Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Bioengineering

Micropatterning en montage van 3D microvaten

doi: 10.3791/54457 Published: September 9, 2016
* These authors contributed equally

Summary

Dit manuscript bevat een spuitgiet methode om microvaten dat fysiologische eigenschappen van endotheel recapituleren ingenieur. De microfluïdische-based proces creëert patent 3D vasculaire netwerken met tailorable omstandigheden, zoals stroom, cellulaire samenstelling, geometrie, en biochemische hellingen. Het fabricageproces en voorbeelden van mogelijke toepassingen worden beschreven.

Abstract

In vitro studie platforms endotheelcellen en vasculaire biologie grotendeels beperkt tot 2D endotheliale celculturen, stroomkamers met polymeer of glazen ondergronden en hydrogel gebaseerde vaatvorming assays. Deze testen, terwijl informatief, niet herhalen lumen geometrie, de juiste extracellulaire matrix, en meercellige nabijheid, die een belangrijke rol bij het moduleren vaatfunctie spelen. Dit manuscript beschrijft een spuitgietwerkwijze met technisch vaartuigen met een diameter in de orde van 100 urn genereren. Microvaten worden vervaardigd door het zaaien van endotheelcellen in een microfluïdische kanaal ingebed in een native type I collageen hydrogel. Door de integratie van parenchymcellen in het collageen matrix voorafgaand aan de vorming van het kanaal, kan specifiek weefsel micro-omgevingen worden gemodelleerd en bestudeerd. Extra modulaties van hydrodynamische eigenschappen en media samenstelling zorgen voor controle van complexe vasculaire functie binnen de gewenste micro-omgeving.Dit platform maakt de studie van perivasculaire celrecrutering, bloed-endotheel interacties stroomreactie en weefselspecifieke microvasculaire interacties. Engineered microvaatjes bieden de mogelijkheid om de invloed van de individuele componenten van een vasculaire niche isoleren en nauwkeurig te regelen zijn chemische, mechanische en biologische eigenschappen vasculaire biologie bestuderen in zowel gezondheid en ziekte.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

De microvasculatuur in elk orgaan helpt bepalen het weefsel micro, onderhouden weefsel homeostase en reguleren ontsteking, permeabiliteit, trombose, en fibrinolyse 1,2. Microvasculaire endotheel, in het bijzonder is de interface tussen de bloedstroom en het omliggende weefsel en daarom een cruciale rol bij het ​​moduleren van vasculaire en orgaanfunctie reactie op stimuli zoals hydrodynamische krachten en circulerende cytokinen en hormonen speelt 3 - 5. Het begrijpen van de gedetailleerde interacties tussen het endotheel, bloed en weefsel micro belangrijk voor de studie van vasculaire biologie en ziekteprogressie. Echter, is vooruitgang geboekt bij het ​​bestuderen van deze interacties werd gehinderd door een beperkte in vitro hulpmiddelen die niet herhalen in vivo microvasculaire structuur en functie 6,7. Daardoor heeft het veld en therapeutische vooruitgang sterk aangevoerde kostbare en tijd-consumeren diermodellen die vaak niet te vertalen naar succes bij mensen 8-10. Terwijl in vivo modellen zijn van onschatbare waarde bij het ​​bestuderen van ziektemechanismen en vasculaire functies, ze complex en vaak geen nauwkeurige controle van individuele cellen, biochemische en biofysische signalen.

Bloedvaten door het hele lichaam beschikt over een volwassen hiërarchische structuur in combinatie met uitgestrekte capillaire bedden, het verstrekken van optimale doorbloeding en voedingsstoffen transport gelijktijdig 11. Aanvankelijk vasculatuur vormen een primitieve plexus die reorganiseert een hiërarchisch vertakte netwerk tijdens vroege ontwikkeling 12,13. Hoewel veel van de bij deze processen signalen goed begrepen 14-16, blijft ongrijpbaar hoe dergelijke vasculaire patroonvorming 15 bepaald. Op zijn beurt, recapituleren dit proces in vitro georganiseerde vasculaire netwerken ingenieur heeft been moeilijke Veel bestaande in vitro platforms. model vaatstelsel, zoals tweedimensionale endotheliale celculturen missen belangrijke kenmerken zoals meercellige nabijheid luminale driedimensionale geometrie, stroom en extracellulaire matrix. Buisvorming assays 3D hydrogels (collageen of fibrine) 17-19 of invasie assays 20,21 zijn gebruikt om de endotheelfunctie bij 3D en hun interacties met andere vasculaire bestuderen 17,22 of weefsel celtypes 23. Echter, geassembleerd lumens in deze testen missen interconnectiviteit, hemodynamische stroom en geschikte perfusie. Bovendien is de neiging tot vasculaire regressie deze buisvorming assays 24 voorkomt lange termijn cultuur en rijping die de mate van functionele studies die uitgevoerd kunnen worden beperkt. Er is dus een groeiende behoefte om in vitro platforms van microvasculaire netwerken die goed kunnen modelleren en engineeringdothelial eigenschappen en kunnen langdurige kweek.

Verschillende vasculaire manipulatietechnieken zijn opgekomen der jaren voor medische toepassingen te vervangen of bypass getroffen vaten bij patiënten met vasculaire ziekte. Grote diameter vaartuigen gemaakt van synthetische materialen zoals polyethyleentereftalaat (PET), en polytetrafluorethyleen (ePTFE) hebben aanzienlijke therapeutische succes op lange termijn patency (gemiddeld 95% patency dan 5 jaar) 25 had. Hoewel klein diameter synthetische transplantaten (<6 mm), meestal te kampen hebben complicaties, zoals intima hyperplasie en trombopoïese 26-28, tissue engineered grafts kleine diameter gemaakt met biologisch materiaal hebben aanzienlijke vooruitgang 29,30 gemaakt. Ondanks de vooruitgang van dit soort, zijn gemanipuleerd schepen op de microschaal een uitdaging gebleven. Adequaat model van de microvasculatuur, is het noodzakelijk om complexe netwerkpatronen met suf genererendoende mechanische sterkte doorgankelijkheid en een matrixsamenstelling die het mogelijk maakt voor zowel nutriënten permeatie voor parenchymale cellen en cellulaire remodeling handhaven.

Dit protocol bevat een nieuwe kunstmatige perfusable vaartuig netwerk dat een inwoner in vivo instelling met een instelbare en controleerbare micro 31 nabootst - 34. De beschreven werkwijze genereert Engineered microvaatjes met een diameter in de orde van 100 urn. Engineered microvaten worden vervaardigd door perfuseren endotheelcellen door middel van een microfluïdische kanaal, dat is ingebed in zacht type I collageen hydrogel. Dit systeem heeft het vermogen om een ​​patroon netten met open luminale structuur genereren repliceren meercellige interacties moduleren extracellulaire matrix samenstelling en fysiologisch relevante hemodynamische krachten toegepast.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Microfabricage van Patterned Polydimethylsiloxane (PDMS) met Network Design

