Abstract
Увеличивается интерес к применению методик синтеза биологии для программирования везикул наружной мембраны (OMV) приводят к очень интересным и уникальных приложений для OMV, где традиционные наночастицы оказываются слишком трудно синтезировать. На сегодняшний день все грамотрицательные бактерии, как было показано, чтобы произвести OMV, демонстрирующих упаковки разнообразных грузов, который включает небольшие молекулы, пептиды, белки и генетический материал. На основании их разнообразных грузов, OMV, участвуют во многих биологических процессах, начиная от межклеточной связи для переноса генов и доставки факторов вирулентности, в зависимости от которых бактерии производить OMV. Только в последнее время бактериальные OMV становятся доступными для использования в широком диапазоне применений путем разработки методов контроля и прямой упаковки рекомбинантных белков в OMV. Этот протокол описывает способ производства, очистки и использования фермента упаковывают OMV, предусматривающий улучшена Overaпроизводство Л.Л. рекомбинантного фермента, повышенной везикуляцией и повышенной стабильности фермента. Успешное использование этого протокола приведет к созданию бактериального штамма, который одновременно производит рекомбинантный белок и направляет его для OMV капсулирования путем создания синтетической связи между рекомбинантным белком и белком наружной мембраны в анкерной. Этот протокол также подробно методы выделения OMV из бактериальных культур, а также надлежащих методов обработки и вещей, которые следует учитывать при адаптации этого протокола для использования для других уникальных приложений, таких как: фармацевтическая доставки лекарственных средств, медицинской диагностике и восстановлению окружающей среды.
Introduction
Представленный здесь метод для проектирования, производства и очистки ферментных загруженным бактериальных везикул наружной мембраны (OMV). OMV невелики, в первую очередь однослойными, протеолипосомы , которые варьируются в размерах от 30-200 нм 1,2. Все грамотрицательных и грамположительных бактерий , которые были изучены на сегодняшний день продемонстрировали выпуск либо OMV или внеклеточного везикул (EV) с их поверхности 3,4. Точный механизм, с помощью которого производится OMV, еще не выяснена из-за разнообразных популяций бактерий, которые секретируют их, а также различные функции, которые они обслуживают. OMV было показано для транспортировки широкого спектра грузов из малых молекул, пептидов и белков генетического материала , где подают разнообразные сложные сигнализации, транслокации генов и вирулентности функции 5,6.
Точные механизмы OMV биогенезе не хорошо охарактеризованы, и, по всей видимости различаются между видами бактерий. Несмотря на Тхиs факт, мы разработали метод для повышения эффективности упаковки рекомбинантного белка в OMV, создавая искусственную связь между интересующим белком и весьма распространенный белок эндогенными по отношению к бактериальной внешней мембране и последующей OMV. При отсутствии синтетического связывания, или искусственно включенной сродства между рекомбинантно экспрессировать белок и OMV наблюдаемая эффективность упаковки очень низкая 7. Этот результат следует ожидать, как включение белков внутри OMV либо происходит через случайный шанс инкапсуляцией именно в тот момент формирования OMV на бактериальной поверхности, или с помощью направленной упаковки с помощью механизмов, недостаточно хорошо изучены. Некоторые успехи были отмечены в упаковки белки просто через более чем выражение в периплазматическое пространство, которое опирается на случайный шанс инкапсуляция, но эффективной упаковки очень белков зависит с некоторыми белками упаковка на высокую эффективность по сравнению с другими мна не пакет вообще 8-10. Используя общие методы синтетической биологии мы стремились инженер кишечной палочки (E.coli) , чтобы одновременно производить, упаковки и секретировать активный интерес фермент в OMV , который обходит существующие ограничения знаний относительно того, как формируются OMV и как груз выбирается для бактерий упаковка.
Для целей настоящего приложения сплит-системы белка биоконъюгации была выбрана в качестве синтетического увязка выбора для облегчения направленного упаковки в OMV. Как следует из названия сплит-системы белка биоконъюгации состоит из двух дополняющих друг друга областей субъединиц, которые взаимодействуют друг с другом. Раскол белковые домены , выбранные для целей настоящего протокола упоминаются как SpyCatcher (SC) и SpyTag (ST) области и являются производными от Streptococcus Пирролидонилпептидаза фибронектин-связывающего белка (FbaB) 11. Эта система сплит белок является необычным в том, что WКурица двух субъединиц находятся в пределах досягаемости isopeptide связь спонтанно образует между проксимальным аспарагиновой кислоты и лизина аминокислотных остатков, создающих ковалентной связи. Формирование Isopeptide связь не требует добавления белков - шаперонов, каталитические ферменты или кофакторов , и может легко происходить при комнатной температуре (RT) и в широком диапазоне физиологически соответствующих условий 12.
Как доказательство концепции, была выбрана phosphotriesterase (PTE) (EC 3.1.8.1) от Brevundimonas diminuta быть упакованы в E.coli , полученный OMV 13. PTE содержит двухъядерный активный сайт Zn / Zn и обладает способностью расщеплять органофосфаты посредством реакции гидролиза конвертерной aryldialkylphosphates в dialkylphosphates и арильных спиртов 14. Воздействие органофосфатам ослабляет надлежащую функцию медиатора через ингибирования гидролиза ацетилхолина ацетилхолинэстеразы в нервно-мышечных синапсах Макинг фосфорорганические соединения , полученные чрезвычайно опасные 15. Длительное или значительное воздействие органофосфатам обычно приводит к неконтролируемым судорогам и обычно приводит к смерти через асфиксию. В то время как ПТЭ демонстрирует самую высокую каталитическую активность по отношению к параоксон, очень мощный инсектицид, он также способен гидролизовать широкий спектр других пестицидов и V / тип G химические нервно - паралитических веществ 16. Для облегчения OMV упаковки, бактериальной плазмиды была разработана, который кодирует ген конструкцию, содержащую индуцируемый промотор, периплазматического последовательность локализации и короткий сайт множественного клонирования выше последовательности гена СК. Введение гена PTE между лидерной последовательностью и последовательностью SC позволило для создания генетического переключателя, мишенью которого слитый белок ПТЭ-SC в периплазматическое пространство для OMV упаковки. Хотя усилия, описанные здесь, сосредоточены на ПТЭ, ген фермента является взаимозаменяемым и может быть легко заменена другой последовательностью гена к FACilitate упаковка альтернативного фермента или белка.
