Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

توجه التغليف البروتين داخل الخارجي غشاء الحويصلات من Published: November 16, 2016 doi: 10.3791/54458
Automatic Translation
1,2, 1, 1
1Center for Bio/Molecular Science & Engineering, Naval Research Laboratory, 2Department of Emergency Medicine, Indiana University of School of Medicine

Abstract

اهتمام متزايد في تطبيق تقنيات البيولوجيا الاصطناعية لبرنامج حويصلات الغشاء الخارجي (OMV) تؤدي إلى بعض التطبيقات مثيرة جدا للاهتمام وفريدة من نوعها لOMV حيث النانوية التقليدية تثبت من الصعب جدا لتجميع. حتى الآن، وقد ثبت عن البكتيريا سالبة الجرام لانتاج أو.ام.في التظاهر التعبئة والتغليف من مجموعة متنوعة من البضائع التي تتضمن جزيئات صغيرة، والببتيدات والبروتينات والمادة الوراثية. وبناء على حمولتها متنوعة، وتورط OMV في العديد من العمليات البيولوجية التي تتراوح بين الاتصالات خلية خلية لنقل الجينات وتسليم عوامل الفوعة اعتمادا عليها البكتيريا تنتج أو.ام.في. إلا في الآونة الأخيرة البكتيرية OMV تكون ميسرة للاستخدام عبر مجموعة واسعة من التطبيقات من خلال تطوير تقنيات لمراقبة والتعبئة والتغليف مباشرة من البروتينات المؤتلف في OMV. يصف هذا البروتوكول وسيلة لإنتاج وتنقية، واستخدام انزيم تعبئتها OMV توفير لتحسين overaإنتاج ليرة لبنانية من انزيم المؤتلف، وزيادة البثور، وتعزيز الاستقرار الانزيم. واستخدام الناجح لهذا البروتوكول يؤدي إلى خلق السلالة البكتيرية التي تنتج في وقت واحد بروتين المؤتلف، وتوجهها لOMV التغليف من خلال استحداث رابط الاصطناعية بين البروتين المؤتلف والخارجي البروتين غشاء مرساة. تفاصيل هذا البروتوكول أيضا طرق لعزل OMV من الثقافات البكتيرية وكذلك التقنيات السليمة للتعامل معها والأشياء في الاعتبار عند التكيف مع هذا البروتوكول للاستخدام في تطبيقات أخرى فريدة من نوعها مثل: تسليم الصيدلانية المخدرات والتشخيص الطبي، وإصلاح البيئة.

Introduction

المقدمة هنا هي طريقة لتصميم وإنتاج وتنقية البكتيرية حويصلات الغشاء الخارجي محملة انزيم (OMV). OMV صغيرة، unilamellar في المقام الأول، proteoliposomes التي تتراوح في حجمها 30-200 نانومتر 1،2. وقد أثبتت جميع البكتيريا سالبة الجرام وموجبة الجرام التي تم دراستها لتاريخ الافراج عنه إما OMV أو الحويصلات خارج الخلية (EV) من سطحها 3،4. آلية دقيقة التي يتم إنتاجها OMV لم يتم بعد توضح تماما بسبب التجمعات البكتيرية المتنوعة التي تفرز لهم، وكذلك الوظائف المختلفة التي تخدمها. وقد ثبت OMV لنقل مجموعة واسعة من البضائع من الجزيئات الصغيرة، والببتيدات والبروتينات والمادة الوراثية تقدم مجموعة متنوعة من الإشارات المعقدة، النبات الجينات، والفوعة تقوم بعملها 5،6.

الآليات الدقيقة لOMV نشوء حيوي لا تتميز بشكل جيد، ويبدو أن تختلف بين الأنواع البكتيرية. وعلى الرغم من ثيالصورة الحقيقة، قمنا بتطوير طريقة لتعزيز كفاءة التعبئة والتغليف من البروتين المؤتلف في OMV عن طريق إنشاء الربط الاصطناعية بين بروتين من الفائدة والبروتين الذاتية وفيرة للغاية لالغشاء الخارجي للبكتيريا ولاحق OMV. في حالة عدم وجود الربط الاصطناعية، أو تقارب إدراجها بشكل مصطنع، بين البروتين المعبر عنه recombinantly وOMV كفاءة التعبئة والتغليف المرصودة منخفضة جدا (7). هذه النتيجة هي التي يمكن توقعها على تضمين البروتينات داخل OMV يحدث إما عن طريق تغليف فرصة عشوائي في نفس اللحظة من تشكيل OMV على سطح البكتيريا أو من خلال التعبئة والتغليف إخراج الآليات التي ليست مفهومة جيدا. وقد لوحظ بعض النجاح في التعبئة والتغليف البروتينات ببساطة من خلال أكثر من التعبير في الفضاء محيط بالجبلة التي تعتمد على تغليف فرصة عشوائي ولكن التعبئة الفعالة هي عالية البروتين تعتمد مع بعض البروتينات التعبئة والتغليف في كفاءة عالية بالمقارنة مع الآخرين عشرفي لا حزمة في كل 8-10. من خلال استخدام تقنيات البيولوجيا التركيبية المشتركة سعينا لهندسة الإشريكية القولونية (إي كولاي) لإنتاج واحد، حزمة وتفرز انزيم نشط من الاهتمام الى OMV أن تلتف القيود المعرفة الحالية بشأن كيف تتشكل OMV وكيف يتم تحديد البضائع عن طريق البكتيريا ل التعبئة والتغليف.

لأغراض هذا التطبيق تم اختيار نظام البروتين bioconjugation الانقسام كما الربط الاصطناعية من خيار لتسهيل التعبئة والتغليف الاتجاه إلى OMV. وكما يوحي اسمها يتكون نظام البروتين bioconjugation تقسيم اثنين من المجالات فرعية التكميلية التي تتفاعل مع بعضها البعض. ويشار إلى المجالات البروتين الانقسام التي تم اختيارها لأغراض هذا البروتوكول باسم SpyCatcher (SC) وSpyTag (ST) المجال و هي مستمدة من المكورات العقدية المقيحة ملزمة فبرونيكتين البروتين (FbaB) 11. هذا النظام بروتين الانقسام هو غير عادي في أن ثالدجاجة مفارز هما على مقربة سندات isopeptide تشكل بشكل عفوي بين الداني الأسبارتيك بقايا حمض أميني ويسين خلق صلة التساهمية. لا يتطلب تشكيل السندات Isopeptide إضافة البروتينات كوصي، والإنزيمات المحفزة، أو العوامل المساعدة ويمكن أن يحدث بسهولة في درجة حرارة الغرفة (RT) وأكثر من مجموعة واسعة من الشروط ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية 12.

