Abstract
Нажмите биохимический были исследованы для использования в многочисленных биоматериалов приложений, в том числе доставки лекарственных средств, тканевой инженерии и клеточной культуры. В частности, свет опосредованной реакции нажатия кнопок, таких как фотоинициированной тиоловых-ена и тиол-ина реакций, получают пространственно-временной контроль над свойствами материалов и открывает возможности для разработки систем с высокой степенью пользователем направленный контроль свойств. Изготовление и модификация гидрогель на основе биоматериалов с использованием точности, обеспечиваемой света и универсальность предлагаемой этими тиол-Х photoclick имеют химий растущий интерес, в частности, для культивирования клеток в четко определенных, биомиметические микросреды. Здесь мы описываем методы для photoencapsulation клеток и последующего photopatterning биохимических репликами в пределах матриц гидрогеля с использованием универсальных и модульные строительные блоки, полимеризованные с помощью реакции photoclick тиол-ена. В частности, подход представляется для сотрудничестваnstructing гидрогели из аллилоксикарбонил (Alloc) -functionalized пептидных сшивок и боковые остатки, пептидные и тиол-функционализированные поли (этиленгликоль) (ПЭГ), которые быстро полимеризуются в присутствии лития acylphosphinate фотоинициатора и cytocompatible доз длинноволнового ультрафиолетового (УФ) света. FACILE методы визуализации photopatterning и количественного определения концентрации пептидов, добавленных описаны. Кроме того, методы устанавливаются для инкапсулирования клеток, специфически человеческих мезенхимальных стволовых клеток, и определение их жизнеспособности и активности. В то время как образование и начальное структурирование тиол-Alloc гидрогелей приведены здесь, эти методы широко могут быть применены к ряду других легких и радикально-инициируемых систем материала (например, тиол-норборнен, тиол-акрилат) с образованием узорных субстратов.
Introduction
Нажмите биохимический все чаще используются при разработке материалов для многочисленных биомедицинских применений, в том числе доставки лекарственных средств, тканевой инженерии, и контролируемой культуре клеток, вследствие их селективных, эффективных и часто cytocompatible реакционными. 1-3 Photoclick химии , которые используют свет для запуска или инициировать реакции (например, азид-алкина, 4 тиол-ена, 5 и тетразол-алкен 6) представляют особый интерес для формирования или модификации биоматериалов. Быстрые темпы в мягких условиях и контроля , когда и где они происходят со светом делают эти реакции хорошо подходит для пользователя направленного управления биоматериала свойств в присутствии клеток. 7,8 В частности, тиол-ена photoclick биохимический были использованы для генерации гидрогель на основе биоматериалов с прочными механическими свойствами и 5,9 для инкапсулирования широкого спектра типов клеток, в том числе, но нет в ограничительном смысле , мезенхимальных стволовых клеток человека (hMSCs), фибробласты, хондроциты и клетки поджелудочной железы, с перспективны для культуры и доставки клеток. 10,11 Кроме того, эти химические составы были использованы для пространственного паттернировании биохимических репликами , чтобы имитировать основные аспекты родной микросреды клеток и облегчения соответствующих клетка-матрица взаимодействий, в том числе адгезию, дифференцировку и вторжения. 3,12
Для строительства тиоловых-ен гидрогели со светом, пептиды , содержащие цистеинов (тиол) обычно вступают в реакцию с полимерами , функционализированных акрилатов или норборненов ( «ВСВ») для быстрого, фотоинициированной полимеризации при cytocompatible условиях. 13 Расширение этого инструментария, мы стремились создать методы формирования гидрогеля с новыми универсальными и доступными строительными блоками, которые требуют минимального синтетической обработки или были коммерчески доступны к их широкому использованию в качестве синтетических матриц. внеклеточного14 В частности, пептиды были модифицированы с аллилоксикарбонил (Alloc) лизинов: охраняемыми один для кулона, интегрин-связывающим группы для содействия клеточной адгезии [K (Alloc) GWGRGDS = Pep1Alloc] или два для неразлагающихся или клеточно-разлагаемые сшивок [K ( Alloc) RGKGRKGK (Alloc) G или KK (Alloc) GGPQGIWGQGK (Alloc) K = Pep2Alloc соответственно]. С использованием этих последовательностей, были созданы условия для быстрой реакции (1-5 мин) с четырьмя плеча тиол-модифицированные поли (этиленгликоль) (PEG4SH) с использованием cytocompatible дозы с большой длиной волны УФ - излучения (10 мВт / см 2 при 365 нм) и фотоинициатор лития фенил-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP). Полученные гидрогели были стабильны в условиях культивирования клеток в течение нескольких недель. Чтобы включить разложение и реконструирование клеток приводом, ферментативно расщепл емую пептид был включен в сшивок гель (т.е. GPQGIWGQ), 15 и модели первичной клетки, мезенхимальных стволовых клеток человека (hMSCs), остается весьма жизнеспособными после того, как инкапсуляция и Дьюринг культуры в пределах этих матриц. Кроме того, пептиды были пространственно узорной в этих материалах, и hMSCs сохраняют жизнеспособность и метаболическую активность в условиях photopatterning. Альтернативные последовательности кулон пептид, который не показан здесь (например, IKVAV, YIGSR, GFOGER и т.д.), также могут быть включены в матрицах , чтобы исследовать дополнительные взаимодействия клеток с окружающей микросреды. Эти результаты являются перспективными для применения этих гидрогелевых материалов на основе трехмерных (3D) культуры и доставки клеток для изучения и прямых взаимодействий клетка-матрикс для различных типов клеток.
При этом методы photoencapsulate клетки и впоследствии photopattern биохимические сигналы в рамках предлагаемой системы гидрогеля представлены (Рисунок 1). Методы для наблюдения и количественной оценки этих photopatterns также демонстрируются: в частности, я) количественное и качественное использование анализа Эллмана для определения modificaции свободных тиолов в пределах узорчатых субстратов и II) комплементарной качественного использования флуоресцентных пептидов (AF488Pep1Alloc) , чтобы наблюдать эти модели в трех измерениях. Кроме того, анализы для определения жизнеспособности (живой / мертвый жизнеспособность / цитотоксичность окрашивание) и метаболической активности (МТС; 3- (4,5-диметилтиазол-2-ил) -5- (3-карбоксиметоксифенил) -2- (4-сульфофенил) -2H-тетразолия) представлены таким образом, чтобы пользователи могли определить cytocompatibility из photoencapsulation и photopatterning условий для различных клеточных линий внутри матриц гидрогеля. В то время как протокол демонстрируется на легкому света на основе системы photoclick гидрогеля, эти способы могут быть применены ко многим другим радикально-инициируемых гидрогелевых систем photoencapsulation и photopatterning в присутствии клеток.
Protocol
1. Подготовка материалов для формирования гидрогеля
- Обобщать подвеска (Pep1Alloc, AF488Pep1Alloc) и сшивающие пептиды (Pep2Alloc) с помощью стандартного твердофазного пептидного синтеза (SPPS) технические приемы и тиол-функционализированный полимер , путем трехступенчатой процедуры для концевых групп модификации (PEG4SH). 14,16 Кроме того , покупка PEG4SH (M п ~ 20 кДа), Pep1Alloc и Pep2Alloc на коммерческой основе .
- Обобщить фотоинициатор (LAP) с помощью двухступенчатой реакции , описанной ниже. 14,17 Выполните шаги синтеза (1.2.1-1.2.11) в вытяжном шкафу и соблюдайте осторожность при обращении с химическими веществами (носить защитные перчатки, одежду и очки) , LAP также могут быть приобретены на коммерческой основе.
- Сухое все изделия из стекла в печи (> 2 ч, 80 ° C).
- Добавьте мешалку в пустой одной горловую круглодонную колбу (100 мл) и крышки с перегородкой.
- Закрепить колбу на верхней части магнитной мешалки перемешивают в плитке с кольцевой стойкой и зажимом.
- яnsert иглу (18 G) через перегородку и оставить наружный конец открыт в атмосферу. Вставьте вторую иглу, прикрепленную к инертного газа линии. Открыть инертную газовую линию (например, аргон или азот) и продуть колбы в течение 10-15 мин.
Примечание: Система будет непрерывно продувают инертным газом, аргоном или азотом, в течение всей реакции. - Передача 1,5 г (~ 1,4 мл) диметиловый фенилфосфонит (ОСТОРОЖНО) в колбу с помощью шприца с иглой, чтобы проникнуть через перегородку. Включите мешалке (средняя скорость) и быть осторожным, чтобы содержимое не брызнуть на стенках колбы.