В качестве второй части синтетической связи, обильное белок наружной мембраны (OmpA) выбирают так, чтобы представить пептидную последовательность ST. В то время как выбор анкерной белка может варьироваться, важно, что белок имеет разрешающий домен, который представляет в периплазматическом пространстве, переносит слитой конструкции без индукции цитотоксичности, как известно, присутствует в OMV, и не агрегирует, когда она является рекомбинантным производится. OmpA является 37,2 кДа трансмембранный порин белок , который , как известно, высоко выражена в бактериальной внешней мембране и последующего OMV 17. Он участвует в транспорте малых молекул, <2 нм в размере, по всей бактериальной мембраны 18. Родной OmpA имеет два структурно уникальные домены, трансмембранный бета ствол мотив и periplasmically растворимый С-концевой части , как известно, взаимодействуют с пептидогликана 19. В мутантного OmpA-ST слитого Designed здесь С-концевую часть OmpA был удален, а ST был слит с periplasmically обращенной N- или С-концами. Удаление периплазматическому часть OmpA уменьшает количество взаимодействий между наружной мембраной и пептидогликана , что приводит к дестабилизации мембраны , приводящей к гипер- везикуляцией 7. Геномные OmpA поддерживалось в дополнение к рекомбинантно экспрессировать OmpA-ST конструкции для смягчения грубой мембранной дестабилизацию.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Получение плазмид
- Приготовьте плазмиды (например, pET22) , содержащий белок якорный (ОмПО) , слитый с биортогональнои области связей (называемый в этом протоколе в качестве якорного-ST), эпитоп тег (например, 6xHis, Myc или FLAG тегов для очистки и идентификации), периплазматический локализация тег, устойчивость к антибиотикам, и соответствующая точка начала репликации на основе выбранного бактериального штамма 7.
- Экстракт плазмидной ДНК из ночных культур с использованием коммерчески доступного набора для выделения ДНК в соответствии с протоколом производителя.
- Приготовьте плазмиды (например, pACYC184) , содержащий фермент / белок (PTE) , чтобы быть упакована в OMV , слитого с комплементарной bioorthogonal области связей с что белка якоря (называемый в этом протоколе в качестве фермента-SC), эпитоп тег, периплазматический локализация тег, устойчивость к антибиотикам, который отличается от плазмиды белка якоря, и соответствующий оригв репликации на основе выбранного бактериального штамма 7.
- Экстракт плазмидной ДНК из ночных культур с использованием коммерчески доступного набора для выделения ДНК в соответствии с протоколом производителя 7.
2. Генерация OMV Packaging кишечной палочки культуры
- Выделение плазмидной
- Очищают плазмиды , кодирующие фермент-SC построить и якорь-СТ конструкции из отдельных линий обслуживания клеток с использованием коммерческого набора плазмида разъединение согласно протоколу производителя 7. Определить концентрацию ДНК и чистоту путем измерения оптической плотности при 260 нм и 280 нм.
- Co-преобразование
- Выберите штамм E.coli , который является коммерчески доступным , чтобы облегчить экспрессию белка.
Примечание: BL21 были использованы здесь (DE3). Т7 lysogen необходим для экспрессии конструкции якоря-ST, которая опирается на промотор фага Т7 и РНК-полимеразы Т7 для PROTвыражение Эйн. Использование других бактериальных штаммов , требует либо наличия гена lysogen Т7 или использование плазмиды, кроме pET22 7. - Развести плазмидной ДНК в эквивалентных молярных концентрациях затем превратить их в компетентные бактериальные клетки либо через теплового шока трансформации или электропорации в соответствии с протоколом производителя для компетентных клеток выбранных.
- Пластинчатые трансформированные клетки на содержащий антибиотик Лурия-Бертани (LB) агаром с обоими ампициллин (pET22) и хлорамфеникол (pACYC184); оба присутствуют в конечных концентрациях 25 мкг / мл.
- Место культуры блюдо при температуре 37 ° С в течение ночи, чтобы изолировать только клоны, содержащие обе плазмиды.
ПРИМЕЧАНИЕ: Колонии, которые выживают выбор антибиотик будет использоваться для всех будущих препаратов OMV. Антибиотики (ампициллин и хлорамфеникол) будут добавлены ко всем жидких культур для поддержания давления отбора и обеспечить присутствие обеих плазмид.
- Выберите штамм E.coli , который является коммерчески доступным , чтобы облегчить экспрессию белка.
3. OMV Производство
- Colony Expansion
- Инокулируйте 5 мл культуральной среды (обычно Потрясающе Бульон (ТБ) или LB), содержащей антибиотики, в указанных концентрациях (этап 2.2.3) с одной колонии из пластин отбора, описанных в 2.2.4.
- Выполните 1: кратное разведение ночной культуры стартера 100 в культуральных колбах с перегородками.
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте объем носителя между 250-500 мл. - Поддержание культуры при 37 ° С качалке при 250 оборотах в минуту, чтобы обеспечить наличие достаточного количества аэрацию культуры достигается.
- Индукция каждую из плазмид
- Дайте бактериальную культуру расти до OD 600 0,6-0,8, примерно 3 ч роста после инокуляции первичной колбы роста.
- Для улучшения конечного выхода ПТЭ-SC нагруженных везикул, центрифугировать всю культуру при 7000 х г в течение 15 мин. Ресуспендируют осадок клеток в подогретого, свежей культуральной среды.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это неавтоматическогоРациональная шаг помогает удалить любую пустую OMV, которые присутствуют в культуральной среде до индукции PTE-SC. - Сделать 20% исходного раствора L-арабинозы в воде и стерильный фильтр, используя фильтр 0,22 мкм. Хранить раствор L-арабинозы при температуре 4 ° С в течение 2-4 недель.
- Добавляют L-арабинозы раствор в колбу культуры до конечной концентрации 0,2% для начала производства ПТЭ-SC.
Примечание: Это помогает предварительно загрузить периплазмическое пространство с PTE-SC до содействия повышению везикул через индукцию мутанта OmpA-ST. - Сделать раствор 1 М изопропиловый β-D-1-тиогалактопиранозида (IPTG) в воде и стерильный фильтр с использованием фильтра 0,22 мкм.
Примечание: IPTG должен быть использован сразу же после увлажненной. Аликвоты IPTG можно хранить в замороженном виде в течение 3-6 месяцев и могут быть разморожены непосредственно перед использованием. - Добавить IPTG после дополнительного 3 ч инкубационного периода до конечной концентрации 0,5 мМ, чтобы начать производство OmpA-ST.
- Разрешить кульратура расти еще в течение 8-14 ч при температуре 37 ° C при встряхивании.
4. OMV Очистка
- Удаление интактных бактерий
- Центрифуга бактериальной культуральной среды в течение 15 мин при 7000 х г при температуре 4 ° С до гранул неповрежденных бактерий.
- Слить и сохранить, средства массовой информации от верхней части столба центрифугирования осадок клеток, следя, чтобы не мешать осадок клеток.
- Повторите шаги 4.1.1 и 4.1.2 для одного дополнительного центрифугирование цикла, чтобы гарантировать, что все неповрежденные бактерии удаляются из средств массовой культуры будучи уверенным, что переливать и сохранить средства массовой информации.
- Удаление белковых агрегатов
- Далее очищают бактериальной культуральной среды с использованием мембраны 0,45 мкм фильтр для удаления остаточных бактерий и нежелательную большого клеточного материала.
Примечание: С помощью биологически совместимого материала мембраны для более высоких подъемов и более низкой адсорбции белка, такие как ацетат целлюлозы (СА) или поливинилидендифторидную (ПВДФ). Шприц объемы фильтра менее чем за 100 мл и объем вакуум-фильтра превышает 100 мл.- Для того, чтобы шприцевой фильтр, рисовать культуральной среды в стерильный шприц 10-50 мл. Приложить фильтр 0,45 мкм до Luer конца шприца. Выжмите поршень и собирать проточного в новый сосуд.
- Для вакуум-фильтр, передача культуральной среды в стерильную фильтрационного аппарата. Присоединить устройство к вакуумному насосу или тонуть аспиратор для создания всасывания. Передача фильтруемой среды в новый сосуд.
- Далее очищают бактериальной культуральной среды с использованием мембраны 0,45 мкм фильтр для удаления остаточных бактерий и нежелательную большого клеточного материала.
- Выделение OMV с помощью ультрацентрифугирования
- Добавьте отфильтрованной культуральной среды в центрифужные пробирки соблюдая осторожность, чтобы сбалансировать противодействующие труб в центрифуге.
- Гранула при ~ 150000 х г в течение 3 ч при температуре 4 ° С в ультрацентрифуге, используя соответствующий ротор, соответствующий как инструмент и трубы время используются.
- Слейте OMV обедненный культуральной среды из гранул OMV, стараясь не потревожить осадок OMV, сразу по завершении Oе, как центрифугирование позволяет осадок OMV оставаться в СМИ смягчит осадок уменьшая восстановление OMV.
Примечание: Этот осадок будет слегка коричневого цвета и в зависимости от исходного количества бактериальной культуры могут или не могут быть видны невооруженным глазом. Аспирационных медиа непосредственно из верхней части трубки центрифугирование также вариант имея в виду, что чем больше средств массовой информации, удаленные из OMV Гранул более чистый конечный образец OMV будет. - Сохраните центрифугированию супернатант для последующего динамического рассеяния света (DLS) тестирование, чтобы убедиться, что частицы OMV были полностью истощены из средств массовой информации.
- Добавить 0,5-1 мл стерильного профильтрованного забуференный фосфатом физиологический раствор (PBS) , рН 7,4 , или 100 мМ N-2 циклогексилметанона-аминоэтансульфоновая кислоты (CHES) буфера при рН 8,0 , к осадку OMV позволяет ему инкубировать в течение 30 мин при комнатной температуре. Убедитесь в том, что осадок не сушит.
Примечание: Крайности в ионной силы раствора, рН и температуры может привести к снижению растворимости OMV и содействовать агрегированномдование. - Тщательно пипеткой очищенный раствор OMV из центрифуги трубки, смешивая осторожно, чтобы гарантировать, весь осадок был подвергнут солюбилизации.
5. Характеристика OMV
- Используйте любой имеющийся в продаже DLS или отслеживания программного обеспечения наночастицами следующие протоколы прилагаемого производителя, уникальные для каждого инструмента, чтобы определить распределение размера OMV и концентрации частиц.
Примечание: Здесь, OMV распределение по размерам и концентрацию определяли с использованием NanoSight LM10 наночастицу слежения и NTA 2.3 программного обеспечения для анализа.- Откройте программное обеспечение.
- Включите микроскоп и очистить все поверхности на микроскоп и слежения за наночастицами блока.
- Добавить ~ 0,5 мл OMV образца непосредственно в окне просмотра устройства слежения частиц через Luer фитинга с 1 мл стерильного шприца будучи уверенным, чтобы покрыть всю смотровое окно без инжекции пузырьков воздуха в систему.
- Место тон наночастицу устройство слежения на столике микроскопа и включите лазер.
- Нажмите кнопку "Capture" в программном обеспечении.
- Отрегулируйте фокус микроскопа и стадии визуализации частиц на экране предварительного просмотра, присутствующего в окне программы.
- Отрегулируйте "затвора камеры" и "усиление камеры" до тех пор, яркие частицы четко не визуализируется на темном фоне.
- Отрегулируйте продолжительность захвата до 60 сек.
- Нажмите кнопку "Запись".
- При появлении запроса, введите температуру / устройства образца, метка образца, а также сохранять видеоданные при завершении из каждого запуска в папку назначенный пользователем.
- Держите все параметры анализа (определение порога, размытие, Минимальная длина дорожки, Мин ожидаемый размер частиц) на режиме автоматического обнаружения и нажмите "Последовательность процесса."
Примечание: Обратитесь к руководству для того, как каждый параметр можно регулировать независимо друг от друга, чтобы прекрасные результаты анализа настроиться. - частиц Запись и распределение по размерам частиц / мл концентрация, как определено с помощью программного обеспечения.
Примечание: Типичная OMV гидродинамическая диапазон размеров между 30-200 нм с концентрацией частиц / мл ~ 10 х 10 8.
- Определение содержания белка OMV
- Используйте стандартный SDS-PAGE и западные протоколы блоттинга для оценки чистоты OMV, выработку ферментов, и эффективность сшивания SC-ST 7.
Примечание: Сшивание эффективность не будет 100% 7.
- Используйте стандартный SDS-PAGE и западные протоколы блоттинга для оценки чистоты OMV, выработку ферментов, и эффективность сшивания SC-ST 7.
6. Проверка ферментного упаковки
- PTE Анализ активности
- Выполнение всех ферментативных анализов в подходящем буфере, таком, как 100 мМ CHES буфере (рН = 8) при 25 ° С либо в кювете или уплотненных в 96/384 луночный планшет.
- Добавьте 5 мкл 1: 1000 разбавлении параоксон в буфере CHES до 90 мкл Чеса и 5 мкл очищенного OMV (~ 36-кратно концентрированной по сравнению с концентрацией OMV, присутствующей в культуральной среде).
Внимание: параоксон является токсичным пестицидаи должны быть обработаны на производителей и институциональных принципов. - Возьмите показания оптической плотности через равные промежутки времени (каждые 20 сек в течение ~ 2 ч общего времени реакции) при 405 нм (е = 18,1 мМ -1 см -1) и при 348 нм (изосбестической е = 5,4 мМ -1 см -1) до наблюдения за развитием реакции хромогенного параоксон продукта распада, р -nitrophenol.
Примечание: При значениях рН выше 8 доминирующий депротонированная форма р -nitrophenol присутствует что позволяет для точного контроля при 405 нм. Во всех других решений сложных или более низком рН, необходимо использовать изосбестической 348 нм , как и множественные формы р -nitrophenol будет присутствовать. - Вычислить начальные скорости реакции путем определения наклона линейной части кривых прогресса от шага 6.1.3 сравнить относительное количество PTE в каждом образце, эффективности упаковки, а также общий объем производства PTE.
- Выполните стандартную ферментативныхпротоколы анализа для определения K M, V макс и к кот для OMV инкапсулированные PTE.
Примечание: Анализ Лайнуивера-Берка могут быть использованы для определения этих кинетических параметров , где Y-перехватывают = 1 / V макс и наклон = К М / В макс 20.
- Трансмембранного субстрата / Диффузия продукта.
- Выполните ту же кинетическую пробирного анализа, как описано на стадии 6.1 с использованием возрастающих концентраций Тритон Х-100 в буфере CHES 0-3% по объему.
Примечание: Добавление Тритон Х-100 до солюбилизированных функций OMV нарушить липидный бислой, допускающие содержание OMV быть свободно доступны к реакционному раствору. - Вычислить и сравнить начальные скорости на каждом уровне Triton X-100, чтобы проверить, трансмембранный прохождение субстрата / продукта, указанного минимального изменения ферментативной активности (начальные скорости) по сравнению с ферментативной активности Iп отсутствие Тритона Х-100. Если существенное увеличение ферментативной активности наблюдается в присутствии Тритона Х-100, вероятно, что субстрат не свободно диффундировать в OMV.
- Анализ активности свободного фермента (как описано выше в разделе 6.1) в присутствии Тритона Х-100, чтобы проверить, что активность фермента не ингибируется самого поверхностно-активного вещества.
Примечание: Если активность сильно влияние Triton X-100, альтернативных добавок, таких как сапонины или различные полисорбат / твин поверхностно-активные вещества могут быть более подходящими для разрыва мембраны OMV.
- Выполните ту же кинетическую пробирного анализа, как описано на стадии 6.1 с использованием возрастающих концентраций Тритон Х-100 в буфере CHES 0-3% по объему.
7. OMV хранения
- Замораживание
- Место ~ 100 мкл аликвоты очищенного OMV непосредственно в жидкий азот, чтобы заморозить оснастке аликвот будучи уверенным, что не в полной мере погрузить ампул или связаться с любым жидким азотом с самого образца.
Примечание: Очищенная OMV может быть замораживали непосредственно в буфер, который был выбран для солюбилизации осадка OMV во время purificatионный процесс без каких - либо дополнительных криопротекторами необходимых 7. - Храните замораживали аликвотах при -80 ° С.
- Размораживайте аликвот из стадии 7.1.1, помещая их на RT будучи уверенным, чтобы не нагревать образцы.
- До подготовки всех образцов для хранения таким образом, выполнить ферментного анализа, описанного на шаге 6.1 сравнения начальных скоростей до и после замораживания, чтобы убедиться в том, что нет существенной потери ферментативной активности пост замораживания-оттаивания.
Примечание: Хранить очищенный OMV при 4 ° С, если снижение активности фермента наблюдается при замерзании.
- Место ~ 100 мкл аликвоты очищенного OMV непосредственно в жидкий азот, чтобы заморозить оснастке аликвот будучи уверенным, что не в полной мере погрузить ампул или связаться с любым жидким азотом с самого образца.
- лиофилизация
- Лиофилизации замораживали очищенные аликвот OMV , использующие коммерчески доступного лиофилизации оборудование 21.
- Хранить лиофилизируют аликвот при комнатной температуре в течение нескольких недель или при температуре -80 ° С в течение многих месяцев.
- Добавьте тот же объем очищенной воды к лиофилизированной OMV как до лиофилизации и выдержать при комнатной температуре в течение 30 мин до регидратации тон образец. Осторожно перемешать, при необходимости будучи уверенным, что не вихревым или разрушать ультразвуком OMV.
- Добавить лиофилизированный порошок OMV непосредственно в пункт-ухода для применений, где до разбавления / солюбилизации не является необходимым.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Одновременная экспрессия двух рекомбинантных белков, как это требуется для упаковочной стратегии OMV, рассмотренное в данном протоколе, может быть достигнуто с помощью ряда различных путей. Здесь два вектора система была использована с совместимыми начала репликации и отдельных индуцируемых генов кассет. Для экспрессии PTE-SC построить коммерческую плазмиды основу (pACY184) был разработан, чтобы включать арабинозы индуцируемый ген кассету и двойник аргинином периплазмической лидерной локализации следует ряд уникальных сайтов рестрикции для облегчения клонирования гена фермента в качестве слитый с белком-SC с-концевым. Плазмидной конструкции , кодирующей белок наружной мембраны якорь является коммерческим вектор pET22 который использует LAC оперон для контроля экспрессии белка и последовательности периплазматический локализации pelB. Короткая последовательность ST был клонирован в усеченном OmpA протеина до начала InSertion в экспрессирующую плазмиду. В обоих плазмид, С-концевую последовательность гексагистидиновый поддерживалось для обеспечения одновременной идентификации слитых белков в образцах OMV. Построение и характеристика этих генных конструкций, в том числе как на N- и С - концевой ST слитых конструкций до OmpA, полностью описаны в разделе Alves и соавт. 7. Конструкции гена, описанные здесь, могут не быть благоприятной для упаковки всех ферментов. В некоторых случаях может возникнуть необходимость изменить периплазматическому сигнала локализации, регуляторные элементы, или теги эпитоп. Кроме того, некоторые белки могут быть непомерно большим и не поперечному внутреннюю мембрану в целом. Ферментативная активность и эффективность упаковки OMV не может быть определено априори , и необходимо будет определить эмпирически для каждого белка - мишени.
Ниже приведены результаты, которые можно было бы обычно ожидать после успешного проведения Oут этот протокол. В комплект входит схема двух / SC расщепленных белковых доменов ST, OmpA-ST и PTE-SC слитых конструкций, а также пример isopeptide образования при бактериальной внешней мембране и последующее герметизация PTE-SC в рамках OMV (Рисунок 1) , Также включены показательные результаты очищенного морфологии OMV через SEM, а также распределение по размерам и абсолютная концентрация OMV определяется с помощью программного обеспечения отслеживания частиц (Рисунок 2). Дальнейшая характеристика содержания белка OMV и экспрессии рекомбинантного белка наблюдаются с помощью SDS-PAGE и Вестерн - блоттинга (рисунок 3). Молекулярные массы белков, представляющих интерес применительно к Протоколу, приведенные здесь следующим образом: родной OmpA (37,2 кДа), OmpA-ST (23 кДа), PTE-SC (51 кДа), OmpA-ST / PTE-SC (74 кДа) , Очищенная OMV должна иметь темно-диапазоне на частоте примерно 37 кДа, что свидетельствует о весьма обильной нативной OmpA. В зависимости от разрешения геля может быть несколько баНСР присутствует в этой области геля как OmpA, OmpF и ОМРС все относительно в изобилии и разделяют подобную молекулярную массу. Дополнительная полоса , которая составляет 2,2 кД больше , чем OmpA-СТ может быть также наблюдается из - за неправильной отщепления лидерной последовательности в результате подавляющий палочка экспрессии машины E.. Важно отметить, что успешно очищенный образец OMV не будет иметь много других с высоким уровнем экспрессии белков. Если другие группы присутствуют либо очистку проводили ненадлежащим образом или бактерии штамма время используются , могут быть упаковки других белков , не наблюдаемые в этой кишечной палочки BL21 (DE3) штамм.
Кроме того, анализы активности и эксперименты пузырек разрыва были предоставлены , чтобы продемонстрировать репрезентативные результаты , которые можно было бы ожидать , если ферментативный субстрат может свободно входить в OMV через трансмембранных пориновых белков (рисунок 4). Параоксон относительно свободно входит вOMV через эндогенных трансмембранных белков пориновых реагировать с упакованным ПТЭ и продукта реакции, р -nitrophenol, также проходит относительно свободно через мембрану OMV. Это явление не будет повсеместным среди всех продуктов, субстрат, и наборы ферментов и должны быть определены экспериментально. Хотя успешный разрыв OMV и высвобождение фермента был замечен с низкой концентрацией моющего средства и PTE (далее Тритон Х-100), такие добавки могут влиять на активность других ферментов.
Плазмидные карты также были включены , чтобы продемонстрировать дизайн стратегии упаковки двух плазмид , использующей SC / ST системы (рисунок 5).
Рисунок 1: Направленный упаковки белков в OMV. Кристаллические структуры для белков, используемых в описанной OMV упаковки Стратокастеретегии: OmpA, ПТЭ, SpyTag (ST) и SpyCatcher (SC); PDB: 2GE4, 1PTA, 4MLI, 4MLI соответственно. Схематическое представление слитых конструкций OmpA-ST и ПТЭ-SC, образующих isopeptide связь на наружной мембране бактерий показана. Эта мембрана слитый гонит инкорпорацию PTE внутри образующего OMV. Рисунок воспроизведен (адаптировано) из Алвес и др. ACS Appl Mat Интерфейсы (2015), 7 (44), с 24,963-24,972 7. Copyright 2015 American Chemical Society. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2: OMV характеристика. (А) СЭМ ультрацентрифуге очищенный OMV из нативных E.coli , [BL21 (DE3)]. (B) Представитель ПРОФ частиц Король распределения по размерам и (C) общая концентрация везикул в среднем более 90 сек образец читает для Native OMV, ПТЭ-SC в отсутствие активации арабинозы (PTE-No A), PTE-SC в присутствии активации арабинозы (PTE-A) N-терминал OmpA-СТ котрансформированы с PTE-SC в присутствии арабинозы и активации IPTG (PTE / OMV-N), а также ультрацентрифуге супернатант (UC надосадочной жидкости). Значительное увеличение производства OMV наблюдалось в образце PTE / OMV-N по сравнению с нативным OMV и PTE-SC строит в одиночку. OMV были количественно определены в супернатанте UC продемонстрировать почти полное восстановление OMV в осадке UC оставляя практически не OMV в надосадочную пост ультрацентрифугирования. Все данные представляют собой среднее (± стандартное отклонение) трех параллельных экспериментов. Рисунок воспроизведен (адаптировано) из Алвес и др. ACS Appl Mat Интерфейсы (2015), 7 (44), с 24,963-24,972 7. Copyright 2015 American Chemical Society.d / 54458 / 54458fig2large.jpg "целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3: Определение содержания белка Очищенный OMV. (А) SDS-PAGE очищенного OMV UC гранула С-концевого OmpA-ST слияния коэкспрессируются с PTE-SC (ПТЭ / OMV) построить демонстрирует представительную обилие OmpA-ST, Native OmpA, PTE-SC и OmpA- ST / PTE-SC isopeptide фьюжн. (Б) Вестерн - блот - анализ с использованием входящего в комплект его тег , присутствующий в OmpA и ПТЭ конструкции для облегчения визуализации с помощью анти-6xHis антитела. Важно отметить, что РТЕ известно димеризации, о чем свидетельствует по-блоттинга наличием большего молекулярного веса его-меченый видов. Даже несмотря на очень высокие уровни экспрессии OmpA-ST там наблюдается не полная конверсия бесплатноPTE-SC с мембраной OmpA-ST / PTE-SC. Несмотря на этот факт, увеличение общего объема производства PTE и повышения эффективности упаковки позволяют предположить, что в то время как образование ковалентных связей не является повсеместным нековалентной ассоциация ST и SC доменов является важным фактором направленной упаковки в рамках OMV. Рисунок воспроизведен (адаптировано) из Алвес и др. ACS Appl Mat Интерфейсы (2015), 7 (44), с 24,963-24,972 7. Copyright 2015 American Chemical Society. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 4: ПТЭ активность и упаковки характеристика. Уровни экспрессии (A) В целом ПТЭ и эффективность упаковки OMV определяется с помощью начальных измерений скорости с использованием пунктOxon в качестве хромогенного субстрата по сравнению PTE в клетке гранул, супернатант UC и очищенных гранул UC OMV. (В) данных , отображающих, демонстрирующих использование Triton X-100 (0,5%) , T100 , чтобы сорвать бислой OMV , позволяющий беспрепятственный доступ субстрата к OMV интерьера. При сравнении этих данных с целью анализов, проведенных в отсутствие T100 облегчает проверку транслокации субстрата через интактные бислоями OMV, если ферментные начальные скорости не изменяются. В случае параоксон было очень мало разницы активности наблюдается при наличии или отсутствии Т100, указывающего, что параоксон свободно проходит через эндогенные поры на OMV. (C) PTE-SC кинетическое подходят данные стандартной Михаэлиса-Ментен кинетики фермента уравнения для PTE / OMV-N и PTE-A. (D) Анализ Lineweaver-Берк используется для определения K M и K кат / К М (48, 4,4 х 10 7; 44 мкМ, 4,9 х10 7 сек -1 М -1 соответственно) демонстрируют сходные кинетические параметры ПТЭ литературе как нативного фермента (90 мкМ, 2,7 х 10 7 сек -1 М -1) с R 2 ≥ 0,999 во всех случаях. Все данные представляют собой среднее (± стандартное отклонение) трех параллельных экспериментов. Рисунок воспроизведен (адаптировано) из Алвес и др. ACS Appl Mat Интерфейсы (2015), 7 (44), с 24,963-24,972 7. Copyright 2015 American Chemical Society. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 5: Типичные плазмидные конструкции для примера системы , описанной здесь. SpyCatcher модифицированный фермент-SC (PTE-SC) плазмиду мишенью для инкапсулирования в рамках OMV (слева). SpyTag MODIFIED мембраны якорь-ST (OmpA-ST-N) плазмиду (справа). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Этот протокол функционирует с целью подтверждения представителя направленной упаковочной техники , в которой фермент интерес производится и упаковывается в OMV кишечной палочки. Как и в случае многих сложных методов существует множество областей, в которых протокол может быть изменен, чтобы приспособить для использования в различных уникальных приложений, некоторые из которых подробно описаны ниже. В то время как механизм OMV упаковки и фермента инкапсулирования могут быть адаптированы к конкретным потребностям Есть несколько шагов в рамках этого протокола, которые имеют решающее значение для его успеха. Первоначальное удаление неповрежденной бактерии и клеточного мусора имеет важное значение и будет влиять на все ниже по течению попытки количественному или анализа проб. Две последовательные стадии центрифугирования с последующей фильтрацией, как правило, достаточно, чтобы удалить эти примеси. Тем не менее, во всех уходу экземпляры должны быть приняты, когда декантации растворы после центрифугирования, чтобы свести к минимуму передачу загрязняющих веществ. Точно так же, окончательный OMV осадок оbtained следующие ультрацентрифугирования часто лишь слабо приклеивают к нижней части трубки центрифуги. В заключительной стадии, необходимо соблюдать осторожность при удалении отработанной культуральной среды, чтобы гарантировать, что осадок остается нетронутой в нижней части сосуда. В некоторых, например это может быть лучше, чтобы сохранить окончательный культуральной среды, пока после анализа проб с использованием DLS или отслеживания наночастицами устройства для обеспечения гранул OMV не был потерян в заключительных этапах протокола. Ниже приведены некоторые дополнительные проблемы, которые могут возникнуть как с этим конкретным протоколом и другие, которые с учетом конкретных потребностей исследователей.
Использование ПТЭ в этой системе обеспечивает отличную модель фермента инкапсуляцией для восстановления окружающей среды фосфорорганические загрязненных территорий с ПТЭ быть легко заменяемый с помощью альтернативного фермента или белка, представляющего интерес. Как описано здесь коэкспрессия PTE-SC с OmpA-ST привело к значительному увеличению общей PTE Expressiна, а также более высокие уровни производства пузырек с более PTE упакована в пузырьках по сравнению с ПТЭ и PTE-SC, выраженной в одиночку. За счет уменьшения количества взаимодействий между наружной мембраной и пептидогликана через С-концевой делецией OmpA гипер- везикуляцией достигается. Это обеспечивает легкий путь для бактерий, чтобы экспортировать рекомбинантный PTE который уменьшает токсические эффекты, которые часто наблюдаются в гиперэкспрессией неместных белков.
В то время как PTE могут быть легко заменены в этой модельной системе, важно отметить, что не все ферментные субстраты будут свободно проходить через бислой OMV, и поэтому крайне важно, чтобы каждый уникальный фермент и субстрат пара испытываться на индивидуальной основе. Даже если субстрат не проходит через мембрану эту технику все еще может быть использован для производства и упаковки фермента в OMV и добавление Triton X-100, или соответствующее альтернативное поверхностно-активное вещество, может быть добавлен при достаточном леVels к разрыву везикул непосредственно перед использованием.
При отсутствии экспрессии рекомбинантного белка и упаковки этот протокол может также служить в качестве основного способа OMV производства и очистки от различных видов бактерий. Альтернативные способы очистки OMV, такие как градиента плотности фракционирования 22, мембранной фильтрации 23 и ультрафильтрации 24, также существуют и могут быть более подходящие способы в зависимости от предполагаемого применения. Эти альтернативные методы очистки также могут быть легко дополнены в этом протоколе вместо ультрацентрифугирования грануляции из OMV для направленной упаковки белка в OMV путем использования биортогональнои синтетической связи.
Другие модификации могут быть сделаны для конкретной системы синтетического сцепления, используемого в данном протоколе, а также от выбранного мембранного белка привязывать. Существуют различные синтетические стратегии для сопряжения двух различных белковs в пределах биологической системы , которые включают в себя: расщепленные белки 25, петельная катушки 26 и раскол интеины 27, просто перечислить некоторые из них. Другие мембраносвязанными или трансмембранные белки , такие как OmpF и ОМРС, скорее всего , обеспечить подходящие ST сайтов модификации, а 28. В некоторых случаях это также может быть необходимо поменять местами ST и SC доменов помещая КА на крепежном белка и гораздо меньший ST на рекомбинантного фермента / белка. Есть также целый ряд различных стратегий по клонированию, которые могут быть реализованы здесь в том числе с использованием нескольких плазмид при тех же самых или различных индукционных систем, одна плазмида с несколькими белками закодирован, или даже с использованием гомологичных методов рекомбинации для включения всех или части выражения система в бактериальный геном.
Микроокружения OMV способствует стабилизации упакованного фермента снижения ферментативной инактивации, что обычно происходит при менее идеальной стОрейдж условия, морозостойкость и лиофилизации 29. Кроме того, ожидается, что OMV обеспечит значительно улучшенную устойчивость к протеолитическому расщеплению, поскольку бислой OMV будет функционировать в качестве физического барьера между активным ферментом и белков, присутствующих в пространстве экстра-OMV. Этот протокол может быть дополнительно расширен, чтобы включить на внешнюю сторону небольшую молекулу, пептид или белок тег для облегчения адресной доставки OMV инкапсулированных белков и аффинной очистки. В то время как PTE был выбран для этого уникального приложения результаты этого исследования, и содержание этого протокола, легко могут быть использованы для разработки аналогичных стратегий белка упаковки для использования в разнообразной фармацевтической доставки, медицинские диагностические и восстановлению окружающей среды , приложения 30.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| IPTG | Any | Always prepare fresh or aliquot and freeze. | |
| L-arabinose | Any | Can be prepared ahead of time and stored at 4 °C. | |
| Ampicillin | Any | Add immediately prior to use after media cools sufficiently from being autoclaved. | |
| Chloramphenicol | Any | Add immediately prior to use after media cools sufficiently from being autoclaved. | |
| TB/LB Culture Media | Any | Other growth medias will likely work similarly. | |
| Triton X-100 | Any | One of many potential suitable surfactants. | |
| Baffled culture flasks | Any | The baffles promote higher levels of aeration. | |
| CHES | Fisher Bioreagents | BP318-100 | Optimal buffer used for paraoxon degredation (pH > 8). |
| Paraoxon | Chem Service | N-12816 | Very toxic substance to be handled carefully and disposed of properly. |
| Syringe Filter 0.45 µm | Thermo Scientific | 60183-221 (30 mm) | Filter diameter will depend on volume of sample. Low protein binding membrane is critical. |
| Shaker incubator | New Brunswick | Excella E24 | Precise temperature and mixing is essential for reproducable bacterial growth. |
| Sorvall Culture Centrifuge | Thermo Scientific | RC 5B PLUS | Large volume (500 ml) culture centrifuge capable of 7,000 x g. |
| Sorvall Ultracentrifuge | Thermo Scientific | WX Ultra 90 | Capable of centrifugal forces ≥150,000 x g. |
| Ultracentrifuge Rotor | Thermo Scientific | AH-629 | Ensure the proper rotor and tubes are used and that everything is properly balanced. |
| Ultra-Clear Ultracentrifuge Tubes (25 x 89 mm) | Beckman Coulter | 344058 | Ensure no stress fractures are present prior to use and that tubes are presicely balanced. |
| Spectrophotometer | Tecan | Infinite M1000 | Necessary for enzyme kinetic assays. |
| DLS/particle tracking | NanoSight | LM10 | Necessary for OMV size distribution and concentration determination. |
| BL21(DE3) | NEB | Suitable bacterial expression strain. | |
| pET22 | EMD Millipore | 69744-3 | Other plasmids can be used in place of these. |
| pACYC184 | NEB | Other plasmids can be used in place of these. | |
| Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | Example kit. |
References
- Avila-Calderon, E. D., et al. Roles of bacterial membrane vesicles. Arch. Microbiol. 197, 1-10 (2015).
- Kulp, A., Kuehn, M. J. Biological functions and biogenesis of secreted bacterial outer membrane vesicles. Annu. Rev. Microbiol. 64, 163-184 (2010).
- Beveridge, T. Structures of Gram negative cell walls and their derived membrane vesicles. J. Bacteriol. 181, 4725-4733 (1999).
- Kulkarni, H. M., Jagannadham, M. V. Biogenesis and multifaceted roles of outer membrane vesicles from Gram-negative bacteria. Microbiology. 160, 2109-2121 (2014).
- Ellis, T. N., Kuehn, M. J. Virulence and immunomodulatory roles of bacterial outer membrane vesicles. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 74, 81-94 (2010).
- Berleman, J., Auer, M. The role of bacterial outer membrane vesicles for intra- and interspecies delivery. Environ. Microbiol. 15, 347-354 (2013).
- Alves, N. J., et al. Bacterial nanobioreactors-directing enzyme packaging into bacterial outer membrane vesicles. ACS Appl. Mater. Interfaces. 7, 24963-24972 (2015).
- Kim, J. Y., et al. Engineered bacterial outer membrane vesicles with enhanced functionality. J. Mol. Biol. 380, 51-66 (2008).
- Haurat, M. F., et al. Selective sorting of cargo proteins into bacterial membrane vesicles. J. Biol. Chem. 286, 1269-1276 (2011).
- Kesty, N. C., Kuehn, M. J. Incorporation of heterologous outer membrane and periplasmic proteins into Escherichia coli outer membrane vesicles. J. Biol. Chem. 279, 2069-2076 (2003).
- Zakeri, B., et al. Peptide tag forming a rapid covalent bond to a protein, through engineering a bacterial adhesion. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109, e690-e697 (2012).
- Li, L., Fierer, J. O., Rapoport, T. A., Howarth, M. Structural analysis and optimization of the covalent association between SpyCatcher and a peptide tag. J. Mol. Biol. 426, 309-317 (2014).
- Dumas, D. P., Durst, H. D., Landis, W. G., Raushel, F. M., Wild, J. R. Inactivation of organophosphorus nerve agents by the phophotriesterase from Pseudomonas-Diminuta. Arch. Biochem. Biophys. 277, 155-159 (1990).
- Bigley, A. N., Raushel, F. M. Catalytic mechanisms for phosphotriesterases. Biochimica et Biochim. Biophys. Acta, Proteins Proteomics. 1834, 443-453 (2013).
- Minton, N. A., Murray, V. S. G. A review of organo-phosphate poisoning. Med. Toxicol. Adverse Drug Exper. 3, 350-375 (1988).
- Bigley, A. N., Xu, C., Henderson, T. J., Harvey, S. P., Raushel, F. M. Enzymatic neutralization of the chemical warfare agent VX: Evolution of phosphotriesterase for phosphorothiolate hydrolysis. J. Am. Chem. Soc. 135, 10426-10432 (2013).
- Chatterjee, S. N., Chaudhuri, K. Gram-negative bacteria: the cell membranes. Outer Membrane Vesicles of Bacteria. SpringerBriefs in Microbiology. , 15-34 (2012).
- Wang, Y. The function of OmpA in Escherichia coli. Biochem. Biophys. Res. Commun. 292, 396-401 (2002).
- Danoff, E. J., Fleming, K. G. The soluble, periplasmic domain of OmpA folds as an independent unit and displays chaperone activity by reducing the self-association propensity of the unfolded OmpA transmembrane beta-barrel. Biophys. Chem. 159, 194-204 (2011).
- Alves, N. J., Kline, J. A. Comparative study on the inhibition of plasmin and delta-plasmin via benzamidine derivatives. Biochem. Biophys. Res. Commun. 457, 358-362 (2015).
- Wang, W. Lyophilization and development of solid protein pharmaceuticals. Int. J. Pharm. 203, 1-60 (2000).
- Goormaghtigh, E., Scarborough, G. A. Density-based separation of liposomes by glycerol gradient centrifugation. Anal. Biochem. 159, 122-131 (1986).
- Alves, N. J., et al. Functionalized liposome purification via Liposome Extruder Purification (LEP). Analyst. 138, 4746-4751 (2013).
- Mayer, L. D., StOnge, G. Determination of free and liposome-associated doxorubicin and vincristine levels in plasma under equilibrium conditions employing ultrafiltration techniques. Anal. Biochem. 232, 149-157 (1995).
- Blakeley, B. D., Chapman, A. M., McNaughton, B. R. Split-superpositive GFP reassembly is a fast, efficient, and robust method for detecting protein-protein interactions in vivo. Mol. BioSyst. 8 (2036), (2012).
- De Crescenzo, G., Litowski, J. R., Hodges, R. S., O'Connor-McCourt, M. D. Real-time monitoring of the interacation of two-stranded de novo designed coiled-coils: effect of chain length on the kinetic and thermodynamic constants of binding. Biochemistry. 42, 1754-1763 (2003).
- Charalambous, A., Antoniades, I., Christodoulou, N., Skourides, P. A. Split-Intein for simultaneous site-specific conjugation of quantum dots to multiple protein targets in vivo. J. Nanobiotechnol. 9, 1-14 (2011).
- Lee, E. Y., et al. Global proteomic profiling of native outer membrane vesicles derived fromEscherichia coli. Proteomics. 7, 3143-3153 (2007).
- Alves, N. J., Turner, K. B., Medintz, I. L., Walper, S. A. Protecting enzymatic function through directed packaging into bacterial outer membrane vesicles. Sci. Rep. 6, 24866 (2016).
- Alves, N. J., Turner, K. B., Medintz, I. L., Walper, S. A. Emerging therapeutic delivery capabilities and challenges utilizing enzyme/protein packaged bacterial vesicles. Ther. Delivery. 6, 873-887 (2015).