كدليل على المفهوم، وقد تم اختيار phosphotriesterase (PTE) (EC 3.1.8.1) من Brevundimonas الضئيلة ليتم تعبئتها في كولاي المستمدة OMV 13. يحتوي PTE على ثنائي النواة الموقع الزنك / الزنك نشط ولديه القدرة على تحطيم الفوسفات العضوية من خلال رد فعل التحلل تحويل aryldialkylphosphates إلى dialkylphosphates والكحول أريل 14. التعرض لالفوسفات العضوية يضعف وظيفة النواقل العصبية السليمة من خلال تثبيط المائي للأستيل كولين قبل أستيل عند التقاطعات العصبية والعضلية ماكينز الفوسفات العضوي المركبات المشتقة خطيرة للغاية (15). لفترات طويلة أو التعرض الكبير لالفوسفات العضوية ينتج عادة في التشنجات لا يمكن السيطرة عليها، وعادة ما يسبب الموت عن طريق الاختناق. في حين PTE يسلك أعلى نشاط الحفاز نحو الباراأكسيون، مبيد حشري قوية جدا، بل هو أيضا قادرة على hydrolyzing مجموعة واسعة من المبيدات الأخرى وV / G نوع غاز الأعصاب الكيميائي 16. لتسهيل OMV التعبئة والتغليف، وقد تم تصميم البلازميد البكتيري أن يشفر بناء الجين الذي يحتوي على المروج محرض، سلسلة توطين محيط بالجبلة، ويبعد مسافة قصيرة متعددة موقع استنساخ المنبع من سلسلة SC الجينات. غرز الجينات PTE بين القائد وتسلسل SC يسمح لخلق التحول الجيني الذي يستهدف تدريب المدرسين-SC الانصهار البروتين إلى الفضاء محيط بالجبلة لOMV التعبئة والتغليف. في حين أن جهود وصفها هنا تركز على تدريب المدرسين، وجين الإنزيم قابلة للتبديل، ويمكن بسهولة أن يتم استبدال مع تسلسل الجينات آخر لبناء واجهاتالتعبئة والتغليف ilitate إنزيم بديل أو البروتين.

وبما أن الجزء الثاني من الربط الاصطناعية، يتم اختيار وفيرة الخارجي بروتين الغشاء (OmpA) لتقديم تسلسل الببتيد ST. في حين أن اختيار البروتين مرساة يمكن أن تختلف، فمن الضروري أن البروتين يحتوي على نطاق المتساهل الذي يطرح داخل الفضاء محيط بالجبلة، تسامح بناء الانصهار دون إحداث السمية الخلوية، ومن المعروف أن تكون موجودة في OMV، ولا تجميع عندما يكون recombinantly أنتجت. OmpA هو 37.2 كيلو دالتون بروتين الغشاء PORIN أن يعرف أن يتم التعبير عنها بشكل كبير في الغشاء الخارجي للبكتيريا ولاحق OMV 17. هو متورط في نقل الجزيئات الصغيرة، <2 نانومتر في الحجم، عبر غشاء البكتيريا (18). مواطن OmpA اثنين من المجالات فريدة من نوعها من الناحية الهيكلية، والغشاء بيتا برميل عزر وجزء للذوبان periplasmically C-محطة معروفة للتفاعل مع ببتيدوغليكان 19. في متحولة OmpA-ST الانصهار المصممد هنا تم حذف الجزء C-محطة من OmpA وتنصهر في ST إلى N- التي تواجه periplasmically أو C-ترميني. حذف جزء محيط بالجبلة من OmpA يقلل من عدد من التفاعلات بين الغشاء الخارجي وببتيدوغليكان مما أدى إلى زعزعة استقرار الغشاء مما يؤدي إلى فرط تحوصل 7. واستمر الجينوم OmpA بالإضافة إلى بناء OmpA-ST أعرب recombinantly للتخفيف الإجمالي زعزعة استقرار الغشاء.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. إعداد البلازميدات

  1. إعداد البلازميد (على سبيل المثال، pET22) التي تحتوي على البروتين مرساة (OmpA) تنصهر إلى مجال الربط biorthogonal (المشار إليها في هذا البروتوكول كما مرساة-ST)، والعلامة حاتمة (مثل 6xHis، MYC أو FLAG العلامات لتنقية وتحديد الهوية)، العلامة محيط بالجبلة التعريب، المقاومة للمضادات الحيوية، والأصل المناسب من النسخ المتماثل تعتمد على سلالة بكتيرية اختيار 7.
    1. استخراج DNA البلازميد من ثقافات بين عشية وضحاها باستخدام المتاحة تجاريا عدة عزل الحمض النووي بعد بروتوكول الشركة المصنعة.
  2. إعداد البلازميد (على سبيل المثال، pACYC184) التي تحتوي على انزيم / بروتين (PTE) ليتم تعبئتها داخل OMV تنصهر إلى المجال الربط bioorthogonal مكملة لتلك التي من البروتين مرساة (المشار إليها في هذا البروتوكول كما انزيم-SC)، والعلامة حاتمة، العلامة محيط بالجبلة التعريب، المقاومة للمضادات الحيوية التي تختلف من البروتين البلازميد مرساة، والاصليه المناسبفي النسخ المتماثل على أساس السلالة البكتيرية اختيار 7.
    1. استخراج DNA البلازميد من ثقافات بين عشية وضحاها باستخدام المتاحة تجاريا عدة عزل الحمض النووي بعد بروتوكول الشركة المصنعة 7.

2. الجيل من OMV التغليف E. ثقافة القولونية

  1. البلازميد عزل
    1. تنقية البلازميدات ترميز الانزيم-SC بناء ومرساة-ST يبني من خطوط الخلايا صيانة منفصلة باستخدام طقم البلازميد العزلة التجارية وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة 7. تحديد تركيز الحمض النووي والنقاء من خلال قياس الامتصاصية في 260 نانومتر و 280 نانومتر.
  2. شارك في التحول
    1. تحديد سلالة كولاي ما هو متاح تجاريا لتسهيل التعبير البروتين.
      ملاحظة: BL21 استخدمت (DE3) خلايا هنا. مطلوب مستذيب T7 للتعبير عن بناء مرساة-ST، الذي يعتمد على المروج T7 وT7 RNA البلمرة لبروتعين التعبير. استخدام سلالات بكتيرية أخرى يتطلب إما وجود الجين مستذيب T7 أو استخدام البلازميد غير pET22 7.
    2. تمييع DNA البلازميد المنقى إلى تركيز المولي تعادل ثم تحويلها إلى خلايا بكتيرية المختصة إما عن طريق الحرارة صدمة التحول أو Electroporation للالتالية بروتوكول الشركة المصنعة للخلايا المختصة المختار.
    3. لوحة تتحول الخلايا على لوريا، Bertani (LB) أجار لوحات مع كل من الأمبيسلين (pET22) والكلورامفينيكول (pACYC184) التي تحتوي على المضادات الحيوية. سواء في الحاضر بتركيزات النهائية من 25 ميكروغرام / مل.
    4. مكان الطبق الثقافة عند 37 درجة مئوية خلال الليل لعزل الحيوانات المستنسخة الوحيدة التي تحتوي على كل من البلازميدات.
      ملاحظة: المستعمرات التي تعيش اختيار المضادات الحيوية سوف تستخدم لكافة الاستعدادات OMV في المستقبل. سيتم إضافة المضادات الحيوية (الأمبيسلين والكلورامفينيكول) لجميع الثقافات السائل للحفاظ على ضغط انتقائي، وضمان وجود كل من البلازميدات.