  1. Wafer Fabrication een negatieve Template van het netwerk ontwerp Ontwerp
    1. Creëer een netwerk patroon met behulp van een computer-aided design (CAD) software. Controleer of de diagonale afmeting tussen de inlaat en uitlaat overeenkomen met de afstand tussen de inlaat en uitlaat reservoirs op de behuizing apparaten toekomstige stappen (zie 2.1.1).
      Opmerking: Het ontwerp van het patroon zelf wordt aangepast afhankelijk van de specifieke onderzoeksdoelen van de gebruiker (zie figuur 1 bijvoorbeeld patronen).
    2. Genereer een masker van het netwerk patroon met behulp van hoge resolutie afdrukken of bestel een chromen fotomasker van een commerciële leverancier. Een meer gedetailleerde protocol van de fotolithografie proces is elders beschikbaar 35.
    3. Reinig een 8 "siliciumwafel gedurende 5 minuten bij 100 W met zuurstof plasmabehandeling.
    4. Giet genoeg negatieve fotolak (SU-82100 werkt ook) op de wafer zodanig dat de resist vormt een klodder met diameter van 2,5 cm. Met behulp van een spin coater, spin de wafer bij 500 rpm met 100 rpm / sec helling en dat gedurende 10 sec. oprit vervolgens aan 1600 rpm met 300 rpm / sec en het gedurende 30 sec. Opmerking: De snelheid en helling rij moeten worden geoptimaliseerd voor elke laboratoriumomstandigheden op een resist dikte van 150 urn werd verkregen.
    5. Soft-bak de wafer bij 65 ° C gedurende 7 min, opvoeren tot 95 ° C met 360 ° C / uur, en laat het gedurende 45 minuten. Langzaam afkoelen tot kamertemperatuur op de hete plaat. Opdruk het vaartuig patroon op het beklede wafer door blootstelling aan 365 nm UV licht onder een chromen fotomasker met blootstelling triple dat de aanbeveling van de fabrikant (350 mJ / cm 2 voor een SU-8 dikte van ongeveer 150 pm).
      Let op: Omdat SU-8 is een negatief te weerstaan, zal de blootgestelde gebieden (alles behalve de patroon design) onoplosbaar is aan de ontwikkelaar in stap 1.1.7 geworden.
    6. Hard-bak de belichte wafer op 65° C gedurende 5 minuten en loopt op tot 95 ° C met 360 ° C / uur wordt gedurende een 25 min, laat ze langzaam afkoelen tot kamertemperatuur op de hete plaat.
    7. Dompel de wafer in SU-8-ontwikkelaar voor 10 - 15 minuten weg te wassen onbelicht weerstaan, dan schoon met isopropylalcohol en droog onder een gecomprimeerd stikstof flow. Inspecteer het patroon onder een lichtmicroscoop te zorgen voor SU-8 resist goed gebonden aan de wafer (zoeken ongewenst afpellen en bellen).
    8. Meet de dikte van de patroonkenmerken met een profilometer volgens de instructies van de fabrikant 36. Tijdens het meten acquisitie vermijden gebieden van de structuur die essentieel zijn voor netwerkfunctie (dwz inlaat- en uitlaatleidingen) als contactgebaseerde profilometer kan de structurele integriteit van de gevormde kenmerken op de wafer compromis. U kunt ook gebruik maken van een non-contact methode (dat wil zeggen, optische profilometer) om dit probleem helemaal te vermijden.
  2. Gediging van Patterned en Flat Mallen voor Collageen Molding
    Opmerking: Behandel silanen in een zuurkast.
    1. Plaats de wafer in een exsiccator met 100 pl trichloor (3,3,3-trifluorpropyl) silaan gedurende 2 uur aan het oppervlak silaniseren.
    2. Transfer gesilaniseerd wafer in een 120 x 120 mm vierkante petrischaal. Pour gemengd en ontgaste PDMS elastomeer en verharder (10: 1 w / w verhouding) op de wafer te bereiken 4 - 6 mm dik. Giet extra PDMS in een aparte 120 x 120 mm vierkante petrischaal vlakke mallen te genereren zonder patronen. Harden bij 65 ° C gedurende 2 uur.
    3. Verwijder uit oven en laat de PDMS afkoelen tot kamertemperatuur. Met behulp van een scalpel voorzichtig snijd een vierkant rond de SU-8 en langzaam trek het PDMS mal van de wafer. Trim randen 30 mm x 30 mm. Voor vlakke mallen, knippen genezen PDMS zonder een bedrukt patroon in vierkante stukjes van ongeveer 40 mm x 40 mm.

2. Housing Devices

  1. fabrication van boven en onder Housing Pieces
    1. Fabriceren vat behuizing met behulp van poly (methyl methacrylaat) (PMMA). Te fabriceren, om de onderdelen van een standaard machine winkel met computer numeriek gestuurde (CNC) frezen mogelijkheden. Zie Figuur 1 voor een schematische weergave van de bovenste en onderste stukken.
    2. Ontwerp het bovenste deel van de behuizing (figuur 1D) van een 20 mm x 20 mm bevatten en aan de onderzijde van het apparaat met een diepte van 1 mm, twee collageeninjectie poorten (4 mm diameter) op de bovenkant van het apparaat gelegen op de hoeken van het plein goed, twee in- en uitlaat reservoirs met 6 mm diameter, en vier schroefgaten (3 mm diameter) op de vier hoeken van het apparaat.
      Opmerking: Extra gaten kunnen worden geboord op de omtrek van het stuk voor de behandeling doeleinden.
    3. Ontwerp het onderste deel van de behuizing (Figuur 1E) een vierkant gat in het midden onder (afmetingen 15 mm x 15 mm) met een omlopende 25 mm x 25 mmplank met een diepte van 0,25 mm. Boor 4 schroefgaten met 4-40 draad. Zorg ervoor dat de schroefgaten in de onderste en bovenste stukken zullen elkaar af te stemmen tijdens toekomstige assemblage stappen.

