Abstract
En stigende interesse i at anvende syntetisk biologi teknikker til at programmere ydre membran vesikler (OMV) fører til nogle meget interessante og unikke applikationer til OMV hvor traditionelle nanopartikler beviser for svært at syntetisere. Til dato har alle gramnegative bakterier vist sig at producere OMV demonstrerer emballering af en række af last, der omfatter små molekyler, peptider, proteiner og genetisk materiale. Baseret på deres forskelligartede fragt, er OMV impliceret i mange biologiske processer lige fra celle-celle-kommunikation til genoverføring og levering af virulensfaktorer afhængig af hvilken bakterier producerer OMV. Først for nylig har bakteriel OMV blevet tilgængelige til brug på tværs af en bred vifte af applikationer gennem udvikling af teknikker til kontrol og direkte pakning af rekombinante proteiner i OMV. Denne protokol beskriver en fremgangsmåde til fremstilling, oprensning og anvendelse af enzym emballeret OMV fastlæggelse af forbedret overall produktion af rekombinant enzym, øget blæredannelse, og øget enzym stabilitet. Vellykket anvendelse af denne protokol vil resultere i skabelse af en bakteriestamme, der samtidig producerer et rekombinant protein og dirigerer det til OMV indkapsling ved at skabe en syntetisk binding mellem det rekombinante protein og en ydre membran anker-protein. Denne protokol beskriver også metoder til isolering OMV fra bakteriekulturer samt ordentlig håndtering teknikker og ting at overveje, når at tilpasse dette protokol til brug for andre unikke applikationer såsom: farmaceutiske stof levering, medicinsk diagnostik, og udbedring af miljøskader.
Introduction
Præsenteret her er en metode til design, produktion og oprensning af enzym-loaded bakterielle ydre membran vesikler (OMV). OMV er små, primært unilamellære, proteoliposomer, der varierer i størrelse fra 30-200 nm 1,2. Alle Gram-negative og Gram-positive bakterier, der er blevet undersøgt til dato har vist frigivelse af enten OMV eller ekstracellulære vesikler (EV) fra deres overflade 3,4. Den præcise mekanisme, hvorved OMV produceres endnu ikke er fuldstændigt belyst på grund af de forskellige bakterielle populationer, der secernerer dem samt de varierende funktioner som de betjener. OMV har vist sig at transportere en bred vifte af gods fra små molekyler, peptider og proteiner til genetisk materiale betjener en række komplekse signalering, gen translokation, og virulens fungerer 5,6.
De nøjagtige mekanismer OMV biogenese er ikke godt karakteriseret, og synes at variere mellem bakteriearter. trods this Faktisk har vi udviklet en fremgangsmåde til forøgelse af emballagen effektiviteten af et rekombinant protein i OMV ved at skabe en syntetisk binding mellem et protein af interesse og en højt rigelige protein endogent for den bakterielle ydre membran og efterfølgende OMV. I mangel af en syntetisk binding, eller kunstigt inkorporeret affinitet mellem det rekombinant udtrykte protein og OMV den observerede emballage effektivitet er meget lav 7. Dette resultat er forventeligt som inkorporering af proteinerne i OMV enten sker gennem tilfældig chance indkapsling på det præcise tidspunkt for OMV dannelse på den bakterielle overflade eller gennem rettet emballage ved mekanismer, der ikke er godt forstået. er blevet observeret en vis succes i emballage proteiner blot ved overekspression i det periplasmiske rum, der er afhængig af tilfældig chance indkapsling men effektiv emballage er meget afhængig med nogle proteiner emballage ved høj effektivitet protein i forhold til andre thved ikke pakke overhovedet 8-10. Ved at udnytte fælles syntetisk biologi teknikker søgte vi at ingeniør Escherichia coli (E. coli) til samtidig at producere, pakke og udskiller et aktivt enzym af interesse i OMV, der omgår nuværende begrænsninger viden om, hvordan OMV dannes, og hvordan lasten er valgt af bakterierne for emballering.
Med henblik på denne ansøgning blev en split protein bioconjugation-system valgt som den syntetiske sammenkædning af valg for at lette retningsbestemt emballage i OMV. Som navnet antyder en split protein bioconjugation Systemet består af to komplementære subunit domæner, der interagerer med hinanden. De split proteindomæner udvalgt med henblik på denne protokol, er benævnt spycatcher (SC) og SpyTag (ST) domæne og er afledt af Streptococcus pyogenes fibronectin-bindende protein (FbaB) 11. Denne opdeling protein system er usædvanligt i, at whøne de to underenheder er inden nærhed en isopeptidbinding spontant danner mellem den proximale asparaginsyre og lysin aminosyrerester skaber en kovalent binding. Isopeptidbinding dannelse kræver ikke tilsætning af chaperoneproteiner, katalytiske enzymer eller cofaktorer og kan let forekomme ved stuetemperatur (RT) og over et bredt område af fysiologisk relevante betingelser 12.
Som en proof of concept, blev phosphotriesterase (PTE) (EF 3.1.8.1) fra Brevundimonas diminuta udvalgt til at være pakket ind i E. coli stammer OMV 13. PTE indeholder en Binuclear Zn / Zn aktive sted og har evnen til at nedbryde organophosphater gennem en hydrolysereaktion omdannelse aryldialkylphosphates i dialkylphosphates og arylalkoholer 14. Udsættelse for organofosfater forringer ordentlig neurotransmitter funktion gennem hæmme hydrolyse af acetylcholin ved acetylcholinesterase ved neuromuskulære junctions Making organophosphat afledte forbindelser ekstremt farlige 15. Langvarig eller betydelig udsættelse for organofosfater almindeligvis resulterer i ukontrollable kramper og typisk forårsager dødsfald via kvælning. Mens PTE udviser den højeste katalytiske aktivitet over paraoxon, en meget potent insekticid, er det også i stand til at hydrolysere et bredt udvalg af andre pesticider og V / G typen kemisk nervemidler 16. For at lette OMV emballage blev et bakterielt plasmid konstrueret, som koder for en genkonstruktion, der indeholder en inducerbar promotor, en periplasmatisk lokalisering sekvens, og en kort multipelt kloningssite opstrøms for SC gensekvens. Insertion af PTE genet mellem lederen og SC-sekvens tillod etablering af en genetisk switch, der er målrettet mod PTE-SC fusionsproteinet til det periplasmatiske rum for OMV emballage. Mens den indsats, der er beskrevet her fokusere på PTE, enzymgenet er udskiftelige og kan let erstattes med et andet gen-sekvens med FACilitate emballering af en alternativ enzym eller protein.
Som den anden del af den syntetiske kobling, er en rigelig ydre membran protein (OmpA) valgt at præsentere ST peptidsekvensen. Mens valget af anker-protein kan variere, er det vigtigt, at proteinet har en eftergivende domæne, der præsenterer inden det periplasmatiske rum, tolererer fusionskonstruktionen uden at inducere cytotoksicitet, er kendt for at være til stede i OMV, og ikke aggregerer, når det er rekombinant produceret. OmpA er et 37,2 kDa transmembran porin protein, der er kendt for at være højt udtrykt i den bakterielle ydre membran og efterfølgende OMV 17. Det er impliceret i transporten af små molekyler, <2 nm i størrelse, på tværs af bakterielle membran 18. Native OmpA har to strukturelt unikke domæner, en transmembran beta barrel motiv og en periplasmisk opløseligt C-terminale del vides at interagere med peptidoglycan 19. I mutanten OmpA-ST fusion designed her den C-terminale del af OmpA blev slettet og ST blev fusioneret til den periplasmisk vendende N- eller C-terminale ender. Sletning det periplasmiske del af OmpA nedsætter antallet af interaktioner mellem den ydre membran og peptidoglycan resulterer i membranen destabilisering fører til hyper-vesikulation 7. Genomisk OmpA blev opretholdt ud over det rekombinant udtrykte OmpA-ST-konstruktionen at afbøde brutto membran destabilisering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fremstilling af plasmider
- Forbered et plasmid (f.eks pET22), der indeholder ankeret protein (OmpA) fusioneret til en bi-ortogonal sammenkædning domæne (der henvises til i denne protokol som anker-ST), epitop-mærke (såsom 6xHis, myc eller FLAG tags for rensning og identifikation), periplasmiske lokalisering tag, antibiotikaresistens, og passende replikationsstartområde baseret på den valgte bakteriestamme 7.
- Uddrag plasmid-DNA fra overnatskulturer under anvendelse af et kommercielt tilgængeligt DNA-isolering kit efter fabrikantens protokol.
- Fremstilling af et plasmid (f.eks pACYC184) indeholdende enzymet / protein (PTE), der skal emballeres i OMV fusioneret til den komplementære bioorthogonal binding domæne til den for ankeret protein (omhandlet i denne protokol som enzym-SC), epitop-tag, periplasmiske lokalisering tag, antibiotikaresistens, der er anderledes end ankeret protein plasmidet, og passende origi replikere baseret på den valgte bakteriestamme 7.
- Uddrag plasmid-DNA fra overnatskulturer under anvendelse af et kommercielt tilgængeligt DNA-isolering kit efter fabrikantens protokol 7.
2. Dannelse af et OMV Packaging E. coli kultur
- plasmid Isolation
- Oprens plasmider, der koder for enzymet-SC konstruere og anker-ST-konstruktioner fra separate vedligeholdelse cellelinjer under anvendelse af en kommerciel plasmid isolation kit i henhold til producentens protokol 7. Bestem DNA-koncentration og renhed ved måling af absorbans ved 260 nm og 280 nm.
- Co-transformation
- Vælg en E. coli stamme, der er kommercielt tilgængelig for at lette proteinekspression.
BEMÆRK: BL21 (DE3) -celler blev anvendt her. T7 lysogen er nødvendig for ekspression af ankeret-ST-konstruktionen, der er afhængig af T7-promotoren og T7 RNA-polymerase for protEin ekspression. Anvendelse af andre bakteriestammer kræver enten tilstedeværelsen af T7 lysogen gen eller anvendelsen af en anden end pET22 7 plasmid. - Fortynd oprenset plasmid-DNA til ækvivalente molære koncentrationer derefter omdanne dem til kompetente bakterieceller via enten varme shock transformation eller elektroporering i overensstemmelse med producentens protokol for de kompetente celler valgt.
- Plate transformerede celler på antibiotikum-indeholdende Luria-Bertani (LB) agarplader med både ampicillin (pET22) og chloramphenicol (pACYC184); begge er til stede ved endelige koncentrationer på 25 ug / ml.
- Placer dyrkningsskålen ved 37 ° C natten over for at isolere kun kloner indeholdende begge plasmider.
BEMÆRK: Kolonier, der overlever antibiotisk selektion vil blive anvendt til alle fremtidige OMV-præparater. Antibiotika (ampicillin og chloramphenicol) vil blive tilføjet til alle flydende kulturer for at opretholde selektivt tryk og sikre tilstedeværelsen af begge plasmider.
- Vælg en E. coli stamme, der er kommercielt tilgængelig for at lette proteinekspression.
3. OMV Production
- Colony Expansion
- Inokulere 5 ml dyrkningsmedier (typisk Terrific Broth (TB) eller LB) indeholdende antibiotika på ovennævnte koncentrationer (trin 2.2.3) med en enkelt koloni fra udvælgelsespladerne beskrevet i 2.2.4.
- Udfør en 1: 100 gange fortynding af natten starterkultur til afskærmede dyrkningskolber.
BEMÆRK: Brug en mængde medier mellem 250-500 ml. - Opretholde kulturen ved 37 ° C under omrystning ved 250 rpm for at sikre, at tilstrækkelig beluftning af kulturen er opnået.
- Induktion af hvert plasmid
- Tillad bakteriekulturen til at vokse til en OD600 på 0,6-0,8, ca. 3 timer af vækst efter podning med den primære vækst kolben.
- At forbedre det endelige udbytte af PTE-SC lastet vesikler, centrifugeres hele kulturen ved 7.000 xg i 15 min. Resuspender cellepelleten i forvarmet, frisk dyrkningsmedium.
BEMÆRK: Denne optional trin medvirker til at fjerne et tomt OMV der er til stede i dyrkningsmedierne før PTE-SC induktion. - Foretag en 20% stamopløsning af L-arabinose i vand og sterilt filter under anvendelse af et 0,22 um filter. Store L-arabinose opløsning ved 4 ° C i 2-4 uger.
- Tilsæt L-arabinose løsning til kulturen kolben til en slutkoncentration på 0,2% at initiere PTE-SC produktion.
BEMÆRK: Dette er med til at preload det periplasmiske rum med PTE-SC før fremme øget vesikulation gennem induktion af mutant OmpA-ST. - Lav en 1 M Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranosid (IPTG) opløsning i vand og sterilt filter under anvendelse af et 0,22 um filter.
BEMÆRK: IPTG skal anvendes øjeblikkeligt, når hydreret. Portioner af IPTG kan opbevares frosset i 3-6 måneder og kan optøs umiddelbart før brug. - Tilføj IPTG efter yderligere 3 timers inkubationsperiode til en slutkoncentration på 0,5 mM til initiere produktionen af OmpA-ST.
- Tillad culTURE at vokse i yderligere 8-14 timer ved 37 ° C under omrystning.
4. OMV Oprensning
- Fjernelse af intakte bakterier
- Centrifugeres den bakterielle dyrkningsmedier i 15 minutter ved 7.000 xg ved 4 ° C for at pelletere intakte bakterier.
- Dekanteres, og gemme, medierne fra toppen af cellepelleten indlæg centrifugering være omhyggelig med at ikke forstyrre cellepelleten.
- Gentag trin 4.1.1 og 4.1.2 for en ekstra centrifugering cyklus for at sikre, at alle intakte bakterier fjernes fra dyrkningsmedier og sørg for at dekantere og gemme medierne.
- Fjernelse af proteinaggregater
- Yderligere at oprense bakterielle dyrkningsmedier under anvendelse af en 0,45 um membranfilter for at fjerne resterende bakterier og uønsket store cellemateriale.
BEMÆRK: Brug et biologisk kompatibelt membran materiale for højere inddrivelser og lavere proteinadsorption såsom celluloseacetat (CA) eller polyvinylidendifluorid (PVDF). Sprøjtefilter rumfang under 100 ml og vakuumfilter mængder på over 100 ml.- Til sprøjte filter, tegne dyrkningsmedium i sterilt 10-50 ml sprøjte. Vedhæfte 0,45 um filter til Luer ende af sprøjten. Tryk stemplet og indsamle gennemstrømning i et nyt fartøj.
- Til vakuum filter, overføre dyrkningsmedium til en steril filtrering apparat. Fastgør enheden til vakuumpumpe eller synke sug til at generere sugning. Overførsel til nyt fartøj filtreret medium.
- Yderligere at oprense bakterielle dyrkningsmedier under anvendelse af en 0,45 um membranfilter for at fjerne resterende bakterier og uønsket store cellemateriale.
- Isolering af OMV via Ultracentifugering
- Tilsæt filtrerede kultur medier i centrifugering rør være omhyggelig med at balancere modsatrettede rør i centrifugen.
- Pellet på ~ 150.000 xg i 3 timer ved 4 ° C i en ultracentrifuge anvendelse af den tilsvarende rotor matching både instrumentet og rør bliver udnyttet.
- Dekanteres OMV udtømte dyrkningsmedier fra OMV pellet, og pas på ikke at forstyrre OMV pellet, straks ved afslutningen of centrifugering som gør det muligt for OMV pellet at forblive i medierne vil blødgøre pillen reducerer OMV opsving.
BEMÆRK: Denne pellet vil være lidt brun og afhængigt af grundbeløbet for bakteriekultur måske eller måske ikke være synlig med det blotte øje. Opsugning medierne direkte fra toppen af centrifugerør er også en mulighed i betragtning af at de flere medier fjernet fra OMV pelletere mere ren den endelige OMV prøven vil være. - Gem den centrifugerede supernatant til senere dynamisk lysspredning (DLS) test for at kontrollere, at OMV partiklerne var fuldt opbrugt fra medierne.
- Tilsættes 0,5-1 ml sterilfiltreret phosphatbufret saltvand (PBS) pH 7,4 eller 100 mM N-cyclohexyl-2-aminoethansulfonsyre (CHES) puffer ved pH 8,0 til OMV pellet tillader det at inkubere i 30 minutter ved stuetemperatur. Sørg for, at pillen ikke tørrer.
BEMÆRK: Ekstreme i opløsning ionstyrke, pH og temperatur kan resultere i reduceret OMV opløselighed og fremme aggregelse. - pipetteres forsigtigt oprensede OMV opløsningen fra centrifugerøret, blanding forsigtigt for at sikre, at hele pellet er blevet solubiliseret.
5. OMV Karakterisering
- Brug en kommercielt tilgængelig DLS eller nanopartikel tracking software efter den leveres producentens protokoller unikke for hvert enkelt instrument til at bestemme OMV størrelsesfordeling og koncentration partikel.
BEMÆRK: Her blev OMV størrelsesfordeling og koncentration bestemmes udnytte NanoSight LM10 Nanopartikel Tracking og NTA 2.3 Analyse software.- Åbne softwaren.
- Tænd mikroskop og rengør alle overflader på mikroskopet og nanopartikel sporing enhed.
- Tilføj ~ 0,5 ml OMV prøve direkte til visning vindue af partiklen tracking enhed gennem Luer fitting med en 1 ml steril sprøjte og sørg for at dække hele visning vindue uden at injicere nogen luftbobler i systemet.
- Placer than nanopartikel sporing enhed på mikroskopet scenen og tænd laseren.
- Klik på "Capture" i softwaren.
- Juster mikroskop fokus og iscenesætte at visualisere partiklerne på preview skærmen til stede i softwaren vinduet.
- Juster "Camera Shutter" og "Camera Gain", indtil lyse partikler er klart visualiseret på en mørk baggrund.
- Juster capture varighed til 60 sek.
- Klik på "Record".
- Når du bliver bedt, indtaste / enhedens temperatur prøve, mærke prøven, og gemme videodata ved afslutningen af den enkelte løbe ind i en bruger, der er udpeget mappe.
- Hold alle analyseparametre (Detection Threshold, Blur, Min Track Længde, Min Forventet Particle Size) på auto opdage mode og klik på "Process Sequence".
BEMÆRK: Se manualen for, hvordan hver enkelt parameter kan indstilles uafhængigt at finjustere analyseresultater. - Optag partikelstørrelsesfordeling og partikler / ml koncentration som bestemt ved softwaren.
BEMÆRK: En typisk OMV hydrodynamisk størrelse er mellem 30-200 nm med en partikel / ml koncentration af ~ 10 x 10 8.
- Bestemmelse OMV Protein Content
- Brug standard SDS-PAGE og Western blot-protokoller til at vurdere OMV renhed, enzymproduktion, og SC-ST krydsbinding effektivitet 7.
BEMÆRK: Tværbinding effektivitet vil ikke være 100% 7.
- Brug standard SDS-PAGE og Western blot-protokoller til at vurdere OMV renhed, enzymproduktion, og SC-ST krydsbinding effektivitet 7.
6. Verifikation af Enzyme Packaging
- PTE Activity Assay
- Udføre alle enzymatiske assays i en egnet puffer, såsom 100 mM CHES buffer (pH 8) ved 25 ° C i enten en kuvette eller multiplekset i en plade med 96/384.
- Tilsæt 5 pi af en 1: 1.000 fortynding af paraoxon i CHES buffer til 90 pi CHES og 5 pi oprenset OMV (~ 36-fold koncentreret sammenlignet med OMV-koncentration til stede i dyrkningsmedierne).
Advarsel: paraoxon er et giftigt pesticidog skal håndteres pr producent og institutionelle retningslinier. - Tag absorbanslæsninger med regelmæssige mellemrum (hver 20 sek for ~ 2 timer total reaktionstid) ved 405 nm (ε = 18,1 mM-1cm-1) og ved 348 nm (isosbestiske punkt ε = 5,4 mM-1cm-1) til overvåge reaktionen progression af det chromogene paraoxon nedbrydningsprodukt, p-nitrophenol.
BEMÆRK: Ved pH-værdier over 8 den dominerende deprotonerede form af p-nitrophenol til stede muliggør nøjagtig overvågning ved 405 nm. I alle andre kompleks eller lavere pH-opløsninger er det nødvendigt at udnytte den isosbestiske punkt på 348 nm som multiple former af p-nitrophenol til stede. - Beregn indledende reaktionshastigheder ved at bestemme hældningen af den lineære del af statusrapporterne Kurverne fra trin 6.1.3 at sammenligne den relative mængde PTE i hver prøve, emballering effektivitet, og den samlede PTE produktion.
- Udfør standard enzymatiskeassayprotokoller at bestemme K M, V max og kcat for OMV indkapslede PTE.
BEMÆRK: En Lineweaver-Burk-analyse kan anvendes til bestemmelse af disse kinetiske parametre, hvor y-skæringspunkt = 1 / V max og hældning = K M / V max 20.
- Transmembrane Substrat / Produkt Diffusion.
- Udfør den samme kinetiske assay-analyse som beskrevet i trin 6.1 under anvendelse stigende koncentrationer af Triton X-100 i CHES buffer fra 0-3 vol-%.
BEMÆRK: Tilsætning af Triton X-100 til de solubiliserede OMV funktioner til at forstyrre lipiddobbeltlaget tillader indholdet af OMV at være frit tilgængelig til reaktionsopløsningen. - Beregne og sammenligne de indledende hastigheder på hvert Triton X-100 plan for at verificere transmembrane passage af substratet / produkt angivet med en minimal ændring af enzymaktivitet (indledende hastigheder) sammenlignet med enzymaktivitet in fravær af Triton X-100. Hvis der observeres en betydelig stigning i enzymaktivitet i nærvær af Triton X-100 er det sandsynligt, at substratet ikke frit diffundere ind i OMV.
- Assay fri enzymaktivitet (som beskrevet ovenfor i afsnit 6.1) i nærværelse af Triton X-100 for at verificere, at enzymaktiviteten inhiberes ikke af selve overfladeaktive middel.
BEMÆRK: Hvis aktiviteten spænder påvirkes af Triton X-100, alternative additiver, såsom saponiner eller forskellige polysorbat / tween overfladeaktive midler kan være mere egnet til at sprænge OMV membran.
- Udfør den samme kinetiske assay-analyse som beskrevet i trin 6.1 under anvendelse stigende koncentrationer af Triton X-100 i CHES buffer fra 0-3 vol-%.
7. OMV Opbevaring
- Fryser
- Place ~ 100 ul portioner af renset OMV direkte i flydende nitrogen til at snap fryse portioner bliver sikker på ikke fuldt dykke hætteglassene eller kontakte nogen flydende nitrogen med selve prøven.
BEMÆRK: Oprenset OMV kan hurtigt nedfrosset direkte i buffer, der blev udvalgt til solubilisering af OMV pellet under purification proces uden ekstra kryobeskyttelsesmidler nødvendige 7. - Opbevar lynfrosset alikvoter ved -80 ° C.
- Optø frosne portioner fra trin 7.1.1 ved at placere dem ved RT være sikker på ikke at opvarme prøverne.
- Før fremstilling alle prøver til opbevaring på denne måde udfører enzymet assayet beskrevet i trin 6.1 sammenligne indledende hastigheder før og efter frysning at kontrollere, at der ikke er nogen signifikant tab i enzymaktivitet efter frysning-optøning.
BEMÆRK: Opbevares oprenset OMV ved 4 ° C, hvis der observeres en reduktion i enzymaktivitet på grund af frysning.
- Place ~ 100 ul portioner af renset OMV direkte i flydende nitrogen til at snap fryse portioner bliver sikker på ikke fuldt dykke hætteglassene eller kontakte nogen flydende nitrogen med selve prøven.
- frysetørring
- Lyofilisere lynfrosset oprensede OMV alikvoter anvender kommercielt tilgængeligt udstyr til frysetørring 21.
- Store lyofiliseret portioner ved stuetemperatur i uger eller ved -80 ° C i mange måneder.
- Tilsæt samme mængde renset vand til den frysetørrede OMV som før lyofilisering og lad stå ved stuetemperatur i 30 min for at rehydrere than prøve. Bland forsigtigt når det er nødvendigt at være sikker på ikke at vortex eller sonikeres OMV.
- Tilføj frysetørret OMV pulver direkte til point-of-care til applikationer, hvor forudgående fortynding / solubilisering er ikke nødvendig.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Samtidig ekspression af to rekombinante proteiner, som er nødvendig for OMV emballagestrategi beskrevet i denne protokol, kan opnås gennem en række forskellige veje. Her blev en to vektor-system med kompatible replikationsoriginer og separate inducerbare genkassetter. Til ekspressionen af PTE-SC konstruere en kommerciel plasmidskelet (pACY184) blev manipuleret til at indeholde en arabinose inducerbar genkassette og en dobbelt arginin periplasmisk lokalisering ledersekvensen efterfulgt af en række af unikke restriktionssteder for at lette kloning af enzymet genet som en fusion til et C-terminalt SC-protein. Plasmidet konstruktion, der koder den ydre membran anker-protein er det kommercielle vektor pET22 som anvender lac-operonet til styring af proteinekspression og pelB periplasmiske lokalisering sekvens. Den korte ST-sekvensen blev klonet ind i trunkerede OmpA-protein forud for Insertion i ekspressionsplasmidet. I begge plasmider, blev den C-terminale hexahistidin-sekvensen opretholdes for at muliggøre samtidig identifikation af fusionsproteinerne i OMV prøver. Konstruktion og karakterisering af disse genkonstruktioner, herunder både de N- og C-terminale ST fusionskonstruktioner til OmpA, er fuldstændigt beskrevet i Alves et al. 7. Genkonstruktionerne beskrevet heri, kan ikke være befordrende for emballering af alle enzymer. I nogle tilfælde kan det være nødvendigt at ændre den periplasmatiske lokalisering signal, de regulatoriske elementer, eller epitop tags. Derudover kan nogle proteiner være uoverkommeligt stor og ude af stand til at tværgående den indre membran helt. Enzymatisk aktivitet og OMV emballage effektivitet kan ikke bestemmes på forhånd og skal bestemmes empirisk for hvert mål protein.
Nedenfor er resultater, som man typisk ville forvente efter en vellykket transporterer out denne protokol. Inkluderet er et skema over de to ST / SC split proteindomæner, OmpA-ST og PTE-SC fusionskonstruktioner samt et eksempel på isopeptide formationen ved den bakterielle ydre membran og efterfølgende indkapsling af PTE-SC i en OMV (figur 1) . Også indbefattet er repræsentative resultater af det oprensede OMV morfologi via SEM samt størrelsesfordeling og absolut OMV koncentration bestemt via partikel tracking software (figur 2). Yderligere karakterisering af OMV proteinindhold og rekombinant proteinekspression ses via SDS-PAGE og Western blot (figur 3). Molekylære vægte for proteiner af interesse specifik for protokollen i henhold her, er som følger: native OmpA (37,2 kDa), OmpA-ST (23 kDa), PTE-SC (51 kDa), OmpA-ST / PTE-SC (74 kDa) . Oprenset OMV bør have et mørkt bånd ved ca. 37 kDa, som er indikativ for meget rigelige native OmpA. Afhængigt af gelen opløsning kan der være flere bands stede i denne region af gelen som OmpA, OmpF og OmpC er alle relativt rigelige og deler en lignende molekylvægt. Et yderligere bånd, der er 2,2 kDa større end OmpA-ST også kan observeres på grund af forkert spaltning af ledersekvensen som et resultat af overvældende E. coli ekspression maskiner. Det er vigtigt at bemærke, at en vellykket oprenset OMV prøven ikke vil have mange andre stærkt udtrykte proteiner. Hvis andre bands er til stede enten oprensningen blev udført forkert eller de bakteriestamme udnyttes kan være emballage andre proteiner ikke blev observeret i denne E. coli BL21 (DE3) stamme.
Endvidere har aktivitetsassays og vesikel ruptur eksperimenter blevet tilvejebragt for at demonstrere repræsentative resultater, som kunne forventes, hvis den enzymatiske substrat frit kan komme ind i OMV gennem transmembrane PORIN proteiner (figur 4). Paraoxon relativt frit kommer ind iOMV gennem endogene transmembrane Porin proteiner til at reagere med det emballerede PTE og reaktionsproduktet, p-nitrophenol, også passerer relativt frit gennem OMV membranen. Dette fænomen vil ikke være allestedsnærværende blandt alle produktområder, substrat og enzym-apparater, og skal eksperimentelt bestemmes. Selvom vellykket OMV brud og enzym frigivelse er blevet set med lave koncentrationer af vaskemiddel og PTE (heri Triton X-100), kan sådanne tilføjelser påvirke aktiviteten af andre enzymer.
Plasmid kort er også medtaget for at vise udformningen af en to-plasmid emballage strategi udnytte SC / ST-systemet (figur 5).
Figur 1: Direkte emballering af proteiner i OMV. Krystalstrukturer for proteinerne anvendes i den beskrevne OMV emballage strattegi: OmpA, PTE, SpyTag (ST) og SpyCatcher (SC); FBF: 2GE4, 1PTA, 4MLI, 4MLI hhv. En skematisk repræsentation af OmpA-ST og PTE-SC fusionskonstruktioner, der er en isopeptidbinding ved den ydre membran af bakterierne er vist. Denne membran fusion driver inkorporering af PTE inden formningen OMV. Figur gengivet (tilpasset) fra Alves et al. ACS Appl Mat Interfaces (2015), 7 (44), s 24,963-24,972 7. Copyright 2015 American Chemical Society. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: OMV karakterisering. (A) SEM af ultracentrifuge oprenset OMV fra native E. coli [BL21 (DE3)]. (B) Repræsentant partikel trac king size fordelinger og (C) samlet vesikel-koncentration i gennemsnit over 90 sek prøve læser for Native OMV, PTE-SC i fravær af arabinose aktivering (PTE-Ingen A), PTE-SC i tilstedeværelse af arabinose aktivering (PTE-A) , N-terminale OmpA-ST co-transformeret med PTE-SC i nærvær af arabinose og IPTG aktivering (PTE / OMV-N), og ultracentrifuge supernatant (UC supernatant). En betydelig stigning i OMV-produktion blev observeret i PTE / OMV-N prøve sammenlignet med det native OMV og PTE-SC-konstruktioner alene. OMV blev kvantificeret i UC supernatanten til at demonstrere en næsten fuldstændig helbredelse af OMV i UC pellet efterlader lidt at ingen OMV i supernatanten efter ultracentrifugering. Alle data repræsenterer middel (± SD) af tredobbelte eksperimenter. Figur gengivet (tilpasset) fra Alves et al. ACS Appl Mat Interfaces (2015), 7 (44), s 24,963-24,972 7. Copyright 2015 American Chemical Society.d / 54.458 / 54458fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Oprenset OMV proteinindhold bestemmelse. (A) SDS-PAGE af den oprensede OMV UC pellet af den C-terminale OmpA-ST-fusion co-udtrykt med PTE-SC (PTE / OMV) konstruere demonstrere repræsentative overflod af OmpA-ST, Native OmpA, PTE-SC og OmpA- ST / PTE-SC isopeptide fusion. (B) Western blot-analyse under anvendelse af den medfølgende his-tag stede i OmpA og PTE konstruktionerne for at lette visualiseringen via et anti-6xHis antistof. Det er vigtigt at bemærke, at PTE vides at dimerisere, hvilket fremgår på blottet ved tilstedeværelsen af større molekylvægt His-mærket arter. Selv om der er meget høje OmpA-ST ekspressionsniveauer observeret der ikke en fuldstændig omdannelse af friPTE-SC til membranbundet OmpA-ST / PTE-SC. På trods af dette faktum, at stigningen i den samlede PTE produktion og forbedret emballage effektivitet tyder på, at mens dannelse covalent binding er ikke allestedsnærværende den ikke-kovalente association af ST og SC-domæner er en vigtig faktor i rettet emballager i den OMV. Figur gengivet (tilpasset) fra Alves et al. ACS Appl Mat Interfaces (2015), 7 (44), s 24,963-24,972 7. Copyright 2015 American Chemical Society. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: PTE aktivitet og emballering karakterisering. (A) Samlet PTE ekspressionsniveauerne og OMV emballage effektivitet bestemmes via indledende hastighedsmålinger udnytte paraoxon som et kromogent substrat sammenligner PTE stede i cellepellets, UC supernatanten, og de oprensede UC OMV-pellets. (B) Repræsentative data, der viser brugen af Triton X-100 (0,5% T100) at forstyrre OMV dobbeltlaget muliggør uhindret adgang for substratet til OMV indre. Sammenligning af disse data til analyser udført i fravær af T100 letter kontrol af translokation af substrat tværs intakte OMV dobbeltlag hvis enzymatiske indledende hastigheder er uændrede. I tilfælde af paraoxon var der meget lidt aktivitet forskel observeret i nærvær eller fravær af T100 indikerer, at paraoxon passerer frit gennem de endogene porer på OMV. (C) PTE-SC kinetiske data passer til standard Michaelis-Menten enzymkinetik ligning for PTE / OMV-N og PTE-A. (D) En Lineweaver-Burk-analyse anvendes til at bestemme K M og kcat / M (48, 4,4 x 10 7 44 um, 4,9 x10 7 sek-1 M-1 henholdsvis) demonstrerer lignende PTE litteratur kinetiske parametre som native enzym (90 uM, 2,7 x 10 7 sek-1 M-1) med R 2 ≥ 0,999 i alle tilfælde. Alle data repræsenterer middel (± SD) af tredobbelte eksperimenter. Figur gengivet (tilpasset) fra Alves et al. ACS Appl Mat Interfaces (2015), 7 (44), s 24,963-24,972 7. Copyright 2015 American Chemical Society. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Repræsentative plasmidkonstruktioner for eksempel her beskrevne system. SpyCatcher modificeret enzym-SC (PTE-SC) plasmid målrettet til indkapsling i OMV (til venstre). SpyTag modifIED membran anker-ST (OmpA-ST-N) plasmid (til højre). Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
This protokolfunktioner at demonstrere en repræsentativ rettet emballage teknik, hvor et enzym af interesse produceres og pakkes i OMV ved E. coli. Som med mange komplekse teknikker der er flere områder, hvor protokollen kan modificeres til at rumme til brug i forskellige unikke applikationer, hvoraf nogle er beskrevet nedenfor. Mens den mekanisme af OMV emballage og enzym indkapsling kan tilpasses specifikke behov der er flere trin i denne protokol, som er afgørende for dens succes. Den indledende fjernelse af intakt bakterie og cellulært debris er af væsentlig betydning og vil påvirke alle downstream forsøg på kvantificering eller prøve analyse. To på hinanden følgende centrifugeringstrin efterfulgt af filtrering er typisk tilstrækkelig til at afhjælpe disse kontaminanter. Men i alle tilfælde skal sørges, når dekantering løsninger efter centrifugering for at minimere overførslen af forurenende stoffer. Tilsvarende endelige OMV pellet obtained efter ultracentrifugering ofte kun løst klæbet til bunden af centrifugerøret. I de sidste stadier, skal der udvises forsigtighed ved fjernelse af brugt dyrkningsmedium for at sikre, at pelleten forbliver uforstyrret i bunden af beholderen. I nogle tilfælde kan det være bedst at beholde den endelige dyrkningsmedium til efter analysen ved hjælp DLS eller nanopartikel sporingsenhed at sikre OMV pellet ikke gik tabt i de sidste trin i protokollen. Nedenfor er nogle ekstra bekymringer, der kan opstå med både denne protokol og andre, der er skræddersyet til specifikke behov forskerne.
Brugen af PTE i dette system giver for en fremragende model enzym indkapsling for udbedring af miljøskader af organophosphat forurenet regioner med PTE bliver let udskiftes med en alternativ enzym eller protein af interesse. Som beskrevet her coekspression af PTE-SC med OmpA-ST resulterede i en stor stigning i den samlede PTE Express godtpå samt højere vesikel produktionsniveau med mere PTE at blive pakket i vesiklerne i forhold til PTE og PTE-SC udtrykt alene. Ved at reducere antallet af interaktioner mellem den ydre membran og peptidoglycan gennem C-terminal deletion af OmpA hyper-vesikeldannelse opnås. Dette giver en nem rute for bakterierne at eksportere det rekombinante PTE, som afbøder de toksiske virkninger, der ofte observeret i overekspression af ikke-hjemmehørende proteiner.
Mens PTE let kan udskiftes i denne model system er det vigtigt at bemærke, at ikke alle enzymsubstrater frit vil passere gennem OMV dobbeltlag, og det er derfor bydende nødvendigt, at hver unikke enzym og substrat par blive testet på en sag til sag. Selv hvis et substrat ikke passerer gennem membranen denne teknik stadig kan anvendes til at fremstille og emballere et enzym i OMV og tilsætning af Triton X-100, eller egnet alternativ overfladeaktivt middel, kan tilsættes på tilstrækkelig leveauer til at sprænge vesiklerne før anvendelse.
I fravær af rekombinant proteinekspression og pakning kan denne protokol også tjene som en grundlæggende fremgangsmåde til OMV produktion og oprensning fra forskellige bakteriearter. Alternative fremgangsmåder til OMV oprensning, såsom densitetsgradientfraktionering 22, membranfiltrering 23, og ultrafiltrering 24, også eksisterer og kan være mere egnede teknikker afhængigt af den tilsigtede anvendelse. Sådanne alternative oprensningsteknikker kan også let suppleres i denne protokol i stedet for ultracentrifugering pelletering af OMV til målrettet emballering af et protein i en OMV ved anvendelse af en bi-ortogonal syntetisk binding.
Andre modifikationer kan foretages til den specifikke syntetiske ledforbindelsessystem anvendt i denne protokol, samt den valgte membran tethering protein. Der er forskellige syntetiske strategier for parring to forskellige proteins inden for et biologisk system, der omfatter: split proteiner 25, coiled spoler 26 og split inteiner 27, bare for at nævne et par stykker. Andre membranbundne eller transmembrane proteiner såsom OmpF og OmpC vil sandsynligvis give egnede ST modifikation sites samt 28. I nogle tilfælde kan det også være nødvendigt at skifte ST og SC domæner placerer SC på forankring protein og den meget mindre ST på det rekombinante enzym / protein. Der er også en række forskellige kloningsstrategier, som kan gennemføres her, herunder brugen af flere plasmider på de samme eller forskellige indsugningssystemer, et enkelt plasmid med multiple proteiner kodet, eller endda udnytte homologe rekombinationsteknikker til at indarbejde alle eller dele af udtrykket systemet i det bakterielle genom.
Mikromiljø OMV bidrager til at stabilisere det emballerede enzym reducere enzymatisk inaktivering der almindeligvis opstår under mindre end ideelle storage betingelser, fryse-tø, og lyofilisering 29. Det forventes også, at OMV vil give meget forbedret resistens over for proteolytisk spaltning som OMV dobbeltlag vil fungere som en fysisk barriere mellem det aktive enzym og de proteiner, der findes i den ekstra-OMV rum. Denne protokol kan yderligere udvides til at omfatte et ydre vendende lille molekyle, peptid eller protein-tag for at lette målrettet afgivelse af OMV indkapslede proteiner og affinitetsoprensning. Mens PTE blev udvalgt til dette enestående program resultaterne af denne undersøgelse, og indholdet af denne protokol, kan nemt bruges til at designe analoge protein emballage strategier til brug i forskellige farmaceutiske levering, medicinske diagnostiske og miljøgenopretningsforanstaltninger applikationer 30.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| IPTG | Any | Always prepare fresh or aliquot and freeze. | |
| L-arabinose | Any | Can be prepared ahead of time and stored at 4 °C. | |
| Ampicillin | Any | Add immediately prior to use after media cools sufficiently from being autoclaved. | |
| Chloramphenicol | Any | Add immediately prior to use after media cools sufficiently from being autoclaved. | |
| TB/LB Culture Media | Any | Other growth medias will likely work similarly. | |
| Triton X-100 | Any | One of many potential suitable surfactants. | |
| Baffled culture flasks | Any | The baffles promote higher levels of aeration. | |
| CHES | Fisher Bioreagents | BP318-100 | Optimal buffer used for paraoxon degredation (pH > 8). |
| Paraoxon | Chem Service | N-12816 | Very toxic substance to be handled carefully and disposed of properly. |
| Syringe Filter 0.45 µm | Thermo Scientific | 60183-221 (30 mm) | Filter diameter will depend on volume of sample. Low protein binding membrane is critical. |
| Shaker incubator | New Brunswick | Excella E24 | Precise temperature and mixing is essential for reproducable bacterial growth. |
| Sorvall Culture Centrifuge | Thermo Scientific | RC 5B PLUS | Large volume (500 ml) culture centrifuge capable of 7,000 x g. |
| Sorvall Ultracentrifuge | Thermo Scientific | WX Ultra 90 | Capable of centrifugal forces ≥150,000 x g. |
| Ultracentrifuge Rotor | Thermo Scientific | AH-629 | Ensure the proper rotor and tubes are used and that everything is properly balanced. |
| Ultra-Clear Ultracentrifuge Tubes (25 x 89 mm) | Beckman Coulter | 344058 | Ensure no stress fractures are present prior to use and that tubes are presicely balanced. |
| Spectrophotometer | Tecan | Infinite M1000 | Necessary for enzyme kinetic assays. |
| DLS/particle tracking | NanoSight | LM10 | Necessary for OMV size distribution and concentration determination. |
| BL21(DE3) | NEB | Suitable bacterial expression strain. | |
| pET22 | EMD Millipore | 69744-3 | Other plasmids can be used in place of these. |
| pACYC184 | NEB | Other plasmids can be used in place of these. | |
| Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | Example kit. |
References
- Avila-Calderon, E. D., et al. Roles of bacterial membrane vesicles. Arch. Microbiol. 197, 1-10 (2015).
- Kulp, A., Kuehn, M. J. Biological functions and biogenesis of secreted bacterial outer membrane vesicles. Annu. Rev. Microbiol. 64, 163-184 (2010).
- Beveridge, T. Structures of Gram negative cell walls and their derived membrane vesicles. J. Bacteriol. 181, 4725-4733 (1999).
- Kulkarni, H. M., Jagannadham, M. V. Biogenesis and multifaceted roles of outer membrane vesicles from Gram-negative bacteria. Microbiology. 160, 2109-2121 (2014).
- Ellis, T. N., Kuehn, M. J. Virulence and immunomodulatory roles of bacterial outer membrane vesicles. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 74, 81-94 (2010).
- Berleman, J., Auer, M. The role of bacterial outer membrane vesicles for intra- and interspecies delivery. Environ. Microbiol. 15, 347-354 (2013).
- Alves, N. J., et al. Bacterial nanobioreactors-directing enzyme packaging into bacterial outer membrane vesicles. ACS Appl. Mater. Interfaces. 7, 24963-24972 (2015).
- Kim, J. Y., et al. Engineered bacterial outer membrane vesicles with enhanced functionality. J. Mol. Biol. 380, 51-66 (2008).
- Haurat, M. F., et al. Selective sorting of cargo proteins into bacterial membrane vesicles. J. Biol. Chem. 286, 1269-1276 (2011).
- Kesty, N. C., Kuehn, M. J. Incorporation of heterologous outer membrane and periplasmic proteins into Escherichia coli outer membrane vesicles. J. Biol. Chem. 279, 2069-2076 (2003).
- Zakeri, B., et al. Peptide tag forming a rapid covalent bond to a protein, through engineering a bacterial adhesion. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109, e690-e697 (2012).
- Li, L., Fierer, J. O., Rapoport, T. A., Howarth, M. Structural analysis and optimization of the covalent association between SpyCatcher and a peptide tag. J. Mol. Biol. 426, 309-317 (2014).
- Dumas, D. P., Durst, H. D., Landis, W. G., Raushel, F. M., Wild, J. R. Inactivation of organophosphorus nerve agents by the phophotriesterase from Pseudomonas-Diminuta. Arch. Biochem. Biophys. 277, 155-159 (1990).
- Bigley, A. N., Raushel, F. M. Catalytic mechanisms for phosphotriesterases. Biochimica et Biochim. Biophys. Acta, Proteins Proteomics. 1834, 443-453 (2013).
- Minton, N. A., Murray, V. S. G. A review of organo-phosphate poisoning. Med. Toxicol. Adverse Drug Exper. 3, 350-375 (1988).
- Bigley, A. N., Xu, C., Henderson, T. J., Harvey, S. P., Raushel, F. M. Enzymatic neutralization of the chemical warfare agent VX: Evolution of phosphotriesterase for phosphorothiolate hydrolysis. J. Am. Chem. Soc. 135, 10426-10432 (2013).
- Chatterjee, S. N., Chaudhuri, K. Gram-negative bacteria: the cell membranes. Outer Membrane Vesicles of Bacteria. SpringerBriefs in Microbiology. , 15-34 (2012).
- Wang, Y. The function of OmpA in Escherichia coli. Biochem. Biophys. Res. Commun. 292, 396-401 (2002).
- Danoff, E. J., Fleming, K. G. The soluble, periplasmic domain of OmpA folds as an independent unit and displays chaperone activity by reducing the self-association propensity of the unfolded OmpA transmembrane beta-barrel. Biophys. Chem. 159, 194-204 (2011).
- Alves, N. J., Kline, J. A. Comparative study on the inhibition of plasmin and delta-plasmin via benzamidine derivatives. Biochem. Biophys. Res. Commun. 457, 358-362 (2015).
- Wang, W. Lyophilization and development of solid protein pharmaceuticals. Int. J. Pharm. 203, 1-60 (2000).
- Goormaghtigh, E., Scarborough, G. A. Density-based separation of liposomes by glycerol gradient centrifugation. Anal. Biochem. 159, 122-131 (1986).
- Alves, N. J., et al. Functionalized liposome purification via Liposome Extruder Purification (LEP). Analyst. 138, 4746-4751 (2013).
- Mayer, L. D., StOnge, G. Determination of free and liposome-associated doxorubicin and vincristine levels in plasma under equilibrium conditions employing ultrafiltration techniques. Anal. Biochem. 232, 149-157 (1995).
- Blakeley, B. D., Chapman, A. M., McNaughton, B. R. Split-superpositive GFP reassembly is a fast, efficient, and robust method for detecting protein-protein interactions in vivo. Mol. BioSyst. 8 (2036), (2012).
- De Crescenzo, G., Litowski, J. R., Hodges, R. S., O'Connor-McCourt, M. D. Real-time monitoring of the interacation of two-stranded de novo designed coiled-coils: effect of chain length on the kinetic and thermodynamic constants of binding. Biochemistry. 42, 1754-1763 (2003).
- Charalambous, A., Antoniades, I., Christodoulou, N., Skourides, P. A. Split-Intein for simultaneous site-specific conjugation of quantum dots to multiple protein targets in vivo. J. Nanobiotechnol. 9, 1-14 (2011).
- Lee, E. Y., et al. Global proteomic profiling of native outer membrane vesicles derived fromEscherichia coli. Proteomics. 7, 3143-3153 (2007).
- Alves, N. J., Turner, K. B., Medintz, I. L., Walper, S. A. Protecting enzymatic function through directed packaging into bacterial outer membrane vesicles. Sci. Rep. 6, 24866 (2016).
- Alves, N. J., Turner, K. B., Medintz, I. L., Walper, S. A. Emerging therapeutic delivery capabilities and challenges utilizing enzyme/protein packaged bacterial vesicles. Ther. Delivery. 6, 873-887 (2015).