3. OMV الإنتاج

  1. توسيع المستوطنات
    1. تطعيم 5 مل من وسائل الإعلام ثقافة (عادة مرق رائع (السل) أو LB) التي تحتوي على المضادات الحيوية في تركيزات المذكورة أعلاه (الخطوة 2.2.3) مع مستعمرة واحدة من لوحات مختارة وصفها في 2.2.4.
    2. إجراء التخفيف 1: أضعاف من الثقافة بداية ليلة وضحاها 100 في قوارير ثقافة حيرة.
      ملاحظة: استخدام حجم وسائل الاعلام بين 250-500 مل.
    3. الحفاظ على الثقافة عند 37 درجة مئوية تهتز في 250 دورة في الدقيقة لضمان تحقيق ذلك تهوية كافية من الثقافة.
  2. تحريض كل البلازميد
    1. السماح للثقافة البكتيرية لتنمو إلى OD 600 من 0،6-0،8، ما يقرب من 3 ساعات من النمو بعد التلقيح من القارورة النمو الأولية.
    2. لتحسين العائد النهائي من PTE-SC الحويصلات تحميل، الطرد المركزي ثقافة كاملة في 7000 x ج لمدة 15 دقيقة. resuspend الكرية خلية في قبل تحسنت، وسائل الإعلام ثقافة جديدة.
      ملاحظة: هذا التقيدIONAL الخطوة تساعد على إزالة أي OMV فارغة موجودة في وسائل الإعلام ثقافة قبل PTE-SC الاستقراء.
    3. جعل 20٪ محلول المخزون من L-أرابينوز في مجال المياه وتصفية العقيمة باستخدام فلتر 0.22 ميكرون. مخزن حل L-أرابينوز في 4 درجة مئوية لمدة 2-4 أسابيع.
    4. إضافة الحل L-أرابينوز إلى قارورة الثقافة إلى التركيز النهائي 0.2٪ لبدء إنتاج بي تي إي-SC.
      ملاحظة: هذا يساعد على تهيئة تحميلها على مساحة محيط بالجبلة مع بي تي إي-SC قبل تشجيع زيادة تحوصل من خلال تحريض متحولة OmpA-ST.
    5. جعل حل 1 م الآيزوبروبيل β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) في المياه وتصفية العقيمة باستخدام فلتر 0.22 ميكرون.
      ملاحظة: IPTG يجب أن تستخدم فورا بمجرد رطب. aliquots من IPTG يمكن تخزين المجمدة لمدة 3-6 أشهر، ويمكن إذابة فورا قبل الاستخدام.
    6. إضافة IPTG بعد فترة حضانة 3 ساعة إضافية لتركيز النهائي من 0.5 ملم إلى بدء إنتاج OmpA-ST.
    7. السماح لطريق مسدودتلح في النمو لمدة 8-14 ساعة إضافية عند 37 درجة مئوية في حين تهتز.

4. OMV تنقية

  1. إزالة البكتيريا سليمة
    1. أجهزة الطرد المركزي في وسائل الإعلام ثقافة البكتيريا لمدة 15 دقيقة في 7000 x ج في 4 درجات مئوية لتكوير البكتيريا سليمة.
    2. صب، وحفظ، وسائل الإعلام من على قمة الخلية بيليه آخر الطرد المركزي الحرص على عدم تعكير صفو بيليه الخلية.
    3. كرر الخطوات من 4.1.1 و 4.1.2 للدورة الطرد المركزي إضافية واحدة لضمان تتم إزالة جميع البكتيريا سليمة من وسائل الإعلام الثقافة ويجري التأكد من صب ووفر وسائل الإعلام.
  2. إزالة الركام البروتين
    1. المزيد من تنقية وسائل الإعلام ثقافة البكتيريا باستخدام فلتر 0.45 ميكرون غشاء لإزالة البكتيريا المتبقية وغير مرغوب فيها المواد الخلوية الكبيرة.
      ملاحظة: استخدام مادة غشاء متوافقة بيولوجيا لاسترداد ارتفاع وانخفاض امتصاص البروتين مثل خلات السليلوز (CA) أو difluoride البولي فينيل (PVDF). أحجام مرشح حقنة أقل من 100 مل وأحجام مرشح فراغ أكبر من 100 مل.
      1. لتصفية حقنة، رسم مستنبت إلى معقمة حقنة 10-50 مل. إرفاق 0.45 ميكرون فلتر لنهاية لور حقنة. خفض الغطاس وجمع التدفق من خلال في سفينة جديدة.
      2. لفراغ مرشح، ونقل مستنبت لجهاز الترشيح العقيمة. إرفاق وحدة لفراغ مضخة أو تغرق الشافطة لتوليد الشفط. نقل متوسطة تصفيتها لسفينة جديدة.
  3. عزل OMV عبر تنبيذ فائق
    1. إضافة وسائل الإعلام الثقافة التي تمت تصفيتها في أنابيب الطرد المركزي الحرص على تحقيق التوازن بين أنابيب معارضة في أجهزة الطرد المركزي.
    2. بيليه في ~ 150000 x ج لمدة 3 ساعات في 4 درجات مئوية في نابذة فائقة السرعة باستخدام الدوار المقابلة مطابقة كل من الصك وأنابيب يجري الاستفادة منها.
    3. صب OMV سائل الإعلام والثقافة المنضب من بيليه OMV، والحرص على عدم تعكير صفو بيليه OMV، وعلى الفور عند الانتهاء سالطرد المركزي و كما يسمح بيليه OMV أن تبقى في وسائل الإعلام سوف تخفف بيليه الحد من الانتعاش OMV.
      ملاحظة: هذا بيليه يكون البني قليلا وهذا يتوقف على مقدار بدءا من ثقافة البكتيرية قد أو قد لا تكون مرئية بالعين. الشفط وسائل الإعلام مباشرة من الجزء العلوي من أنبوب الطرد المركزي هو أيضا خيار مع الأخذ في الاعتبار أن أكثر إزالتها من OMV سائل الإعلام بيليه أكثر نقاء وعينة OMV النهائية ستكون.
    4. حفظ طاف طرد لديناميكية في وقت لاحق اختبار تشتت الضوء (DLS) للتحقق من أن جزيئات OMV تم استنفاد كامل من وسائل الإعلام.
    5. إضافة 0.5-1 مل من تصفيتها الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) ودرجة الحموضة 7.4 أو 100 ملي N عازلة العقيمة -Cyclohexyl-2-aminoethanesulfonic حمض (الشطرنج) في الرقم الهيدروجيني 8.0 إلى بيليه OMV والسماح لها لاحتضان لمدة 30 دقيقة في RT. تأكد من أن بيليه لا تجف.
      ملاحظة: المتطرفة في حل القوة الأيونية، ودرجة الحموضة، ودرجة الحرارة قد يؤدي إلى انخفاض الذوبان OMV وتعزيز aggregation.
    6. بعناية الماصة الحل OMV تنقيته من أنبوب الطرد المركزي، خلط بلطف لضمان تم بالفاعلات بيليه بأكمله.