3. microvaatje Device Fabrication

  1. Voorbereiding van Materialen
    1. Was en autoclaaf twee sets van pincet, een roestvrijstalen spatel, een kleine, platte schroevendraaier, roestvrij stalen schroeven, en diverse roestvrij staal pluggen. Voor de vervaardiging van de vaten, ook geautoclaveerd micropatterned PDMS mallen, PDMS vlak en vierkant, dekglaasjes (22 x 22 mm) en katoenen stukken.
    2. Steriliseer de PMMA behuizing stukken in bleekwater gedurende ten minste 1 uur en spoel na met geautoclaveerd water in de weefselkweek kap twee keer, en laat aan de lucht drogen in steriele weefselkweek gerechten (150 mm x 25 mm).
  2. Steriele Polyethyleenimine-glutaraldehyde (PEI - GA) Coating
    1. Behandel innerlijke bronnen van gesteriliseerde droge PMMA stukkenmet plasma gedurende ongeveer 1 min. Voeg 1% Polyethyleenimine (PEI) op de binnenste wells (de 20 mm vierkante goed op de bovenkant en de 25 mm vierkante plank aan de onderkant) van de PMMA stukken voor 10 min. Spoelen met steriele H 2 O en laten drogen in de weefselkweek kap.
      Opmerking: De tijd die nodig is voor plasma behandeling is variabel, afhankelijk van het apparaat dat wordt gebruikt - de PEI moeten spreiden gemakkelijk wijst op een hydrofiel oppervlak. Zo niet, kunnen extra plasmabehandeling nodig.
    2. Toepassen 0,1% glutaaraldehyd (GA) op PEI behandelde oppervlakken van de PMMA stukken voor 30 min. Spoel tweemaal met steriel water en laten drogen.
      Opmerking: In toekomstige stappen, zal collageen hechten aan het gecoate oppervlak door middel van collageen-glutaaraldehyde verknoping. Dit helpt veilig te stellen de gel op zijn plaats binnen het apparaat tijdens toekomstige assemblage stappen en de rest van het apparaat kweekperiode.
  3. Collageen Gel Voorbereiding
    1. Fabriceren vaartuigen met 0,6% - 1% collageenoplossingen. Tot 0,75% collageen voor schip fabricage te maken, meng type I collageen voorraad-oplossing (1,5% - geïsoleerd van rat staarten 37) met natriumhydroxide (NaOH), 10x Media Supplement (M199), en celcultuur media. Houd alle oplossingen op het ijs.
    2. Bepaal het volume van collageen door de volgende vergelijking, waarbij V ƒinal het eindvolume gel nodig (gewoonlijk 1 ml collageen per apparaat is voldoende), V stock collageen is de hoeveelheid voorraad collageen nodig, C stock collageen aandeel van de voorraad collageen en C ƒinal collageen is de gewenste concentratie van het collageen in het vat.
      vergelijking 1
    3. Gebruik een 1 ml spuit met de juiste hoeveelheid collageen voorraad naar een nieuwe 30 ml conische buis. Bepaal de volumes van de neutraliserende NaOH (V NaOH), M199 10x media supplement(V 10 X) en celcultuur media (V 1 X) als volgt en afzonderlijk te mengen in een 15 ml conische buis:
      vergelijking 2
    4. Voeg het mengsel van neutraliserende reagens (V 10 X, V NaOH, 1 x V) aan de gealiquoteerde collageen, en met een kleine spatel voorzichtig de oplossing te mengen totdat een homogene gel is verkregen. Voorkomen dat er luchtbellen door langzaam en voorzichtig roeren.
    5. Cellen opnemen in de matrix in de gewenste concentratie (bijvoorbeeld 0,5-20.000.000 cellen / ml), voeg de cellen aan de collageenoplossing nadat het is gemengd met de neutraliserende reagentia en blijf roeren totdat de cellen homogeen verdeeld.
    6. Wanneer de cellen toegevoegd, stel het volume van celkweekmedia om de extra hoeveelheid geschikt, zoals bepaald door de volgende vergelijking, waarbij V cellen </ sub> is het vereiste volume van de celsuspensie, C ƒinal celdichtheid is de gewenste dichtheid van cellen in het vat, C suspensie celdichtheid de dichtheid van cellen in de voorraadoplossing.
      vergelijking 3
  4. Collageen Injectie - Top Piece
    1. Plaats de micropatterned PDMS mal in een 100 mm x 20 mm schaal. Plasma reinigen van de PDMS mal voor 1 min.
    2. De bovenzijde PMMA stuk bovenop het PDMS mal zodat het vierkant reservoirs op de mal zijn direct onder de inlaat en uitlaat reservoirs (zie Figuur 1D - stippellijnen). De roestvrijstalen paspennen in de inlaat en uitlaat reservoir gaten aan de bovenkant PMMA stuk goed toegankelijk vanuit de reservoirs om het patroon te behouden.
    3. Gebruik een 1 ml injectiespuit uitpakken ~ 0,5-0,6 ml collageen. Zorg dat er geen luchtbellen in de spuit te blijven.
    4. Druk lightly met een pincet op de bovenste behuizing flush contact tussen het bovenste stuk en de PDMS mal te waarborgen. Injecteren collageen langzaam door een injectie-poort aan de top PMMA stuk. Controleer dat collageen vult de 20 mm x 20 mm domein boven het patroon en niet lekken.
    5. Sluit de schotel zonder verdringen de paspennen en laten geleren in een 37 ° C incubator gedurende 30 minuten.
  5. Collageen Injectie - Bottom Piece
    1. Plaats een 22 x 22 mm glazen dekglaasje in het midden van het bodemdeel. Gebruik een 1 ml spuit gelijkmatig doseren ~ 0,25 ml collageen op het glaasje. Voorzichtig lager de PDMS flat vierkant over de collageen, het waarborgen van de PDMS is plat tegen de PMMA en er zijn geen ingesloten bellen. Laten geleren bij 37 ° C gedurende 30 minuten.
  6. inrichtingsamenstel
    1. Na geleren, voeg genoeg PBS rond de flat PDMS stuk op het onderste stuk van de PDMS (ongeveer 1 ml) omringen. Gebruik een pincet om het even welke e verwijderenXCESS collageen rond de randen, en langzaam trek het PDMS stuk. Voeg meer PBS bovenop de collageen hydratatie.
    2. Om het bovenste stuk te bereiden, gebruik pincet op te halen de top PMMA stuk en draai het om zodat de PDMS mal is op de top. Voeg een paar druppels van PBS aan de interface, dan snel en stevig verwijder de PDMS mal van de top PMMA stuk.
    3. Verwijder roestvrij staal paspennen uit de andere kant van PMMA behuizing met een andere pincet. Voeg enkele druppels PBS op de micropatterned collageen. Klap de PMMA bovenste stuk boven, zodat het collageen naar beneden gericht en plaats 4 schroeven in de hoek gaten.
    4. Leg de bovenste stuk op de top van het onderste stuk, het uitlijnen van de schroeven met de hoek gaten aan de onderkant stuk. Sta niet toe dat de twee stukken om tegen elkaar te schuiven. Gebruik een schroevendraaier om de schroeven met een zachte aanraking te scherpen. Niet te strak.
    5. Zuig het PBS rond het PMMA oppervlak en leg een klein piece katoen onder een rand van de inrichting. Met behulp van een pipet, verwijder PBS uit de reservoirs en te vervangen door celkweek media. Laat het apparaat samen gel in een 37 ° C incubator gedurende ten minste 1 uur.
  7. cel zaaien
    1. Cultuur navelstrengader endotheliale cellen van de mens (HUVEC) in endothelial growth media bij 37 ° C (CO 2, O 2) 38 tot confluentie. Gebruik waar mogelijk tussen passages 4 en 7.
    2. Trypsinize endotheelcellen door het wassen van de kolf met 6 ml PBS en vervolgens toevoegen van 2 ml van 0,05% trypsine bij 37 ° C om de cellen te scheiden. Laat de cellen in trypsine tot het meeste focale adhesies hebben losgemaakt en de cellen worden afgerond (dit duurt gewoonlijk ongeveer 2-3 minuten). Stop de reactie door toevoeging van trypsine 4 ml endotheelgroeifactor medium dat foetaal runderserum (FBS). Was de kolf met de media verscheidene keren te zorgen voor de cellen losgemaakt van de fles en het verzamelenin een conische buis.
    3. Tel de cellen met een hemocytometer en resuspendeer ze bij een dichtheid van 10 miljoen cellen per ml. Verwijder alle celcultuur media van de inlaat en uitlaat reservoirs. Met behulp van een 200 gl gel lading-punt, voeg 10 ul celsuspensie in het midden van de inlaat reservoir. De cellen moeten beginnen te stromen in het netwerk onmiddellijk vacht het netwerk.
    4. Voeg 200 ul medium gelijkelijk voor zowel reservoirs en laat cellen hechten en verspreiden binnen het netwerk gedurende tenminste 1 uur.
  8. Device Cultuur
    1. Cultuur het apparaat door zwaartekracht stroom door het netwerk door het toevoegen van 200 ul van celkweekmedia het inlaatreservoir en 50 pi de uitlaatreservoir. Met deze methode van de cultuur, te vervangen media om de 12 uur tot endotheliale levensvatbaarheid te handhaven.
      Opmerking: als continue stroom kweekomstandigheden gewenst (constante shear stress te behouden, het verzamelen van de media bij de uitlaat, etc.) een syringe pomp kan worden gebruikt in plaats van de zwaartekracht gedreven cultuur.
    2. Laat de gezaaide endotheelcellen tenminste 24 uur te bevestigen en te stabiliseren voordat continue stroom. Voordat continue stroom instellen, onderhouden hulpmiddelen met zwaartekracht aangedreven stroomomstandigheden.
      OPMERKING: De media voorwaarden voor toegepaste stroom verschillen van de zwaartekracht gedreven cultuur. De toevoeging van een plasma expander, zoals dextran, de media stabiliseert de gemanipuleerde microvaatjes en voorkomt vasculaire collaps tijdens langdurige perfusie 39.
    3. Om media te maken voor continue stroom setup, te ontbinden 3,5% dextran (70 kDa) in endotheliale groei media voor een optimale kweekvat. Met behulp van steriele techniek, vul 10 ml spuiten met endotheelcellen groeimedium met 3,5% dextran.
    4. Bereid een steriele kweekschaal voor stroming door smelten gaten in de zijwand van een petrischaal met een soldeerbout.
    5. Bevestig 12 "silicon buis (1/32" ID) om een ​​Luer lock koppeling (Female, 1/16 "ID), en een 1 /16 "straight tube to tube connector met een 1" slangsegment aan de andere kant. Plaats een 1/4 "20G stompe naald (los van de naaldnaaf) aan het vrije einde van de 1" segment. Bereid ook een 3 'slangsegment bevestigd aan een buis naar buis 90 ° bocht connectoruitvoering (in de behuizingsinlaat te monteren). In de volgende stappen wordt de langere buis worden geregen door de ovenschaal en aan de 3 "segment via de 20 G naald. Outlet slang moet inlaatbuis spiegel, met een gratis een Luer lock koppeling einde in plaats van. Autoclaaf alle segmenten voor gebruik.
    6. Draad geautoclaveerd en uitlaat buizen door gaten in de ovenschaal. Bevestig 3 "segmenten naar innerlijke 20 G naalden. Bevestig de Luer lock koppeling aan de media spuit en perfuseren media door de slang met behulp van de injectiepomp op een hoog debiet. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen in de slang of connectoren, aangezien deze stroom naar het vat zal belemmeren.
    7. Plaats de connector joint in de behuizing inlaat. Stel de spuit pomp naar de gewenste stroomsnelheid en beginnen perfusie.
      LET OP: Dit kan worden aangepast, afhankelijk van het schip geometrie en experimentele omstandigheden van toegepaste schuifspanningen. Een 100 urn diameter kanaal een stroomsnelheid van 3 pl / min werkt goed.
    8. Desgewenst laat perfusaat met voorbereide uitlaat slang ingebracht in een steriele 5 ml polystyreen ronde bodem buis die 500 pl medium.
      Opmerking: Een kleine hoeveelheid medium wordt toegevoegd aan de verzamelbuis te belvorming die stroom kan blokkeren voorkomen.
    9. Afhankelijk van de stroomsnelheid, moet de injectiespuit worden bijgevuld na 24 tot 36 uur. Dit wordt gedaan door het verwijderen van de stekker uit de behuizing toevoer, ter vervanging van de spuit, en waardoor media perfuseren met een hoog debiet voor enkele minuten. Deze volgorde zorgt ervoor dat de bubbels niet maken kennis met de slang. Reset de pomp naar de gewenste stroomsnelheid voor cultuur, steek de stekker in de behuizing inlaat, enterug naar de incubator.