- Добавьте 1,6 г (~ 1,46 мл) по каплям 2,4,6-триметилбензоил (ОСТОРОЖНО) в колбу, содержащую диметиловый фенилфосфонит, используя шприц с иглой проколоть перегородку.
- Накройте реакционный сосуд с фольгой для защиты от света и перемешивают в течение 18 ч в атмосфере аргона или азота.
- На следующий день, увеличить высоту колбы, поместите масляную баню на мешалкой,Н.Д. осторожно опустите колбы в масляной ванне. Нагревают ванну и колбу до 50 ° С при сохранении перемешивании магнитной мешалкой.
- Растворить 3,05 г бромида лития в 50 мл 2-бутанона. Поднимите колбу из масляной бани и добавляют раствор лития бромистого в круглодонную колбу, на короткое время удаления перегородку наливать в колбу.
- Уплотнение колбу снова с перегородке (ВНИМАНИЕ: Перегородка будет по-прежнему иметь иглу, ведущую к линиям аргона и иглой обезвоздушивание), опустить колбу обратно в масляную баню, нагретую, и позволяют реакции протекать в течение 10 мин. Твердый осадок будет формироваться.
- Через 10 минут, выключите аргон, снимите колбу с огня и дайте смеси отдыхать в течение 4 ч (покрытой фольгой для защиты от света, как светочувствительный инициатор был произведен. Держите вентиляционное отверстие иглы место.
- Налейте продукт в фритты воронку стеклянную или воронку выстлана соответствующей фильтровальной бумагой. Полоскание фильтрат 3 раза с помощью 50 мл 2-бутанона до галить любой непрореагировавший бромид лития.
- Сухая (сначала на настольном , а затем в вакуум - эксикаторе) и анализировать продукт 1 H ЯМР в D 2 O. Характеристические пики при 1,8-1,9 (6H, с), 2,1-2,2 (3Н, с), 6,7-6,8 (2H, с), 7,3-7,4 (2H, м), 7,4-7,5 (1H, м), и 7,5 -7,7 (2H, м). 14,17
- Используйте таблицу для расчета объема и концентрации каждого исходного раствора (PEG4SH, Pep1Alloc, Pep2Alloc, LAP) , которые должны быть готовы , чтобы сделать гидрогели (таблица 1). Для того, чтобы не-узорной гели, убедитесь, что [SH] = [Alloc] так, чтобы все реактивные группы потребляются в процессе полимеризации. Если photopatterning гелей планируется, включают избыточное количество тиоловых функциональных групп в процессе формирования геля на основе стехиометрии (например, 0,2-5 мМ, [SH]> [Alloc]) для последующего взаимодействия с Pep1Alloc.
Примечание: Гели должен содержать больше, чем 5 массовых процентов (% мас) PEG4SH для обеспечения быстрой полимеризации (в течение 5 мин). Тем не менее, нижний диапазон масс%s могут быть изучены , если приложение требует гидрогели с более низкими модулями (например, <0,5 кПа); полимеризации должны быть проверены и скорректированы соответствующим образом для этих низких% вес композиций. Аналогичным образом , концентрация Pep1Alloc может быть отрегулирована для различных областей применения (например, 0,2-5 мм), описанными в литературе для тиоловых функционализованных пептидов. 18-21 концентрация LAP рекомендуется около 0,067% масс (2,2 мм) или менее, как описано, как более высокие концентрации могут уменьшить жизнеспособность клеток. - Подготовить исходные растворы Pep1Alloc, Pep2Alloc, PEG4SH и LAP в стерильных условиях для культивирования клеток на основе расчетов в таблице 1.
- Для Pep1Alloc и Pep2Alloc, по отдельности взвешивают общую массу Pep1Alloc и Pep2Alloc из синтеза пептидов и растворяют в стерильном фосфатно-буферным солевым раствором (PBS), содержащем 1% пенициллина / стрептомицина (PS) и 0,5 мкг / мл фунгизона (ФЗ). Типичные концентрации приготовленного диапазона исходных растворовот 20-100 мг / мл пептида. Смешайте эти запасы для достижения гели с окончательной модулей , имеющих значение для применений мягких тканей (модуль Юнга ~ 0,5-5 кПа). 22,23 аликвота и хранят при -20 ° С до использования.
- Для PEG4SH, весят PEG4SH в стерильную пробирку микроцентрифужных и растворить в PBS + PS + ФЗ. Типичные концентрации этого диапазона исходного раствора от 250-430 мг / мл (20-30% PEG4SH по весу).
- Для LAP, взвешивать LAP в стерильную центрифужную пробирку и растворяют в PBS + PS + FZ до конечной концентрации 7,5 мг / мл.
Примечание: Подготовка свежих решений PEG4SH и LAP рекомендуется для каждого инкапсулирования или геля эксперимента, чтобы обеспечить постоянное время полимеризации.
- Подготовка стерильным шприцем Tip Пресс-формы для формирования гидрогелей.
- Аккуратно вырежьте советы прочь 1 мл шприцы с помощью лезвия бритвы, а затем удалить плунжеры из шприца валов.
- Погрузите шприцами валов и плунжеров в 70% этаноле в течение 15 мин апе место в стерильной капот культуре клеток высохнуть (30 мин). Если избыточные капли этанола остаются внутри шприца вала, используйте поршень, чтобы вытолкнуть их.
- Подготовить стерильный предметное стекло пресс-форм для формирования гидрогелей.
- Замочите стеклах (кратные 2) и резиновые прокладки (толщиной 0,254 мм, 2 небольшие кусочки, используемые в качестве прокладок, прямоугольник с дисками, выбито, или квадратная форма рамы) в 70% этаноле в течение 15 мин, и место в стерильной капот культуре клеток сушить.
- Шерсть половина стерилизованных слайдам с помощью анти-клеевым покрытием на инструкции производителя , чтобы предотвратить прилипание в верхней части геля на поверхности скольжения (например, если есть 4 слайдов, 2 горки будут , покрытых анти-клей). Они будут служить в верхней части стекла слайд-формы.
- Калибровка лампы для шприца или предметное стекло пресс-форм.
Примечание: Для этих экспериментов использовалась ртутная дуговая лампа с внешним адаптером узла фильтра и 365 нм внешнего фильтра. Другие лампыs , которые производят соответствующие интенсивности длинноволнового ультрафиолетового света может быть использован как сообщалось другими. 24-27- Приложить коллимирующей линзы до конца заполненной жидкостью световод, чтобы обеспечить интенсивность относительно равномерное освещение во всех образцах. По мере необходимости, регулировать расстояние световода из образца (ов), чтобы достичь размера пятна, который будет охватывать образцы, представляющие интерес.
- Поместите разрез шприца пресс-формы в держателе микроцентрифужных трубки (держать шприц форму в вертикальном положении). Держите радиометра на высоте наконечника шприца , где будет проходить образцы и регулировать затвор (%) открыт для достижения интенсивность света 10 мВт / см 2 при 365 нм. Запись регулируемых параметров для последующего использования.
- Поместите предметное стекло плесень на верхнюю часть стерильной поверхности (например, в верхней части коробки пипетку в шкафу биологической безопасности). Держите детектор радиометра на высоте стекле формы и отрегулировать затвор (% открыт) для достижения интенсивность света 10 мВт / см 2 при 365 нм. Запись регулируемых параметров для последующего использования.
2. Гидрогель Формирование и Photopatterning
- Получение Non-узорчатых гидрогелей.
Примечание: На данный момент в протоколе, если гидрогели для использования в приложениях для культивирования клеток, все последующие шаги должны быть выполнены в стерильных условиях в стерильной камере или капюшоном.- Смешайте исходные растворы PEG4SH, Pep2Alloc, Pep1Alloc, LAP и PBS + PS + ФЗ согласно расчету электронных таблиц (таблица 1 пример). Пипетировать полученного раствора предшественника геля энергично, чтобы обеспечить равномерное смешивание раствора.
- Готовят толстые гидрогели формованные в кончиков шприца с помощью пипетки 10-20 мкл раствора-предшественника геля (ПЭГ / Пеп / LAP / PBS) в кончик стерильным, вырезание шприца. Сделать одного геля на шприц, приблизительно 0,5-1,5 мм толщиной в зависимости от объема и диаметра шприца.