5. OMV توصيف

  1. استخدام أي متاحة تجاريا DLS أو تتبع جسيمات متناهية الصغر البرامج التالية بروتوكولات وقدمت الشركة المصنعة فريدة من نوعها لكل أداة لتحديد OMV توزيع حجم وتركيز الجسيمات.
    ملاحظة: هنا، تم تحديد OMV توزيع حجم وتركيز الاستفادة NanoSight LM10 تتبع جسيمات متناهية الصغر والهيئة الوطنية للمواصلات 2.3 برنامج تحليل.
    1. فتح البرنامج.
    2. تشغيل المجهر وتنظيف جميع الأسطح على وحدة المجهر وتتبع جسيمات متناهية الصغر.
    3. إضافة ~ 0.5 مل من عينة OMV مباشرة إلى نافذة عرض للجهاز تتبع الجسيمات من خلال بالتركيبة مع 1 مل محقنة معقمة ويجري التأكد من تغطية نافذة عرض كامل دون ضخ أي فقاعات الهواء في النظام.
    4. مكان رانه جسيمات متناهية الصغر تتبع وحدة على المسرح المجهر وتشغيل الليزر.
    5. انقر على "التقاط" في البرنامج.
    6. ضبط التركيز المجهر وتنظيم لتصور الجسيمات على الحاضر شاشة العرض في إطار البرنامج.
    7. ضبط "مصراع الكاميرا" و "كسب كاميرا" حتى يتم تصور جزيئات مضيئة بشكل واضح على خلفية داكنة.
    8. ضبط مدة القبض على 60 ثانية.
    9. انقر على "سجل".
    10. عند المطالبة، إدخال العينة في درجة الحرارة / الجهاز، تسمية العينة، وحفظ البيانات والفيديو عند الانتهاء من كل تشغيل إلى مجلد مستخدم معين.
    11. منع جميع المعلمات تحليل (كشف عتبة، والضبابية، ومين طول المسار، مين المتوقعة حجم الجسيمات) على السيارات وضع كشف وانقر فوق "تسلسل عملية."
      ملاحظة: راجع دليل لكيفية لكل معلمة يمكن تعديلها بشكل مستقل إلى نتائج تحليل غرامة تصل قيمتها.
    12. سجل توزيع حجم الجسيمات والجسيمات / متركيز لتر على النحو الذي يحدده البرنامج.
      ملاحظة: OMV الهيدروديناميكية مدى محدد حجم ما بين 30-200 نانومتر مع تركيز الجسيمات / مل من ~ 10 × 10 8.
  2. تحديد OMV محتوى البروتين
    1. استخدام معيار SDS-PAGE والبروتوكولات الغربية وصمة عار لتقييم OMV النقاء، وإنتاج الإنزيم، وكفاءة يشابك SC-ST 7.
      ملاحظة: سوف يشابك الكفاءة لا تكون 100٪ 7.

6. التأكيد من أنزيم التعبئة والتغليف

  1. PTE آخر الفحص
    1. أداء جميع المقايسات الأنزيمية في منطقة عازلة مناسبة مثل 100 مم الشطرنج عازلة (درجة الحموضة 8) عند 25 درجة مئوية في أي كفيت أو المضاعفة في لوحة جيدا 96/384.
    2. إضافة 5 ميكرولتر من 1: 1000 تخفيف من الباراأكسيون العازلة في الشطرنج إلى 90 ميكرولتر من الشطرنج و 5 ميكرولتر من OMV تنقيته (~ 36 أضعاف تتركز بالمقارنة مع تركيز OMV الحالي في وسائل الإعلام والثقافة).
      تحذير: الباراأكسيون هو المبيدات الحشرية السامةويجب أن يتم التعامل معها في تصنيع والمبادئ التوجيهية المؤسسية.
    3. أخذ قراءات الامتصاصية في فترات منتظمة (كل 20 ثانية ل~ 2 ساعة إجمالي وقت رد الفعل) في 405 نانومتر (ε = 18.1 مم -1 سم -1) وفي 348 نانومتر (isosbestic ε نقطة = 5.4 مم -1 سم -1) ل مراقبة تطور رد فعل مولد اللون الباراأكسيون نواتج تحلل، ص -nitrophenol.
      ملاحظة: في قيم الرقم الهيدروجيني فوق 8 شكل deprotonated المهيمن ص -nitrophenol موجودا يسمح لرصد دقيق في 405 نانومتر. في جميع الحلول المعقدة أو أقل درجة الحموضة أخرى لا بد من الاستفادة من نقطة isosbestic من 348 نانومتر كما أشكالا متعددة من -nitrophenol ص سيكون حاضرا.
    4. حساب السرعات رد الفعل الأولية من خلال تحديد المنحدر من جزء خطية من منحنيات تقدم من الخطوة 6.1.3 لمقارنة كمية النسبية لتدريب المدرسين في كل عينة، والكفاءة التعبئة والتغليف، وإجمالي إنتاج PTE.
    5. أداء الأنزيمية القياسيةبروتوكولات الفحص لتحديد K M، V ماكس وك القط لOMV مغلفة تدريب المدرسين.
      ملاحظة: يمكن استخدام تحليل خطيطة لبورك لتحديد هذه الثوابت الحركية حيث التقاطع y = 1 / V ماكس والمنحدر = K M / V ماكس 20.
  2. الغشاء الركيزة / انتشار المنتج.
    1. تنفيذ نفس تحليل الفحص الحركي كما هو موضح في الخطوة 6.1 استخدام تركيزات متزايدة من تريتون X-100 العازلة في الشطرنج 0-3٪ من حيث الحجم.
      ملاحظة: إضافة تريتون X-100 على وظائف OMV بالفاعلات لتعطيل طبقة ثنائية المادة الدهنية مما يسمح لمحتويات OMV لتكون في متناول بحرية إلى محلول التفاعل.
    2. حساب ومقارنة سرعات الأولية في كل مستوى تريتون X-100 للتحقق من مرور عبر الغشاء الركيزة / المنتج المشار إليها بواسطة تغيير طفيف في نشاط إنزيم (السرعات الأولية) مقارنة على نشاط انزيم طن غياب تريتون X-100. إذا لوحظ زيادة كبيرة في نشاط انزيم في وجود تريتون X-100 فمن المرجح أن الركيزة لا تنتشر بحرية في OMV.
    3. لا تحول دون فحص نشاط انزيم الحرة (كما هو موضح أعلاه في القسم 6.1) في وجود تريتون X-100 للتحقق من نشاط انزيم من قبل السطحي نفسه.
      ملاحظة: إذا كان يتأثر النشاط إلى حد كبير من قبل تريتون X-100، والمضافات البديلة، مثل السابونين أو بوليسوربات مختلف / قد تكون السطحي توين أكثر ملاءمة للتمزق الغشاء OMV.

7. OMV التخزين

  1. تجميد
    1. قسامات مكان ~ 100 ميكرولتر من OMV تنقية مباشرة في النيتروجين السائل لالتقاط تجميد وقسامات يجري التأكد أن لا يغرق تماما قارورة أو الاتصال بأي النيتروجين السائل مع العينة نفسها.
      ملاحظة: تنقية OMV يمكن المفاجئة المجمدة مباشرة في المخزن المؤقت الذي تم تحديده لالانحلال بيليه OMV خلال purificatعملية أيون مع أي cryoprotectants الإضافية الضرورية 7.
    2. تخزين قسامات مبكرة في المجمد -80 درجة مئوية.
    3. ذوبان الجليد قسامات المجمدة من الخطوة 7.1.1 عن طريق وضعها في RT يجري التأكد من عدم تسخين العينات.
    4. قبل إعداد جميع العينات للتخزين في هذه الطريقة إجراء فحص انزيم هو موضح في الخطوة 6.1 مقارنة السرعات الأولية قبل وبعد تجميد للتحقق من عدم وجود خسائر كبيرة في انزيم آخر نشاط تجميد أذاب.
      ملاحظة: مخزن تنقية OMV في 4 درجات مئوية إذا لوحظ انخفاض في نشاط انزيم بسبب التجميد.
  2. تجفيد
    1. يجفد المفاجئة المجمدة قسامات OMV النقاء باستخدام المعدات تجفيد المتاحة تجاريا 21.
    2. متجر مجفف بالتجميد aliquots في RT لمدة أسابيع أو في -80 درجة مئوية لمدة عدة أشهر.
    3. إضافة نفس الحجم من الماء النقي إلى OMV مجفف بالتجميد كما قبل تجفيد واسمحوا الوقوف على RT لمدة 30 دقيقة لترطيب رإنه عينة. المزيج بلطف عند الضرورة يجري التأكد من عدم دوامة أو يصوتن OMV.
    4. إضافة مسحوق مجفف بالتجميد OMV مباشرة إلى نقطة من الرعاية للتطبيقات حيث مسبق تخفيف / الإذابة وليس من الضروري.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