4. Inrichting Analyse

  1. permeabiliteit Analyse
    1. Met 40 kDa FITC-dextraan op de permeabiliteit van het vat in situ te visualiseren. Plaats het vat behuizing op een confocale microscoop en focus op het vliegtuig vat. Voeg 5 uM 40 kDa FITC-dextran aan de inlaat en het beeld op 4x vergroting, 25 msec belichtingstijd, en op 1 beeld per seconde gedurende 10 min.
    2. Analyseer de afbeelding serie met de analyse code om de permeabiliteit van dextran schatten de overkant van de vaatwand in collageen (um / sec) gebaseerd op een model gepubliceerd door Zheng et. al. 31.
  2. Immunokleuring & Confocale Imaging Analyse
    1. Om schepen te lossen, perfuseren met 3,7% formaldehyde via de inlaat 20 minuten en wassen door perfuseren PBS drie keer (20 min per wasbeurt). Blok-specifieke antilichaambinding met 2% runderserumalbumine (BSA) en 0,5% Triton X-100 perfused via het netwerk 1 uur. Perfuseren primair antilichaam oplossing overnacht bij 4 ° C en was driemaal met PBS. Perfuseren secundair antilichaam oplossingen 1-2 uur, opnieuw wassen met PBS op dezelfde wijze.
    2. Neem immunofluorescentie beelden van kleine bloedvaten in situ met behulp van een confocale microscoop met een z-stap van 1 urn. Beeld de microvaatjes bij een vergroting van 4x, 10x of 20X.
      Let op: Vergroting van 4X zal de wereldwijde structuur van het netwerk informatie te verschaffen, terwijl de 10X en 20X vergrote afbeeldingen cellulaire details zoals rek, knooppunt formatie, etc zal bieden.
    3. Analyseer de afbeelding stacks met behulp van ImageJ met Z projecties (Image / Stacks / Z-project), doorsneden (Image / Stacks / Orthogonal view), en 3D-reconstructies (Image / Stacks / 3D Project).
  3. Scanning Electron Microscopy Imaging
    1. Voor elektronenmicroscopie analyse vast te stellen in situ door perfuseren halve sterkte Karnovsky's solution (2% paraformaldehyde / 2,5% glutaraldehyde in 0,2 M cacodylate buffer) gedurende de nacht. Demonteer het schip en voorzichtig scheiden de twee stukken. Trim randen en volledig onder te dompelen in de fixerende oplossing voor meerdere dagen.
    2. Dompel het dikke bovenste gedeelte van het vat in 25% glutaaraldehyde gedurende 20 min en spoel drie keer met PBS (2 min elk). Dehydrateer in serie ethanol wasbeurten van 50%, 70%, 85% (2 minuten elk) en twee wassingen in 100% ethanol (5 min elk).
    3. Bereid het monster voor analyse met verdere uitdroging door kritisch punt drogen volgende protocol van de fabrikant 40. Sputteren jas van het schip met goud-palladium (7 nm) en geanalyseerd onder een scanning elektronenmicroscoop met een versnellingsspanning van 5 kV, spot maat 3.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

De gemanipuleerde vat platform creëert functionele microvasculatuur ingebed in een natuurlijke collageen type I matrix en zorgt voor strakke controle van de cellulaire, biochemische en biofysische milieu in vitro. Tot complete microvaten fabriceren, worden humane navelstreng endotheelcellen (HUVEC) geperfuseerd via het collageen geïntegreerde microfluïdische netwerk waar zij hechten aan octrooi lumen en confluent endotheel vormen. Zoals geïllustreerd in figuur 1A-C, kan de vaatgeometrie zijn toegesneden op vragen over stroomsnelheid tortuositeit beantwoorden, en vertakking hoeken, onder anderen. Moduleren van de stroomsnelheid door de microvaatjes inzicht in de schuifspanning-respons van endotheelcellen. Eerder heeft fabricage nadruk gelegd vooral op schepen in de 100 pm groottebereik echter microvaatjes tot 500 urn of, in sommige gevallen, zo klein als 50 pm in diameter zijn geweest successfully gemaakt en gekweekt. Voorbeelden van lange termijn openheid worden getoond evenals het overleven van microvaatjes gekweekt onder zwaartekracht aangedreven stroming (figuur 2A) en continue toegepaste stroom (figuur 2B). De in vivo-achtige eigenschappen van gemanipuleerde microvaatjes kan worden aangetoond op verschillende manieren. Verschillende endotheelfunctietest kan gemeten worden met dit platform, waaronder barrièrefunctie (figuur 3A), cel-cel interacties en signalering (figuur 3B) en angiogene hermodellering (Figuur 3C). Een kritische eigenschap van deze microvaten is hun vermogen om te reageren op inflammatoire stimuli in een biologisch relevante manier. Dit wordt het best aangetoond door hun interactie met bloed in Figuur 4A-C indien niet geactiveerd endotheel in rust (figuur 4B) en geactiveerd endotheel induceert trombusvorming (Figuur 4C). Door het kweken van endotheelcellen van differing oorsprong in dit platform, is het mogelijk om de functionele heterogeniteit tussen endotheelcellen begrijpen vanuit verschillende bronnen. Figuur 5A-C toont een voorbeeld van deze heterogeniteit twee verschillende humane stamcellen afgeleide endotheliale celsoorten die indien gekweekt in het microvaatje systeemdisplay drastisch anders fenotypes 41. Door het afstemmen van de stroom profielen, mobiele compositie en kweekomstandigheden, gemanipuleerde microvaatjes een krachtig in vitro tool om endotheliale biologie en microvasculatuur in zowel de gezondheid en ziekte te bestuderen.