Примечание: Большие объемы могут быть изучены на основежелаемый размер геля, где верхние пределы могут существовать на основе диффузионных ограничений для Pep1Alloc во время photopatterning и / или питательные вещества / отходы в / из инкапсулированных клеток во время культивирования клеток. - Приготовьте тонкие гидрогели в формы предметного стекла, помещая резиновую прокладку (толщиной 0,254 мм) вокруг краев предметного стекла без покрытия. Пипетка 5-10 мкл раствора предшественника геля (один или несколько 5-10 мкл гели могут быть приготовлены с помощью пипетки одну или несколько точек из раствора на один слайд) на предметное стекло без покрытия и поместите предметное стекло, покрытое антиадгезионного в верхней части раствора геля (более крупные гели, вплоть до размеров предметного стекла, могут быть сделаны в зависимости от конечного применения). Безопасные стеклянные слайды с маленькими зажимы стабилизироваться.
- Место формы под лампой и установить интенсивность лампы (например,% затвор открыт) для достижения 10 мВт / см 2 на поверхности геля для наконечника шприца форм или предметное стекло пресс - форм на основе измерений на этапе 1.7.2 и1.7.3, соответственно.
- Применить свет в течение от 1 до 5 мин, чтобы обеспечить полную полимеризацию гелей. Используйте более короткое время полимеризации для гелей с содержанием выше PEG4SH (8% по весу или более, 1 мин) и больше для гелей с более низким содержанием PEG4SH (5-8% по весу, 3-5 мин), чтобы получить полностью полимеризованный гидрогели с модулями внутри диапазон мягких тканей (0,5-5 кПа).
- Место гели из наконечника шприца пресс-форм в стерильный необработанной пластины 48-хорошо, и место стеклянные слайды в стерильном блюдо.
- Промыть 3 х 15 мин с клеточной культуральной среды или соответствующий буфер (например, PBS + PS + ФЗ, реакционный буфер Эллмана) на основе планируемых экспериментов, как подробно описано ниже.
- Получение узорчатого гидрогелей.
- Смешайте исходные растворы PEG4SH, Pep2Alloc, внахлестку и PBS + PS + FZ согласно расчету с электронными таблицами, оставляя свободными тиолами (0,2-5 мм) для последующей реакции с Pep1Alloc. Пипетировать раствор предшественника энергично, чтобы обеспечить равномерное перемешивание раствора.
- Подготовить толстые и тонкие гидрогели, как изложенные в шагах 2.1.2 2.1.6.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не оставляйте гели в среде роста до photopatterning. Свободные тиолы могут потребляться видов в среде роста (например, образование дисульфидной с тиол-содержащих белков) и не позволит структурирование геля без дополнительных стадий обработки (например, снижение дисульфидных связей). - Готовят растворы Pep1Alloc (конечная концентрация ~ 3-20 мг / мл) и 2,2 мМ LAP.
- Накройте предварительно сформированные гели с раствором / LAP Pep1Alloc и инкубировать в течение 1 часа при 37 ° С.
- Удалите излишки раствора Pep1Alloc / LAP. Если гели были подвергнуты формовке в наконечнике шприца, используйте лопаточку, чтобы тщательно передачи гели из 48-луночного планшета, в котором они высиживания в стерильную предметное стекло для кучность стрельбы.
- Поместите фотошаблона с желаемым рисунком непосредственно поверх syringe- и предметного стекла формованные гелей. Убедитесь, что печатная часть маски касается геля для оптимального PattERN верность (то есть, маска должна полностью прочитать и быть эмульсионной стороной вниз). Место образцы под лампой и облучают в течение 1 мин с параметрами ламп, используемых для стеклянных пластинках (этап 1.7.3).
- После того, как кучность, место шприц-формованные гели в стерильный, 48-луночные культуральные без ткани обработанной пластины, и место предметного стекла формованные гели, которые приклеивают к предметные стекла в стерильную посуду.
- Промыть 3 х 15 мин с клеточной культуральной среде или подходящем буфере (например, PBS + PS + FZ, реакционный буфер Эллмана) на основе планируемых экспериментов.
3. Визуализация и Количественное Photopatterning
- Анализ Эллмана для выявления и количественной оценки свободными тиолами в Photopatterned гидрогелей.
- Подготовка реакционного буфера Эллмана, рабочий раствор цистеина, стандарты и реагента Эллмана, как описано ниже.
- Для реакционного буфера Эллмана, растворить 2,4 г двухосновного фосфата натрия (Na 2 HPO4) и 74,4 мг этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) в 200 мл DIH 2 O (0,1 М Na 2 HPO 4, 1 мМ ЭДТА). Доводят рН до 7,5-8 с растворами гидроксида натрия (NaOH) или фосфорной кислоты (H 3 PO 4).
- Для получения рабочего раствора цистеина, растворяют 5,27 мг цистеина в 15 мл реакционного буфера (2 мМ цистеина).
- Для цистеин стандартов, разбавленных цистеин рабочего раствора в реакционном буфере до конечной концентрации 2, 1,5, 1,25, 1, 0,75, 0,5, 0,25 и 0 мМ цистеина.
- Для Реагент Эллмана, растворите 4 мг реагента Эллмана в 1 мл реакционного буфера. Разрушать ультразвуком до полного растворения реагента Эллмана.
- Количественно концентрации свободных тиолов в гелей с анализом Эллмана (рисунок 2).
Примечание: "Тонкий" 5 мкл гидрогели, формуют между предметными стеклами, описаны в приведенной ниже процедуры и рекомендовал, чтобы обеспечить быструю диффузию реагентов т Эллманаhrough геля (т.е. он принимает этот реагент более длительное время для диффузии через толстые гели).- Определить объем набухшего геля "тонких" 5 мкл гелей (V S) на основе объемного набухания, Q.
- Сделайте три 20 'толстых' гелями мкл с помощью шприца пресс-форм. Место гели в буфере для реакции Эллмана в течение 24 ч и впоследствии весят (равновесное опухшие массы, M S). Лиофилизации гели и затем взвешивают (сухой массы M D).
- Используя измеренные значения массы для толстых гелей, вычислить объемный набухания 28 при Q = 1 + ρ полимер / ρ растворитель (М S / M D -1) , где ρ полимер = 1,07 г / см 3 для ПЭГ, 29 ρ = 1,0 растворитель г / см 3 для PBS / H 2 O.
- Вычислить теоретические сухой массы геля для использования для анализа Эллмана (здесь, "тонкие" гели 5 мкл обычно являются USED), путем суммирования массы отдельных компонентов PEG4SH, Pep1Alloc и Pep2Alloc (M D = M PEG4SH + M + M Pep1Alloc Pep2Alloc). Например, гель 5 мкл , содержащий 10% вес PEG4SH содержит приблизительно 0,000535 г ПЭГ, рассчитанное M PEG4SH = 0,005 см 3 х 1,07 г / см 3 х 0,10. Pep1Alloc и Pep2Alloc массы могут быть вычислены таким же образом , на основе мас% в растворе (см таблицу для значений), предполагая , что р ≈ 1,0 г / см 3 для этих водных растворов.
Примечание: Гели также могут быть высушены и взвешены вместо расчета теоретической сухой массы. Тем не менее, это может быть сложным, чтобы последовательно измерять сухую массу тонких, 5 мкл гелей. - На основании прогнозируемой сухой массы , а значение Q определяется из "толстых" гелей, вычислите предсказанное набухший массу M S для «тонкой» геля (уравнение на этапе 3.1.2.1.1). Предположим, что ρ ≈ 1,0 г / см
Примечание: Возможно, приведенный выше метод рекомендуется использовать для определения V S для опухших гелей как «тонких» 5 мкл гелей трудно передать для взвешивания.
- Форма тонких гидрогели для формирования паттерна, как описано в разделе 2.2 (5 мкл объема). В частности, чтобы гели с избыточными свободными тиолами и 'патрону половину этих образцов с использованием Pep1Alloc четкую покровное затопить подвергать весь гель со светом (например, 6 всего гели с избытком тиола: 3 немодифицированной без'patterned' и 3 ' с рисунком ').
Примечание: Для этого теста, 'по образцу' Гели потоп подвергаются воздействию света без фотошаблон. Этот метод используется для определения общего количества свободных тиолов, потребляемых во всем образце геля и продемонстрировать, насколько эффективно свободными тиолами, может быть модифицирован с пептидом. Исходя из этой информации,количество свободных тиолов, потребляемых при переносе изображения с фотошаблона могут быть предсказаны на основании толщины геля и площади рисунка (областей под воздействием света). - Место 'по образцу' и не'patterned 'гели в лунки 48-луночного планшета и прополоскать 3 х 15 мин с буфером для реакции Эллмана, чтобы позволить диффузию непрореагировавших видов из геля и равновесия набухания произойти.
