutische Erfolge mit Langzeitdurchgängigkeit (durchschnittlich 95% Durchgängigkeit über 5 Jahre) 25 hatte. Obwohl mit kleinem Durchmesser synthetische Transplantate (<6 mm) in der Regel Komplikationen konfrontiert wie Intimahyperplasie und Thrombopoese 26 - 28, Gewebe mit kleinem Durchmesser Transplantate mit biologischen Material entwickelt haben erhebliche Fortschritte gemacht 29,30. Trotz Fortschritten dieser Art entwickelt, Schiffe, die auf der Mikroskala haben eine Herausforderung geblieben. Um adäquat microvasculature zu modellieren, ist es notwendig, komplexe Netzwerkstrukturen mit suf zu erzeugenreichend mechanische Festigkeit Durchgängigkeit und mit einer Matrix-Zusammensetzung zu erhalten, die für die parenchymalen Zellen und Zellumbau für beide Nahrungsmittelpermeation ermöglicht.

Dieses Protokoll stellt einen neuartigen künstlichen perfundierbaren Gefäßnetz , das eine native in vivo nachahmt mit einem abstimmbaren und steuerbaren Mikroumgebung schaffen 31-34. Das beschriebene Verfahren erzeugt Engineered microvessels mit einem Durchmesser in der Größenordnung von 100 & mgr; m. Ausgeführt microvessels werden hergestellt durch Perfusion Endothelzellen durch einen mikrofluidischen Kanal, der in weichen Typ eingebettet ist I-Hydrogel-Kollagen. Dieses System hat die Fähigkeit, gemusterten Netzwerke mit offenen Struktur luminalen erzeugen, replizieren multi-zellulären Interaktionen modulieren extrazellulären Matrixzusammensetzung und gelten physiologisch relevanten hämodynamischen Kräften.

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Protocol

1. Mikrofertigung von Patterned Polydimethylsiloxane (PDMS) mit Network Design

  1. Waferherstellung eine negative Vorlage des Network Design zu erstellen
    1. Erstellen Sie ein Netzwerkmuster mit einem beliebigen Computer-Aided Design (CAD) Software. Stellen Sie sicher, dass die diagonalen Abmessung zwischen dem Einlass und Auslass zwischen den Ein- und Austritts Stauseen auf den Gehäuseeinrichtungen in Zukunft vor, um den Abstand übereinstimmen (siehe 2.1.1).
      Hinweis: Das Design des Musters selbst Brauch beruht auf den spezifischen Forschungsziele des Benutzers abhängig (Abbildung 1 zum Beispiel Muster sehen).
    2. Generieren Sie eine Maske des Netzmuster hochauflösenden Druck mit oder eine Chromphotomaske von einem kommerziellen Anbieter bestellen. Eine detailliertere Protokoll des photolithographischen Prozesses ist an anderer Stelle 35 zur Verfügung.
    3. Reinigen eines 8 "Silizium-Wafer für 5 min bei 100 W mit Sauerstoff-Plasmabehandlung.
    4. Gießen Sie genug Negativphotoresist (SU-82100 funktioniert gut) auf den Wafer, so dass die Formen einen Klecks mit einem Durchmesser von 2,5 cm widerstehen. Mit Hilfe eines Spin-Coater, drehen Sie das Wafer bei 500 Umdrehungen pro Minute mit 100 Umdrehungen pro Minute / sec Rampe und halten für 10 Sekunden. Rampe dann mit 300 rpm / sec bis 1600 rpm und 30 Sekunden halten. Hinweis: Die Geschwindigkeit und die Rampe müssen für jeden Laborbedingung optimiert werden, um eine Dicke von 150 & mgr; m Resists ergeben.
    5. Soft-bake dem Wafer bei 65 ° C für 7 min, Rampe bis zu 95 ° C mit 360 ° C / h und 45 min aufrechterhalten. Langsam auf Raumtemperatur auf der heißen Platte nach unten. Impressum das Gefäßmuster auf den beschichteten Wafer durch Belichtung mit 365 nm UV - Licht unter einer Chrom - Photomaske, mit der Exposition das Dreifache der Herstellerempfehlung (350 mJ / cm 2 für eine SU-8 Dicke von etwa 150 & mgr; m).
      Hinweis: Da SU-8 ist ein Negativ-Resist, die belichteten Bereiche (alles außer dem Musterentwurf) wird 1.1.7 in Schritt in den Entwickler unlöslich werden.
    6. Hart backen dem belichteten Wafer bei 65° C für 5 min und mit 360 ° C / h auf 95 ° C hochzufahren und für 25 Minuten halten, dann lassen Sie es langsam auf der heißen Platte auf RT abkühlen.
    7. Tauchen Sie die Wafer in SU-8-Entwickler 10 - 15 min abzuwaschen nicht belichteten Resist dann sauber mit Isopropylalkohol und trocken unter einem komprimierten Stickstoffstrom. Überprüfen Sie das Muster unter einem Lichtmikroskop die SU-8-Resist, um sicherzustellen, ist gut mit dem Wafer verbunden (suchen Sie nach unerwünschten Peeling und Blasen).
    8. Messen der Dicke der Mustermerkmale unter Verwendung eines Profilometers gemäß den Anweisungen des Herstellers 36. Während der Messwerterfassung vermeiden Bereiche der Struktur , die für die Netzwerkfunktion essentiell sind (dh Einlaß- und Auslaßleitungen) als Kontakt basierend Profilometer könnte die strukturelle Integrität der strukturierten Merkmale auf dem Wafer beeinträchtigen. Alternativ können Sie einen berührungsloses Verfahren (dh optische Profilometer) insgesamt um dieses Problem zu vermeiden.
  2. Geration von Patterned und Flachpressformen für das Collagen Molding
    Hinweis: Behandeln Sie Silane innerhalb einer chemischen Abzugshaube.
    1. Platzieren des Wafers in einem Exsikkator mit 100 ul Trichlor (3,3,3-trifluorpropyl) silan für 2 Stunden die Oberfläche silanisiert.
    2. Übertragen silanisierte Wafer in eine 120 x 120 mm im Quadrat Petrischale. Gießen gemischt und entgastem PDMS-Elastomer und Härter (10: 1 w / w-Verhältnis) über den Wafer 4 zu erreichen - 6 mm Dicke. Gießen Sie zusätzliche PDMS in eine separate 120 x 120 mm im Quadrat Petrischale flache Formen ohne Muster zu erzeugen. Härtung bei 65 ° C für 2 Stunden.
    3. Aus dem Ofen nehmen und lassen Sie die PDMS auf Raumtemperatur abkühlen lassen. Mit schneiden mit einem Skalpell vorsichtig ein Quadrat um die SU-8 und langsam die PDMS-Form aus dem Wafer abzulösen. Schneiden Kanten bis 30 mm x 30 mm. Für flache Formen, schneiden PDMS ohne Prägemuster in quadratische Stücke etwa 40 mm x 40 mm gehärtet.

2. Gehäuse Devices

  1. fabricatIon von oben und unten Gehäuseteile
    1. Fabrizieren Behältergehäuse unter Verwendung von Poly (methylmethacrylat) (PMMA). die Teile von einem Standard-Maschinenwerkstatt mit CNC-gesteuerten (CNC) Fräsfunktionen Zur Herstellung und bestellen. Siehe Abbildung 1 eine schematische Darstellung der oberen und unteren Teile.
    2. Gestalten Sie das Gehäuseoberteil (1D) enthalten eine 20 mm x 20 mm und an der Unterseite des Gerätes mit einer Tiefe von 1 mm, zwei Kollagen Injektionsöffnungen (4 mm Durchmesser) auf der Oberseite des Gerätes an den Ecken des Platzes gut, zwei Ein- und Auslaufreservoirs mit 6 mm Durchmesser und vier Schraubenlöcher (3 mm Durchmesser) an den vier Ecken des Geräts.
      Anmerkung: Zusätzliche Löcher können an der Peripherie des Stücks zur Handhabung Zwecke gebohrt werden.
    3. Gestalten Sie das untere Gehäuseteil (Abbildung 1E) ein quadratisches Loch in der Mitte zu umfassen (Abmessungen 15 mm x 15 mm) mit einer umlaufenden 25 mm x 25 mmRegal mit einer Tiefe von 0,25 mm. Bohren Sie 4 Schraubenlöcher mit 4-40 Gewinde. Sicherstellen, dass die Schraubenlöcher in der unteren und oberen Teilen decken zusammen bei zukünftigen Montageschritte.

3. Mikrogefäßbauelementherstellung

  1. Herstellung von Materialien
    1. Waschen und Autoklaven zwei Sätze von Pinzette, ein Spatel aus rostfreiem Stahl, einem kleinen flachen Schraubendreher, Schrauben aus Edelstahl, und mehrere Edelstahlpassstifte. Für die Herstellung der Gefäße, auch mikro PDMS Formen Autoklaven, PDMS flach Quadrate, Glasplättchen (22 x 22 mm) und Baumwolle Stücke.
    2. Sterilisieren der PMMA Gehäuseteile in Bleichmittel für mindestens 1 Stunde, dann spülen mit autoklavierten Wasser in der Gewebekultur Haube zweimal, und an der Luft trocknen in sterilen Gewebekulturschalen (150 mm x 25 mm).
  2. Sterile Polyethylenimin-Glutaraldehyd (PEI - GA) Beschichtung
    1. Behandeln innere Vertiefungen trocken sterilisiert PMMA Stückemit Plasma etwa 1 min. 1% Polyethylenimin (PEI) auf die inneren Brunnen (die 20 mm im Quadrat und auf der Oberseite und der 25 mm im Quadrat Regal auf der Unterseite) der PMMA-Stücke für 10 min. Spülen mit sterilem H 2 O und erlauben in der Gewebekultur - Haube trocknen.
      Hinweis: Die Zeit für die Plasmabehandlung in Abhängigkeit von der verwendeten Gerätevariable ist - sollte das PEI verbreitet leicht eine hydrophile Oberfläche anzeigt. Falls nicht, können zusätzliche Plasmabehandlung erforderlich sein.
    2. Gelten 0,1% Glutaraldehyd (GA) auf PEI für 30 min Oberflächen der Stücke PMMA behandelt. Spülen Sie zweimal mit sterilem Wasser und trocknen lassen.
      Hinweis: In zukünftigen Schritten wird Kollagen anhaften kollagen Glutaraldehyd Vernetzung der beschichteten Oberfläche durch. Dies hilft, das Gel an Ort und Stelle innerhalb der Vorrichtung bei zukünftigen Montageschritte und während der gesamten Vorrichtung Kulturperiode zu sichern.
  3. Collagen Gel Vorbereitung
    1. Fabrizieren Gefäße mit 0,6% - 1% KollagenLösungen. Um Typ 0,75% Kollagen für Gefäßherstellung, mischen I - Kollagen - Stammlösung (1,5% - isoliert aus Rattenschwänzen 37) mit Natriumhydroxid (NaOH), 10x Medien Supplement (M199) und Zellkulturmedien. Halten Sie alle Lösungen auf dem Eis.
    2. Bestimmen Sie das Volumen von Kollagen durch die folgende Gleichung, wobei V ƒinal das endgültige Volumen des Gels ist erforderlich ( in der Regel 1 ml Kollagen pro Gerät ausreichend ist), V Lager Kollagen ist das Volumen der Lager Kollagen benötigt, Kollagen C Lager ist die Konzentration der Vorrats Kollagen und C ƒinal Kollagen ist die gewünschte Konzentration des Kollagens in dem Gefäß.
      Gleichung 1
    3. Verwenden Sie eine 1-ml-Spritze das entsprechende Volumen an Lager Kollagen zu einem neuen 30 ml konischen Röhrchen zu übertragen. Bestimmen Sie die Volumina der Neutralisierungs NaOH (V NaOH), M199 10x Medien ergänzen(V 10 X), und Zellkulturmedien (V 1 X) wie folgt und getrennt in einem 15 ml konischen Röhrchen vermischen:
      Gleichung 2
    4. Fügen Sie die Mischung von neutralisierenden Reagenzien (V 10 X, V NaOH, V 1 X) an den aliquotierten Kollagen, und mit einem kleinen Spatel sanft die Lösung zu mischen , bis ein homogenes Gel erhalten wird. Vermeiden Sie Blasen durch Rühren langsam und sanft eingeführt werden.
    5. (- 20 Millionen Zellen / ml beispielsweise 0,5), fügen die Zellen zu der Kollagenlösung , nachdem sie mit den neutralisierenden Reagenzien gemischt wird, und weiter rühren , bis die Zellen homogen verteilt sind , um Zellen in die Matrix in der gewünschten Konzentration einzuarbeiten.
    6. Wenn Zellen hinzugefügt werden, die Lautstärke von Zellkulturmedien das zusätzliche Volumen aufzunehmen, wie durch die folgende Gleichung bestimmt, wobei V Zellen </ sub> das erforderliche Volumen der Zellsuspension ist, C ƒinal Zelldichte die gewünschte Dichte der Zellen in dem Gefäß ist C Suspensionszelldichte in der Stammlösung , die Dichte der Zellen.
      Gleichung 3
  4. Collagen Injection - Top Stück
    1. Legen Sie die mikro PDMS-Form in einer 100 mm x 20 mm Schale. Plasma die PDMS-Form für 1 min reinigen.
    2. Richten Sie die obere PMMA Stück auf der Oberseite der PDMS - Form , so dass die quadratischen Reservoirs auf der Form direkt unter den Ein- und Austritts Stauseen sind (siehe Abbildung 1D - gestrichelte Linien). Legen Sie die Edelstahl Passstifte in die Einlass- und Auslass-Reservoir Löcher auf der Oberseite PMMA Stück freien Zugang aus den Behältern auf das Muster zu halten.
    3. Verwenden Sie eine 1-ml-Spritze ~ 0,5 zu extrahieren - 0,6 ml Kollagen. Stellen Sie sicher, dass keine Luftblasen in der Spritze verbleiben.
    4. Drücken Sie lightly mit einer Pinzette auf dem oberen Gehäuse bündig Kontakt zwischen dem Oberteil und der PDMS-Form zu gewährleisten. Injizieren Kollagen langsam durch eine Injektionsöffnung auf der Oberseite PMMA Stück. Überprüfen Sie, ob Kollagen im 20 mm x 20 mm Domäne über dem Muster füllt und leckt nicht aus.
    5. Schließen Sie das Gericht, ohne die Passstifte drängeln und lassen für 30 Minuten in einem 37 ° C Inkubator zu gelieren.
  5. Collagen Injection - Bodenstück
    1. Legen Sie ein 22 x 22 mm Deckglas in der Mitte des unteren Teils. Verwenden, um eine 1 ml Spritze ~ 0,25 ml Kollagen gleichmäßig auf den Objektträger aus Glas zu verzichten. Die PDMS flaches Quadrat über das Kollagen vorsichtig senken, die PDMS flach auf dem PMMA sichergestellt und es gibt keine eingeschlossenen Luftblasen. Erlauben bei 37 ° C für 30 min zu gelieren.
  6. Gerätemontage
    1. Nach dem Gelieren, fügen Sie genug PBS um das flache PDMS Stück auf dem Unterteil der PDMS (ca. 1 ml) zu umgeben. Verwenden einer Pinzette eine beliebige E zu entfernenxcess Kollagen an den Rändern, und langsam das PDMS Stück abziehen. Fügen Sie mehr PBS auf dem Kollagen Hydratation beizubehalten.
    2. Um das obere Stück herzustellen, verwenden Pinzette die obere PMMA Stück zu holen und es umdrehen, so dass die PDMS-Form an der Spitze ist. Fügen Sie ein paar Tropfen PBS auf die Schnittstelle, dann schnell und fest die PDMS-Form aus dem oberen PMMA Stück entfernen.
    3. Sanft Edelstahl Paßstifte von der anderen Seite des Gehäuses unter Verwendung eines anderen PMMA Pinzette entfernen. Fügen Sie mehrere Tropfen PBS auf die mikro Kollagen. Drehen Sie die PMMA-Stück über, so dass das Kollagen nach unten zeigt und legen 4 Schrauben in die Ecke Löcher.
    4. Sanft legen Sie das Oberteil auf der Oberseite des unteren Teils, auf dem Bodenstück die Schrauben mit den Eckbohrungen ausrichten. Nicht erlauben, die beiden Teile gegeneinander gleiten können. Verwenden Sie einen Schraubendreher, um die Schrauben anzuziehen eine sanfte Berührung mit. Nicht zu fest anziehen.
    5. Absaugen PBS die PMMA-Oberflächen umgeben und legen Sie eine kleine piece von Baumwolle unter einer Kante des Geräts. Mit einer Pipette entfernen Sie das PBS aus den Vorratsbehältern und ersetzen mit Zellkulturmedien. Lassen Sie das Gerät zu gelieren zusammen in einem 37 ° C Inkubator für mindestens 1 Std.
  7. Zellaussaat
    1. Kultur menschlicher Nabelvenen - Endothelzellen (HUVECs) in endothelialen Wachstumsmedium bei 37 ° C (CO 2, O 2) bis zur Konfluenz 38. Wann immer möglich, verwenden Sie zwischen den Kanälen 4 und 7.
    2. Trypsinize Endothelzellen durch mit 6 ml PBS, die Kulturflasche gewaschen und dann Zugabe von 2 ml 0,05% Trypsin bei 37 ° C um die Zellen zu dissoziieren. Lassen Sie die Zellen in Trypsin, bis die meisten der Fokaladhäsionen abgelöst haben, und die Zellen sind abgerundet (dies dauert in der Regel etwa 2 - 3 min). Stoppen Sie die Trypsin Reaktion von 4 ml endothelialer Wachstumsmedien Zugabe enthält fötalen Rinderserum (FBS). Waschen Sie die Flasche mit den Medien mehrmals die Zellen zu gewährleisten, aus dem Kolben gelöst und sammelnin einem konischen Röhrchen.
    3. Zählen Sie die Zellen unter Verwendung eines Hämozytometers und resuspendieren sie bei einer Dichte von 10 Millionen Zellen pro ml. Entfernen Sie alle Zellkulturmedien von den Ein- und Austritts Stauseen. Mit Hilfe eines 200 ul Gel Lade Spitze, mit 10 & mgr; l Zellsuspension in der Mitte des Einlassreservoir. Die Zellen sollten beginnen, in das Netz fließen sofort und Mantel das Netzwerk.
    4. Nach Zugabe von 200 ul Medien gleichmäßig auf beide Behälter und lassen Zellen anhängen und verbreiten innerhalb des Netzwerks für mindestens 1 Stunde.
  8. Geräte - Kultur
    1. Kultur die Vorrichtung mit Schwerkraft angetrieben Fluss durch das Netzwerk durch Zugabe von 200 ul Zellkulturmedien zu dem Einlassreservoir und 50 & mgr; l zu dem Auslass-Reservoir. Bei dieser Art der Kultur, ersetzen Medien alle 12 Stunden endotheliale Lebensfähigkeit zu erhalten.
      Hinweis: Wenn kontinuierliche Strömung Kulturbedingungen wünschenswert sind (konstante Schubspannung zu halten, sammeln Medien am Ausgang, etc.) ein SYRinge Pumpe kann anstelle der Schwerkraft angetrieben Kultur verwendet werden.
    2. Lassen Sie die ausgesäten Endothelzellen mindestens 24 Stunden zu befestigen und zu stabilisieren, bevor kontinuierlichen Strom angelegt wird. Vor dem kontinuierlichen Fluss Setup, halten die Geräte mit der Schwerkraft angetriebenen Strömungsverhältnisse.
      HINWEIS: Die Medienbedingungen für angewandte Strömung unterscheiden sich von der Schwerkraft angetrieben Kultur. Die Zugabe eines Plasmaexpander, wie Dextran, auf das Medium stabilisiert die engineered microvessels und verhindert vaskulären Kollaps während anhaltender Perfusion 39.
    3. Medien für kontinuierlichen Fluss Setup machen, lösen sich 3,5% Dextran (70 kDa) in endothelialen Wachstumsmedien für optimale Gefäßkultur. Unter Verwendung einer sterilen Technik füllen 10 ml Spritzen mit endothelialen Wachstumsmedium mit 3,5% Dextran.
    4. Vorbereiten eines sterilen Kulturschale für die Strömung durch Löcher in der Seitenwand einer Petrischale mit einem Lötkolben schmelzen.
    5. Bringen Sie 12 "Silikonschlauch (1/32" ID) zu einem Luer-Lock-Kupplung (weiblich, 1/16 "ID) und ein 1 /16 "geraden Rohr-Rohrverbinder mit einem 1" Schlauchsegment am anderen Ende. Legen Sie eine 1/4 "20G stumpfe Nadel (von der Nadelnabe Haus) mit dem freien Ende des 1" Segment. Auch ein 3 "Schlauchsegment vorbereiten zu einem Rohr-zu-Rohr Winkel 90 ° Anschluss Gelenk befestigt (im Gehäuseeingang eingebaut werden). In den folgenden Schritten wird der längere Schlauch durch die vorbereitete Schale geschraubt werden und an die 3 "Segment über die 20 G-Nadel. Outlet Schlauch sollte Zulaufschlauch, wobei ein freies Ende anstelle eines Luer-Lock-Kupplung spiegeln. Autoclave alle Segmente vor der Verwendung.
    6. Gewinde autoklaviert Eintritts- und Austrittsrohrdurchgangslöcher in die vorbereitete Schale. Bringen Sie 3 "Segmente Innen 20 G Nadeln. Bringen Sie den Luer-Lock-Kupplung an die Medien Spritze und perfuse Medien durch den Schlauch mit der Spritzenpumpe mit einer hohen Strömungsgeschwindigkeit eingestellt. Stellen Sie sicher, dass es keine Blasen im Schlauch oder Stecker sind, da diese Strömung zu dem Behälter zu behindern.
    7. Legen Sie die connector Gelenk in den Gehäuseeinlass. Stellen Sie die Spritzenpumpe auf die gewünschte Durchflussrate und beginnen Perfusion.
      ANMERKUNG: Dies kann in Abhängigkeit von der Behältergeometrie und experimentellen Bedingungen der angewandten Scherspannungen eingestellt werden. Für einen 100 & mgr; m Durchmesser Kanal, einer Flussrate von 3 & mgr; l / min gut funktioniert.
    8. Falls gewünscht, sammeln Perfusat mit Schlauch vorbereitet Auslass eine sterile 5 ml Polystyrol-Rundbodenröhrchen mit 500 ul Medium eingelegt in.
      Hinweis: Eine geringe Menge an Medien ist mit dem Sammelrohr hinzugefügt Blasenbildung zu verhindern, die Strömung blockieren.
    9. Je nach Strömungsgeschwindigkeit, müssen die Spritze kann nach 24 bis 36 Stunden wieder aufgefüllt werden. Dies wird durch das Entfernen des Verbinders von dem Gehäuseeinlass, Ersetzen der Spritze durchgeführt und ermöglicht Medien mit einer hohen Strömungsrate für mehrere min zu perfundieren. Diese Folge stellt sicher, daß Luftblasen werden nicht in die Rohrleitung eingeführt. Setzen Sie die Pumpe auf die gewünschte Durchflussrate für Kultur, stecken Sie den Stecker in die Gehäuseeinlass undRückkehr in den Inkubator.

4. Geräteanalyse

  1. Permeability Analyse
    1. Anwendung 40 kDa FITC-Dextran die Durchlässigkeit des Behälters in situ zu visualisieren. Legen Sie das Behältergehäuse auf einem konfokalen Mikroskop und konzentrieren sich an der Behälterebene. In 5 uM 40 kDa FITC-Dextran mit dem Einlass und Bild mit 4-facher Vergrößerung, 25 ms Belichtungszeit und bei 1 Bild pro Sekunde für 10 min.
    2. Analysieren der Bildserie mit Analysecode der Permeabilität von Dextran über die Gefäßwand in Kollagen (um / s) zu schätzen basierend auf einem Modell von Zheng et veröffentlicht. al. 31.
  2. Immunostaining & konfokale Bildanalyse
    1. Um dies zu beheben Gefäße, perfuse mit 3,7% Formaldehyd durch den Einlass 20 min und Wasch durch Perfusion PBS dreimal (20 Minuten pro Waschgang). Block unspezifische Antikörperbindung mit 2% Rinderserumalbumin (BSA) und 0,5% Triton X-100 pedurch das Netzwerk für 1 h rfused. Perfundieren primären Antikörperlösungen über Nacht bei 4 ° C und waschen dreimal mit PBS. Perfuse sekundären Antikörperlösungen für 1 bis 2 h und waschen wieder mit PBS auf die gleiche Weise.
    2. Immunofluoreszenz nehmen Bilder von Mikrogefäßen in situ ein konfokales Mikroskop mit einem z-Schritt von 1 & mgr; m verwendet wird . Bild die microvessels bei einer Vergrößerung von 4X, 10X oder 20X.
      Hinweis: Die Vergrößerung des 4X liefert globale Netzwerk Strukturinformationen, während 10X und 20X vergrößerten Bildern zelluläre Details liefern wird, wie Dehnung, Kreuzung Bildung usw.
    3. Analysieren Sie die Bildstapeln mit ImageJ mit Z Projektionen (Bild / Stacks / Z-Projekt), Querschnitte (Bild / Stacks / Orthogonal-Ansicht) und 3D-Rekonstruktionen (Bild / Stacks / 3D-Projekt).
  3. Rasterelektronenmikroskopie Imaging
    1. Für die Elektronenmikroskopie - Analyse, fix in situ durch Perfusion halber Stärke Karnovsky des Solution (2% Paraformaldehyd / 2,5% Glutaraldehyd in 0,2 M Cacodylatpuffer) über Nacht. Zerlegen Sie den Behälter und sorgfältig trennen die beiden Stücke. Schneiden Kanten und tauchen vollständig in der Fixierungslösung für mehrere Tage.
    2. Tauchen Sie den dicken oberen Teil des Behälters in 25% Glutaraldehyd für 20 min und spülen dreimal mit PBS (2 min jeweils). Entwässern in serielle ethanol Waschungen mit 50%, 70%, 85% (2 min jeweils) und zwei Waschungen in 100% Ethanol (jeweils 5 min).
    3. Bereiten Sie die Probe für die Analyse mit weiteren Dehydratisierung durch Trocknen am kritischen Punkt gemäß dem Protokoll des Herstellers 40. Sputter Mantel des Gefäßes mit Gold-Palladium (7 nm) und zu analysieren, unter einem Rasterelektronenmikroskop mit einer Beschleunigungsspannung von 5 kV, Fleckgrße 3.

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Representative Results

Die konstruierte Schiff Plattform schafft funktionelle microvasculature in einem natürlichem Kollagen Typ I Matrix eingebettet und ermöglicht eine strenge Kontrolle der zellulären, biophysikalische und biochemische Umgebung in vitro. Engineered microvessels, humane Nabelschnurvenen-Endothelzellen (HUVECs) herzustellen sind durch die kollagen eingebettet mikrofluidischen Netzwerk durchbluteten, wo sie legen ein Patent Lumen und konfluenten Endothel zu bilden. Wie in 1A-C dargestellt, kann der Behältergeometrie speziell Fragen zur Strömungsgeschwindigkeit, die Verwindung zu beantworten ausgebildet sein, und die Winkel abzweig, unter anderem. Modulieren der Strömungsrate durch die Mikrogefäße gibt Einblick in die Schubspannung-Reaktion von Endothelzellen. Zuvor hat Herstellungs Fokus vor allem auf Schiffen in der 100 & mgr; m Grßenbereich war jedoch Mikrogefßen bis zu 500 & mgr; m oder in einigen Fällen so klein wie 50 & mgr; m im Durchmesser succ gewesenessfully hergestellt und kultiviert. Beispiele für langfristige Durchgängigkeit sind sowie das Überleben von Mikrogefßen unter der Schwerkraft angetriebenen Strömungs (2A) und kontinuierliche angelegten Strömungs (2B) kultiviert gezeigt. Die in vivo -ähnliche Eigenschaften von technischen microvessels kann auf verschiedene Weise demonstriert werden. Verschiedene endothelial Funktionen können über diese Plattform , gemessen werden, einschließlich der Barrierefunktion (3A), Zell-Zell - Wechselwirkungen und Signalisieren (3B) und angiogene Remodellierung (3C). Ein kritisches Merkmal dieser microvessels ist ihre Fähigkeit, entzündliche Reize in einer biologisch relevanten Art und Weise zu reagieren. Dies wird am besten durch ihre Wechselwirkung mit Vollblut in 4A-C gezeigt , in dem nicht aktivierten Endothel Ruhe (4B) und aktiviertes Endothel induziert Thrombusbildung (4C). Durch Kultivieren von Endothelzellen differing Ursprung innerhalb dieser Plattform ist es möglich , die funktionelle Heterogenität zwischen Endothelzellen aus verschiedenen Quellen. 5A-C veranschaulicht ein Beispiel für diese Heterogenität mit zwei verschiedenen humanen Stammzellen abgeleiteten endothelialen Zelltypen zu verstehen , dass , wenn sie in der microvessel Systemanzeige drastisch unterschiedlichen Phänotypen 41. Durch die Abstimmung der Strömungsprofile, Zellzusammensetzung und Kulturbedingungen bieten engineered microvessels in - vitro - Werkzeug ein leistungsfähiges Endothel Biologie und microvasculature sowohl in Gesundheit und Krankheit zu studieren.

Abbildung 1
Abbildung 1. Schematische Darstellung der Netzwerkdesigns und Microchannel- Fabrication - Protokoll. Die Gefäßnetzgeometrie gezielt unterschiedliche Strömungsmuster zu erzeugen , gestaltet werden. A. Zum Beispiel wird ein verzweigtes Design fl gesunkenow Raten nahe dem Zentrum (eine 8 - fache Reduktion in einem 3 x 3 Raster) auf dem Endothel in Regionen unterschiedlicher Scherspannung resultierende im gleichen Gefäß 31. B. Ein hochverzweigtes Gitter folgt dem gleichen Prinzip wie die bisherige Konstruktion jedoch mit einer größeren Plexus. Mit dieser Konstruktion werden die Effekte einer 50 - fachen Reduktion der Strömungsgeschwindigkeit, was zu einer Schergeschwindigkeit Reduktion 10-500 sec -1 beobachtet werden kann , wenn ein Druckabfall von 1000 Pa über das Netzwerk 32 angelegt. C. komplexere Designs in pathologischen Kontext 42 auftreten zu beantworten , die oft wie eine gewundene Netz mit scharfen Ecken 32 Fragen zur endothelial Reaktion auf Unterbrechungen laminaren Strömung verwendet werden. Mikrogefßen aus diesen Mustern haben einen Durchmesser von 100 -. 150 & mgr; m D. Es gibt während der Mikrokanalherstellungs drei Hauptschritte. Zunächst wird der obere Teil des Gehäuses jig auf der Oberseite des PDM platziertS gemustertes Netzwerk Form, so daß der Einlaß und Auslaß ausgerichtet sind. Collagen I wird dann in den geschlossenen Raum durch die Einspritzöffnungen (schwarzer Pfeil) injiziert. Typischerweise wird eine 0,75% Kollagen-I-Gemisch für die Herstellung verwendet. Erfolgreiche microvessel Herstellung kann mit so niedrig wie 0,6% Kollagen erreicht werden, jedoch weniger als 0,6% führt in der Regel zu einer unzureichenden mechanischen Festigkeit und Kanal collapse. E. Eine dünne Schicht aus Kollagen ist mit dem Bodenstück auf der Oberseite des Deckglases gegeben und abgeflacht mit einem anderen PDMS Stück. F. nach dem Gelieren bei 37 ° C werden die PDMS Formen entfernt und die oberen und unteren Gehäusevorrichtungen sind zusammen um das Netzwerk zu umschließen geschraubt. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 2
> Abbildung 2. Micro-Ader Cultured mit kontrollierter Strömungsprofile. A. HUVECs ausgesät in Mikrogefßen kultiviert unter Schwerkraft angetrieben Strömung und B. kontinuierliche Strömung mit einer Rate von 3 & mgr; l / min aufgetragen. Kultur unter Anwendung Strömung wird am besten unter Zusatz von 3,5% Dextran zu den Medien erreicht , die innerhalb des Lumens gezeigt worden ist , die Bildung verbessern Übergang durch Ausüben physikalischer Druck auf Kollagenbasis microvessels mikrofluidischen zu stabilisieren, obwohl der genaue Mechanismus dieser Effekt Antriebs ist unklar 39 . Mikrogefße wurden für die Endothel - Junction Protein CD31 oder Cluster of Differentiation 31 (rot) gefärbt und von Willebrand - Faktor (VWF) Granulat (grün). A ', B'. In den beiden Bedingungen, ausgedrückt HUVECs endothelialen Marker der Zell-Zell - Junctions und VWF Granulat. A ", B". zeigen Orthogonalansichten Patent und abgerundeten Lumen nach 6 Tagen in der Kultur.arge.jpg "target =" _ blank "> Klicken Sie hier um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 3
Abbildung 3. Engineered Micro - Ader für das Studium der Endothelfunktion. A. Endothelial Barrierefunktion kann nach der Perfusion von FITC (Fluoresceinisothiocyanat) bewertet werden konjugierter Dextran durch die Netze ( ganz oben) und die anschließende Messung seiner Diffusion in die Masse Kollagen (unten). Verwendung von benutzerdefinierten Code können Videos von der Perfusion analysiert werden zu plotten Pixelintensität über einem interessierenden Bereich innerhalb des Rahmens über die Zeit der Permeabilitätskoeffizient K (& mgr; m / sec) des FITC-Dextran zu bestimmen. Früheren Veröffentlichungen des lab haben gezeigt , daß die Permeabilität dieser konstruierte Schiffe ist vergleichbar mit der ex vivo Säugergefäße 31,43. B. Endothel-Interaktionen bei PERIVascular oder Stützzellen können durch Modulieren der zellulären Zusammensetzung der Kollagenmatrix in dieser Plattform analysiert werden. Hier kann ein Beispiel für diese Zell-Zell-Wechselwirkungen zu sehen, wenn glatten Muskelzellen eingebettet sind im Kollagen die Gefäße umgibt. Nach 14 Tagen in Kultur, wie die glatten Muskelzellen (gefärbt für alpha Glattmuskelaktin (αSMA) in grün) assoziieren mit dem Endothel und erweitern Prozesse entlang der Gefäßwand und wirken als perivaskuläre Zellen in den orthogonalen Projektionen 31 gesehen. Bilder im Feld A und B gezeigt sind Reproduktionen aus einer früheren Publikation 31. C. Angiogenen Sprießen und Umbau kann durch Modifizieren des Kulturmedien umfassen angiogenen Stimuli in engineered microvessels ausgewertet werden. Ohne angiogenen Stimuli zeigen HUVECs minimal Sprießen (links); mit angiogenen Stimuli (1 uM niedermolekularer Inhibitor von GSK-3, 20 ng / ml vaskulärer endothelialer Wachstumsfaktor, und 20 ng / ml basic fibroblast growth-Faktor), HUVECs leicht in die Matrix sprießen wie in oben nach unten Projektionen und orthogonalen Ansichten (rechts) zu sehen. Die Sprosslänge und Anzahl ist leicht quantifizierbar mit ImageJ Software 41. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 4
Abbildung 4. Blut-Endothel - Interaktionen. Engineered microvessels sind Ruhe und angemessen reagieren zu Entzündungsreize. A. Ein unverändertes, HUVEC kultiviert Schiff nahe dem Einlass fotografiert zeigt starke CD31 junctional Färbung (rot) und ein rundes, offenes Lumen. A '. Orthogonal Ansicht des Lumens dargestellt. B. Wenn Vollblut mit Citrat versetztem mit CD41a-markierten Plättchen (grün) wird durch ein ähnlich Ruhebehälter perfundiert, minimal admenhalt von Blutplättchen (grün) an das Endothel beobachtet. C. Mit der Exposition gegen inflammatorische Reize wie Phorbol-12-Myristat-13-acetat (PMA, 50 ng / ml) zu den Medien, die Perfusion von Blut führt zur Bildung von großen Thromben (CD41a-markiertem, grün) innerhalb des Kanals und Adhäsion von Leukozyten (CD45 + gekennzeichnet, weiß) an der Gefäßwand 31. Bilder hier sind von einer früheren Veröffentlichung 31 reproduziert gesehen. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 5
Abbildung 5. Micro - Ader generiert mit menschlicher Stammzellen Abgeleitet-ECs. Zusätzliche endothelialen Zellquellen können verwendet werden , entwickelt microvessels zu erzeugen. Zu Beginn dieses Jahres Palpant et. al. zeigten , dass zwei verschiedene Subtypen ohemogenic Endothelzellen (gekennzeichnet durch die Expression von HAND1 und eine hohe hemogenic Potenzial) und endokardiale artigen Endothelzellen (gekennzeichnet teilweise durch expression: f humanen embryonalen Stammzellen gewonnenen Endothelzellen kann durch Manipulieren Wnt / β-Catenin-Signalisierung während der Differenzierung erhalten werden, von NFATc1 und GATA4) 41. A. Wenn ausgesät und kultiviert in der 3D - Schiff - Plattform unterziehen hemogenic ECs einige angiogenen sprießen. B. jedoch die endokardiale artigen ECs sind viel angiogenen und wandernd, was darauf hindeutet , funktionelle Unterschiede, vielleicht als Reaktion auf fließen, zwischen den beiden Subtypen von ECs (diese Arbeit im Detail in einer früheren Veröffentlichung vorgestellt 41). Beide Zelltypen exprimieren CD31 junctional Proteine ​​(rot) und einige VWF (grün). Orthogonal Blick auf beide zeigen Patent - Lumen. C. Eine rasterelektronenmikroskopische Aufnahme der endokardialen artigen ECs innerhalb des Gefäßes zeigt einen angiogenen sprießen wie gesehenvon der luminalen Seite. Bilder in den Feldern A und B dargestellt sind Reproduktionen von Palpant et. al. 41. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Discussion

Engineered microvessels sind ein in vitro - Modell , wo physiologische Eigenschaften wie luminalen Geometrie, hydrodynamischen Kräfte und mehrzelligen Wechselwirkungen vorhanden und abstimmbaren sind. Diese Art von Plattform ist in leistungsstark , dass es bietet die Möglichkeit , endothelial Verhalten in einer Vielzahl von Kontexten zu modellieren und zu studieren , wo die in vitro Kulturbedingungen können zu der der Mikroumgebung in Frage abgestimmt werden. Zum Beispiel werden die Antriebsmechanismen endothelial Prozesse, wie Angiogenese, bekannt 44 unterschiedlich in verschiedenen Organen und in verschiedenen pathologischen Zuständen, wie Gesundheit und Erkrankung auftreten. Aus diesem Grund ist planar Endothelzellkultur durchweg unzureichend 6 und als solche das Feld stark auf kostspielige und zeitraubende Tiermodellen gestützt.

Tiermodelle, während informativ und wichtig für den Fortschritt von der biologischen Forschung, nicht übersetzen immer gut in die Klinik.Dies wurde auf die Unterschiede zwischen den murinen und humanen biology weitgehend zurückgeführt, insbesondere in Bezug auf ihre Reaktion auf Reize 9,45. Es ist daher wichtig , imstande zu sein , in vitro - Modelle aufbauen, die zusätzlichen humanspezifische Daten zur Verfügung stellen kann , um Informationen aus Tiermodellen gewonnenen ergänzen. In vitro - Plattformen das Potenzial haben , die Mikroumgebung von Interesse mit der zusätzlichen Kapazität abzustimmen , dass Umgebung nachzuahmen. Schlüsselmerkmale eines solchen Systems sollten dreidimensionale Struktur und Geometrie, extrazelluläre Matrixzusammensetzung (ECM), Parenchymzelle Nähe und Interaktion, die Durchblutung und biochemische Reize umfassen. Ausgeführt microvessels haben die Fähigkeit, alle diese Parameter zu integrieren. Dies kann gleichzeitig ein allumfassendes Modell oder in eine schrittweise Weise hinzugefügt zu schaffen, durchgeführt werden, um individuelle Reaktionen und Wechselwirkungen zu isolieren.

Ein leistungsstarker Aspekt technischer microvessels ist die Fähigkeit,Kontrollfluss und zu manipulieren ausgeübten hydrodynamischen Kräfte auf das Endothel. Als Beispiel lässt sich das Gerät unter der Schwerkraft angetriebenen Strömungsbedingungen oder mit kontinuierlicher Perfusion (Abbildung 2) kultiviert werden. Der Betrag der Schubspannung an der Gefäßwand kann in beiden Bedingungen durch Änderungen der Strömungsrate und der Behältergeometrie moduliert werden. Der Hauptunterschied zwischen den beiden Zuständen ist die zeitliche Verteilung der Schubspannung innerhalb des Gefäßes. In Schwerkraft angetriebenen Strömungsbedingungen ist die Scherspannung im Laufe der Zeit nicht konstant. Die Fließgeschwindigkeit und Scherbelastung am höchsten sind unmittelbar nach einem Medienwechsel, wenn die Einlassreservoir voll ist. Da die Medien Drains, nimmt die Scherspannung. Dies führt zu einer Reihe von Scherbeanspruchung im Laufe von 12 Stunden. Die Experimente, die eine genaue Kontrolle über die hydrodynamischen Eigenschaften (zum Beispiel die Auswirkungen von Scherspannung auf das Endothel zu untersuchen) erfordern sollten kontinuierlichen Fluss Kulturbedingungen verwendet werden.

Engineered microvessels kann eine breite Palette von Fragen mit relativ einfachen Änderungen zu beantworten abgestimmt werden. Verschiedene Zelltypen, sowohl parenchymale und endotheliale können verschiedene Organ zu modellieren Systemen verwendet werden. Neben microvessels mit endothelialen Zellaussaat, Epithelzellen könnte statt dessen verwendet werden , um die Kanal für Studien zur Linie in Bezug auf die Darmschleimhaut, Lungenbläschen, Nierenkanälchen Herstellung usw. Sobald die Mikroumgebung von Zellzusammensetzung definiert ist, die Nährlösung (dh Medien, Blut, Wachstumsfaktoren oder andere biologisch relevante Flüssigkeit) , die verwendet wird , um die Vorrichtung zu perfuse können komplexe Fragen zu Zellsignalisierung, quiescence, Scherspannung zu beantworten geändert werden , Nährstoffe, Arzneimittelreaktion und vieles mehr. Darüber hinaus kann die Geometrie des Behälters speziell auf Schubspannung und Tortuosität zu untersuchen endothelial Antwort ausgelegt werden. Als Beispiel einer kürzlich erschienenen Publikation von Zheng et. al. zeigten , dass Endothelzellen increas habenin microvessel Regionen mit hoher Scherspannung und Strömungsbeschleunigung ed VWF-Sekretion und Faseranordnung. Insbesondere VWF Bündel typischerweise an Ecken und scharfe Kurven innerhalb des Netzwerks gebildet. Die Netzwerkgeometrie kann auch zur Herstellung mehrzelligen tubules ausgebildet sein. Zum Beispiel kann ein Design , das zwei parallele Kanäle , die jeweils mit ihren eigenen Einlass und Auslass verwendet werden könnte , enthält einen Konzentrationsgradienten zu erzeugen , oder ein benachbartes tubule Umgebung (zB Lymphgefäß mit benachbarten microvessel) zu modellieren. Die gitterartige Struktur der aktuellen Netzwerk - Designs (gezeigt in 1A-C) sind vorteilhaft für die numerische Strömungsmodellierung und für die strukturelle Integrität während der Herstellung, sind aber nicht indikativ für vaskuläre Struktur in den Körper. In künftigen Studien physiologischeren Netzwerk Muster wie diejenigen mit hierarchischen Verzweigung und abgerundeten Ecken verwendet werden.

Während alle Schritte dieses Verfahrens skizziert sind wichtig, dasind einige wichtige Schritte, die für eine erfolgreiche engineered microvessel Fertigung erforderlich sind. Das Kollagengel gründlich eine homogene Lösung zu erreichen, gemischt werden, und es ist wichtig, keine Blasen während dieser Stufe einzuführen. Dies ist für die Lebensfähigkeit der Zellen und die physiologische Funktion, insbesondere für Experimente, die parenchymale Zellen in der Kollagen-Matrix umfassen. Wenn eine gleichförmige Mischung des Kollagens schwierig zu erhalten ist, den pH-Wert der Lösung zu gewährleisten, ist es neutral ist. Wenn das Problem weiterhin besteht, ist es möglich, die Kollagen-Lager ersetzt werden sollte. Ein weiterer wichtiger Schritt ist die Montage der oberen und unteren Gehäuseteile - es wichtig ist, nicht mit Gewalt zu verwenden, da dies die Kanäle zum Einsturz bringen. Mehrere Übungsrunden kann notwendig sein, ein Gefühl für die Menge an Kraft, während Schrauben dreh anzuwenden erforderlich zu erhalten. Wenn der Kanal Zusammenbruch oder Zerschlagung auch nach der Praxis auftritt weiterhin, ist es möglich, die PDMS-Netzwerk ist aufgrund absorpt verziehenIonen von Feuchtigkeit. Beginnend mit frisch zubereiteten PDMS Formen helfen dieses Problem zu lösen. Unsachgemäß Gewindebohrungen in der unteren Vorrichtung kann auch Kanal Kollaps verursachen. Wenn die Schrauben nicht in der Lage sind glatt zu drehen, während der Montage müssen zusätzliche Kraft oft in einem strukturellen Versagen resultierenden angewendet werden. Der letzte entscheidende Schritt, die hervorgehoben werden sollte, ist die Bedeutung der häufigen Fütterung, in der Regel alle 12 Stunden. Dies ist wesentlich für das Endothel zu erhalten und verhindert das Gerät vor dem Austrocknen. In dem Fall, dass Endothelzellen erscheinen ungesund oder lösen sich von der Kollagenwand, mögliche Wege ausgesät endothelial Gesundheit zu verbessern, werden die Gefäße häufiger zu füttern, eine Spritzenpumpe verwenden kontinuierlichen Fluss zu übernehmen, oder den pH-Wert des Kollagen-Gel, um sicherzustellen, physiologischer Ebene ist.

Derzeit ist diese Plattform zur Herstellung mit extrazellulären Matrix von geeigneter Steifigkeit beschränkt bei der Montage die strukturelle Integrität des Kanals aufrechtzuerhalten. Dichtes collagen bei oder größer als 6 mg / ml ist ausreichend, aber Kollagen weniger als 6 mg / ml und andere Matrices wie dezellularisierte Matrix aus ganzen Organe sind zu schwach. Dies kann durch Verwendung einer Mischung von Kollagen mit der Matrix in Frage überwunden werden. Ausgeführt microvessels werden auch durch ihre Größenskala beschränkt. Die Schiffe können auf eine untere Grenze von müssten etwa 100 & mgr; m, aber wesentliche Änderungen einen kleineren Maßstab zu erreichen, angewendet werden, hergestellt werden. Obwohl engineered microvessels ein dreidimensionales Lumen erzeugen, ist das Netzwerk selbst planar. Um eine wirklich dreidimensionale Gefäßplexus schaffen, würde zusätzliche Modifikationen angewendet werden müssen, wie beispielsweise ein mehrschichtiges Netzwerk schaffen, indem mehrere konstruierte Schiffe zu stapeln.

Die repräsentativen Ergebnisse in dieser Methode dargestellt zeigen, wie Engineered microvessels verwendet werden können Barrierefunktion, Zell-Zell-Signalisierung (pericyte Rekrutierung und Gefäßstabilisierung), Angiogenese und Thrombose zu beurteilen. highlights dieser Studien sind hier mit ausführlicheren Präsentationen in früheren Publikationen 31,32 präsentiert. Diese Studien zeigen , wie pericytes wandern und Mantel das Endothel von technischen microvessels 31, Blutplättchen an aktiviertes Endothel 31 und Schubspannung moduliert Endothelaktivierung und VWF - Sekretion und Montage 32. Engineered microvessels kann verwendet werden , um vaskularisierten Geweben bauen und Modellorganspezifische Systeme, wie die Niere 33 oder das Herz 34. Die Fähigkeit, diese physiologischen Blut Endothel-Interaktionen und stimmen die Mikroumgebung in Bezug auf replizieren zu scheren Stress, Geometrie, ECM und zelluläre Zusammensetzung werden zukünftige Studien von Gefäßerkrankungen ermöglichen.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Acknowledgments

Die Autoren möchten die Lynn und Mike Garvey Imaging Labor am Institut für Stammzell und Regenerative Medizin, sowie die Washington Nanofabrication Einrichtung an der Universität von Washington zu bestätigen. Sie erkennen auch die finanzielle Unterstützung des National Institute of Health gewährt DP2DK102258 (zu YZ) und die Ausbildung gewährt T32EB001650 (bis SSK und MAR) und T32HL007312 (MAR).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Wafer Fabrication
AutoGlow Plasma System AutoGlow
Headway Spin Coater Headway Research, Inc  PWM32 Spin Coater 
ABM Contact Aligner AB-M
Alpha Step Profilometer Tencor Alpha Step 200
SU-8 Developer Microchem Y020100
SU-8 Resist Microchem SU-8 2000
8" silicon wafer Wafer World Inc.
Tabletop Micro Pattern Generator Heidelberg Instruments μPG 101 For generation of photomask
Hot plate VWR 97042-646
Ispropyl alcohol Avantor Performance Materials 9088
Petri dishes (120 x 120 mm, square) Sigma-Aldrich Z617679
Trichloro(3,3,3-trifluoropropyl)silane Sigma-Aldrich MKBG3805V
Polydimethylsiloxane (PDMS) elastomer base and curing agent Dow Corning Sylgard 184 Mixed at 10:1 (w/w)
Vacuum desiccator Sigma-Aldrich Z119024-1EA
Oven VWR 9120976
Device Fabrication and Culture
poly(methyl methacrylate) (PMMA) Plexiglas
Corona Treater Electro-Technic Products, Inc. BD-20 Handheld device for plasma treatment of PMMA devices and PDMS molds
Soldering Iron Weller  WTCPS
Stainless Steel Truss Head Slotted Machine Screw McMaster-Carr  91785A096
Stainless steel dowel pins McMaster-Carr  93600A060
Tweezers  Miltex 24-572 Any similar tweezers may be used
Spatula (Micro Spoon) Electron Microscopy Services 62410-01
Screw driver Any flat head screwdriver may be used, autoclaved
Glass coverslips (22 x 22 mm) Fisher Scientific 12-542B
Bleach Clorox 4460030966
Petri dishes (150 x 25 mm) Corning 430599
Petri dishes (100 x 20 mm) Corning 2909
Cotton, cut into 1 cm x 3 cm pieces Autoclaved
Polyethyleneimine (PEI) Sigma-Aldrich P3143 Dilute to 1% in cell culture grade water
Glutaraldehyde Sigma-Aldrich G6257 Dilute to 0.1% in cell culture grade water
Sterile H2O Autoclaved DI H2O
Type I collagen, dissolved in 0.1% acetic acid Isolated from rat tails as described in Rajan et. al. 2006 (ref #37)
1 ml syringe BD 309659
10 ml syringe BD 309604
15 ml conical tubes Corning 352097
30 ml conical tubes Corning 352098
M199 10x Media  Life Technologies 11825-015
1 N NaOH (sterile) Sigma-Aldrich 415413 Dilute to 1 N in cell culture grade water
HUVECs Lonza
Endothelial growth media Lonza CC-3124
Trypsin Corning 25-052-CI
Fetal bovine serum (FBS) Thermofisher Scientific 10082147
Dextran from Leuconostoc spp. (70 kDa) Sigma-Aldrich 31390
Phosphate Buffered Saline (PBS) Corning 21-031-CV
Hemocytometer Hausser Scientific Co. 3200
Gel loading tips VWR 37001-152
18 G Blunt Fill Needle BD  305180
20 G Stainless Steel Dispensing Needle McMaster-Carr 75165A123
Tygon 1/32” ID, 3/32" OD Silicon Tubing Cole-Parmer EW-95702-00
1/16" Tube-to-tube Coupling McMaster-Carr 5116K165
90° Elbow Connectors, Tube-to-Tube McMaster-Carr 5121K901
Luer Lock Coupling (Female, 1/16" ID) McMaster-Carr 51525K211
Plastic Forceps, with Jaw Grips Electron Microscopy Services 72971
Dual Syringe Pump Harvard Apparatus 70-4505
5 ml Polystyrene Round-bottom tube Fisher Scientific 14-959-2A
Device Analysis
Formaldehyde Sigma-Aldrich F8775
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A8806-5G
Triton X-100 Sigma-Aldrich T-9284
Rabbit anti-hCD31 Abcam ab32457 1:25 working dilution
FITC conjugated anti-von Willebrand Factor antibody Abcam ab8822 1:100 working dilution
Goat anti-rabbit 568 secondary antibody Thermofisher Scientific A-11011 1:100 working dilution
Hoescht Thermofisher Scientific H1399 Resuspended in DMSO
Sodium cacodylate  Sigma-Aldrich C0250 To make 0.2 M cacodylate buffer
Ethanol VWR International BDH1164-4LP
40 kDa FITC-conjugated Dextran Sigma-Aldrich FD40S 
Additional Culture Reagents 
CHIR-99021 Selleck Chem S2924 Small molecule GSK-3 inhibitor
Human recombinant VEGF Peprotech 100-20
Human recombinant bFGF Peprotech AF-100-18B

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Bioengineering Heft 115 Tissue Engineering microvasculature Endothelzellen Gefäß Engineering 3D-Zellkultur Mikro
Mikrostrukturierung und Montage von 3D-Micro-Ader
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Roberts, M. A., Kotha, S. S., Phong, … More

Roberts, M. A., Kotha, S. S., Phong, K. T., Zheng, Y. Micropatterning and Assembly of 3D Microvessels . J. Vis. Exp. (115), e54457, doi:10.3791/54457 (2016).

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