التعبير في وقت واحد من اثنين من البروتينات المؤتلف، كما هو مطلوب لاستراتيجية التعبئة والتغليف OMV بالتفصيل في هذا البروتوكول، ويمكن تحقيق ذلك من خلال عدد من السبل المختلفة. هنا، تم استخدام نظام اثنين من ناقلات مع أصول المتوافقة مع النسخ المتماثل وأشرطة الكاسيت الجينات محرض منفصلة. للتعبير عن PTE-SC بناء العمود الفقري البلازميد التجاري (pACY184) تم هندستها لتشمل الارابينوز كاسيت الجينات محرض والتوأم أرجينين محيط بالجبلة تسلسل زعيم توطين تليها سلسلة من تقييد مواقع فريدة من نوعها لتسهيل استنساخ الجين الانزيم باعتباره الانصهار لبروتين SC C-المحطة. وبناء ترميز البلازميد والخارجي البروتين غشاء مرساة هو pET22 ناقلات التجارية الذي يستخدم الاوبرون لاك للسيطرة على تعبير البروتين وpelB تسلسل توطين محيط بالجبلة. تم استنساخ تسلسل ST قصيرة إلى البروتين OmpA اقتطاع قبل INSErtion في التعبير البلازميد. في كل من البلازميدات، والحفاظ على تسلسل hexahistidine C-محطة للسماح بتحديد وقت واحد من البروتينات الانصهار في عينات OMV. البناء وتوصيف هذه التركيبات الجينية، بما في ذلك كل من N- ومحطة ج ST يبني الانصهار لOmpA، موصوفة بشكل كامل في ألفيس وآخرون. 7. يبني الجينات الموصوفة هنا قد لا تكون مواتية لتعبئة جميع الانزيمات. في بعض الحالات قد يكون من الضروري تغيير إشارة محيط بالجبلة التوطين، والعناصر التنظيمية، أو العلامات حاتمة. بالإضافة إلى ذلك، قد تكون بعض البروتينات كبير باهظة وغير قادر على المستعرضة الغشاء الداخلي تماما. النشاط الأنزيمي والكفاءة التعبئة والتغليف OMV لا يمكن تحديدها مسبقا، وسوف تحتاج إلى أن تحدد تجريبيا لكل بروتين الهدف.

وفيما يلي النتائج التي يتوقع المرء عادة بعد إجراء بنجاح سحزب التحرير هذا البروتوكول. وشملت هو التخطيطي اثنين من المجالات البروتين / SC انقسام ST، OmpA-ST والانصهار بي تي إي-SC يبني فضلا كمثال على تشكيل isopeptide في الغشاء الخارجي للبكتيريا والتغليف لاحق من PTE-SC ضمن OMV (الشكل 1) . كما يوجد أيضا نتائج ممثلة من التشكل OMV تنقيته عن طريق وزارة شؤون المرأة وكذلك حجم التوزيع والمطلق تركيز OMV تحديدها عن طريق برنامج تتبع الجسيمات (الشكل 2). وينظر إلى مزيد من توصيف محتوى البروتين OMV وتعبير البروتين المؤتلف عبر SDS-PAGE وصمة عار الغربية (الشكل 3). الأوزان الجزيئية للبروتينات ذات أهمية خاصة لبروتوكول المقدمة هنا هي على النحو التالي: OmpA الأصلي (37.2 كيلو دالتون)، OmpA-ST (23 كيلو دالتون)، PTE-SC (51 كيلو دالتون)، OmpA-ST / بي تي إي-SC (74 كيلو دالتون) . ينبغي أن يكون تنقيته OMV الفرقة المظلمة في حوالي 37 كيلو دالتون الذي يدل على OmpA الأصلي وفيرة للغاية. تبعا لقرار هلام قد يكون هناك با متعددةتفاحة موجودة في هذه المنطقة من الجل لأن OmpA، OmpF وOmpC كلها وفيرة نسبيا وتشترك في الوزن الجزيئي مماثل. فرقة الإضافية التي هي 2.2 كيلو دالتون أكبر من OmpA-ST يمكن أيضا لاحظت بسبب الانقسام غير لائق من تسلسل زعيم نتيجة ساحقة في E. الآلات التعبير القولونية. من المهم أن نلاحظ أن عينة OMV تنقية بنجاح لن يكون لها العديد من البروتينات الأخرى أعرب للغاية. إذا فرق أخرى موجودة أجريت إما تنقية خارج بطريقة غير سليمة أو البكتيريا سلالة يجري استخدام يمكن التعبئة والتغليف البروتينات الأخرى لم يلاحظ في هذه السلالة كولاي BL21 (DE3).

وعلاوة على ذلك، تم تقديم فحوصات النشاط والتجارب حويصلة تمزق لإظهار نتائج ممثلة بأنه من المتوقع إذا الركيزة الأنزيمية يمكن أن تدخل بحرية OMV من خلال بروتينات الغشاء PORIN (الشكل 4). الباراأكسيون نسبيا يدخل بحريةOMV من خلال بروتينات الغشاء PORIN الذاتية لتتفاعل مع تدريب المدرسين وتعبئتها وناتج التفاعل، ص -nitrophenol، كما يمر بحرية نسبيا من خلال غشاء OMV. وهذه الظاهرة لا تكون في كل مكان بين جميع المنتجات، الركيزة، ومجموعات انزيم ويجب أن تحدد تجريبيا. على الرغم من نجاح تمزق OMV وإطلاق إنزيم وقد شوهد مع تركيزات منخفضة من المنظفات وتدريب المدرسين (هنا تريتون X-100)، قد اضافات من هذا القبيل يؤثر على نشاط الأنزيمات الأخرى.

وقد تم إدراج خرائط البلازميد للتدليل على تصميم استراتيجية التعبئة والتغليف اثنين البلازميد باستخدام SC / نظام ST (الشكل 5).

شكل 1
الشكل 1: التعبئة والتغليف إخراج من البروتينات في OMV. هياكل الكريستال للبروتينات المستخدمة في التعبئة والتغليف STRAT OMV صفهEGY: OmpA، تدريب المدرسين، SpyTag (ST) وSpyCatcher (SC)؛ PDB: 2GE4، 1PTA، 4MLI، 4MLI، على التوالي. ويرد التمثيل التخطيطي للOmpA-ST وتدريب المدرسين-SC يبني الانصهار تشكيل السندات isopeptide في الغشاء الخارجي للبكتيريا. هذا الانصهار غشاء يدفع إدراج تدريب المدرسين داخل OMV تشكيل. شخصية مستنسخة (مكيف) من ألفيس وآخرون. ACS تطبيق ورقة مات واجهات (2015)، 7 (44)، ص 24،963-24،972 7. حقوق التأليف والنشر 2015 الجمعية الكيميائية الأمريكية. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2: OMV التوصيف. (A) SEM من نابذة تنقية OMV من كولاي الأم [BL21 (DE3)]. (ب) الممثل تراك الجسيمات ملك حجم التوزيعات و (C) متوسط التركيز الكلي للحويصلة أكثر من 90 ثانية يقرأ عينة لOMV الأصلية، PTE-SC في غياب تفعيل الارابينوز (PTE رقم أ)، PTE-SC في وجود تفعيل الارابينوز (PTE-A) ، N-محطة OmpA-ST مع بي تي إي-SC بحضور الارابينوز وتفعيل IPTG (PTE / OMV-N)، وطاف نابذة (UC طاف) تحولت المشترك. ولوحظ وجود زيادة كبيرة في انتاج أو.ام.في في العينة PTE / OMV-N مقارنة OMV الأصلية وتدريب المدرسين-SC يبني وحده. وتم قياس كمية OMV في طاف جامعة كاليفورنيا لإثبات الانتعاش الكامل تقريبا OMV في بيليه جامعة كاليفورنيا ترك شيئا يذكر لولا OMV في آخر طاف تنبيذ فائق. يمثل جميع البيانات يعني (± SD) من التجارب ثلاث نسخ. شخصية مستنسخة (مكيف) من ألفيس وآخرون. ACS تطبيق ورقة مات واجهات (2015)، 7 (44)، ص 24،963-24،972 7. حقوق التأليف والنشر 2015 الجمعية الكيميائية الأمريكية.د / 54458 / 54458fig2large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الشكل (3): منقى OMV تحديد محتوى البروتين. (A) SDS-PAGE لتنقية بيليه OMV جامعة كاليفورنيا في OmpA-ST الانصهار C-محطة coexpressed مع بي تي إي-SC (PTE / OMV) بناء يتظاهرون فرة تمثيلية من OmpA-ST، أصلي OmpA، PTE-SC وOmpA- ST / بي تي إي-SC الانصهار isopeptide. (ب) تحليل لطخة غربية باستخدام شملت له العلامة الموجودة في OmpA وتدريب المدرسين يبني لتسهيل التصور عن طريق الأجسام المضادة لمكافحة 6xhis. من المهم أن نلاحظ أن تدريب المدرسين من المعروف أن dimerize، كما تشهد بذلك وصمة عار بسبب وجود أكبر الوزن الجزيئي له الموسومة الأنواع. حتى وإن كانت هناك مستويات عالية جدا من التعبير OmpA-ST رصدها وهى ليست هناك تحويل كامل للمجانابي تي إي-SC لغشاء ملزمة OmpA-ST / بي تي إي-SC. وعلى الرغم من هذه الحقيقة، فإن الزيادة في إنتاج PTE العام وتحسين كفاءة التعبئة والتغليف تشير إلى أن حين تشكيل التساهمية السندات ليست في كل مكان في جمعية غير التساهمية من ST والمجالات SC هو عامل مهم في التعبئة والتغليف توجه داخل OMV. شخصية مستنسخة (مكيف) من ألفيس وآخرون. ACS تطبيق ورقة مات واجهات (2015)، 7 (44)، ص 24،963-24،972 7. حقوق التأليف والنشر 2015 الجمعية الكيميائية الأمريكية. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (4)
الشكل 4: النشاط تدريب المدرسين وتوصيف التعبئة والتغليف. (A) وعموما PTE مستويات التعبير والكفاءة التعبئة والتغليف OMV تحدد عن طريق قياسات السرعة الأولية باستخدام الفقرةأوكسون باعتبارها الركيزة اللونية مقارنة PTE موجودة في الكريات الخلايا، وطاف جامعة كاليفورنيا، والنقاء الكريات جامعة كاليفورنيا OMV. (ب) بيانات تمثيلية مما يدل على استخدام تريتون X-100 (0.5٪ T100) لتعطيل طبقة ثنائية OMV مما يتيح الوصول دون عوائق الركيزة إلى OMV الداخلية. وبمقارنة هذه البيانات لفحوصات أجريت في غياب T100 يسهل التحقق من النبات من الركيزة عبر طبقات ثنائية OMV سليمة إذا السرعات الأولية الأنزيمية هي دون تغيير. في حالة الباراأكسيون كان هناك اختلاف النشاط القليل جدا لوحظت في وجود أو عدم وجود T100 مشيرا إلى أن الباراأكسيون يمر بحرية من خلال المسام الذاتية على OMV. (C) PTE-SC الحركي تناسب البيانات القياسية ميخائيل-مينتن حركية إنزيم المعادلة لتدريب المدرسين / OMV-N وPTE-A. (د) تحليل خطيطة لبيرك المستخدمة لتحديد K M وك القط / K M (48، 4.4 × 10 7 و 44 ميكرومتر، 4.9 س10 7 ثانية -1 م -1، على التوالي) مما يدل مماثلة الأدب PTE المعلمات الحركية مثل انزيم الأصلي (90 ميكرومتر، 2.7 × 10 7 ثانية -1 م -1) مع R 2 ≥ 0.999 في جميع الحالات. يمثل جميع البيانات يعني (± SD) من التجارب ثلاث نسخ. شخصية مستنسخة (مكيف) من ألفيس وآخرون. ACS تطبيق ورقة مات واجهات (2015)، 7 (44)، ص 24،963-24،972 7. حقوق التأليف والنشر 2015 الجمعية الكيميائية الأمريكية. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 5
الرقم 5: يبني البلازميد التمثيلية لنظام المثال هو موضح هنا. SpyCatcher تعديل انزيم-SC (بي تي إي-SC) البلازميد استهدفت لتغليف داخل OMV (يسار). SpyTag modifالعبوات الناسفة غشاء مرساة-ST (OmpA-ST-N) البلازميد (يمين). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

يعمل هذا البروتوكول على إثبات وجود ممثل الموجهة تقنية التعبئة والتغليف التي تنتج انزيم من الفائدة وتعبئتها في OMV من قبل كولاي. كما هو الحال مع العديد من التقنيات المعقدة هناك مناطق متعددة في أي بروتوكول يمكن تعديلها لاستيعاب لاستخدامها في تطبيقات فريدة من نوعها مختلفة، بعضها موضح أدناه. في حين أن آلية OMV التعبئة والتغليف والتغليف الإنزيم يمكن تكييفها لتلائم الاحتياجات الخاصة هناك العديد من الخطوات في هذا البروتوكول، الذي تعتبر بالغة الأهمية لنجاحها. إزالة الأولية للبكتيريا سليمة والحطام الخلوي ذات أهمية كبيرة، وسوف تؤثر على جميع المحاولات اللاحقة في الكميات أو تحليل العينات. خطوتين الطرد المركزي المتعاقبة تليها الترشيح هو عادة كافية لإزالة هذه الملوثات. ومع ذلك، في جميع الحالات الرعاية التي ينبغي اتخاذها عند حلول الصب بعد الطرد المركزي للحد من نقل الملوثات. وبالمثل، فإن النهائي OMV بيليه سbtained تنبيذ فائق التالية غالبا ما يكون الالتزام فقط فضفاضة إلى أسفل أنبوب الطرد المركزي. في المراحل النهائية، يجب توخي الحذر عند إزالة مستنبت قضى لضمان أن بيليه لا تزال دون عائق في الجزء السفلي من السفينة. في بعض المثال قد يكون من الأفضل الإبقاء على مستنبت نهائية حتى بعد تحليل العينة باستخدام DLS أو تتبع جسيمات متناهية الصغر الجهاز لضمان لم يكن خسر في الخطوات النهائية للبروتوكول بيليه OMV. وفيما يلي بعض المخاوف الإضافية التي قد تنشأ مع كل هذا بروتوكول معين وغيرها من الجهات التي صممت خصيصا لتلائم الاحتياجات الخاصة الباحثون.

استخدام PTE في هذا النظام ينص على الكبسلة انزيم نموذجا ممتازا لإصلاح البيئة من مناطق الفوسفات العضوي ملوثة PTE يجري استبدالها بسهولة عن طريق انزيم بديل أو البروتين من الفائدة. كما هو موضح هنا أدى coexpression من PTE-SC مع OmpA-ST في زيادة كبيرة في expressi PTE العامعلى فضلا عن ارتفاع مستويات الإنتاج حويصلة مع مزيد من PTE يتم تعبئتها داخل الحويصلات مقارنة تدريب المدرسين وتدريب المدرسين-SC أعرب وحدها. عن طريق الحد من عدد من التفاعلات بين الغشاء الخارجي وببتيدوغليكان من خلال الحذف C-محطة من OmpA فرط تحوصل يتحقق. ويوفر هذا الطريق السهل للبكتيريا لتصدير PTE المؤتلف الذي يخفف من الآثار السامة التي غالبا ما لوحظ في overexpression من البروتينات غير الأصلية.

في حين يمكن بسهولة استبدال تدريب المدرسين في هذا النظام النموذج، من المهم أن نلاحظ أن ليس كل ركائز انزيم سوف تمر بحرية من خلال طبقة ثنائية OMV ولذلك فمن الضروري أن كل انزيم فريدة من نوعها وزوج الركيزة يتم اختبارها على كل حالة على حدة. حتى لو ركيزة لا يمر عبر غشاء هذه التقنية لا يزال من الممكن استخدامها لإنتاج وتعبئة انزيم في OMV وإضافة تريتون X-100، أو السطحي بديل مناسب، ويمكن أن يضاف على كافيا جنيهVELS إلى تمزق الحويصلات قبل استخدامها.

في غياب تعبير البروتين المؤتلف والتعبئة والتغليف يمكن لهذا البروتوكول أيضا بمثابة الطريقة الأساسية لإنتاج أو.ام.في وتنقية من الأنواع البكتيرية المختلفة. الطرق البديلة لتنقية OMV، مثل كثافة التدرج تجزئة 22، الترشيح الغشائي 23، والترشيح الفائق 24، وتوجد أيضا ويمكن أن يكون أكثر التقنيات المناسبة تبعا للتطبيق المقصود. ويمكن أيضا أن هذه التقنيات تنقية بديلة أن تستكمل بسهولة في هذا البروتوكول في مكان التكوير تنبيذ فائق من OMV لتغليف موجهة للبروتين إلى OMV من خلال استخدام الربط الاصطناعية biorthogonal.

تعديلات أخرى يمكن إدخالها على نظام الربط الاصطناعية الخاصة المستخدمة في هذا البروتوكول فضلا عن نخبة من البروتين غشاء الربط. هناك استراتيجيات الاصطناعية المختلفة لالاقتران اثنين من البروتينات المختلفةالصورة ضمن نظام البيولوجي والتي تشمل: البروتينات انقسام 25، لفائف ملفوف 26، وانقسام inteins 27، فقط لقائمة قليلة. سوف أخرى غشاء ملزمة أو الغشاء البروتينات مثل OmpF وOmpC المرجح أن توفر لمواقع تعديل ST مناسبة وكذلك 28. في بعض الحالات قد يكون من الضروري أيضا مبادلة ST والمجالات SC وضع SC على البروتين رسو وST أصغر بكثير على انزيم المؤتلف / البروتين. وهناك أيضا عدد من الاستراتيجيات استنساخ المختلفة التي يمكن تنفيذها هنا بما في ذلك استخدام البلازميدات متعددة في ظل أنظمة الحث نفس أو مختلفة، البلازميد واحد مع بروتينات متعددة ترميز، أو حتى استخدام تقنيات إعادة التركيب مثلي لدمج كل أو أجزاء من التعبير النظام في جينوم بكتيري.