Figuur 1
Figuur 1. Schematische voorstelling van netwerk opzetten en Microchannel Fabrication protocol. Het vasculaire netwerk geometrie specifiek kan worden ontworpen om verschillende stromingspatronen genereren. A. Bijvoorbeeld, een vertakt ontwerp zal zijn afgenomen flow tarieven nabij het ​​centrum (een 8 voudige reductie in een 3 bij 3 rooster) resulteert in gebieden van verschillende schuifspanning op het endotheel in hetzelfde vat 31. B. Een sterk vertakt raster volgens hetzelfde principe als het vorige ontwerp, maar met een grotere plexus. Met dit ontwerp, de gevolgen van een 50 voudige verlaging van stroomsnelheid, waardoor een afschuifsnelheid reductie van 10 tot 500 sec -1 kan worden waargenomen wanneer een drukval van 1000 Pa over het netwerk 32 aangebracht. C. Meer complexe ontwerpen zoals een kronkelig netwerk met scherpe hoeken 32 kunnen voor vragen over endotheliale reactie op onderbrekingen laminaire stroming, die vaak in pathologische situaties 42 beantwoorden. . Microvaatjes die van deze patronen een diameter van 100 - 150 urn D. Er zijn drie belangrijke stappen tijdens fabricage microkanaal. Eerst wordt het bovengedeelte van de behuizing mal bovenop de PDMS gevormde netwerk matrijs zodanig dat de inlaat en uitlaat uitgelijnd. Collageen I wordt vervolgens geïnjecteerd in de omsloten ruimte door de injectieopeningen (zwarte pijl). Typisch wordt een 0,75% collageen I mengsel voor fabricage. Succesvol microvaatje fabricage kan worden bereikt met zo laag als 0,6% collageen, maar minder dan 0,6% ligt meestal onvoldoende mechanische sterkte en kanaal instorten. E. Een dun laagje collageen wordt toegevoegd aan het onderste stuk bovenop het dekglaasje en afgeplatte met een ander stuk PDMS. F. Na gelering bij 37 ° C, worden de PDMS mallen worden verwijderd en de bovenste en onderste behuizing mallen elkaar geschroefd om het netwerk te voegen. klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2
> Figuur 2. microvaten gekweekt met gecontroleerde stroom Profiles. A. HUVEC's uitgezet in microvaatjes gekweekt onder zwaartekracht gedreven stroming en B. toegepaste continue stroming met een snelheid van 3 pl / min. Cultuur onder toepassing stroom wordt het beste bereikt met de toevoeging van 3,5% Dextran aan het medium dat is aangetoond dat microfluïdische collageen gebaseerde microvaten stabiliseren door het uitoefenen van fysieke druk binnen het lumen dat knooppunt vorming verbeteren, hoewel het exacte mechanisme achter dit effect onduidelijk 39 . Microvaten werden gekleurd voor de endotheliale junction eiwit CD31 of CD-merker 31 (rood) en von Willebrand factor (VWF) korrels (groen). A ', B'. In beide omstandigheden HUVEC uitgedrukt endotheliale markers van cel-cel verbindingen en VWF korrels. A ", B". Orthogonal uitzicht tonen octrooi en afgeronde lumens na 6 dagen in de cultuur.arge.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 3
Figuur 3. Engineered microvaten voor de Studie van de functie van het endotheel. Een endotheliale barrièrefunctie. Kan worden vastgesteld na perfusie van FITC (fluoresceïne isothiocyanaat) geconjugeerd dextran via netwerken (boven) gevolgd door meting van de diffusie in de bulk collageen (onder). Aangepaste code, video's van de perfusie worden geanalyseerd om pixelintensiteit plot over een gebied van belang in het frame op tijd de permeabiliteit coëfficiënt K (um / sec) van de FITC-dextraan bepalen. Eerdere publicaties van het laboratorium hebben aangetoond dat de permeabiliteit van deze gemanipuleerde vaartuigen is vergelijkbaar met die van ex vivo zoogdieren vaartuigen 31,43. B. Endotheliale cel interacties met perivascular of steuncellen kan in dit platform worden geanalyseerd door het moduleren van de cellulaire samenstelling van de collageenmatrix. Hier kan een voorbeeld van deze cel-cel interacties worden gezien wanneer gladde spiercellen ingebed in het collageen rondom de vaten. Na 14 dagen in kweek, de gladde spiercellen (gekleurd voor alfa gladde spieractine (αSMA) in groen) associëren met het endotheel en processen uitstrekken langs de vaatwand en fungeren als perivasculaire cellen gezien in de orthogonale projecties 31. Afbeeldingen getoond in paneel A en B zijn reproducties van een eerdere publicatie 31. C. Angiogene kiemen en verbouwing kan in gemanipuleerde microvaten worden geëvalueerd door het wijzigen van het kweekmedium aan angiogene stimuli bevatten. Zonder angiogene stimuli, HUVEC's tonen minimale kiemen (links); met angiogene stimuli (1 uM kleinmoleculige remmer van GSK-3, 20 ng / ml vasculaire endotheliale groeifactor, en 20 ng / ml basische fibroblast growth factor), HUVEC gemakkelijk ontkiemen in de matrix zoals te zien in top-down projecties en orthogonale uitzicht (rechts). De spruit lengte en het aantal is eenvoudig te kwantificeren met ImageJ software 41. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 4
Figuur 4. Bloed-endotheel interacties. Engineered microvaten zijn rustig en adequaat te reageren op inflammatoire stimuli. A. Een niet-gemodificeerde, HUVEC gekweekte schip gefotografeerd in de buurt van de inlaat toont sterke CD31 junctional kleuring (rood) en een ronde open lumen. A '. Orthogonal Gezien het lumen weergegeven B. Wanneer gecitreerd bloed met CD41a-gelabelde bloedplaatjes (groen) geperfuseerd door een soortgelijke zwakke vat, minimaal adhesion bloedplaatjes (groen) aan het endotheel waargenomen. C. Blootstelling aan inflammatoire stimuli zoals forbol-12-myristaat-13-acetaat (PMA, 50 ng / ml) aan de media, perfusie van bloed resulteert in de vorming van grote trombi (CD41a gemerkt, groen) in het kanaal en adhesie van leukocyten (CD45 + label, wit) aan de vaatwand 31. Beelden hier gezien worden gereproduceerd van een eerdere publicatie 31. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 5
Figuur 5. Samengesteld microvaatjes met menselijke stamcellen afgeleide-EC. Extra endotheelcellen bronnen kunnen worden gebruikt om gemodificeerde microvaatjes genereren. Eerder dit jaar, Palpant et. al. aangetoond dat twee verschillende subtypes of humane embryonale stamcellen afgeleide endotheelcellen kan worden verkregen door het manipuleren Wnt / β-catenine signalering gedurende differentiatie hemogenic endotheelcellen (gekenmerkt door expressie van HAND1 en een hoge hemogenic potentiaal) en endocardiale-achtige endotheelcellen (gekenmerkt gedeeltelijk door expressie van NFATC1 en GATA4) 41. A. Wanneer gezaaid en gekweekt in de 3D ​​vat platform, hemogenic EC ondergaan enkele angiogene sprouting. B. echter, de endocardiale-achtige EC zijn veel meer angiogene en trekvogels, wat suggereert functionele verschillen, misschien als reactie op stromen tussen de twee subtypes van EC (dit werk wordt meer in detail beschreven in een eerdere publicatie 41). Beide celtypen te uiten CD31 junctional eiwitten (rood) en enkele VWF (groen). Orthogonale beide tonen octrooi lumen. C. Een scanning elektronenmicroscoop beeld van de endocardiale-achtige EC in het vat vertoont een angiogene sprout gezienuit de luminale zijde. Beelden gepresenteerd op de panelen A en B zijn reproducties van Palpant et. al. 41. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Gemanipuleerde microvaatjes een in vitro model waarbij fysiologische karakteristieken zoals luminale geometrie, hydrodynamische krachten en meercellige interacties aanwezig zijn en instelbaar zijn. Dit type platform is krachtig omdat het de mogelijkheid biedt te modelleren en bestuderen endotheliale gedrag in verschillende contexten, waar de in vitro kweekomstandigheden kunnen worden afgestemd op dat van de micro betrokken. Bijvoorbeeld, de mechanismen die endotheliale processen, zoals angiogenese, bekend anders optreden in verschillende organen en verschillende pathologische toestanden, zoals gezondheid en ziekte 44. Daarom vlakke endotheliale celculturen is altijd ontoereikend 6 en als zodanig het veld veel verlaat op dure en tijdrovende diermodellen.

Diermodellen, terwijl informatief en essentieel voor de ontwikkeling van biologisch onderzoek, niet altijd goed te vertalen naar de kliniek.Dit is grotendeels toe te schrijven aan de verschillen tussen muizen en menselijke biologie, in het bijzonder met betrekking tot hun reactie op stimuli 9,45. Daarom is het essentieel om te kunnen bouwen in vitro modellen dat aanvullende mensspecifieke data informatie uit diermodellen aanvulling kan bieden. In vitro platforms mogelijk het micromilieu van belang na te bootsen met de extra capaciteit te stemmen die omgeving. Sleutelkenmerken van een dergelijk systeem moet bevatten driedimensionale structuur en geometrie, samenstelling extracellulaire matrix (ECM), parenchymcel nabijheid en interactie bloedstroom en biochemische stimuli. Gemanipuleerde microvaatjes hebben de capaciteit om al deze parameters bevatten. Dit kan tegelijkertijd worden gedaan om een ​​allesomvattend model te maken, of toegevoegd in een stapsgewijze manier om individuele reacties en interacties te isoleren.

Een krachtig aspect van gemanipuleerde microvaatjes is de mogelijkheid ombesturingsstroom en manipuleren van de hydrodynamische krachten op het endotheel. Als voorbeeld kan de inrichting worden gekweekt onder zwaartekracht aangedreven stroomomstandigheden of continue perfusie (figuur 2). De grootte van de schuifspanning op de vaatwand kan worden gemoduleerd in beide gevallen via veranderingen in stroomsnelheid en de vaatgeometrie. Het belangrijkste verschil tussen de twee condities is de temporele spreiding van de afschuifspanning in het vat. In de zwaartekracht gedreven stroom voorwaarden, de shear stress is niet constant in de tijd. De stroomsnelheid en schuifspanning het grootst onmiddellijk nadat wisselen van media wanneer de inlaat reservoir vol. Als de media drains, wordt de schuifspanning verminderen. Dit leidt tot een reeks schuifspanning in de loop van 12 uur. Experimenten die nauwkeurige controle over de hydrodynamische eigenschappen vereist (bijvoorbeeld om de effecten van afschuifspanning op het endothelium studie) moet gebruiken continue stroom kweekomstandigheden.

Engineered microvaten kan worden afgestemd op een breed scala van vragen met relatief eenvoudig wijzigingen beantwoorden. Verschillende celtypen, zowel parenchymale en endotheliale kan worden gebruikt om verschillende orgaansystemen modelleren. Naast het vervaardigen van microvaatjes met endotheelcellen enten kan epitheelcellen in plaats daarvan worden gebruikt om het kanaal voor studies over de darmwand, longblaasjes, niertubuli, enz lijn. Zodra de micro wordt bepaald door celsamenstelling, de voedingsoplossing (dwz media, bloed, groeifactoren of andere biologisch relevante vloeistof) die wordt gebruikt om het apparaat perfuseren kan worden aangepast aan ingewikkelde vragen cell signaling, rust, afschuifspanning beantwoorden , voedingsstoffen, drug respons, en nog veel meer. Bovendien kan de geometrie van het vat zijn toegesneden op endotheliale responding stress en tortuositeit scheren. Als voorbeeld, een recente publicatie van Zheng et. al. toonden aan dat endotheliale cellen increased VWF secretie en fiber assemblage in microvaatjes regio's met hoge shear stress en stroomversnelling. In het bijzonder, bundels VWF typisch gevormd op de hoeken en scherpe bochten binnen het netwerk. Het netwerk geometrie kan ook worden ontworpen om meercellige tubuli fabriceren. Kan bijvoorbeeld een ontwerp dat twee parallelle kanalen elk met een eigen inlaat en uitlaat bevat worden gebruikt om een concentratiegradiënt te genereren of een aangrenzend tubulus omgeving (bijvoorbeeld lymfevaten met aangrenzende microvaatjes) model. De grid-achtige structuren van de huidige netwerk ontwerpen (zie figuur 1A-C) zijn voordelig voor computational fluid modellering en voor de structurele integriteit tijdens de fabricage, maar zijn niet indicatief van vasculaire structuur in het lichaam. In toekomstige studies zou meer fysiologische netwerk patronen zoals die met hiërarchische vertakkingen en afgeronde hoeken worden gebruikt.

Terwijl alle stappen in deze procedure zijn belangrijk, daarzijn verschillende kritische stappen die nodig zijn voor een succesvolle ontworpen microvaatje fabricage. De collageengel moet grondig worden gemengd om een ​​homogene oplossing te bereiken, en het is essentieel niet bellen voeren tijdens deze stap. Dit is essentieel voor cellevensvatbaarheid en fysiologische functie, in het bijzonder voor experimenten die parenchymcellen in de collageenmatrix omvatten. Als een uniform mengsel van het collageen is moeilijk te verkrijgen, controleer de pH van de oplossing te waarborgen, is neutraal. Als het probleem aanhoudt, is het mogelijk het collageen voorraad moet worden vervangen. Een andere belangrijke stap is de assemblage van de bovenste en onderste delen van de behuizing - noodzakelijk is veel kracht te gebruiken want dit kan de kanalen te storten. Verscheidene praktijkrondes kan nodig zijn om een ​​gevoel van de hoeveelheid kracht die nodig is om toe te passen tijdens het draaien schroeven verkrijgen. Als kanaal instorting of Smashing zich blijft voordoen, zelfs na de praktijk, is het mogelijk het PDMS netwerk is krom geworden als gevolg van absorption vocht. Ab vers gemaakte PDMS mallen helpt dit probleem. Onjuist schroefgaten in de onderkant apparaat kan ook leiden tot kanaal instorten. Wanneer de schroeven niet kunnen soepel draaien tijdens montage moet extra kracht uitgeoefend vaak tot structurele falen. De laatste belangrijke stap die moet worden benadrukt is het belang van frequent voeren, meestal om de 12 uur. Dit is essentieel voor het endotheel en het voorkomen van de inrichting uitdroogt. Indien geënt endotheelcellen verschijnen ongezonde of loskoppelen van het collageen wand mogelijke manieren om te verbeteren endotheliale gezondheid worden om de schepen vaker voeden, met een spuit pomp continue stroom toe te passen of controleer de pH van de collageengel te waarborgen is een fysiologisch niveau.

Momenteel wordt dit platform beperkt tot vervaardiging van extracellulaire matrix van geschikte stijfheid structurele integriteit van het kanaal te houden tijdens de montage. dichte collagen aan of groter dan 6 mg / ml is voldoende, maar collageen minder dan 6 mg / ml en andere matrices zoals cellen ontdane matrijs van gehele organen te zwak. Dit kan worden ondervangen door toepassing van een mengsel van collageen met de matrix betrokken. Engineered microvaten zijn ook beperkt door hun grootte schaal. Schepen kunnen worden vervaardigd met een ondergrens van ongeveer 100 urn, maar ingrijpende wijzigingen zouden moeten worden aangebracht op een kleinere schaal bereiken. Hoewel ontworpen microvaatjes creëren een driedimensionaal lumen, het netwerk zelf vlak is. Om een ​​echt driedimensionaal vasculaire plexus te creëren, zouden extra aanpassingen moeten zodanig worden toegepast als het creëren van een meerlaags netwerk door het stapelen van meerdere gemanipuleerde schepen.

De representatieve resultaten die in deze werkwijze zien hoe engineered microvaatjes kan worden gebruikt om barrièrefunctie, cel-cel signaal (pericyte rekrutering en vasculaire stabilisatie), angiogenese en trombose te beoordelen. highliGHTS van deze studies worden hier gepresenteerd met meer gedetailleerde presentaties in eerdere publicaties 31,32. Deze studies laten zien hoe pericytes migreren en de vacht van de endotheel van gemanipuleerde microvaten 31, bloedplaatjes zich aan geactiveerd endotheel 31 en vloeistof shear stress moduleert endotheliale activering en VWF secretie en montage 32. Gemanipuleerde microvaatjes kan verder worden gebruikt voor gevasculariseerde weefsels en model orgaanspecifieke systemen, zoals de nieren en het hart 33 34 bouwen. Het vermogen om deze fysiologische bloed-endotheel interacties en stem repliceren de micro opzichte van stress, geometrie, ECM afschuiving en cellulaire samenstelling toekomstige studies van vasculaire ziekten mogelijk.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

De auteurs willen graag de Lynn en Mike Garvey Imaging Laboratory aan het Instituut erkennen voor Stem Cell en Regenerative Medicine, evenals de Washington Nanofabrication Facility aan de Universiteit van Washington. Ze hebben ook de financiële steun van de National Institute of Health erkennen verleent DP2DK102258 (tot YZ) en training geeft T32EB001650 (tot SSK en MAR) en T32HL007312 (MAR).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Wafer Fabrication
AutoGlow Plasma System AutoGlow
Headway Spin Coater Headway Research, Inc  PWM32 Spin Coater 
ABM Contact Aligner AB-M
Alpha Step Profilometer Tencor Alpha Step 200
SU-8 Developer Microchem Y020100
SU-8 Resist Microchem SU-8 2000
8" silicon wafer Wafer World Inc.
Tabletop Micro Pattern Generator Heidelberg Instruments μPG 101 For generation of photomask
Hot plate VWR 97042-646
Ispropyl alcohol Avantor Performance Materials 9088
Petri dishes (120 x 120 mm, square) Sigma-Aldrich Z617679
Trichloro(3,3,3-trifluoropropyl)silane Sigma-Aldrich MKBG3805V
Polydimethylsiloxane (PDMS) elastomer base and curing agent Dow Corning Sylgard 184 Mixed at 10:1 (w/w)
Vacuum desiccator Sigma-Aldrich Z119024-1EA
Oven VWR 9120976
Device Fabrication and Culture
poly(methyl methacrylate) (PMMA) Plexiglas
Corona Treater Electro-Technic Products, Inc. BD-20 Handheld device for plasma treatment of PMMA devices and PDMS molds
Soldering Iron Weller  WTCPS
Stainless Steel Truss Head Slotted Machine Screw McMaster-Carr  91785A096
Stainless steel dowel pins McMaster-Carr  93600A060
Tweezers  Miltex 24-572 Any similar tweezers may be used
Spatula (Micro Spoon) Electron Microscopy Services 62410-01
Screw driver Any flat head screwdriver may be used, autoclaved
Glass coverslips (22 x 22 mm) Fisher Scientific 12-542B
Bleach Clorox 4460030966
Petri dishes (150 x 25 mm) Corning 430599
Petri dishes (100 x 20 mm) Corning 2909
Cotton, cut into 1 cm x 3 cm pieces Autoclaved
Polyethyleneimine (PEI) Sigma-Aldrich P3143 Dilute to 1% in cell culture grade water
Glutaraldehyde Sigma-Aldrich G6257 Dilute to 0.1% in cell culture grade water
Sterile H2O Autoclaved DI H2O
Type I collagen, dissolved in 0.1% acetic acid Isolated from rat tails as described in Rajan et. al. 2006 (ref #37)
1 ml syringe BD 309659
10 ml syringe BD 309604
15 ml conical tubes Corning 352097
30 ml conical tubes Corning 352098
M199 10x Media  Life Technologies 11825-015
1 N NaOH (sterile) Sigma-Aldrich 415413 Dilute to 1 N in cell culture grade water
HUVECs Lonza
Endothelial growth media Lonza CC-3124
Trypsin Corning 25-052-CI
Fetal bovine serum (FBS) Thermofisher Scientific 10082147
Dextran from Leuconostoc spp. (70 kDa) Sigma-Aldrich 31390
Phosphate Buffered Saline (PBS) Corning 21-031-CV
Hemocytometer Hausser Scientific Co. 3200
Gel loading tips VWR 37001-152
18 G Blunt Fill Needle BD  305180
20 G Stainless Steel Dispensing Needle McMaster-Carr 75165A123
Tygon 1/32” ID, 3/32" OD Silicon Tubing Cole-Parmer EW-95702-00
1/16" Tube-to-tube Coupling McMaster-Carr 5116K165
90° Elbow Connectors, Tube-to-Tube McMaster-Carr 5121K901
Luer Lock Coupling (Female, 1/16" ID) McMaster-Carr 51525K211
Plastic Forceps, with Jaw Grips Electron Microscopy Services 72971
Dual Syringe Pump Harvard Apparatus 70-4505
5 ml Polystyrene Round-bottom tube Fisher Scientific 14-959-2A
Device Analysis
Formaldehyde Sigma-Aldrich F8775
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A8806-5G
Triton X-100 Sigma-Aldrich T-9284
Rabbit anti-hCD31 Abcam ab32457 1:25 working dilution
FITC conjugated anti-von Willebrand Factor antibody Abcam ab8822 1:100 working dilution
Goat anti-rabbit 568 secondary antibody Thermofisher Scientific A-11011 1:100 working dilution
Hoescht Thermofisher Scientific H1399 Resuspended in DMSO
Sodium cacodylate  Sigma-Aldrich C0250 To make 0.2 M cacodylate buffer
Ethanol VWR International BDH1164-4LP
40 kDa FITC-conjugated Dextran Sigma-Aldrich FD40S 
Additional Culture Reagents 
CHIR-99021 Selleck Chem S2924 Small molecule GSK-3 inhibitor
Human recombinant VEGF Peprotech 100-20
Human recombinant bFGF Peprotech AF-100-18B

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rubanyi, G. M. The role of endothelium in cardiovascular homeostasis and diseases. J. Cardiovasc. Pharmacol. 22, Suppl 4 37-44 (1993).
  2. van Hinsbergh, V. W. The endothelium: vascular control of haemostasis. Eur. J. Obstet. Gynecol. Reprod. Biol. 95, (2), 198-201 (2001).
  3. Chiu, J. -J., Chien, S. Effects of Disturbed Flow on Vascular Endothelium: Pathophysiological Basis and Clinical Perspectives. Physiol. Rev. 91, 327-387 (2011).
  4. Qi, Y., Jiang, J., et al. PDGF-BB and TGB-b1 on cross-talk between endothelial and smooth muscle cells in vascular remodeling induced by low shear stress. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 1908-1913 (2011).
  5. Sozzani, S., Del Prete, A., Bonecchi, R., Locati, M. Chemokines as effector and target molecules in vascular biology. Cardiovasc. Res. 107, (3), 364-372 (2015).
  6. Huh, D., Hamilton, G. A., Ingber, D. E. From 3D cell culture to organs-on-chips. Trends Cell Biol. 21, (12), 745-754 (2011).
  7. Staton, C. a, Reed, M. W. R., Brown, N. J. A critical analysis of current in vitro and in vivo angiogenesis assays. Int. J. Exp. Pathol. 90, 195-221 (2009).
  8. Greek, R., Menache, A. Systematic Reviews of Animal Models: Methodology versus Epistemology. Int. J. Med. Sci. 10, 206-221 (2013).
  9. Can Animal Models of Disease Reliably Inform Human Studies. PLoS Med. van der Worp, H. B., Howells, D. W., et al. 7, (3), e1000245 (2010).
  10. Leong, X. -F., Ng, C. -Y., Jaarin, K. Animal Models in Cardiovascular Research: Hypertension and Atherosclerosis. Biomed Res. Int. 2015, 528757 (2015).
  11. Pries, A. R., Secomb, T. W. Making Microvascular Networks Work: Angiogenesis, Remodeling, and Pruning. Physiology. 29, 446-455 (2014).
  12. D'Amore, P. Mechanisms Of Angiogenesis. Annu. Rev. Physiol. 49, 453-464 (1987).
  13. Geudens, I., Gerhardt, H. Coordinating cell behaviour during blood vessel formation. Development. 138, 4569-4583 (2011).
  14. Ribatti, D., Nico, B., Crivellato, E. The development of the vascular system: a historical overview. Methods Mol. Biol. 1214, 1-14 (2015).
  15. Ribatti, D., Nico, B., Crivellato, E. Morphological and molecular aspects of physiological vascular morphogenesis. Angiogenesis. 12, (2), 101-111 (2009).
  16. Bautch, V. L. VEGF-directed blood vessel patterning: From cells to organism. Cold Spring Harb. Perspect. Med. 2, (9), 1-12 (2012).
  17. Stratman, A. N., Schwindt, A. E., Malotte, K. M., Davis, G. E. Endothelial-derived PDGF-BB and HB-EGF coordinately regulate pericyte recruitment during vasculogenic tube assembly and stabilization. Blood. 116, 4720-4730 (2010).
  18. Bach, T. L., Barsigian, C., et al. VE-Cadherin mediates endothelial cell capillary tube formation in fibrin and collagen gels. Exp. Cell Res. 238, (238), 324-334 (1998).
  19. Kubow, K. E., Conrad, S. K., Horwitz, aR. Matrix microarchitecture and myosin II determine adhesion in 3D matrices. Curr. Biol. 23, (17), 1607-1619 (2013).
  20. Potapova, I. A., Gaudette, G. R., et al. Mesenchymal Stem Cells Support Migration, Extracellular Matrix Invasion, Proliferation, and Survival of Endothelial Cells In Vitro. Stem Cells. 25, (7), 1761-1768 (2007).
  21. Bayless, K. J., Davis, G. E. Sphingosine-1-phosphate markedly induces matrix metalloproteinase and integrin-dependent human endothelial cell invasion and lumen formation in three-dimensional collagen and fibrin matrices. Biochem. Biophys. Res. Commun. 312, (4), 903-913 (2003).
  22. Hellström, M., Gerhardt, H., et al. Lack of pericytes leads to endothelial hyperplasia and abnormal vascular morphogenesis. J. Cell Biol. 152, (3), 543-553 (2001).
  23. Tulloch, N. L., Muskheli, V., et al. Growth of Engineered Human Myocardium With Mechanical Loading and Vascular Coculture. Circ. Res. 109, 47-59 (2011).
  24. Davis, G. E., Saunders, W. B. Molecular balance of capillary tube formation versus regression in wound repair: role of matrix metalloproteinases and their inhibitors. J. Investig. dermatology Symp. 11, (1), 44-56 (2006).
  25. Kannan, R. Y., Salacinski, H. J., Butler, P. E., Hamilton, G., Seifalian, A. M. Current status of prosthetic bypass grafts: a review. J. Biomed. Mater. Res. B. Appl. Biomater. 74, 570-581 (2005).
  26. Nerem, R. M., Seliktar, D. Vascular Tissue Engineering. Annu. Rev. Biomed. Eng. 3, (1), 225-243 (2001).
  27. Melchiorri, A. J., Hibino, N., Fisher, J. P. Strategies and techniques to enhance the in situ endothelialization of small-diameter biodegradable polymeric vascular grafts. Tissue Eng. Part B. Rev. 19, (4), 292-307 (2013).
  28. Abbott, W. M., Callow, A., Moore, W., Rutherford, R., Veith, F., Weinberg, S. Evaluation and performance standards for arterial prostheses. J. Vasc. Surg. 17, (4), 746-756 (1993).
  29. Niklason, L. E. Functional Arteries Grown in Vitro. Science. 284, (5413), 489-493 (1999).
  30. Niklason, L., Counter, C. Blood vessels engineered from human cells - Authors' reply. Lancet. 366, (9489), 892-893 (2005).
  31. Zheng, Y., Chen, J., et al. In vitro microvessels for the study of angiogenesis and thrombosis. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109, 9342-9347 (2012).
  32. Zheng, Y., Chen, J., Lòpez, J. A. Flow-driven assembly of VWF fibres and webs in in vitro microvessels. Nat. Commun. 6, 7858 (2015).
  33. Ligresti, G., Nagao, R. J., et al. A Novel Three-Dimensional Human Peritubular Microvascular System. J. Am. Soc. Nephrol. 27, (2015).
  34. Roberts, M. A., Tran, D., et al. Stromal cells in dense collagen promote cardiomyocyte and microvascular patterning in engineered human heart tissue. Tissue Eng. Part A. (2016).
  35. Qin, D., Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft lithography for micro- and nanoscale patterning. Nat. Protoc. 5, (3), 491-502 (2010).
  36. Alpha-Step 200 Manual. Tencor Instruments. (1989).
  37. Rajan, N., Habermehl, J., Coté, M. -F., Doillon, C. J., Mantovani, D. Preparation of ready-to-use, storable and reconstituted type I collagen from rat tail tendon for tissue engineering applications. Nat. Protoc. 1, (6), 2753-2758 (2006).
  38. Baudin, B., Bruneel, A., Bosselut, N., Vaubourdolle, M. A protocol for isolation and culture of human umbilical vein endothelial cells. Nat. Protoc. 2, (3), 481-485 (2007).
  39. Leung, A. D., Wong, K. H. K., Tien, J. Plasma expanders stabilize human microvessels in microfluidic scaffolds. J. Biomed. Mater. Res. - Part A. 100, (7), 1815-1822 (2012).
  40. Tousimis SAMDRI-780 Critical Point Drying Apparatus. Tousimis Research Corporation. (1987).
  41. Palpant, N. J., Pabon, L., et al. Inhibition of β-catenin signaling respecifies anterior-like endothelium into beating human cardiomyocytes. Development. 142, (18), 3198-3209 (2015).
  42. Gimbrone, M. a, Topper, J. N., Nagel, T., Anderson, K. R., Garcia-Cardena, G. Endothelial Dysfunction, Hemodynamic Forces, and Atherogenesis. Thromb. Haemost. 82, 722-726 (1999).
  43. Wu, M. H., Ustinova, E., Granger, H. J. Integrin binding to fibronectin and vitronectin maintains the barrier function of isolated porcine coronary venules. J. Physiol. 532, (3), 785-791 (2001).
  44. Ribatti, D., Nico, B., Vacca, A., Roncali, L., Dammacco, F. Endothelial cell heterogeneity and organ specificity. J. Hematother. Stem Cell Res. 11, 81-90 (2002).
  45. Shanks, N., Greek, R., Greek, J. Are animal models predictive for humans. Philos. Ethics. Humanit. Med. 4, 2 (2009).
Micropatterning en montage van 3D microvaten
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Roberts, M. A., Kotha, S. S., Phong, K. T., Zheng, Y. Micropatterning and Assembly of 3D Microvessels . J. Vis. Exp. (115), e54457, doi:10.3791/54457 (2016).More

Roberts, M. A., Kotha, S. S., Phong, K. T., Zheng, Y. Micropatterning and Assembly of 3D Microvessels . J. Vis. Exp. (115), e54457, doi:10.3791/54457 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter