Abstract
Ett ökande intresse av att syntetisk biologi tekniker för att programmera yttre membranvesiklar (OMV) leder till några mycket intressanta och unika applikationer för OMV där traditionella nanopartiklar har visat alltför svårt att syntetisera. Hittills har alla gramnegativa bakterier visats producera OMV demonstrera förpackning av en mängd gods som inkluderar små molekyler, peptider, proteiner och genetiskt material. Baserat på deras varierande last, är OMV inblandade i många biologiska processer som sträcker sig från cell-cellkommunikation till genöverföring och leverans av virulensfaktorer beroende på vilka bakterier producerar OMV. Först nyligen har bakteriell OMV blivit tillgängliga för användning inom ett brett spektrum av applikationer genom att utveckla metoder för att styra och direkt paketering av rekombinanta proteiner i OMV. Detta protokoll beskriver en metod för framställning, rening och användning av enzym förpackade OMV föreskriver förbättrad Overall produktion av rekombinant enzym, ökad blåsbildning, och förbättrad stabilitet enzym. Framgångsrik användning av detta protokoll kommer att leda till skapandet av en bakteriestam som samtidigt producerar ett rekombinant protein och styr det för OMV inkapsling genom att skapa en syntetisk koppling mellan det rekombinanta proteinet och ett yttre membranförankringsprotein. Detta protokoll också detaljer metoder för att isolera OMV från bakterieodlingar samt korrekt hantering tekniker och saker att tänka på när anpassa detta protokoll för användning för andra unika applikationer såsom: läkemedels drug delivery, medicinsk diagnostik och miljöåterställning.
Introduction
Som presenteras här är en metod för konstruktion, tillverkning och rening av enzymbelastade bakteriella yttre membranvesiklar (OMV). OMV är små, främst unilamellära, proteoliposomer som varierar i storlek från 30 till 200 nm 1,2. Alla gramnegativa och grampositiva bakterier som har studerats till dags dato har visat frisättning av antingen OMV eller extracellulära vesiklar (EV) från deras yta 3,4. Den exakta mekanismen genom vilken OMV produceras ännu inte helt klarlagd på grund av de olika bakteriepopulationen som utsöndrar dem samt de olika funktioner som de tjänar. OMV har visat att transportera ett brett spektrum av last från små molekyler, peptider och proteiner till genetiskt material som serverar en mängd komplexa signalerings, gen translokation, och virulens funktioner 5,6.
De exakta mekanismerna för OMV biogenes är inte väl karakteriserade, och tycks skilja mellan bakteriearter. trots this faktum, har vi utvecklat en metod för att förbättra packningseffektiviteten av ett rekombinant protein i OMV genom att skapa en syntetisk bindning mellan ett protein av intresse och en högt förekommande proteinet endogent för det bakteriella yttermembranet och efterföljande OMV. I avsaknad av en syntetisk koppling, eller artificiellt bildat affinitet mellan rekombinant uttryckta proteinet och OMV den observerade packningseffektiviteten är mycket låg 7. Detta resultat är att vänta som inkorporering av proteinerna inom OMV antingen sker genom slumpen inkapsling i samma ögonblick av OMV bildning vid bakterieytan eller genom riktad förpackningar av mekanismer som inte är väl förstådda. Viss framgång har observerats i förpacknings proteiner helt enkelt genom överuttryck i det periplasmatiska utrymmet som förlitar sig på slumpen inkapsling men effektiv förpackning är hög proteinberoende med vissa proteiner förpackning med hög effektivitet jämfört med andra thpå inte paket alls 8-10. Genom att utnyttja gemensamma syntetisk biologiska tekniker försökte vi ingenjör Escherichia coli (E. coli) för att samtidigt producera, paketera och utsöndra ett aktivt enzym av intresse i OMV som kringgår aktuella kunskaps begränsningar för hur OMV bildas och hur lasten väljs av bakterierna för förpackning.
Vid tillämpningen av denna ansökan ett delat protein biokonjugering systemet valdes som den syntetiska länk val för att underlätta riktad förpackning i OMV. Som namnet antyder en delad protein biokonjugering Systemet består av två komplementära subenhet domäner som interagerar med varandra. De delade proteindomäner som valts ut inom ramen för detta protokoll kallas den Spycatcher (SC) och SpyTag (ST) domän och härrör från Streptococcus pyogenes fibronektin-bindande protein (FbaB) 11. Denna uppdelning proteinsystem är ovanligt i att whöna de två subenheter är inom närhet en isopeptidbindning bildar spontant mellan den proximala asparaginsyra och lysin aminosyrarester skapar en kovalent bindning. Isopeptidbindning bildning kräver inte tillsats av chaperonproteiner, katalytiska enzymer eller kofaktorer och kan lätt ske vid rumstemperatur (RT) och över ett brett område av fysiologiskt relevanta villkoren 12.
Som en proof of concept, var phosphotriesterase (PTE) (EG 3.1.8.1) från Brevundimonas diminuta väljs för att packas i E. coli erhållet OMV 13. PTE innehåller en binukleär Zn / Zn aktiv plats och har förmågan att bryta ner organiska fosforföreningar genom en hydrolysreaktion konvertera aryldialkylphosphates i dialkylphosphates och arylalkoholer 14. Exponering för organofosfater försämrar korrekt neurotransmittorfunktion genom att hämma hydrolys av acetylkolin genom acetylkolinesteras vid neuromuskulära korsningar making fosfororganiska härledda föreningar extremt farliga 15. Långvarig eller betydande exponering mot organofosfater resulterar vanligtvis i okontrollerbara kramper och vanligtvis leder till döden via kvävning. Medan PTE uppvisar den högsta katalytiska aktiviteten mot paraoxon, en mycket potent insekticid, är det också förmåga att hydrolysera ett brett spektrum av andra pesticider och V / G Typ kemiska nervmedel 16. För att underlätta OMV förpackning ades en bakteriell plasmid utformad som kodar en genkonstruktion som innehåller en inducerbar promotor, ett periplasmatiskt lokaliseringssekvens, och en kort multipelt kloningsställe uppströms om SC-gensekvensen. Insättning av PTE-genen mellan ledaren och SC-sekvens möjliggjorde skapandet av en genetisk switch som riktar PTE-SC-fusionsprotein till det periplasmatiska utrymmet för OMV förpackning. Medan de ansträngningar som beskrivs här fokuserar på PTE, är enzymgenen utbytbara och kan lätt ersättas med en annan gen-sekvensen med FACilitate förpackning av ett alternativt enzym eller protein.
Som den andra delen av den syntetiska koppling, är en riklig yttre membranprotein (OmpA) valt att presentera ST-peptidsekvensen. Medan valet av förankringsproteinet kan variera, är det väsentligt att proteinet har en tillåtande domän som presenteras inom det periplasmatiska utrymmet, tolererar fusionskonstruktionen utan att inducera cytotoxicitet, är känd för att vara närvarande i OMV, och sammanställer inte när det är rekombinant produceras. OmpA är en 37,2 kDa trans porin protein som är känt för att vara mycket uttryckas i bakterieyttermembranet och efterföljande OMV 17. Det är inblandad i transporten av små molekyler, <2 nm i storlek, över bakteriemembranet 18. Nativt OmpA har två strukturellt unika domäner, en transmembran beta fat motiv och en periplasmically löslig C-terminala delen kända för att interagera med peptidoglykan 19. I mutanten OmpA-ST fusion designed här den C-terminala delen av OmpA ströks och ST fuserades till den periplasmically vänd N- eller C-terminaler. Radera periplasmatiska delen av OmpA minskar antalet interaktioner mellan det yttre membranet och peptidoglykan resulterar i membranet destabilisering leder till hyper-blåsbildning 7. Genomisk OmpA bibehölls utöver den rekombinant uttryckta OmpA-ST-konstruktionen för att mildra grov membran destabilisering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Framställning av plasmider
- Förbered en plasmid (t.ex. pET22) innehåller ankar protein (OmpA) smält till en biortogonal länk domän (som avses i detta protokoll som ankare-ST), epitopmärkning (såsom 6xHis, myc eller FLAG taggar för rening och identifiering), periplasmisk lokalisering tag, antibiotikaresistens, och lämplig replikeringsursprung baserat på den valda bakteriestam 7.
- Utdrag plasmid DNA från övernattskulturer med hjälp av en kommersiellt tillgänglig DNA-isoleringskit enligt tillverkarens protokoll.
- Förbered en plasmid (t.ex. pACYC184) innehållande enzymet / protein (PTE) som skall förpackas i OMV sammansmält med den komplementära bioorthogonal länk domän som i ankarprotein (som avses i detta protokoll som enzym SC), epitopmarkör, periplasmisk lokalisering tagg, antibiotikaresistens som är annorlunda än ankarproteinet plasmiden, och lämplig origi föröka baserat på den valda bakteriestam 7.
- Utdrag plasmid DNA från övernattskulturer med hjälp av en kommersiellt tillgänglig DNA-isoleringskit efter tillverkarens protokoll 7.
2. Generering av en OMV Aging E. coli Kultur
- plasmid Isolation
- Rena plasmider som kodar för enzymet-SC konstruera och ankar ST konstruktioner från separata underhåll cellinjer med hjälp av en kommersiell plasmid-isoleringskit enligt tillverkarens protokoll 7. Bestämma DNA-koncentration och renhet genom att mäta absorbansen vid 260 nm och 280 nm.
- Co-transformation
- Välj en E. coli-stam som är kommersiellt tillgänglig för att underlätta proteinexpression.
OBS: BL21 (DE3) -celler användes här. T7-lysogen krävs för expression av ankaret-ST-konstruktionen, som bygger på T7-promotorn och T7-RNA-polymeras för protEin uttryck. Användning av andra bakteriestammar kräver antingen närvaron av T7 lysogen genen eller användning av en annan än pET22 7 plasmid. - Späd renade plasmid-DNA för motsvarande molära koncentrationer sedan omvandla dem till kompetenta bakterieceller via antingen värmechock omvandling eller elektroporering efter tillverkarens protokoll för de kompetenta cellerna valt.
- Plate transformerade celler på antibiotikainnehållande Luria-Bertani (LB) agarplattor med både ampicillin (pET22) och kloramfenikol (pACYC184); båda närvarande vid slutliga koncentrationer på 25 | ig / ml.
- Placera kulturen skålen vid 37 ° C över natten för att isolera endast kloner innehållande båda plasmiderna.
OBS: Kolonier som överlever antibiotikaselektion kommer att användas för alla framtida OMV förberedelser. Antibiotika (ampicillin och kloramfenikol) kommer att läggas till alla vätskekulturer att upprätthålla selektivt tryck och se till att närvaron av båda plasmiderna.
- Välj en E. coli-stam som är kommersiellt tillgänglig för att underlätta proteinexpression.
3. OMV Produktion
- koloni Expansion
- Inokulera 5 ml av odlingsmedia (typiskt Terrific Broth (TB) eller LB) innehållande antibiotika vid de ovannämnda koncentrationerna (steg 2.2.3) med en enda koloni från selektionsplattorna som beskrivs i 2.2.4.
- Gör en 1: 100-faldig spädning av natten startkultur i bafflade odlingsflaskor.
OBS: Använd en volym av media mellan 250-500 ml. - Upprätthålla kulturen vid 37 ° C under skakning vid 250 varv per minut för att säkerställa att tillräcklig luftning av kulturen uppnås.
- Induktion av varje plasmid
- Låt bakteriekultur att växa till en OD 600 av 0,6-0,8, ca 3 timmar av tillväxt efter ympning av den primära tillväxtkolven.
- För att förbättra det slutliga utbytet av PTE-SC laddade vesiklar, centrifugera hela kulturen vid 7000 xg under 15 min. Resuspendera cellpelleten i förvärmda, färskt odlingsmedia.
OBS: Denna optional steg hjälper till att avlägsna eventuella tomma OMV som är närvarande i odlingsmedia före PTE-SC induktion. - Gör en 20% stamlösning av L-arabinos i vatten och sterilfilter med användning av ett 0,22 pm filter. Store L-arabinos-lösning vid 4 ° C under 2-4 veckor.
- Tillsätt L-arabinos lösning till odlingskolven till en slutlig 0,2% koncentration för att initiera PTE-SC produktion.
OBS: Detta bidrar till att förladda det periplasmatiska utrymmet med PTE-SC innan främja ökad blåsbildning genom induktion av muterade OmpA-ST. - Gör en 1 M Isopropyl β-D-1-tiogalaktopyranosid (IPTG) lösning i vatten och sterilfilter med användning av ett 0,22 pm filter.
OBS: IPTG måste användas omedelbart efter hydrerad. Alikvoter av IPTG kan förvaras fryst under 3-6 månader och kan tinas omedelbart före användning. - Lägga IPTG efter ytterligare 3 h inkubationsperiod till en slutlig koncentration av 0,5 mM för att initiera produktionen av OmpA-ST.
- Tillåta culture att växa under ytterligare 8-14 h vid 37 ° C under skakning.
4. OMV Rening
- Borttagning av intakta bakterier
- Centrifugera den bakteriella odlingsmedier för 15 min vid 7000 xg vid 4 ° C för att pelle intakta bakterier.
- Dekantera och spara, media från toppen av cellpelleten efter centrifugering var noga med att inte störa cellpelleten.
- Upprepa steg 4.1.1 och 4.1.2 för en ytterligare centrifuge cykel för att säkerställa att alla intakta bakterier avlägsnas från odlingsmedia att se till att dekantera och spara media.
- Avlägsnande av proteinaggregat
- Ytterligare rena bakteriekulturen media med en 0,45 um membranfilter för att avlägsna kvarvarande bakterier och oönskad stor cellmaterial.
OBS: Använd en biologiskt kompatibel membranmaterial för högre återvinningar och lägre proteinadsorption såsom cellulosaacetat (CA) eller polyvinylidendifluorid (PVDF). Sprutfilter volymer mindre än 100 ml och vakuumfilter volymer större än 100 ml.- Till sprutfilter, dra odlingsmedium i sterila 10-50 ml spruta. Bifoga 0,45 ^ m filter för att Luer änden av sprutan. Tryck kolven och samla genomströmning i ett nytt fartyg.
- För vakuumfilter, överföra odlingsmedium till en steril filtreringsapparat. Fäst enheten vakuumpump eller sjunka aspirator att generera sug. Överför filtrerat medium till ett nytt fartyg.
- Ytterligare rena bakteriekulturen media med en 0,45 um membranfilter för att avlägsna kvarvarande bakterier och oönskad stor cellmaterial.
- Isolering av OMV via Ultracentrifugering
- Lägg den filtrerade odlingsmedia i centrifugrör vara noga med att balansera motsatta rören i centrifugen.
- Pellet vid ~ 150.000 xg under 3 h vid 4 ° C i en ultracentrifug med användning av motsvarande rötor matchning både instrumentet och rören som används.
- Häll av OMV utarmat odlingsmedier från OMV pellets, försiktigt så att inte störa OMV pelleten omedelbart vid slutför of centrifugering som gör det möjligt för OMV pelleten att stanna kvar i media kommer att mjukna pelleten minska OMV återhämtning.
OBS: Denna pellet blir något brun och beroende på utgångsbeloppet för bakteriekultur kan eller kanske inte syns med blotta ögat. Aspirera mediet direkt från toppen av centrifugeringsröret är också ett alternativ med tanke på att de mer media avlägsnas från OMV pelletera mer ren slut OMV provet kommer att vara. - Spara centrifug supernatanten för senare dynamisk ljusspridning (DLS) tester för att kontrollera att OMV partiklarna var helt uttömda från media.
- Lägga 0,5-1 ml steril filtrerad Fosfatbuffrad saltlösning (PBS), pH 7,4 eller 100 mM N-cyklohexyl-2-aminoetansulfonsyra (CHES) buffert vid pH 8,0 till OMV pelleten så att den kan inkubera under 30 min vid RT. Se till att pelleten inte torkar.
OBS: Extrema i lösning jonstyrka, pH och temperatur kan resultera i reducerad OMV löslighet och främja aggreningen. - pipettera noggrant den renade OMV lösningen från centrifugröret, blanda försiktigt för att säkerställa att hela pelleten har solubiliserats.
5. OMV Karakterisering
- Använd någon kommersiellt tillgänglig DLS eller nanopartiklar spårningsprogram efter den medföljande tillverkarens protokoll är unika för varje instrument för att bestämma OMV storleksfördelning och partikelkoncentration.
OBS: Här var OMV storleksfördelning och koncentration bestämdes med användning av NanoSight LM10 Nanoparticle Tracking och NTA 2,3 Analysis.- Öppna programmet.
- Slå på mikroskop och rengöra alla ytor på mikroskopet och nanopartiklar spårningsenhet.
- Lägg ~ 0,5 ml OMV prov direkt till fönstret av spårningspartikel enheten via luerkoppling med en 1 ml steril spruta att se till att täcka hela fönstret utan att injicera någon luftbubblor i systemet.
- plats than nanopartiklar tracking enhet på mikroskop scenen och slå på lasern.
- Klicka på "Capture" i programmet.
- Justera mikroskopet fokus och steg för att visualisera partiklar på förhandsgranskningsskärmen närvarande i fönstret programvara.
- Justera "kamerans slutare" och "Camera Gain" tills ljusa partiklar tydligt visualiseras på en mörk bakgrund.
- Justera fånga varaktighet till 60 sek.
- Klicka på "Record".
- När du uppmanas ange / enhet temperatur prov, märka provet, och spara videodata vid slutförandet av varje försök till en användare angiven mapp.
- Håll alla analysparametrar (detektionströskel, Blur, Min spårlängd Min Förväntad partikelstorlek) på auto upptäcka läge och klicka på "processekvens."
OBS: Se manualen för hur varje parameter kan justeras självständigt finjustera analysresultat. - Spela partikelstorleksfördelning och partiklar / ml koncentration som bestäms av programmet.
OBS: En typisk OMV hydrodynamisk storleksintervallet är mellan 30-200 nm med en partikel / ml koncentration av ~ 10 x 10 8.
- Fastställande OMV Proteininnehåll
- Använd standard SDS-PAGE och Western blot-protokoll för att bedöma OMV renhet, enzymproduktion och SC-ST tvärbindningseffektivitet 7.
OBS: Tvärbindning effektivitet kommer inte att vara 100% 7.
- Använd standard SDS-PAGE och Western blot-protokoll för att bedöma OMV renhet, enzymproduktion och SC-ST tvärbindningseffektivitet 7.
6. Kontroll av enzymPackAging
- PTE Aktivitetsanalys
- Utför alla enzymatiska analyser i en lämplig buffert, såsom 100 mM CHES-buffert (pH 8) vid 25 ° C i antingen en kuvett eller multiplexeras i en 96/384-brunnsplatta.
- Tillsätt 5 | il av en 1: 1000-spädning av paraoxon i CHES-buffert till 90 ^ il CHES och 5 | j, l av renat OMV (~ 36-faldigt koncentrerad jämfört med OMV koncentrationen närvarande i odlingsmedium).
Varning: paraoxon är ett giftigt bekämpningsmedeloch måste hanteras per tillverkare och institutionens riktlinjer. - Ta absorbansmätningar med jämna mellanrum (var 20: e sekund för ~ 2 h total reaktionstid) vid 405 nm (ε = 18,1 mM -1 cm -1) och vid 348 nm (isosbestiska punkt ε = 5,4 mM -1 cm -1) till övervaka reaktions utvecklingen av det kromogena paraoxon nedbrytningsprodukt, p-nitrofenol.
OBS: Vid pH-värden över 8 den dominerande deprotonerade formen av p-nitrofenol är närvarande vilket möjliggör noggrann övervakning vid 405 nm. I alla andra komplex eller lägre pH-lösningar är det nödvändigt att utnyttja den isosbestiska punkten för 348 nm som multipla former av p-nitrofenol kommer att vara närvarande. - Beräkna initiala reaktionshastigheter genom att bestämma lutningen för den linjära delen av förloppskurvorna från steg 6.1.3 för att jämföra den relativa kvantiteten av PTE i varje prov, packningseffektiviteten, och total PTE produktion.
- Utför standard enzymatiskanalysprotokoll för att bestämma K M, V max och kcat för OMV inkapslade PTE.
OBS: En Lineweaver-Burk-analys kan utnyttjas för bestämning av dessa kinetiska parametrar där y-axeln = 1 / V max och lutning = K M / V max 20.
- Transmembrana Substrate / Produkt Diffusion.
- Utför samma kinetiska analys analys som beskrivs i steg 6,1 utnyttja ökande koncentrationer av Triton X-100 i CHES buffert från 0-3% i volym.
OBS: Tillsatsen av Triton X-100 till de solubiliserade OMV funktionerna att störa lipiddubbelskiktet möjliggör innehållet i OMV att vara fritt tillgänglig för reaktionslösningen. - Beräkna och jämföra de initiala hastigheterna vid varje Triton X-100-nivå för att kontrollera transmembranpassage av substratet / produkt indikeras med minimal förändring av enzymaktivitet (initiala hastigheter) jämfört med enzymaktiviteten in frånvaro av Triton X-100. Om en avsevärd ökning av enzymaktivitet observeras i närvaro av Triton X-100 är det troligt att underlaget inte fritt inte diffundera in i OMV.
- Analys fri enzymaktivitet (som beskrivs ovan i avsnitt 6.1) i närvaro av Triton X-100 för att verifiera att enzymaktiviteten hämmas inte av det ytaktiva själv.
OBS: Om aktiviteten är kraftigt påverkad av Triton X-100, alternativa tillsatser, såsom saponiner eller olika polysorbat / tween ytaktiva ämnen kan vara lämpligare för att spräcka OMV membranet.
- Utför samma kinetiska analys analys som beskrivs i steg 6,1 utnyttja ökande koncentrationer av Triton X-100 i CHES buffert från 0-3% i volym.
7. OMV Lagring
- Frysning
- Plats ~ 100 | il alikvoter av renat OMV direkt i flytande kväve för att knäppa frysa portioner vara noga med att inte helt dränka flaskorna eller kontakta någon flytande kväve med själva provet.
OBS: Renat OMV kan snabbfrystes direkt i bufferten som valdes för solubilisering av OMV pelleten under purification process utan extra kryoskyddsmedel nödvändiga 7. - Lagra snabbfrystes alikvoter vid -80 ° C.
- Tina frysta alikvoter från steg 7.1.1 genom att placera dem vid RT är säker på att inte värma proverna.
- Före framställning av alla prover för lagring på detta sätt utföra enzymanalysen beskrivs i steg 6,1 jämföra initialhastigheter före och efter frysning för att verifiera att det inte finns någon signifikant förlust av enzymaktivitet stolpen frysning-tining.
OBS: Store renat OMV vid 4 ° C om en reduktion i enzymaktivitet observeras på grund av frysning.
- Plats ~ 100 | il alikvoter av renat OMV direkt i flytande kväve för att knäppa frysa portioner vara noga med att inte helt dränka flaskorna eller kontakta någon flytande kväve med själva provet.
- lyofilisering
- Lyofilisera snäpp fryst renade OMV portioner utnyttjar kommersiellt tillgänglig frystorkning utrustning 21.
- Store lyofiliserades alikvoter vid RT under veckor eller vid -80 ° C i flera månader.
- Tillsätt samma volym renat vatten till det lyofiliserade OMV som före lyofilisering och låt stå vid RT under 30 min för att rehydrera than prov. Blanda försiktigt vid behov vara säker på att inte virvel eller sonikera OMV.
- Lägg lyofiliserat OMV pulver direkt till point-of-care för applikationer där tidigare utspädning / upplösningen är inte nödvändigt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Samtidig expression av två rekombinanta proteiner, som erfordras för OMV förpackningsstrategi som beskrivs i detta protokoll, kan åstadkommas genom ett antal olika vägar. Här var en två vektorsystem används med kompatibla ursprung för replikation och separata inducerbara gen kassetter. För expression av PTE-SC konstruera en kommersiell plasmidryggrad (pACY184) var konstruerad för att inkludera en arabinos inducerbar gen kassett och en tvilling arginin periplasmisk lokalisering ledarsekvens följt av en serie av unika restriktionsställen för att underlätta kloning av enzymet genen som en fusion till en C-terminal SC-protein. Plasmidkonstruktionen som kodar för den yttre membranankarprotein är den kommersiella vektorn pET22 som utnyttjar lac operonet för kontroll av proteinuttryck och pelB periplasmatiska lokaliseringssekvens. Den korta ST-sekvensen klonades in i den trunkerade OmpA proteinet före insertion in i expressionsplasmiden. I båda plasmider, var den C-terminala hexahistidin-sekvensen upprätthålls för att möjliggöra samtidig identifiering av fusionsproteinerna i OMV-prover. Konstruktion och karaktärisering av dessa genkonstrukt, inklusive både de N- och C-terminal ST fusionskonstruktioner till OmpA, beskrives fullständigt i Alves m.fl.. 7. Genkonstruktionerna som beskrivs här kan inte vara gynnsamt för förpackning av alla enzymer. I vissa fall kan det vara nödvändigt att ändra det periplasmatiska lokaliseringssignalen, de regulatoriska elementen, eller de epitopmarkörer. Dessutom kan vissa proteiner vara oöverkomligt stor och oförmögen till tvärgående det inre membranet helt och hållet. Enzymatisk aktivitet och OMV packningseffektiviteten kan inte bestämmas a priori och kommer att behöva bestämmas empiriskt för varje målprotein.
Nedan finns resultat som ett normalt skulle förvänta sig efter framgångsrikt bär out detta protokoll. Inkluderat är en schematisk bild av de två ST / SC split proteindomäner, OmpA-ST och PTE-SC-fusionskonstruktionerna såväl som ett exempel på isopeptide bildning vid det bakteriella yttermembranet och efterföljande inkapsling av PTE-SC inom en OMV (figur 1) . Även representativa resultat av det renade OMV morfologi via SEM samt storleksfördelning och absolut OMV koncentration bestäms via spårningspartikel programvara (Figur 2) ingår. Ytterligare karakterisering av OMV proteinhalt och rekombinant proteinuttryck ses via SDS-PAGE och Western blöt (Figur 3). Molekylvikterna för proteiner av intresse som är specifika för det protokoll som avses här är följande: native OmpA (37,2 kDa), OmpA-ST (23 kDa), PTE-SC (51 kDa), OmpA-ST / PTE-SC (74 kDa) . Renat OMV bör ha ett mörkt band vid ungefär 37 kDa, vilket är ett tecken på den mycket rikligt förekommande nativa OmpA. Beroende på gelén upplösning kan det finnas flera bands närvarande i denna region av gelén som OmpA, OmpF och OMPC är alla relativt rikligt förekommande och dela en liknande molekylvikt. En ytterligare band som är 2,2 kDa större än OmpA-ST också kan observeras på grund av felaktig klyvning av ledarsekvensen till följd av överväldigande E. coli uttrycks maskiner. Det är viktigt att notera att en framgångsrikt renad OMV prov inte kommer att ha många andra höggradigt uttryckta proteiner. Om andra band är närvarande antingen reningen utfördes felaktigt eller de bakteriestam som utnyttjas kan förpacknings andra proteiner som inte observerats i denna E. coli BL21 (DE3) -stammen.
Vidare har aktivitetsanalyser och blåsbrott experiment tillhandahållits för att visa representativa resultat som skulle kunna förväntas om den enzymatiska substratet fritt kan komma in i OMV genom trans Porin proteiner (Figur 4). Paraoxon relativt fritt kommer in iOMV via endogena transmembrana Porin proteiner för att reagera med den förpackade PTE och reaktionsprodukten, p-nitrofenol, passerar också relativt fritt genom OMV membranet. Detta fenomen kommer inte att vara allestädes närvarande bland alla produkt, substrat och enzym set och måste bestämmas experimentellt. Även framgångsrika OMV bristning och enzymfrisättning har setts med låga koncentrationer av tvättmedel och PTE (häri Triton X-100), kan sådana tillsatser påverka aktiviteten hos andra enzymer.
Plasmid kartor har också inkluderats för att demonstrera utformningen av ett två plasmid förpackningsstrategi utnyttjar SC / ST (Figur 5).
Figur 1: Riktad förpackning av proteiner i OMV. Kristallstrukturer för de proteiner som används i den beskrivna OMV förpacknings strattegi: OmpA, PTE, SpyTag (ST) och SpyCatcher (SC); PBF: 2GE4, 1PTA, 4MLI, 4MLI, respektive. En schematisk representation av OmpA-ST och PTE-SC fusionskonstruktioner som utgör en isopeptidbindning vid det yttre membranet hos bakterierna visas. Denna membranfusion driver införlivandet av PTE i formnings OMV. Figur återges (anpassad) från Alves et al. ACS Appl Mat Interfaces (2015), 7 (44), sid 24,963-24,972 7. Copyright 2015 American Chemical Society. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: OMV karakterisering. (A) SEM av ultracentrifug renat OMV från nativa E. coli [BL21 (DE3)]. (B) representant partikel trac king size fördelningar och (C) totalt vesikler koncentration medelvärde över 90 sekunder prov läser för Native OMV, PTE-SC i frånvaro av arabinos aktivering (PTE-nr A), PTE-SC i närvaro av arabinos aktivering (PTE-A) , N-terminal OmpA-ST samtransformerade med PTE-SC i närvaro av arabinos och IPTG aktivering (PTE / OMV-N), och ultracentrifug supernatanten (UC supernatant). En betydande ökning av OMV produktion observerades i PTE / OMV-N prov jämfört med Native OMV och PTE-SC konstruktioner ensam. OMV kvantifierades i UC vätskan för att demonstrera en nästan fullständig återvinning av OMV i UC pelleten lämnar liten eller ingen OMV i supernatanten efter ultracentrifugering. Alla data representerar medel (± SD) av trefaldiga experiment. Figur återges (anpassad) från Alves et al. ACS Appl Mat Interfaces (2015), 7 (44), sid 24,963-24,972 7. Copyright 2015 American Chemical Society.d / 54.458 / 54458fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Renat OMV proteinhalt bestämning. (A) SDS-PAGE av det renade OMV UC pellet av den C-terminala OmpA-ST fusion samuttrycks med PTE-SC (PTE / OMV) konstruera visar representativa överflöd av OmpA-ST, Native OmpA, PTE-SC och OmpA- ST / PTE-SC isopeptide fusion. (B) Western blot-analys med användning av den medföljande his-taggen finns i OmpA och PTE konstruktioner för att underlätta visualisering via en anti-6xHis antikropp. Det är viktigt att notera att PTE är känt att dimerisera, vilket framgår på blotten genom närvaron av större molekylvikt His-märkt species. Även om det finns mycket höga OmpA-ST uttrycksnivåer observerade det inte finns en fullständig omvandling av friPTE-SC till membranbundna OmpA-ST / PTE-SC. Trots detta faktum, ökningen av den totala produktionen PTE och förbättrad förpacknings effektivitet tyder på att medan kovalent bindningsbildning är inte överallt icke-kovalent association av ST och SC-domäner är en viktig faktor i riktade förpackningar inom OMV. Figur återges (anpassad) från Alves et al. ACS Appl Mat Interfaces (2015), 7 (44), sid 24,963-24,972 7. Copyright 2015 American Chemical Society. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: PTE aktivitet och förpacknings karakterisering. (A) Total PTE expressionsnivåer och OMV packningseffektiviteten bestäms via initiala hastighetsmätning som utnyttjar paraoxon som kromogent substrat som jämför PTE närvarande i cellpelletar, UC supernatanten och de renade UC OMV pellets. (B) Representativa data som demonstrerar användning av Triton X-100 (0,5% T100) för att störa OMV biskikt tillåta obehindrat tillträde av substrat till OMV inre. Jämföra dessa data till analyser utförda i frånvaro av T100 underlättar kontrollen av translokation av substrat över intakta OMV biskikt om enzymatiska initiala hastigheter är oförändrade. När det gäller paraoxon det fanns mycket lite aktivitet skillnad observerades i närvaro eller frånvaro av T100 indikerar att paraoxon passerar fritt genom endogena porerna på OMV. (C) PTE-SC kinetiska data passar till standard Michaelis-Menten enzymkinetik ekvation för PTE / OMV-N och PTE-A. (D) En Lineweaver-Burk-analys används för att bestämma K M och kcat / M (48, 4,4 x 10 7, 44 ^ M, 4,9 x10 7 sek -1 M -1, respektive) visar liknande PTE litteratur kinetiska parametrar som nativt enzym (90 ^ M, 2,7 x 10 7 sek -1 M -1) med R2 ≥ 0,999 i alla fall. Alla data representerar medel (± SD) av trefaldiga experiment. Figur återges (anpassad) från Alves et al. ACS Appl Mat Interfaces (2015), 7 (44), sid 24,963-24,972 7. Copyright 2015 American Chemical Society. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Representativa plasmidkonstruktioner för exemplet här beskrivna systemet. Spycatcher modifierat enzym-SC (PTE-SC) plasmiden riktade för inkapsling i OMV (till vänster). SpyTag modifIED membranankar ST (OmpA-ST-N) plasmid (höger). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta protokoll funktioner för att visa en representativ riktad förpackningsteknik där ett enzym av intresse produceras och förpackas i OMV av E. coli. Som med många komplexa tekniker det finns flera områden där protokollet kan modifieras för att rymma för användning i olika unika applikationer, av vilka några beskrivs nedan. Medan mekanismen för OMV förpackningar och enzym inkapsling kan anpassas till specifika behov finns flera steg i detta protokoll som är avgörande för dess framgång. Den initiala avlägsnande av intakt bakterie och cellrester är av stor betydelse och kommer att påverka alla försök nedströms vid kvantifiering eller provanalys. Två på varandra följande centrifugeringssteg följt av filtrering är vanligtvis tillräcklig för att avlägsna dessa föroreningar. Men i alla fall försiktighet bör iakttas när dekantering lösningar efter centrifugering för att minimera överföring av föroreningar. På liknande sätt, den slutliga OMV pelleten obtained efter ultracentrifugering är ofta endast löst vidhäftade till botten av centrifugröret. I slutskedet, måste man vara försiktig när du tar bort det förbrukade odlingsmedium för att se till att pelleten förblir ostörd vid botten av kärlet. I vissa fall kan det vara bäst att behålla den slutliga odlingsmediet förrän provanalys med hjälp av DLS eller nanopartiklar tracking enhet för att säkerställa OMV pelleten inte förlorat i de sista stegen i protokollet. Nedan finns några ytterligare problem som kan uppstå med både denna protokoll och andra som är anpassade till specifika behov forskarna.
Användningen av PTE i detta system ger en utmärkt modell enzym inkapsling för miljöåterställning av fosfororganiska förorenade områden med PTE är lätt utbytbara genom ett alternativt enzym eller protein av intresse. Som beskrivs här samuttryck av PTE-SC med OmpA-ST resulterade i en stor ökning av den totala PTE expressipå samt högre vesikler produktionsnivåer med mer PTE som förpackas i vesiklarna jämfört med PTE och PTE-SC uttryckt ensam. Genom att reducera antalet interaktioner mellan det yttre membranet och peptidoglykan genom den C-terminala deletion av OmpA hyper-blåsbildning uppnås. Detta ger en enkel väg för bakterierna att exportera det rekombinanta PTE som mildrar de toxiska effekterna som ofta observeras i överuttryck av främmande proteiner.
Medan PTE lätt kan bytas ut i detta modellsystem är det viktigt att notera att inte alla enzymsubstrat fritt kommer att passera genom OMV tvåskiktsmembran och det är därför viktigt att varje unikt enzym och substrat par testas från fall till fall. Även om ett substrat inte passerar genom membranet denna teknik fortfarande kan användas för att framställa och förpacka ett enzym i OMV och tillsatsen av Triton X-100, eller lämplig alternativ ytaktivt medel, kan tillsättas vid tillräcklig leVels att brista vesiklarna före användning.
I frånvaro av rekombinant proteinuttryck och förpackningen kan detta protokoll också fungera som en grundläggande metod för OMV produktion och rening från olika bakteriearter. Alternativa metoder för OMV rening, såsom densitetsgradient fraktionering 22, membranfiltrering 23, och ultrafiltrering 24, också föreligga och kan vara mer lämpliga tekniker beroende på den avsedda tillämpningen. Dessa alternativa reningstekniker kan också lätt kompletteras i detta protokoll i stället för ultracentrifugeringspellete av OMV för den riktade förpackning av ett protein i en OMV genom användning av en biortogonal syntetisk koppling.
Andra modifieringar kan göras till den specifika syntetiska länksystemet som används i detta protokoll samt den valda membran sammanlänkning protein. Det finns olika syntetiska strategier för parning två olika proteins inom ett biologiskt system som inkluderar: split proteiner 25, lindade spolar 26, och split inteiner 27, bara för att nämna några. Andra membranbundna eller transmembranproteiner som OmpF och OMPC skulle sannolikt ge lämpliga ST modifieringsställen samt 28. I vissa fall kan det också vara nödvändigt att byta ST och SC-domäner placera SC på förankrings protein och mycket mindre ST på det rekombinanta enzym / protein. Det finns också ett antal olika kloningsstrategier som kan genomföras här, inklusive användning av flera plasmider under samma eller olika insugningssystem, en enda plasmid med flera proteiner som kodas, eller ens använda homolog rekombination tekniker för att inkorporera hela eller delar av uttrycket systemet i bakteriegenomet.
Den mikro av OMV hjälper till att stabilisera den förpackade enzymet minskar enzymatisk inaktivering som ofta sker under mindre än idealisk storage förhållanden, frysning och upptining och frystorkning 29. Det förväntas också att OMV ger kraftigt förbättrad motståndskraft mot proteolytisk klyvning som OMV tvåskiktsmembran kommer att fungera som en fysisk barriär mellan det aktiva enzymet och proteiner som finns i den extra OMV utrymme. Detta protokoll kan vidare utvidgas till att omfatta en yttre inför liten molekyl, peptid, eller protein tag för att underlätta riktad leverans av OMV inkapslade proteiner och affinitetsrening. Medan PTE valdes för denna unika applikation resultaten av denna studie, och innehållet i detta protokoll, lätt kan användas för att utforma analoga protein förpackningar strategier för användning i diverse läkemedelsleverans, medicinsk diagnostik och miljöåterställning applikationer 30.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| IPTG | Any | Always prepare fresh or aliquot and freeze. | |
| L-arabinose | Any | Can be prepared ahead of time and stored at 4 °C. | |
| Ampicillin | Any | Add immediately prior to use after media cools sufficiently from being autoclaved. | |
| Chloramphenicol | Any | Add immediately prior to use after media cools sufficiently from being autoclaved. | |
| TB/LB Culture Media | Any | Other growth medias will likely work similarly. | |
| Triton X-100 | Any | One of many potential suitable surfactants. | |
| Baffled culture flasks | Any | The baffles promote higher levels of aeration. | |
| CHES | Fisher Bioreagents | BP318-100 | Optimal buffer used for paraoxon degredation (pH > 8). |
| Paraoxon | Chem Service | N-12816 | Very toxic substance to be handled carefully and disposed of properly. |
| Syringe Filter 0.45 µm | Thermo Scientific | 60183-221 (30 mm) | Filter diameter will depend on volume of sample. Low protein binding membrane is critical. |
| Shaker incubator | New Brunswick | Excella E24 | Precise temperature and mixing is essential for reproducable bacterial growth. |
| Sorvall Culture Centrifuge | Thermo Scientific | RC 5B PLUS | Large volume (500 ml) culture centrifuge capable of 7,000 x g. |
| Sorvall Ultracentrifuge | Thermo Scientific | WX Ultra 90 | Capable of centrifugal forces ≥150,000 x g. |
| Ultracentrifuge Rotor | Thermo Scientific | AH-629 | Ensure the proper rotor and tubes are used and that everything is properly balanced. |
| Ultra-Clear Ultracentrifuge Tubes (25 x 89 mm) | Beckman Coulter | 344058 | Ensure no stress fractures are present prior to use and that tubes are presicely balanced. |
| Spectrophotometer | Tecan | Infinite M1000 | Necessary for enzyme kinetic assays. |
| DLS/particle tracking | NanoSight | LM10 | Necessary for OMV size distribution and concentration determination. |
| BL21(DE3) | NEB | Suitable bacterial expression strain. | |
| pET22 | EMD Millipore | 69744-3 | Other plasmids can be used in place of these. |
| pACYC184 | NEB | Other plasmids can be used in place of these. | |
| Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | Example kit. |
References
- Avila-Calderon, E. D., et al. Roles of bacterial membrane vesicles. Arch. Microbiol. 197, 1-10 (2015).
- Kulp, A., Kuehn, M. J. Biological functions and biogenesis of secreted bacterial outer membrane vesicles. Annu. Rev. Microbiol. 64, 163-184 (2010).
- Beveridge, T. Structures of Gram negative cell walls and their derived membrane vesicles. J. Bacteriol. 181, 4725-4733 (1999).
- Kulkarni, H. M., Jagannadham, M. V. Biogenesis and multifaceted roles of outer membrane vesicles from Gram-negative bacteria. Microbiology. 160, 2109-2121 (2014).
- Ellis, T. N., Kuehn, M. J. Virulence and immunomodulatory roles of bacterial outer membrane vesicles. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 74, 81-94 (2010).
- Berleman, J., Auer, M. The role of bacterial outer membrane vesicles for intra- and interspecies delivery. Environ. Microbiol. 15, 347-354 (2013).
- Alves, N. J., et al. Bacterial nanobioreactors-directing enzyme packaging into bacterial outer membrane vesicles. ACS Appl. Mater. Interfaces. 7, 24963-24972 (2015).
- Kim, J. Y., et al. Engineered bacterial outer membrane vesicles with enhanced functionality. J. Mol. Biol. 380, 51-66 (2008).
- Haurat, M. F., et al. Selective sorting of cargo proteins into bacterial membrane vesicles. J. Biol. Chem. 286, 1269-1276 (2011).
- Kesty, N. C., Kuehn, M. J. Incorporation of heterologous outer membrane and periplasmic proteins into Escherichia coli outer membrane vesicles. J. Biol. Chem. 279, 2069-2076 (2003).
- Zakeri, B., et al. Peptide tag forming a rapid covalent bond to a protein, through engineering a bacterial adhesion. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109, e690-e697 (2012).
- Li, L., Fierer, J. O., Rapoport, T. A., Howarth, M. Structural analysis and optimization of the covalent association between SpyCatcher and a peptide tag. J. Mol. Biol. 426, 309-317 (2014).
- Dumas, D. P., Durst, H. D., Landis, W. G., Raushel, F. M., Wild, J. R. Inactivation of organophosphorus nerve agents by the phophotriesterase from Pseudomonas-Diminuta. Arch. Biochem. Biophys. 277, 155-159 (1990).
- Bigley, A. N., Raushel, F. M. Catalytic mechanisms for phosphotriesterases. Biochimica et Biochim. Biophys. Acta, Proteins Proteomics. 1834, 443-453 (2013).
- Minton, N. A., Murray, V. S. G. A review of organo-phosphate poisoning. Med. Toxicol. Adverse Drug Exper. 3, 350-375 (1988).
- Bigley, A. N., Xu, C., Henderson, T. J., Harvey, S. P., Raushel, F. M. Enzymatic neutralization of the chemical warfare agent VX: Evolution of phosphotriesterase for phosphorothiolate hydrolysis. J. Am. Chem. Soc. 135, 10426-10432 (2013).
- Chatterjee, S. N., Chaudhuri, K. Gram-negative bacteria: the cell membranes. Outer Membrane Vesicles of Bacteria. SpringerBriefs in Microbiology. , 15-34 (2012).
- Wang, Y. The function of OmpA in Escherichia coli. Biochem. Biophys. Res. Commun. 292, 396-401 (2002).
- Danoff, E. J., Fleming, K. G. The soluble, periplasmic domain of OmpA folds as an independent unit and displays chaperone activity by reducing the self-association propensity of the unfolded OmpA transmembrane beta-barrel. Biophys. Chem. 159, 194-204 (2011).
- Alves, N. J., Kline, J. A. Comparative study on the inhibition of plasmin and delta-plasmin via benzamidine derivatives. Biochem. Biophys. Res. Commun. 457, 358-362 (2015).
- Wang, W. Lyophilization and development of solid protein pharmaceuticals. Int. J. Pharm. 203, 1-60 (2000).
- Goormaghtigh, E., Scarborough, G. A. Density-based separation of liposomes by glycerol gradient centrifugation. Anal. Biochem. 159, 122-131 (1986).
- Alves, N. J., et al. Functionalized liposome purification via Liposome Extruder Purification (LEP). Analyst. 138, 4746-4751 (2013).
- Mayer, L. D., StOnge, G. Determination of free and liposome-associated doxorubicin and vincristine levels in plasma under equilibrium conditions employing ultrafiltration techniques. Anal. Biochem. 232, 149-157 (1995).
- Blakeley, B. D., Chapman, A. M., McNaughton, B. R. Split-superpositive GFP reassembly is a fast, efficient, and robust method for detecting protein-protein interactions in vivo. Mol. BioSyst. 8 (2036), (2012).
- De Crescenzo, G., Litowski, J. R., Hodges, R. S., O'Connor-McCourt, M. D. Real-time monitoring of the interacation of two-stranded de novo designed coiled-coils: effect of chain length on the kinetic and thermodynamic constants of binding. Biochemistry. 42, 1754-1763 (2003).
- Charalambous, A., Antoniades, I., Christodoulou, N., Skourides, P. A. Split-Intein for simultaneous site-specific conjugation of quantum dots to multiple protein targets in vivo. J. Nanobiotechnol. 9, 1-14 (2011).
- Lee, E. Y., et al. Global proteomic profiling of native outer membrane vesicles derived fromEscherichia coli. Proteomics. 7, 3143-3153 (2007).
- Alves, N. J., Turner, K. B., Medintz, I. L., Walper, S. A. Protecting enzymatic function through directed packaging into bacterial outer membrane vesicles. Sci. Rep. 6, 24866 (2016).
- Alves, N. J., Turner, K. B., Medintz, I. L., Walper, S. A. Emerging therapeutic delivery capabilities and challenges utilizing enzyme/protein packaged bacterial vesicles. Ther. Delivery. 6, 873-887 (2015).