- Добавить реакционного буфера Extra Эллмана в промытые гелей , так что V S с реакцией буфера кратно 20 мкл. Например, если прогнозируемая V S составляет 15 мкл, добавляют 5 мкл реакционного буфера (20 мкл), и если предсказанное V S составляет 30 мкл, 10 мкл реакционного буфера (40 мкл).
- Пипетировать стандарты цистеина в отдельные лунки (не содержащие гели) из 96-луночного планшета в упаковке 20 мкл в зависимости от объема , используемого в предыдущей стадии (то есть, если предыдущий шаг имел V S + дополнительная реакция бuffer = 40 мкл, добавляют 40 мкл каждого стандарта на отдельные пустые лунки).
- Развести реагент Эллмана в буфере для реакции (кратные 180 мкл буфера реакции + 3,6 мкл реагента Эллмана; например, 183,6 на 20 мкл или 367,2 мкл на 40 мкл на этапе 3.1.2.5).
- Добавьте реагент Разводненная Эллмана в лунки, содержащие стандарты и образцы. Для 20 мкл образцов, добавляют 183,6 мкл раствора в каждую лунку. Дважды это количество реагента разбавленный Эллмана на 40 мкл образцов (или масштабировать соответственно в зависимости от размера образца).
- Выдержите или разместить на шейкере в течение 1 ч и 30 мин (при комнатной температуре), или до тех пор пока цвет раствора не совпадает с цветом гелей путем визуального осмотра, чтобы обеспечить достаточную диффузию желтого 2-нитро-5-thiobenzoate дианиона (TNB 2-), который образуется при взаимодействии реагента Эллмана со свободными тиолами, из геля.
- Возьмите по 100 мкл раствора из образцов и сtandards и поместить в лунки 96-луночного планшета.
- Измерить оптическую плотность при 405 нм на планшет-ридере.
- Для обработки данных, построения стандартной кривой (образцы со стадии 3.1.1.3) (оптической плотности в зависимости от концентрации) и установите линейную функцию. С помощью линейной функции, концентрацию свободных тиолов в растворе 'разбавленный гель' (гель + реакционный буфер), может быть вычислено на основании значений оптической плотности. И, наконец, принимая во внимание «разбавления» с реакционным буфером, определяют свободную тиольную концентрацию в гелях без реакционного буфера. (Например, если 15 мкл гель разбавляют буфером реакции 5 мкл, умножить на 20/15).
- Определить объем набухшего геля "тонких" 5 мкл гелей (V S) на основе объемного набухания, Q.
- Визуализация photopatterns с реагентом Эллмана (фиг.3А).
- Замочите тонких гидрогели узорчатые с Pep1Alloc в буфере для реакции Эллмана в течение 1 часа.
- Удалите излишки реакционного буфера, аккуратно протерев вокруг краев гидрогеля с тканью.
- Реагент для пипеток Эллмана непосредственно на поверхности геля. Сразу же изображение на световым микроскопом при 10х или стереомикроскопа с цветной камерой.
Примечание: Гели должны быть отображены сразу , потому что модели визуализации будет рассеивать в течение 5 минут , как желтый ТНБ 2- иона , полученного путем расщепления реагента Эллмана при реакции с тиолами в непромышленной узорной области распространяется по всему геля. Номера узорчатые регионы появляются слабо желтого до невооруженным глазом; для лучшего разрешения и меньших моделей, увеличении (например, использование микроскопа) требуется.
- Подготовка реакционного буфера Эллмана, рабочий раствор цистеина, стандарты и реагента Эллмана, как описано ниже.
- Визуализация Photopatterns с флуоресцентными пептидами (рис 3B).
- Для визуализации моделей с более высоким разрешением или в трех измерениях, photopattern в AF488-модифицированный Pep1Alloc (или аналогичный флуоресцентной пептид) для гелей на этапе 2.2.
- Изображение на флуоресцентный микроскоп. Конфокальной микроскопии может быть использован здесь, чтобы принять г-STобразы ACK геля таким образом, что рисунок может наблюдаться в x-, y- и Z-плоскости.
Примечание: С помощью флуоресценции, гели должны быть защищены от света, чтобы обеспечить стабильность флуорофора AF488 и максимальной флуоресценции. Гели не должны быть немедленно отображены, так как флуоресцентный пептид является достаточно стабильным, если защищенном от света месте (хранить в контейнере, завернутого в фольгу при 4 ° С).
4. Ячейка Инкапсуляция в гидрогелей и Photopatterning
- Сбор и подготовка клеток для инкапсуляции.
- После стандартных стерильных процедур культивирования клеток млекопитающих, Trypsinize и собирают клетки, представляющие интерес из пластин. Гасят трипсина с ростовой среды после того, как происходит отслоение (например, для Т-75 колбу, 5 мл трипсина, гасили 5 мл среды, промыть пластины с 5 мл среды для определения общего количества 15 мл).
Примечание: трипсином время может варьироваться между типами клеток, но, как правило, происходят от 5 до 15 мин. Альтернативные detachmen клетокТ - агенты (например, VERSENE) могут быть использованы для сбора клеток , если это желательно. - Граф клеток (как минимум 100 или в соответствии с протоколом производителя) от аликвоты трипсином суспензии клеток с использованием гемоцитометра или другого подсчета клеток устройства во время центрифугирования суспензии основная часть клеток (90-110 XG, 5 мин). Повторное приостановить осадок клеток после центрифугирования в минимальном объеме PBS или ростовой среды и повторного подсчета, если исходная суспензия трипсином ячейка слишком разведенным.
- Повторное приостановить клеток в минимальном объеме ЗФР и аликвотных частей для каждого условия геля в микроцентрифужных пробирках так, что будет 5000 клеток / мкл при смешивании с раствором геля (до полимеризации).
Примечание: Типичные аликвоты клеточные содержат 300,000-500,000 клетки и достаточно, чтобы сделать 60-100 мкл суспензии гель / клетки, которые могут быть использованы в течение 3-5 х 20 мкл гелей с 5000 клеток / мкл. Более высокие или более низкие плотности клеток могут быть использованы для капсулирования, в зависимости от количества межклеточныхпротив клеток-матрица контактная желательно, соответственно, и должны быть определены для каждого приложения. - Центрифуга клеток / PBS аликвоты (90-110 мкг, 5 мин).
- Тщательно аспирата PBS из осадка клеток в микроцентрифужных трубки непосредственно перед инкапсуляцией.
Примечание: Если клетки чувствительны к воздействию усилий сдвига, второй шаг центрифугирование , может быть устранена путем подсчета (например, гемоцитометр) и впоследствии aliquotting Трипсинизированные клеточной суспензии (трипсин + медиа + клеток) в порции , необходимые для каждого условия геля. Эти аликвоты центрифугируют один раз (90-110 мкг, 5 мин) и трипсин + носитель отсасывают, оставляя осадок клеток для капсулирования.
- После стандартных стерильных процедур культивирования клеток млекопитающих, Trypsinize и собирают клетки, представляющие интерес из пластин. Гасят трипсина с ростовой среды после того, как происходит отслоение (например, для Т-75 колбу, 5 мл трипсина, гасили 5 мл среды, промыть пластины с 5 мл среды для определения общего количества 15 мл).
- Инкапсуляция клетки в Non-узорчатых гидрогелей.
- Сразу же после того, как аспирационных PBS, приостановить осажденные клетки в PEG4SH, Pep2Alloc, Pep1Alloc, внахлестку и PBS + PS + FZ, рассчитанному в таблице до конечной концентрации 5000 клеток / мкл.
- Плесень и полимеризуется гидрогели как Described шагами 2.1.2 2.1.6.
Примечание: Когда инкапсулирования клеток в формы предметного стекла, необходимо соблюдать осторожность при снятии верхних салазок постполимеризация для предотвращения сдвига геля, который может привести к гибели клеток. Для того, чтобы помочь с удалением геля из пресс-формы, слайд-формы могут быть размещены в стерильной PBS или среде роста после полимеризации смачивать прокладку и гидрогеля, что делает его легче удалить верхний слайд. Метод, чтобы предотвратить этот сдвиг в целом является использование шприца пресс-форм. - Полоскание гели 3 х 10 мин в среде роста для удаления непрореагировавших видов и избыток LAP.
- Инкубируйте гели в ростовой среде при температуре 37 ° С и 5% CO 2 до желаемого момента времени для дальнейшего анализа. Пополнять среды каждые 48 ч или , как определено для применения (например, типичный интервал подачи для определенного типа клеток и среды).
- Инкапсуляция клеток и Photopatterning в присутствии клеток.
- Сразу же после того, как аспирационных PBS,приостановить осажденные клетки в PEG4SH, Pep2Alloc, внахлестку и PBS + PS + FZ, рассчитанному в таблице до конечной концентрации 5000 клеток / мкл. Оставьте соответствующую концентрацию свободных тиолов (например, 2 мм) для последующего взаимодействия с Pep1Alloc.
- Плесень, полимеризуется и модели гидрогели, как описано в пунктах 2.2.2 2.2.8.
- Полоскание гели 3 х 10 мин в среде роста после того, как кучность для удаления непрореагировавших видов и избыток LAP.
- Инкубируйте гели в ростовой среде при температуре 37 ° С и 5% CO 2 до желаемого момента времени для дальнейшего анализа. Пополнять среды каждые 48 ч или, как определено для применения.
5. Определение Жизнеспособность и метаболическую активность инкапсулированных клеток
- Выполните Live / Dead цитотоксичности , чтобы определить Encapsulated Жизнеспособность клеток (рис 4а).
- Удалить среду для роста из гелей и полоскать 3 х 15 мин с PBS, чтобы позволить диффузии среды из гELS.
- Оттепель живые / мертвые решения цитотоксичности (этидий гомодимер-1 и кальцеина AM).
- Добавьте 2 мкл 2 мМ этидия гомодимер-1 и 0,5 мкл 4 мМ растворов кальцеина AM до 1 мл стерильной PBS. Vortex для обеспечения полного перемешивания.
- Добавьте 300 мкл раствора для окрашивания на каждый гель формы шприца в 48-луночные планшеты, или достаточно, чтобы покрыть поверхность геля на предметное стекло в стерильном блюдо, и инкубируют в течение 45 мин.
- Удаления избытка раствора для окрашивания и прополоскать, чтобы удалить избыток красителя из гелей (3 х 15 мин с PBS).
- Изображение на конфокальной микроскопии (Z-стека изображений) или на эпи-флуоресцентного микроскопа с возможностью г-стека при 10Х и 488/525 нм Ex / Em. Количественно количество жизнеспособных клеток путем проецирования Z-стеки и подсчета количества живых (зеленый по всему телу клетки) и мертвых (красных ядер) клеток с программным обеспечением обработки изображений.
- Выполните метаболической активности анализа , чтобы определить активность клеток пост-инкапсуляцию (FIGUповторно 4В).
- 24 ч до анализа подачи инкапсулированные клетки со свежей средой роста.
Примечание: Добавить носитель в несколько дополнительных скважин (не содержащих гелей или гелей, без клеток) в качестве контрольных (фоновых показаний). - В то время точки интереса, оттаивать раствор реагента MTS.
Примечание: Для того, чтобы определить метаболическую активность в течение долгого времени, начальный момент времени (12-24 ч после инкапсуляция) рекомендуется в качестве эталона для сравнения с более поздние моменты времени. - Добавить реагента MTS в каждую лунку (20 мкл на 100 мкл среды роста).
- Инкубируйте образцы в течение 1-4 ч при температуре 37 ° С и 5% CO 2, в соответствии с инструкциями изготовителя.
Примечание: время инкубации, должно быть достаточным для клеток, чтобы уменьшить MTS и позволить диффузию продукта формазана из геля. Следовательно, толстые гели, такие как наконечника шприца гели могут потребовать более длительного времени инкубации (~ 4 ч) для уменьшения достаточного МТС и диффузии. - Пипетировать 100 мкл снижается MTS / Mediumв чистые лунки 96-луночного планшета и абсорбцию при 490 нм на планшет-ридере.
- Вычтите фоновой оптической плотности для лунок без клеток из образцов значений оптической плотности для генерации одобренными значения оптической плотности.
- 24 ч до анализа подачи инкапсулированные клетки со свежей средой роста.
Representative Results
Установка и процедура photoencapsulate клеток и впоследствии photopattern гели , содержащие инкапсулированные клетки, изображенные на рисунке 1, и пример для приготовления исходных растворов с получением 10% вес геля приведены в таблице 1. Используя таблицу 1, количество мономеров (PEG4SH , Pep2Alloc, ± Pep1Alloc) и фотоинициатора (LAP) требуется полимеризоваться гидрогели вычисляется. Исходя из этих расчетов, исходные растворы PEG4SH, Pep1Alloc, Pep2Alloc и LAP получают и смешивают с и без Pep1Alloc для формирования и photopatterning гели, соответственно (Рис . 1А) Затем клетки собирают из пластин, подсчитывали и центрифугировали в соответствующих количествах для капсулирования (Фиг.1В). Клеточный осадок ресуспендировали в гелеобразующего раствора (пептид / полимер / LAP в PBS), и клетки / мономер смеси переносят стекла или шприц мольDS. Клетки заключены в гидрогель при наложении света (1-5 минут 10 мВт / см 2 при 365 нм) (рис 1C). Для photopatterning (рис 1D), гели пропитаны Pep1Alloc и LAP в течение 30 мин до 1 ч и 30 мин, что позволяет диффузии пептида и инициатора в полимеризованной матрице. Эти пептидные нагруженные гели покрыты фотошаблонов с заданными узорами и подвергаются воздействию второй дозы света (1 мин) для конъюгации пептидов свободных тиолов в матрице. Подвеска привязи только ковалентно связаны с гелем в регионах , подвергшихся воздействию света, облегчая соответствующие клетка-матрица взаимодействий и имитируя основные механические и биохимические свойства нативной микроокружения клеток по направлению зондирования функции клеток и судьбу в пробирке.
Анализ Эллмана обеспечивает легкое и недорогой метод количественной модификации геля и пептида включения в пределах photopatterned подложки. Узорчатого и не являющиеся рисунком гели (т.е. гели с добавлением или без пептида модификации) вымачивают в буфере для реакции после полимеризации Эллмана. Далее, стандарты цистеина и гели замоченные в буфере помещают в 48-луночные планшеты и инкубировали с реагентом Эллмана (Фигура 2А, слева). Через 1 час 30 минут, аликвоты образцов помещают в отдельные лунки 96-луночного планшета, и оптическая плотность регистрируется при 405 нм. Калибровочная кривая (рис 2А, справа) от стандартов цистеин нанесены (оптическая плотность в зависимости от концентрации, линейной аппроксимации), и количество свободных тиолов в геле может быть определена на основе их коэффициента разбавления. Эти свободные тиольные концентрации для различных полимеризационных и photopatterning условиях 10% -ного геля показаны на фигуре 2В. Гели полимеризоваться в течение 1 или 5 мин без Pep1Alloc (синие полоски, I = 1 мин и II = 5 мин) имеют статистически подобные концентрации свободного тиоловых, что указывает на тшляпа быстрая реакция происходит и гелеобразования завершается в течение 1 мин (Стьюдента-тест, р> 0,05). Таким образом, дополнительное воздействие света (2-5 минут) не приводит к дальнейшему конверсии функциональных групп. Гели полимеризуют в течение 1 мин без Pep1Alloc были пропитаны Pep1Alloc (3 мг / мл) и LAP (2,2 мМ) в течение 30 и 90 мин (зеленые полоски, II = 30 мин и IV = 90 мин) и подвергаются воздействию второй дозы света в течение 1 мин. Уменьшение свободных тиолов (60-80% по отношению к условию 1 мин) указывает на эффективную модификацию гелей с подвесными репликами в этих условиях. Если выше модификация желательно, повышенные концентрации раствора Pep1Alloc могут быть использованы в качестве доступности Pep1Alloc для свободных тиолов в более разбавленных растворы пептидов может ограничить конверсию; Например, мы обнаружили, что концентрации до 20 мг / мл Pep1Alloc продукта> 90% конверсию свободных тиолов.
Уникально, образцы пептидов добавляют к гидрогель можетбыстро визуализируют с помощью реагента Эллмана (Фигура 3А, в возрасте до 5 мин). Тем не менее, визуализация картины теряется в течение долгого времени (более 5 мин) за счет диффузии желтого ТНБ 2- дианиона через гель. Для улучшения разрешения изображения и наблюдать образцы в трех измерениях (X, Y и Z-плоскостей) и в присутствии клеток, флуоресцентный пептидный добавление (AF488Pep1Alloc) могут быть использованы. На рисунке 3В x-, y- и г-проекции стеков изображений , сделанных с помощью конфокальной микроскопии показаны, демонстрируя разрешение модели (масштаб мкм).
Примерно (94 ± 2)% и (94 ± 1)% от hMSCs инкапсулировать в разлагаемых гелей (Pep2Alloc = GPQG ↓ WGQ) остаются жизнеспособными (зеленые тела клетки) 1 и 6 дней после того, как инкапсуляция, соответственно, с небольшим количеством мертвых клеток (красные ядра ) наблюдается (рис 4А). Кроме того, hMSC растекания наблюдается через 6 дней после инкапсулирования (
2fig1.jpg "/>
Рисунок 1:. Установка для инкапсулирования клеток в гидрогели и впоследствии photopatterning с биохимической кия (А) Маточные растворы макромеров и фотоинициатора получают и смешивают (PEG4SH = позвоночник, Pep2Alloc = сшивок, Pep1Alloc = кулон клейкая фрагмент (УВАЖЕНИЕМ), LAP = фотоинициатор ). (В) Клетки собирают для капсулирования. (С) Клетки смешивают с макромер растворами без или с интегрин-связывающих пептидов (PEG4SH / Pep2Alloc / LAP или PEG4SH / Pep2Alloc / Pep1Alloc / LAP, соответственно) и герметизированы при воздействии света. (D) Гели , содержащие избыточные группы тиоловых во время образования геля (здесь, PEG4SH / Pep2Alloc / внахлестку сформирован с 2 - миллиметровыми избыток тиоловых) , могут быть сформированы с помощью биохимических репликами последующим добавлением пептидов , функционализированных одной Alloc группы (Pep1Alloc, например, УВАЖЕНИЕМ, IKVAV и т.д.) , чтобы способствовать адгезии клетокв пределах конкретных областей геля. Здесь структурирование гелей с флуоресцентно меченных RGDS показан. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рис . 2: установка для анализа количественного Эллмана и результаты оценить модификацию узорчатых гидрогели (A) Гели и стандарты цистеина инкубируют в 48-луночные планшеты с реагентом Эллмана. Линейная стандартная кривая построена для определения концентрации цистеина в образцах геля. (B) Избыток свободных тиолов включены в гидрогели во время образования геля и потребляются на кучность с кулоном Alloc-пептида (I = 1 мин полимеризации; II = 5 мин полимеризации; III = 30 мин инкубации с Pep1Alloc; IV = 90 мин инкубации Wi й Pep1Alloc; и III и IV полимеризуется и узорной светом в течение 1 мин). Приведенные данные показывают среднее значение (п = 3) с ошибками , показывая стандартную ошибку. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рис . 3: Анализ Эллмана и флуоресцентные изображения для визуализации photopatterned гидрогели реагент (А) Эллмана может использоваться для быстрого обнаружения паттернов (линии) в х- и у-плоскости (желтый = без рисунка область, масштаб бар = 1 мм). (B) Флуоресцентные пептиды могут быть использованы для наблюдения образцов в x-, y-, и Z-плоскости (зеленый = узорной область; масштаб мкм бар 200; 10X воды нагишом цель; Ex / Эм 488/525 нм).large.jpg "целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
. Рисунок 4: Жизнеспособность и метаболическая активность клеток в неразлагающихся photopatterned гидрогели (А) Пример конфокальной г-стек (г-проекция; 10X воды нагишом цель) жизнеспособной (зеленый; Ex / Em 488/525 нм) и мертвый hMSCs (красный, Ex / Em 543/580 нм) инкапсулируются в гидрогели 24 ч после инкапсуляция (Масштаб бар = 200 мкм). Клетки распространяются в пределах этих гидрогелей 6 дней после того, как инкапсуляция (врезка изображения, масштаб бар = 50 мкм). (B) Клетки метаболически активны 1 и 3 дня (темные и светлые полосы, соответственно) после инкапсулирования для различных полимеризации (I = 1 мин полимеризации; II = 5 мин полимеризации) и условия паттерна (III = 30 мин инкубации с Pep1Alloc ; IV = 90 мин incubatioп с Pep1Alloc; и полимеризуют и узорной светом в течение 1 мин). Приведенные данные показывают среднее значение (п = 3) с ошибками , показывая стандартную ошибку. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Таблица 1: Пример настройки для расчета объемов растворов для изготовления гидрогели ячеек в электронной таблице, которые выделены синим указывают на заданные пользователем параметры;. остальные величины рассчитываются на основе этих параметров. Окончательные объемы для каждого исходного раствора, чтобы сделать гель выделены оранжевым цветом. Белые клетки содержат формулы, используемые для расчета конечных объемов на основе заданных пользователем параметров. Следует отметить, что концентрация 2,2 мМ LAP эквивалентно 0,067% мас.
Discussion
Процедура, представленная здесь демонстрирует методы photoencapsulate клеток в гидрогели, образованных химии клик тиол-ена и впоследствии photopattern гели с биохимическими репликами. Использование света первоначально образуют гидрогели позволяет равномерное смешивание и суспензии клеток внутри раствора полимера до полимеризации. Быстра полимеризаци "замки" гель в форме, определенной пресс-формы и герметизирует подвешенный клеток внутри сети гидрогеля. Гели могут также быть отлиты в многочисленные различные формы (например, предметные стекла или кончиков шприца) , в зависимости от конечного применения желаемого. Например, клетки, заключенные в капсулы для 3D культуры в гидрогели, прикрепленных к предметные стекла особенно полезны для приложений для обработки изображений, как ослабление света ограничена в пределах тонкого образца. Шприц-формы могут быть использованы для быстрого инкапсулирования клеток, что позволяет большее количество образцов, приготовленных в течение короткого времени (по сравнению с предметное стеклоы), которые могут быть использованы для проведения экспериментов, требующих большого количества клеток, таких как проточная цитометрия или КПЦР. Впоследствии эти гели затем могут быть составлены по образцу с биохимическими репликами , чтобы вызвать желательные клеточные ответы , такие как дифференциация или вторжения. 30,31
Анализы для жизнеспособности и метаболической активности указывают на выживание клеток для системы материального и условий формирования паттерна представленных. Обратите внимание, что метаболическая активность не контролировали до 3-й день в неразлагающихся гелей (RGKGRK пептид поперечных связей), чтобы оценить начальные эффекты полимеризации и кучность условий на функции клеток. Кроме того, анализ целостности мембраны (живой / мертвый жизнеспособность / цитотоксичность окрашивание) из hMSCs через 1 и 6 дней после инкапсулирования в гелях с сформулированными разлагающегося пептида поперечную сшивку (GPQGIWGQ) поддерживает, что клетки сохраняют жизнеспособность и распространяются на 1 неделю в культуре. Жизнеспособность дополнительных клеточных линий было сообщено в условиях photopatterning 32 , аналогичных тем ,используется здесь и может быть оценена для описанной системы гидрогеля с использованием живого / мертвого окрашивания и анализы метаболической активности. В то время как мы не наблюдали проблем с жизнеспособности клеток с использованием этой системы материалов и связанных с ними процедур (4.2 и 4.3), некоторые типы клеток могут быть чувствительны к свободных радикалов и / или воздействие света. В этом случае пользователи могут рассмотреть вопрос об использовании не-фотоинициированной систем материалов, такие как азид-алкина, 12 FXIII, 31 или Дильса Альдера на основе химических составов пластовых гидрогель. 33
FACILE методы для обнаружения и количественного определения паттерна биохимических репликами в пределах гелей также представлены (3.1 и 3.2). Анализ Эллмана представляет особый интерес , поскольку реагенты являются коммерчески доступными и установка дополнительных шагов синтетической переработки или более дорогие реагенты (например, флуоресцентно-меченного пептида) не требуется. Анализ Эллмана может быть использован для точного определения модификации свободных тиолов с биохимическими репликами под differeнт photopatterning условия, а также быстро визуализировать модели. Для количественной оценки пептида инкорпорации, тиольную функциональную группу концентрацию до и после формирования паттерна, как количественная мера пептида включения, непосредственно оценивали с помощью анализа Эллмана. В то время как этот тип квантификации может быть сделано с флуоресцентно меченных пептидов, 34 формирования изображения на основе Количественное требует большего времени обработки и анализа шагов (например, синтез флуоресцентно-меченного пептида и генерации калибровочной кривой , чтобы связать флюоресценции концентрации пептида с помощью анализа изображений). Для визуализации пептида включения, реагент Эллмана могут быть непосредственно применены к образцам и немедленно визуализируется. В то время как ограничивается х и у-плоскостей для визуализации образов, метод может быть использован в качестве простого, рутинного метода, чтобы определить, является ли матрицы, содержащие свободные тиольные группы, которые были с рисунком. Важно отметить, что анализ Эллмана не Considered cytocompatible, так что в то время как он может быть использован для наблюдения и количественной оценки photopatterns, она не может быть сделано в присутствии клеток. Для получения изображения кучность в трех измерениях и в присутствии клеток, конъюгации флуоресцентных пептидов в матрицах гидрогелевых остается мощным и широко используемый подход. Разрешение шаблонов может быть оценена в x-, y-, и г-плоскости с помощью конфокальной микроскопии, и этот метод cytocompatible так, что клетки в узорчатых регионах или не-узорной регионах могут быть идентифицированы. Взятые вместе, методы анализа и обработки изображений на основе Эллман являются взаимодополняющими инструментами для исследователей, чтобы оценить как количественно, так и качественно photopatterning биохимических репликами в системе материалов.
Photoclick, или в более широком смысле Фотоинициированная, биохимический для формирования и модификации гидрогелей в присутствии клеток многочисленны. Формовочные, инкапсуляция и методы, представленные паттерна здесь не ИтITED к описанной материальной системы и могут быть применены к альтернативным основе света химических систем , таких как тиольные алкина, 35 азид-алкина, 4 и других тиоловых-ена химических (например, тиол-норборнен), 10,13, а также с разные фотоинициаторы, такие как Irgacure 2959, эозин Y и камфорохинона. Обратите внимание, что пользователи , возможно , потребуется настроить параметры процедуры (например, инкубационные времена, времена полимеризации, плотность ячеек) , чтобы гарантировать , что условия остаются cytocompatible для этих других систем. Поскольку процесс формирования рисунка требует диффузии Alloc-модифицированного пептида (ов) в гидрогель (2.2.3-2.2.5), этот процесс может оказаться наиболее полезным для добавления интегрин-связывающих фрагментов (например, пептидов или белков внеклеточного матрикса фрагменты) в гидрогеле, где присоединение лиганда к сети требуется для генерации тяговых усилий с помощью клеточного и полной активации интегрина. 36 Обратите внимание, что для биомолекул , который можетбыть так же активны в растворе или при иммобилизации (например, факторы роста или цитокины), стадию инкубации для диффузии фрагмента (~ 1 час) в гидрогель может привести к сигнализации событий, свернутые результаты формирования паттерна. Другие методы были созданы для фактора роста иммобилизации или местного секвестрации для их структурирование. 37-39 Кроме того, разрешение модели диктуется контроля над освещенности. Здесь, фотошаблонов позволяют создавать шаблоны через глубину геля и в х и у-плоскостей; Тем не менее, больше пространственный контроль над паттернировании биохимических репликами в гелей может быть достигнута с альтернативными методами облучения , такие , как использование двухфотонного конфокальный микроскоп для создания изображения в x-, y- и z- самолетов. 34,40 И, наконец, важно отметить, что в то время как материал, система используется в рамках этой процедуры, только изначально модифицирован с биохимическими репликами, ортогональные photoclick биохимический может быть использован, чтобы позволить AlteРационы в матричных свойств с течением времени. 12 Порядок и методы , представленные здесь разнообразить существующие подходы к созданию синтетических матриц с четко определенными и spatiotemporally-регулируемыми свойствами. В частности, коммерческая доступность реагентов и материалов, используемых в рамках данной процедуры будет полезна широкому кругу исследователей, заинтересованных в использовании гидрогеля на основе биоматериалов для применения в контролируемой культуре клеток.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана программами Delaware Кобре в Drug Discovery и в передовых биоматериалов, финансируемых за счет институциональных наград развития из Национального института медицинских наук Генералы в Национальном институте здоровья (P20GM104316 и P30 GM110758-01, соответственно), Благотворительные фонды Пью (00026178), Национальный научный фонд Карьера Award (DMR-1253906), то Burroughs Wellcome фонд (1006787), и программа Национального научного фонда IGERT SBE2 в университете штата Делавэр (общение Л. Савицкий). Авторы благодарят Delaware Biotechnology Institute биоимиджинга центра при Университете штата Делавэр для обучения и доступа к конфокальной микроскопии, г-жа Кэтрин Wiley за помощь во время съемок клипа, г-н Мэтью Реман за щедрое предоставление hMSCs, выделенные из костного мозга, профессор Кристофер Дж . Kloxin и г-н Стивен Ма за щедро обеспечивая фотошаблонов, и профессор Уилфред Чен для использования автоматизированной ридере.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Custom Peptides | Various Vendors | ---- | Peptides may also be synthesized via standard SPPS techniques with materials from vendors including ChemImpex and ChemPep. |
| 4-arm PEG Thiol, MW 20k | JenKem USA | 4ARM-SH | Listed under Multi-arm Homofunctional PEGs. PEG4SH may also be synthesized as previously referenced. |
| Lithium Phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate | Colorado Photopolymer Solutions | Li-TPO | |
| Dimethyl Phenylphosphonite | Sigma Aldrich | 149470 | Caution, causes severe skin burns and eye damage. Wear protective gloves, clothing, and eye protection. |
| 2,4,6-Trimethylbenzoyl Chloride | Sigma Aldrich | 682519 | Caution, causes severe skin burns and eye damage. Wear protective gloves, clothing, and eye protection. |
| Lithium Bromide | Sigma Aldrich | 213225 | |
| 2-Butanone | Sigma Aldrich | 360473 | |
| Flask, Round Bottom, 100 ml | Chemglass | CG-1506-05 | |
| 80 ml Filter Funnel, Buchner, Medium Frit | Chemglass | CG-1402-L-02 | Filter paper inside a regular glass funnel may be used if desired. |
| Magnetic Stir Bars | Various Vendors | ---- | |
| Magnetic Stirring and Hot Plate | Various Vendors | ---- | |
| Vacuum Dessicator | Various Vendors | ---- | |
| Deuterium Oxide | Acros Organics | 16630 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | ThermoFisher Scientific | 14190-250 | |
| Penicillin Streptomycin | ThermoFisher Scientific | 15070-063 | |
| Fungizone | ThermoFisher Scientific | 15290-018 | |
| Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red | ThermoFisher Scientific | 15400-054 | Select appropriate medium and trypsin depending on cell type. |
| Microcentrifuge tubes | Various Vendors | ---- | 1.5 or 2 ml sizes, sterile. |
| BD Syringe with Slip (Luer) Tips (Without Needle) | Fisher Scientific | 14-823-16H | Product number listed here is for a 1 ml syringe (16H), Various sizes are available (14-823-XX). |
| Fisherfinest Premium Plain Glass Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-544-1 | |
| High-Purity Silicone Rubber, 0.010" Thick, 6" x 8" Sheet, 55A Durometer (Gasket) | McMaster Carr | 87315K62 | |
| Ethanol, 200 Proof | Decon Labs | 2701 | |
| RainX, Original | Amazon | 800002243 | May be purchased from other vendors. |
| Sigmacote | Sigma Aldrich | SL2 | |
| Photomasks | Advance Reproductions Corporation | ---- | Photomask Division, different designs may be printed as desired. |
| DTNB; Ellman's Reagent; 5,5-dithio-bis(2-nitrobenzoic acid) | ThermoFisher Scientific | PI-22582 | |
| Sodium Phosphate Dibasic | Sigma Aldrich | S5136 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma Aldrich | E6758 | |
| Sodium Hydroxide, Pellets/Certified ACS | Fisher Scientific | S318 | |
| Orthophosphoric Acid | Alfa Aesar | 33266 | |
| Cysteine Hydrochloride Monohydrate | Sigma Aldrich | C7880 | |
| LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit, for mammalian cells | ThermoFisher Scientific | L-3224 | |
| CellTiter 96 Aqueous One Solution Assay | Promega | G3582 | |
| Centrifuge | Various Vendors | ---- | Capable of speeds at 90-110 x g. |
| Multiwell Plate Reader | Various Vendors | ---- | Capable of reading absorbance at 405 nm in a 96-well plate. |
| Epifluorescent or Confocal Microscope | Various Vendors | ---- | To visualize peptide patterns and cells within hydrogels. |
| Omnicure Exfo Series 2000 | Excelitas Technologies | ---- | Alternate light systems may be used to polymerize hydrogels. |
| Zeiss Zen Lite Software | Zeiss | ---- | Available at zeiss.com; compatible with images taken on Zeiss microscopes |
| ImageJ | NIH | ---- | Available at imagej.nih.gov; applicable for general image analysis |
References
- Kolb, H. C., Finn, M. G., Sharpless, K. B. Click Chemistry: Diverse Chemical Function from a Few Good Reactions. Angew Chemie - Int Ed. 40 (11), 2004-2021 (2001).
- Xi, W., Scott, T. F., Kloxin, C. J., Bowman, C. N. Click Chemistry in Materials Science. Adv Funct Mater. 24 (18), 2572-2590 (2014).
- Azagarsamy, M. A., Anseth, K. S. Bioorthogonal click chemistry: An indispensable tool to create multifaceted cell culture scaffolds. ACS Macro Lett. 2 (1), 5-9 (2013).
- Adzima, B. J., Tao, Y., Kloxin, C. J., DeForest, C. A., Anseth, K. S., Bowman, C. N. Spatial and temporal control of the alkyne-azide cycloaddition by photoinitiated Cu(II) reduction. Nat Chem. 3 (3), 256-259 (2011).
- Hoyle, C. E., Bowman, C. N. Thiol-ene click chemistry. Angew Chemie - Int Ed. 49 (9), 1540-1573 (2010).
- Fan, Y., Deng, C., Cheng, R., Meng, F., Zhong, Z. In situ forming hydrogels via catalyst-free and bioorthogonal "tetrazole-Alkene" photo-click chemistry. Biomacromolecules. 14 (8), 2814-2821 (2013).
- Burdick, J. A., Murphy, W. L. Moving from static to dynamic complexity in hydrogel design. Nat Commun. 3, 1269 (2012).
- Rehmann, M. S., Kloxin, A. M. Tunable and dynamic soft materials for three-dimensional cell culture. Soft Matter. 9 (29), 6737-6746 (2013).
- Yang, T., Long, H., Malkoch, M., Gamstedt, K. E., Berglund, L., Hult, A. Characterization of well-defined poly(ethylene glycol) hydrogels prepared by thiol-ene chemistry. J Polym Sci Part A Polym Chem. 49 (18), 4044-4054 (2011).
- Fairbanks, B. D., et al. A versatile synthetic extracellular matrix mimic via thiol-norbornene photopolymerization. Adv Mater. 21 (48), 5005-5010 (2009).
- Roberts, J. J., Bryant, S. J. Comparison of photopolymerizable thiol-ene PEG and acrylate-based PEG hydrogels for cartilage development. Biomaterials. 34 (38), 9969-9979 (2013).
- DeForest, C. A., Polizzotti, B. D., Anseth, K. S. Sequential click reactions for synthesizing and patterning three-dimensional cell microenvironments. Nat Mater. 8 (8), 659-664 (2009).
- Lin, C. C., Ki, C. S., Shih, H. Thiol-norbornene photoclick hydrogels for tissue engineering applications. J Appl Polym Sci. 132 (8), (2015).
- Sawicki, L. A., Kloxin, A. M. Design of thiol-ene photoclick hydrogels using facile techniques for cell culture applications. Biomater Sci. 2 (11), 1612-1626 (2014).
- Patterson, J., Hubbell, J. A. Enhanced proteolytic degradation of molecularly engineered PEG hydrogels in response to MMP-1 and MMP-2. Biomaterials. 31 (30), 7836-7845 (2010).
- Fairbanks, B. D., Singh, S. P., Bowman, C. N., Anseth, K. S. Photodegradable, photoadaptable hydrogels via radical-mediated disulfide fragmentation reaction. Macromolecules. 44 (8), 2444-2450 (2011).
- Fairbanks, B. D., Schwartz, M. P., Bowman, C. N., Anseth, K. S. Photoinitiated polymerization of PEG-diacrylate with lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate: polymerization rate and cytocompatibility. Biomaterials. 30 (35), 6702-6707 (2009).
- Yang, F., et al. The effect of incorporating RGD adhesive peptide in polyethylene glycol diacrylate hydrogel on osteogenesis of bone marrow stromal cells. Biomaterials. 26 (30), 5991-5998 (2005).
- Wacker, B. K., et al. Endothelial cell migration on RGD-peptide-containing PEG hydrogels in the presence of sphingosine 1-phosphate. Biophys J. 94 (1), 273-285 (2008).
- Wilson, M. J., Liliensiek, S. J., Murphy, C. J., Murphy, W. L., Nealey, P. F. Hydrogels with well-defined peptide-hydrogel spacing and concentration: impact on epithelial cell behavior. Soft Matter. 8 (2), 390-398 (2012).
- Qiong Liu, S., et al. Injectable biodegradable polyethylene glycol/ RGD peptide hybrid hydrogels for in vitro chondrogenesis of human mesenchymal stern cellsa. Macromol Rapid Commun. 31 (13), 1148-1154 (2010).
- Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix Elasticity Directs Stem Cell Lineage Specification. Cell. 126 (4), 677-689 (2006).
- Levental, I., Georges, P. C., Janmey, P. A. Soft biological materials and their impact on cell function. Soft Matter. 3 (3), 299-306 (2007).
- Lin, C. C., Raza, A., Shih, H. PEG hydrogels formed by thiol-ene photo-click chemistry and their effect on the formation and recovery of insulin-secreting cell spheroids. Biomaterials. 32 (36), 9685-9695 (2011).
- Khetan, S., Burdick, J. Cellular encapsulation in 3D hydrogels for tissue engineering. J Vis Exp. (32), e1590 (2009).
- Bryant, S. J., Nuttelman, C. R., Anseth, K. S. Cytocompatibility of UV and visible light photoinitiating systems on cultured NIH/3T3 fibroblasts in vitro. J Biomater Sci Polym Ed. 11 (5), 439-457 (2000).
- Burdick, J. A., Chung, C., Jia, X., Randolph, M. A., Langer, R. Controlled Degradation and Mechanical Behavior of Photopolymerized Hyaluronic Acid Networks Controlled Degradation and Mechanical Behavior of Photopolymerized Hyaluronic Acid Networks. Society. 6 (1), 386-391 (2005).
- Marsano, E., Gagliardi, S., Ghioni, F., Bianchi, E. Behaviour of gels based on (hydroxypropyl) cellulose methacrylate. Polymer (Guildf). 41 (21), 7691-7698 (2000).
- Bryant, S. J., Anseth, K. S. Photopolymerization of Hydrogel Scaffolds. Scaffolding Tissue Eng. , 71-90 (2005).
- Khetan, S., Burdick, J. A. Patterning hydrogels in three dimensions towards controlling cellular interactions. Soft Matter. 7 (3), 830-838 (2011).
- Mosiewicz, K. A., et al. In situ cell manipulation through enzymatic hydrogel photopatterning. Nat Mater. 12 (11), 1072-1078 (2013).
- Williams, C. G., Malik, A. N., Kim, T. K., Manson, P. N., Elisseeff, J. H. Variable cytocompatibility of six cell lines with photoinitiators used for polymerizing hydrogels and cell encapsulation. Biomaterials. 26 (11), 1211-1218 (2005).
- Nimmo, C. M., Owen, S. C., Shoichet, M. S. Diels - Alder Click Cross-Linked Hyaluronic Acid Hydrogels for Tissue Engineering. , 824-830 (2011).
- DeForest, C. A., Anseth, K. S. Cytocompatible click-based hydrogels with dynamically tunable properties through orthogonal photoconjugation and photocleavage reactions. Nat Chem. 3 (12), 925-931 (2011).
- Fairbanks, B. D., Sims, E. A., Anseth, K. S., Bowman, C. N. Reaction rates and mechanisms for radical, photoinitated addition of thiols to alkynes, and implications for thiol-yne photopolymerizations and click reactions. Macromolecules. 43 (9), 4113-4119 (2010).
- Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture. Biotechnol Bioeng. 103 (4), 655-663 (2009).
- Wylie, R. G., et al. Spatially controlled simultaneous patterning of multiple growth factors in three-dimensional hydrogels. Nat Mater. 10 (10), 799-806 (2011).
- Pompe, T., Salchert, K., Alberti, K., Zandstra, P., Werner, C. Immobilization of growth factors on solid supports for the modulation of stem cell fate. Nat Protoc. 5 (6), 1042-1050 (2010).
- Hudalla, G. A., Murphy, W. L. Biomaterials that regulate growth factor activity via bioinspired interactions. Adv Funct Mater. 21 (10), 1754-1768 (2011).
- Lee, S. H., Moon, J. J., West, J. L. Three-dimensional micropatterning of bioactive hydrogels via two-photon laser scanning photolithography for guided 3D cell migration. Biomaterials. 29 (20), 2962-2968 (2008).