المكروية من OMV تساعد على تحقيق الاستقرار في انزيم تعبئتها الحد تعطيل الأنزيمية التي تحدث عادة في ظل أقل من المثالي الواحدشروط أوراج، وتجميد ذوبان الجليد، وتجفيد 29. ومن المتوقع أيضا أن OMV شأنها أن تحسن إلى حد كبير مقاومة التحلل البروتيني كما طبقة ثنائية OMV سوف تكون بمثابة حاجز مادي بين الإنزيم النشط والبروتينات الموجودة في الفضاء خارج OMV. هذا البروتوكول يمكن كذلك توسعت لتشمل الخارجية التي تواجه الصغيرة جزيء، الببتيد، أو علامة البروتين لتسهيل ايصال المستهدفة من البروتينات OMV مغلفة وتنقية تقارب. في حين تم اختيار تدريب المدرسين لهذا التطبيق الفريد نتائج هذه الدراسة، ومضمون هذا البروتوكول، ويمكن بسهولة أن تستخدم لتصميم استراتيجيات البروتين التعبئة والتغليف مماثلة للاستخدام في تسليم الصيدلانية متنوعة، التشخيص الطبي، والمعالجة البيئية التطبيقات 30.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
IPTG Any Always prepare fresh or aliquot and freeze.
L-arabinose Any Can be prepared ahead of time and stored at 4 °C.
Ampicillin Any Add immediately prior to use after media cools sufficiently from being autoclaved.  
Chloramphenicol  Any Add immediately prior to use after media cools sufficiently from being autoclaved.  
TB/LB Culture Media Any Other growth medias will likely work similarly.
Triton X-100 Any One of many potential suitable surfactants.  
Baffled culture flasks Any The baffles promote higher levels of aeration.  
CHES Fisher Bioreagents BP318-100 Optimal buffer used for paraoxon degredation (pH > 8).
Paraoxon Chem Service N-12816 Very toxic substance to be handled carefully and disposed of properly.  
Syringe Filter 0.45 µm Thermo Scientific 60183-221 (30 mm) Filter diameter will depend on volume of sample. Low protein binding membrane is critical.
Shaker incubator New Brunswick Excella E24 Precise temperature and mixing is essential for reproducable bacterial growth. 
Sorvall Culture Centrifuge Thermo Scientific RC 5B PLUS Large volume (500 ml) culture centrifuge capable of 7,000 x g.
Sorvall Ultracentrifuge  Thermo Scientific WX Ultra 90 Capable of centrifugal forces ≥150,000 x g.
Ultracentrifuge Rotor Thermo Scientific AH-629 Ensure the proper rotor and tubes are used and that everything is properly balanced.
Ultra-Clear Ultracentrifuge Tubes (25 x 89 mm) Beckman Coulter 344058 Ensure no stress fractures are present prior to use and that tubes are presicely balanced.
Spectrophotometer  Tecan Infinite M1000 Necessary for enzyme kinetic assays.
DLS/particle tracking NanoSight  LM10 Necessary for OMV size distribution and concentration determination.  
BL21(DE3) NEB Suitable bacterial expression strain.
pET22 EMD Millipore 69744-3 Other plasmids can be used in place of these.  
pACYC184 NEB Other plasmids can be used in place of these.  
Gel Extraction Kit Qiagen 28704 Example kit.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Avila-Calderon, E. D., et al. Roles of bacterial membrane vesicles. Arch. Microbiol. 197, 1-10 (2015).
  2. Kulp, A., Kuehn, M. J. Biological functions and biogenesis of secreted bacterial outer membrane vesicles. Annu. Rev. Microbiol. 64, 163-184 (2010).
  3. Beveridge, T. Structures of Gram negative cell walls and their derived membrane vesicles. J. Bacteriol. 181, 4725-4733 (1999).
  4. Kulkarni, H. M., Jagannadham, M. V. Biogenesis and multifaceted roles of outer membrane vesicles from Gram-negative bacteria. Microbiology. 160, 2109-2121 (2014).
  5. Ellis, T. N., Kuehn, M. J. Virulence and immunomodulatory roles of bacterial outer membrane vesicles. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 74, 81-94 (2010).
  6. Berleman, J., Auer, M. The role of bacterial outer membrane vesicles for intra- and interspecies delivery. Environ. Microbiol. 15, 347-354 (2013).
  7. Alves, N. J., et al. Bacterial nanobioreactors-directing enzyme packaging into bacterial outer membrane vesicles. ACS Appl. Mater. Interfaces. 7, 24963-24972 (2015).
  8. Kim, J. Y., et al. Engineered bacterial outer membrane vesicles with enhanced functionality. J. Mol. Biol. 380, 51-66 (2008).
  9. Haurat, M. F., et al. Selective sorting of cargo proteins into bacterial membrane vesicles. J. Biol. Chem. 286, 1269-1276 (2011).
  10. Kesty, N. C., Kuehn, M. J. Incorporation of heterologous outer membrane and periplasmic proteins into Escherichia coli outer membrane vesicles. J. Biol. Chem. 279, 2069-2076 (2003).
  11. Zakeri, B., et al. Peptide tag forming a rapid covalent bond to a protein, through engineering a bacterial adhesion. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109, e690-e697 (2012).
  12. Li, L., Fierer, J. O., Rapoport, T. A., Howarth, M. Structural analysis and optimization of the covalent association between SpyCatcher and a peptide tag. J. Mol. Biol. 426, 309-317 (2014).
  13. Dumas, D. P., Durst, H. D., Landis, W. G., Raushel, F. M., Wild, J. R. Inactivation of organophosphorus nerve agents by the phophotriesterase from Pseudomonas-Diminuta. Arch. Biochem. Biophys. 277, 155-159 (1990).
  14. Bigley, A. N., Raushel, F. M. Catalytic mechanisms for phosphotriesterases. Biochimica et Biochim. Biophys. Acta, Proteins Proteomics. 1834, 443-453 (2013).
  15. Minton, N. A., Murray, V. S. G. A review of organo-phosphate poisoning. Med. Toxicol. Adverse Drug Exper. 3, 350-375 (1988).
  16. Bigley, A. N., Xu, C., Henderson, T. J., Harvey, S. P., Raushel, F. M. Enzymatic neutralization of the chemical warfare agent VX: Evolution of phosphotriesterase for phosphorothiolate hydrolysis. J. Am. Chem. Soc. 135, 10426-10432 (2013).
  17. Chatterjee, S. N., Chaudhuri, K. Gram-negative bacteria: the cell membranes. Outer Membrane Vesicles of Bacteria. SpringerBriefs in Microbiology. , 15-34 (2012).
  18. Wang, Y. The function of OmpA in Escherichia coli. Biochem. Biophys. Res. Commun. 292, 396-401 (2002).
  19. Danoff, E. J., Fleming, K. G. The soluble, periplasmic domain of OmpA folds as an independent unit and displays chaperone activity by reducing the self-association propensity of the unfolded OmpA transmembrane beta-barrel. Biophys. Chem. 159, 194-204 (2011).
  20. Alves, N. J., Kline, J. A. Comparative study on the inhibition of plasmin and delta-plasmin via benzamidine derivatives. Biochem. Biophys. Res. Commun. 457, 358-362 (2015).
  21. Wang, W. Lyophilization and development of solid protein pharmaceuticals. Int. J. Pharm. 203, 1-60 (2000).
  22. Goormaghtigh, E., Scarborough, G. A. Density-based separation of liposomes by glycerol gradient centrifugation. Anal. Biochem. 159, 122-131 (1986).
  23. Alves, N. J., et al. Functionalized liposome purification via Liposome Extruder Purification (LEP). Analyst. 138, 4746-4751 (2013).
  24. Mayer, L. D., StOnge, G. Determination of free and liposome-associated doxorubicin and vincristine levels in plasma under equilibrium conditions employing ultrafiltration techniques. Anal. Biochem. 232, 149-157 (1995).
  25. Blakeley, B. D., Chapman, A. M., McNaughton, B. R. Split-superpositive GFP reassembly is a fast, efficient, and robust method for detecting protein-protein interactions in vivo. Mol. BioSyst. 8 (2036), (2012).
  26. De Crescenzo, G., Litowski, J. R., Hodges, R. S., O'Connor-McCourt, M. D. Real-time monitoring of the interacation of two-stranded de novo designed coiled-coils: effect of chain length on the kinetic and thermodynamic constants of binding. Biochemistry. 42, 1754-1763 (2003).
  27. Charalambous, A., Antoniades, I., Christodoulou, N., Skourides, P. A. Split-Intein for simultaneous site-specific conjugation of quantum dots to multiple protein targets in vivo. J. Nanobiotechnol. 9, 1-14 (2011).
  28. Lee, E. Y., et al. Global proteomic profiling of native outer membrane vesicles derived fromEscherichia coli. Proteomics. 7, 3143-3153 (2007).
  29. Alves, N. J., Turner, K. B., Medintz, I. L., Walper, S. A. Protecting enzymatic function through directed packaging into bacterial outer membrane vesicles. Sci. Rep. 6, 24866 (2016).
  30. Alves, N. J., Turner, K. B., Medintz, I. L., Walper, S. A. Emerging therapeutic delivery capabilities and challenges utilizing enzyme/protein packaged bacterial vesicles. Ther. Delivery. 6, 873-887 (2015).

Tags

الكيمياء الحيوية، العدد 117، حويصلات الغشاء الخارجي (OMV)، وتنقية وتعبئة موجهة، الانزيم،
توجه التغليف البروتين داخل الخارجي غشاء الحويصلات من<em&gt; كولاي</em&gt;: تصميم وإنتاج وتنقية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Alves, N. J., Turner, K. B., Walper, … More

Alves, N. J., Turner, K. B., Walper, S. A. Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification. J. Vis. Exp. (117), e54458, doi:10.3791/54458 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter