Abstract
Klicka kemiska har undersökts för användning i många biomaterial program, inklusive drug delivery, tissue engineering och cellodling. I speciella, ljusmedierad klick reaktioner, såsom fotoinitierad tiol-en och tiol-yn reaktioner, råd spatiotemporal kontroll över materialegenskaper och tillåta utformningen av system med en hög grad av användarvänlighet riktad egendom kontroll. Tillverkning och modifiering av hydrogel-baserade biomaterial med hjälp av precisions ges av ljus och mångsidigheten som erbjuds av dessa tiol-X photoclick kemiska är av växande intresse, i synnerhet för odling av celler inom väl definierade, biomimetiska mikromiljöer. Här beskriver vi metoder för photoencapsulation av celler och efterföljande photopatterning av biokemiska signaler inom hydrogel matriser med hjälp av mångsidiga och modulbyggstenar polymeriseras av en tiol-en photoclick reaktion. Närmare bestämt är en metod presenteras för samarbetenstructing hydrogeler från allyloxikarbonyl (Alloc) -functionalized peptidtvärbindningar och vidhängande peptiddelar och tiol-funktionaliserade poly (etylenglykol) (PEG) som snabbt polymeriserar i närvaro av litium acylphosphinate fotoinitiator och cytocompatible doser av lång våglängd ultraviolett (UV) ljus. Facile tekniker för att visualisera photopatterning och kvantifiera koncentrationen av peptider tillsatta beskrivs. Dessutom är metoder som fastställts för inkapslings celler, speciellt humana mesenkymala stamceller, och bestämma deras livskraft och aktivitet. Medan bildande och initiala mönstring av tiol-Alloc hydrogeler Här visas dessa tekniker i stort sett kan tillämpas på ett antal andra lätta och radikal-initierade materialsystem (t.ex., tiol-norbornen, tiol-akrylat) att generera mönstrade substrat.
Introduction
Klicka kemiska används alltmer i utformningen av material för många biomedicinska tillämpningar, inklusive drug delivery, vävnadsteknik, och kontrollerad cellodling, på grund av deras selektiva, effektiva och ofta cytocompatible reaktiviteter. 1-3 Photoclick kemi som använder ljus för att utlösa eller initiera reaktioner (t ex, azid-alkyn, 4 tiol-en, 5 och tetrazol-alken 6) är av särskilt intresse för bildning eller modifiering av biomaterial. Snabb takt under milda förhållanden och kontroll över när och var de sker med ljus gör dessa reaktioner väl lämpade för användarstyrd kontroll av biomaterial egenskaper i närvaro av celler. 7,8 I synnerhet har tiol-en photoclick kemiska använts att generera hydrogel-baserade biomaterial med robusta mekaniska egenskaper 5,9 och för inkapsling av en bred variation av celltyper, inklusive, men ingent begränsat till, humana mesenkymala stamceller (hMSCs), fibroblaster, kondrocyter och pankreasceller, med löfte för cellodling och leverans. 10,11 Vidare har dessa kemiska använts för den rumsliga mönstring av biokemiska signaler för att efterlikna de viktigaste aspekterna av infödda cellmikromiljöer och underlätta lämpliga cell-matrix interaktioner, inklusive adhesion, differentiering och invasion. 3,12
För byggandet av tiol-en hydrogeler med ljus, peptider som innehåller cysteiner (tiol) vanligen reageras med polymerer funktionaliserade med akrylater eller norbornener ( "ene") för snabb, fotoinitierad polymerisation under cytocompatible förhållanden. 13 Expanderande denna verktygslåda, försökte vi etablera metoder för hydrogel formation med nya mångsidiga och tillgängliga byggstenar som krävs minimal syntetisk bearbetning eller kommersiellt tillgängliga mot deras breda användning som syntetiska extracellulära matriser.14 Specifikt peptider modifierats med allyloxikarbonyl (Alloc) -skyddade lysiner: en för hängande, integrinbindande grupper för att främja celladhesion [K (Alloc) GWGRGDS = Pep1Alloc] eller två för icke-nedbrytbara eller cell nedbrytbara tvärbindningar [K ( Alloc) RGKGRKGK (Alloc) G eller KK (Alloc) GGPQGIWGQGK (Alloc) K = Pep2Alloc respektive]. Rade med dessa sekvenser, var förhållanden upprättas för snabb reaktion (1-5 min) med fyra-armad tiol-modifierade poly (etylenglykol) (PEG4SH) med användning cytocompatible doser av lång våglängd UV-ljus (10 mW / cm 2 vid 365 nm) och fotoinitiatorn litium fenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP). De resulterande hydrogelerna var stabil under cellodlingsbetingelser för veckor. För att möjliggöra cell driven nedbrytning och ombyggnad, var en enzymatiskt klyvbar peptid inkorporerad i gelén tvärbindningar (dvs GPQGIWGQ), 15 och en modell primär cell, humana mesenkymala stamceller (hMSCs), fortsatt mycket lönsamt efter inkapsling och During kultur inom dessa matriser. Vidare har peptider har rumsligt mönstrade i dessa material, och hMSCs förbli livskraftig och metaboliskt aktiva i photopatterning förhållanden. Alternativa hängande peptidsekvenser, som inte visas här (t.ex., IKVAV, YIGSR, GFOGER, etc.), kan också införlivas i matriserna för att sondera ytterligare cellinteraktioner med den omgivande mikromiljö. Dessa resultat är lovande för tillämpning av dessa hydrogel-baserade material för tredimensionell (3D) cellodling och leverans för att studera och direkta cell-matris-interaktioner för en mängd olika celltyper.
Häri metoder photoencapsulate celler och därefter photopattern biokemiska signaler inom det föreslagna hydrogelen systemet presenteras (Figur 1). Tekniker för att observera och kvantifiera dessa photopatterns också demonstreras: särskilt att i) den kvantitativa och kvalitativa användning av Ellmans analys bestämmer Modificaning av fria tioler inom mönstrade substrat och ii) den komplementära kvalitativ användning av fluorescerande peptider (AF488Pep1Alloc) att följa dessa mönster i tre dimensioner. Vidare, för att analyser bestämma viabilitet (Live / Dead viabilitet / cytotoxicitet-färgning) och metabolisk aktivitet (MTS; 3- (4,5-dimetyltiazol-2-yl) -5- (3-karboximetoxifenyl) -2- (4-sulfofenyl) 2H-tetrazolium) presenteras så att användare kan bestämma cytocompatibility av photoencapsulation och photopatterning villkor för olika cellinjer inom hydrogel matriser. Medan protokollet kan påvisas vid facile ljusbaserad photoclick hydrogel system kan teknikerna tillämpas på ett stort antal andra radikal-initierade hydrogel system för photoencapsulation och photopatterning i närvaro av celler.
Protocol
1. Beredning av material för Hydrogel Bildning
- Syntetisera hänge (Pep1Alloc, AF488Pep1Alloc) och tvärbindnings peptider (Pep2Alloc) av standard fast fas peptidsyntes (SPPS) teknik och tiol-funktionaliserade polymeren med trestegsförfarandet för slutgrupp modifiering (PEG4SH). 14,16 Alternativt köpa PEG4SH (M n ~ 20 kDa), Pep1Alloc och Pep2Alloc kommersiellt.
- Syntetisera fotoinitiator (LAP) genom tvåstegsreaktion beskrivs nedan. 14,17 Utför syntessteg (1.2.1-1.2.11) i ett dragskåp och försiktig vid hantering av kemikalier (skyddshandskar, kläder och glasögon) . LAP också kan köpas kommersiellt.
- Torr alla glas i ugnen (> 2 timmar, 80 ° C).
- Lägga till en omrörarstav till en tom single-halsad rundbottnad kolv (100 ml) och täck med ett septum.
- Fast kolven på toppen av en magnetisk omröring värmeplatta med ett ringstativ och klämma.
- jagnsert en nål (18 G) genom septumet och lämna den yttre änden öppen mot atmosfären. Sätt i en andra nål fäst vid gas en inert linje. Öppna den inerta gasen linjen (t.ex. argon eller kväve) och rensa kolven under 10-15 min.
OBS: Systemet kommer att kontinuerligt spolas med inert gas, argon eller kväve, under reaktionen. - Överföring 1,5 g (~ 1,4 ml) dimetyl phenylphosphonite (OBS) till kolven, med användning av en spruta med nål för att sticka hål genom skiljeväggen. Slå på omrörningsplatta (medelhastighet) och vara noga med att innehållet inte stänker på sidorna av kolven.
- Lägg 1,6 g (~ 1,46 ml) 2,4,6-trimetylbensoyl klorid (FÖRSIKTIGHET) droppvis till kolven innehållande dimetyl phenylphosphonite, med användning av en spruta med en nål för att tränga igenom septum.
- Täcka reaktionskärlet med folie för att skydda mot ljus och rör om under 18 timmar under argon eller kväve.
- Nästa dag, höja höjden på kolven, placera ett oljebad på omrörare, ennd försiktigt sänka kolven i oljebad. Värm badet och kolven till 50 ° C under upprätthållande av magnetisk omröring.
- Lös 3,05 g litiumbromid i 50 ml 2-butanon. Höja kolven ut ur oljebadet och tillsätt litiumbromid lösning på den rundbottnade kolven, kortvarigt avlägsna septumet att strömma in i kolven.
- Tillslut kolven igen med septumet (FÖRSIKTIGHET: Septum kommer fortfarande att ha en nål som leder till de argon linjer och en nål för att ventilera), sänka kolven tillbaka in värms oljebad, och låt reaktionen fortsätta i 10 min. En fast fällning bildas.
- Efter 10 minuter, stänger argon, ta bort kolven från värmen och låt blandningen vila i fyra timmar (täckt med folie för att skydda från ljus som en ljuskänslig initiator har producerats. Håll ventilationsnålen plats.
- Häll produkten i en tratt av glasfritta eller tratt fodrade med lämpligt filterpapper. Skölj filtrat 3 gånger med 50 ml 2-butanon med rEFlytta eventuell oreagerad litiumbromid.
- Torka (första på bänk och sedan i vakuumexsickator) och analysera produkten med en H NMR i D 2 O. Karakteristiska toppar vid 1,8-1,9 (6H, s), 2,1-2,2 (3H, s), 6,7-6,8 (2H, s), 7,3-7,4 (2H, m), 7,4-7,5 (1H, m), och 7,5 -7,7 (2H, m). 14,17
- Använd ett kalkylprogram för att beräkna volymen och koncentrationen av varje stamlösning (PEG4SH, Pep1Alloc, Pep2Alloc, LAP) som måste vara beredda att göra hydrogeler (tabell 1). För att göra icke-mönstrade geler, se till att [SH] = [Alloc] så att alla reaktiva grupper konsumeras under polymerisationen. Om photopatterning av geler är planerad, innefatta en överskottsmängd av tiolfunktionella grupper under gelbildningen baseras på stökiometrin (t.ex. 0,2-5 mM, [SH]> [Alloc]) för senare reaktion med Pep1Alloc.
OBS: Gel bör innehålla mer än 5 viktprocent (vikt-%) PEG4SH att säkerställa snabb polymerisation (inom 5 min). Dock lägre vikt-% intervalls kan undersökas om ansökan kräver hydrogeler med lägre moduler (t.ex. <0,5 kPa); polymerisation bör kontrolleras och justeras efter dessa låga vikt% kompositioner. På liknande sätt kan Pep1Alloc koncentrationen justeras för olika tillämpningar (t.ex., från 0,2 till 5 mm) såsom rapporterats i litteraturen för tiol-funktionaliserade peptider. 18-21 LAP koncentration rekommenderas omkring 0,067 vikt-% (2,2 mM) eller mindre, såsom beskrivits, som högre koncentrationer kan minska cellviabiliteten. - Bered stamlösningar av Pep1Alloc, Pep2Alloc, PEG4SH och LAP under sterila förhållanden för cellodling baserat på beräkningar i tabell 1.
- För Pep1Alloc och Pep2Alloc, individuellt väga den totala massan av Pep1Alloc och Pep2Alloc från peptidsyntes och lös upp i steril fosfatbuffrad saltlösning (PBS) innehållande 1% penicillin / streptomycin (PS) och 0,5 | ig / ml fungizon (FZ). Typiska koncentrationer av beredd stamlösningar intervall20-100 mg / ml peptid. Blanda dessa bestånd för att uppnå geler med slutmoduler är relevant för mjukdels applikationer (Youngs modul ~ 0,5-5 kPa). 22,23 Alikvotera och förvara vid -20 ° C fram till användning.
- För PEG4SH, väga PEG4SH i en steril mikrocentrifugrör och lös i PBS + PS + FZ. Typiska koncentrationer av denna förrådslösning sträcker sig från 250 till 430 mg / ml (20-30% PEG4SH vikt).
- För LAP, väga LAP i en steril mikrocentrifugrör och lös i PBS + PS + FZ till en slutlig koncentration av 7,5 mg / ml.
OBS: Förberedelser färska lösningar av PEG4SH och LAP rekommenderas för varje inkapsling eller gel experiment för att säkerställa konsekventa polymerisationstider.
- Förbereda Sterila sprutspetsen Formar för Forming Hydrogeler.
- Skär försiktigt tips off av 1 ml sprutor med ett rakblad och därefter avlägsna kolvarna från sprutan axlar.
- Dränka sprutan axlarna och kolvar i 70% etanol under 15 min end rum i en steril cellodlings huva för att torka (30 min). Om överskott droppar etanol kvar inuti sprutaxeln använder kolven för att driva ut dem.
- Förbereda Steril glasslid Formar för Forming Hydrogeler.
- Blötlägg objektglas (multiplar av 2) och gummipackningar (0,254 mm tjock, 2 små bitar som används som mellanlägg, en rektangel med skivor stansas ut, eller fyrkantig ram form) i 70% etanol under 15 minuter, och plats i sterila cellodlings huva att torka.
- Coat hälften av de steriliserade objektglasen med anti-adhesiv beläggning per tillverkarens anvisningar för att förhindra vidhäftning av toppen av gelén till glidytan (t.ex., om det finns 4 diabilder, 2-bilder kommer att vara belagda med anti-adhesiv). Dessa kommer att fungera som toppen av glasskivan formen.
- Kalibrera lampa för sprutor eller glas glidformar.
NOTERA: För dessa experiment framställdes en kvicksilverbåglampa med ett externt filter adapteranordning och 365 nm externt filter används. andra lampas som producerar lämpliga intensiteter av lång våglängd UV-ljus kan användas som rapporterats av andra. 24-27- Bifoga en kollimatorlins till slutet av den vätskefyllda ljusledare för att säkerställa relativt jämn ljusintensitet i alla prover. Efter behov, justera avståndet av ljusledaren från provet (s) för att uppnå en punktstorlek som kommer att täcka prover av intresse.
- Placera ett snitt spruta mögel i ett mikrocentrifugrör hållare (för att hålla sprutan mögel i vertikalt läge). Håll radiometern i höjd med sprutspetsen där proven kommer att hållas och justera slutaren (% öppen) för att uppnå en ljusintensitet på 10 mW / cm 2 vid 365 nm. Notera de justerade inställningarna för senare användning.
- Placera en glasskiva mögel på toppen av en steril yta (t.ex., toppen av en pipettspets låda inom en biosäkerhetsskåp). Håll radiometerdetektorn på höjden av glasskivan mögel och justera slutaren (% öppen) för att uppnå en ljusintensitet på 10 mW / cm 2 vid 365 nm. Notera de justerade inställningarna för senare användning.
2. Hydrogel Bildning och Photopatterning
- Framställning av icke-mönstrade Hydrogeler.
OBS: Vid denna punkt i protokollet, om hydrogeler är att användas i cellodlingstillämpningar, alla efterföljande steg bör utföras under sterila betingelser i en steril skåp eller huva.- Blanda förrådslösningar av PEG4SH, Pep2Alloc, Pep1Alloc, LAP, och PBS + PS + FZ enligt beräknings kalkylblad (se tabell 1 exempel). Pipettera den resulterande gelén prekursorlösningen kraftfullt för att säkerställa jämn blandning av lösningen.
- Förbereda tjocka hydrogeler formade i sprut tips genom pipettering 10-20 | il av gelföregångaren lösning (PEG / Pep / LAP / PBS) i spetsen av en steril, spruta cut. Gör en enda gel per spruta, ca 0,5-1,5 mm tjock baserat på volym och spruta diameter.
OBS: Större volymer kan utforskas på grundval avönskad gel storlek där övre gränser kan existera baserat på diffusions begränsningar för Pep1Alloc under photopatterning och / eller näringsämnen / avfall till / från inkapslade celler under cellodling. - Förbereda tunna hydrogeler i glasobjektglasformar genom att placera gummipackningen (0,254-mm tjock) runt kanterna på den icke-belagda objektglas. Pipett 5-10 pl gelföregångaren lösning (enstaka eller flera 5-10 il geler kan göras genom att pipettera en eller flera punkter av lösningen på en enda bild) på icke-belagda glasskiva och placera glasskiva belagd med anti-bindemedel på toppen av gellösningen (större geler, upp till storleken av objektglaset, kan göras beroende på den slutliga tillämpningen). Säkra glas med små bindemedel klipp för att stabilisera.
- Placera formar under lampan och ställ in lampans intensitet (t.ex.% aren öppen) för att uppnå 10 mW / cm2 vid gelytan för sprutspetsen formar eller glasskiva formar baserat på mätningar i steg 1.7.2 och1.7.3, respektive.
- Applicera ljus under 1 till 5 min för att medge fullständig polymerisation av geler. Använd en kortare polymerisationstid för geler med högre PEG4SH innehåll (8 vikt-% eller högre, 1 min) och längre geler med lägre PEG4SH innehåll (5-8 vikt%, 3-5 min) att producera fullt polymeriserade hydrogeler med moduler inom utbudet av mjuka vävnader (0,5-5 kPa).
- Place geler från sprutspetsen formar i en steril icke-behandlade 48-brunnars platta, och placera objektglas i en steril skål.
- Skölj 3 x 15 min med cellodlingsmedium eller lämplig buffert (t.ex. PBS + PS + FZ, Ellman reaktion buffert) baserat på planerade experiment, som beskrivs nedan.
- Framställning av Mönstrade Hydrogeler.
- Blanda stamlösningar av PEG4SH, Pep2Alloc, LAP, och PBS + PS + FZ enligt beräknings kalkylblad, lämnar fria tioler (0,2-5 mm) för senare reaktion med Pep1Alloc. Pipet prekursorlösningen kraftfullt för att säkerställa jämn blandning av lösningen.
- Förbered tjocka och tunna hydrogeler som läggs fram i steg 2.1.2 till 2.1.6.
OBS: Placera inte geler i odlingsmedium före photopatterning. Fria tioler kan konsumeras för varje art i tillväxtmediet (t.ex., disulfidbildning med tiolinnehållande proteiner) och kommer inte att tillåta mönstring av gelén utan ytterligare behandlingssteg (t.ex. reduktion av disulfidbindningar). - Bereda lösningar av Pep1Alloc (slutlig koncentration ~ 3-20 mg / ml) och 2,2 mM LAP.
- Täcka förformade geler med Pep1Alloc / LAP-lösning och inkubera under en timme vid 37 ° C.
- Ta bort överflödigt Pep1Alloc / LAP lösning. Om geler göts i en sprutspets, använd en spatel för att noggrant överföra gelema från 48-brunnars platta i vilken de är inkubering till en steril glasskiva för mönstring.
- Placera en fotomask med det önskade mönstret direkt ovanpå syringe- och glasglidgjutna geler. Säkerställa att den tryckta delen av masken vidrör gelén för optimal pattern trohet (dvs mask bör läsa rätt och vara emulsionssidan nedåt). Placera proverna under lampan och bestråla under 1 minut med lampan inställningar som används för glasskivor (steg 1.7.3).
- Efter mönstring, plats spruta gjutna geler i en steril, 48-väl icke-vävnadsodling behandlad plåt, och plats glasskiva gjutna geler som anslutit sig till de glasskivor i en steril skål.
- Skölj 3 x 15 min med cellodlingsmedium eller lämplig buffert (t.ex. PBS + PS + FZ, Ellman reaktion buffert) baserat på planerade experiment.
3. Visualisering och kvantifiering av Photopatterning
- Ellmans analys för att detektera och kvantifiera fria tiolerna i Photopatterned Hydrogeler.
- Förbereda Ellmans reaktionsbuffert, cystein arbetslösning, standarder, och Ellmans reagens såsom beskrivs nedan.
- För Ellmans Reaction Buffer, upplösa 2,4 g natriumfosfat dibasisk (Na 2 HPO4) och 74,4 mg etylendiamintetraättiksyra (EDTA) i 200 ml DIH 2 O (0,1 M Na 2 HPO 4, 1 mM EDTA). Justera pH till 7,5-8 med lösningar av natriumhydroxid (NaOH) eller fosforsyra (H 3 PO 4).
- För cystein Working Solution, upplösa 5,27 mg cystein i 15 ml reaktionsbuffert (2 mM cystein).
- För Cystein Standards, utspädd cystein arbetslösning i reaktionsbuffert till en slutlig koncentration av 2, 1,5, 1,25, 1, 0,75, 0,5, 0,25, och 0 mM cystein.
- För Ellman reagens, upplösa 4 mg Ellman reagens i 1 ml reaktionsbuffert. Sonikera för fullständig upplösning av Ellmans reagens.
- Kvantifiera koncentrationen av fria tioler i geler med Ellmans analys (Figur 2).
OBS: "tunn" 5 il hydrogeler, gjuten mellan glasskivor, beskrivs i proceduren nedan och rekommenderade att möjliggöra snabb spridning av Ellman reagens through gelen (dvs det tar reagens en längre tid att diffundera genom tjocka geler).- Bestämma den svällda gelén volymen av "tunna" 5 | il geler (V S) baserat på det volumetriska svällningsförhållandet, Q.
- Gör tre 20 pl "tjocka" geler använder sprutformar. Placera geler i Ellman reaktion buffert för 24 timmar och därefter väga (jämvikt svullna massa, M S). Lyofilisera geler och därefter väga (torrvikt, M D).
- Genom att använda de uppmätta massorna för tjocka geler, beräkna den volymetriska svällningsförhållandet 28 av Q = 1 + ρ polymer / ρ lösningsmedel (M S / M D -1) där ρ polymer = 1,07 g / cm 3 för PEG, 29 ρ lösningsmedel = 1,0 g / cm 3 för PBS / H2O
- Beräkna teoretisk torrvikt gel som skall användas för Ellmans analys (här, 5 il "tunna" geler är typiskt uSED), genom att summera massorna av enskilda komponenter PEG4SH, Pep1Alloc och Pep2Alloc (M D = M PEG4SH + M Pep1Alloc + M Pep2Alloc). Till exempel kan en 5 | j, l gel innehållande 10 vikt% PEG4SH innehåller cirka 0,000535 g PEG som beräknas av M PEG4SH = 0,005 cm 3 x 1,07 g / cm 3 x 0,10. Pep1Alloc och Pep2Alloc massorna kan beräknas på ett liknande sätt baserat på vikt% i lösning (se kalkylbladet för värden), förutsatt ρ ≈ 1,0 g / cm3 för dessa vattenlösningar.
OBS: Gel kan även torkas och vägs i stället för att beräkna den teoretiska torrvikt. Kan det emellertid vara svårt att konsekvent mäta torrvikt av de tunna, 5 | il geler. - Baserat på den förutspådda torr massa och Q-värdet bestäms från "tjocka" geler, beräkna den förutsagda svullna massa M S för "tunn" gel (ekvation i steg 3.1.2.1.1). Antag att ρ ≈ 1,0 g / cm
OBS: Ovanstående metod rekommenderas för att bestämma V s för svullna geler som "tunna" 5 il geler är svåra att överföra för vägning.
- Form tunna hydrogeler för mönstring som beskrivs i avsnitt 2.2 (5 pl volym). Specifikt göra geler med överskott av fria tioler och "mönster" hälften av dessa prover med Pep1Alloc med hjälp av en tydlig täck att översvämma exponera hela gelén med ljus (t.ex. 6 totalt geler med överskott tiol: 3 omodifierad icke-'patterned "och 3 ' mönstrad').
OBS: För denna analys, "mönstrade" geler är översvämning exponeras för ljus utan en fotomask. Denna metod används för att bestämma det totala antalet fria tioler som konsumeras i hela gelén provet och för att visa hur effektivt fria tioler kan modifieras med peptid. Ur denna informationantalet fria tioler förbrukas under mönstring med en fotomask kan förutsägas baserat på gelén tjocklek och mönsterarean (regioner som utsätts för ljus). - Plats "mönstrad" och icke-'patterned 'geler i brunnar i en 48-brunnars platta och skölj 3 x 15 min med Ellmans reaktionsbuffert för att tillåta diffusion av oreagerade arter ut ur gelén och jämvikt svullnad uppstå.
- Lägg extra Ellman reaktion buffert till de sköljda gelerna så att V: s med reaktionsbuffert är en multipel av 20 pl. Till exempel, om den förutsagda V S är 15 | il, tillsätt 5 pl reaktionsbuffert (20 | j, l), och om den förutsagda V S är 30 | il, tillsätt 10 | il reaktionsbuffert (40 | j, l).
- Pipet cystein-standarder i enskilda brunnar (ej innehållande geler) av en 96-brunnars platta i multiplar om 20 | j, l, beroende på den volym som används i det föregående steget (dvs om det tidigare steget hade Vs + extra reaktions bUffer = 40 pl, tillsätt 40 | il av varje standard till individuella tomma brunnar).
- Späd Ellman reagens i reaktionsbuffert (multiplar av 180 pl reaktionsbuffert + 3,6 l Ellman reagens, t ex 183,6 för 20 l eller 367,2 pl 40 pl i steg 3.1.2.5).
- Lägga utspädd Ellmans reagens till brunnar innehållande standarder och prover. För 20 ul prover, tillsätt 183,6 l lösning till varje brunn. Dubbla denna mängd av utspädd Ellmans reagens i 40 ul prover (eller skala i enlighet därmed baserat på storleken av provet).
- Inkubera eller placera på en skak under 1 timme och 30 minuter (vid rumstemperatur) eller tills lösningens färg matchar färgen på gelerna genom visuell inspektion för att säkerställa tillräcklig diffusion av den gula 2-nitro-5-tiobensoat dianjon (TNB 2-), som genereras vid reaktion av Ellmans reagens med fria tioler, från gelén.
- Ta 100 pl lösning från prover och sSTANDARDER och placera i brunnar i en 96-brunnsplatta.
- Läs absorbans vid 405 nm på en plattläsare.
- Att bearbeta data, rita standardkurvan (prover från steg 3.1.1.3) (absorbans mot koncentration) och montera en linjär funktion. Med hjälp av linjär funktion, koncentrationen av fria tioler i "utspädd gel lösning (gel + reaktionsbuffert) kan beräknas baserat på absorbansmätningar. Slutligen, med hänsyn till den "utspädning" med reaktionsbuffert, fastställa den fria tiolen koncentrationen i gelerna utan reaktionsbuffert. (T.ex. om 15 pl gel späddes med 5 pl reaktionsbuffert, multiplicera med 20/15).
- Bestämma den svällda gelén volymen av "tunna" 5 | il geler (V S) baserat på det volumetriska svällningsförhållandet, Q.
- Visualisering av photopatterns med Ellmans reagens (figur 3A).
- Blöt tunna hydrogeler mönstrade med Pep1Alloc i Ellmans reaktionsbuffert under 1 timme.
- Avlägsna överskott av reaktionsbuffert genom att försiktigt torka runt kanterna på hydrogelen med en vävnad.
- Pipett Ellmans reagens direkt på ytan av gelén. Omedelbart bild på ett ljusmikroskop vid 10X eller stereo med en färgkamera.
Obs: Gel måste avbildas omedelbart eftersom visualiseringsmönster kommer att försvinna inom fem minuter som den gula TNB 2- jon produceras genom klyvning av Ellman reagens vid reaktion med tioler i icke-mönstrad region diffunderar genom gelén. Icke-mönstrade regioner visas svagt gult för blotta ögat; för bättre upplösning och mindre mönster, förstoring (t.ex., användning av ett mikroskop) krävs.
- Förbereda Ellmans reaktionsbuffert, cystein arbetslösning, standarder, och Ellmans reagens såsom beskrivs nedan.
- Visualisering av Photopatterns med fluorescerande peptider (figur 3B).
- För att visualisera mönster med högre upplösning eller i tre dimensioner, photopattern en AF488-modifierat Pep1Alloc (eller liknande fluorescerande peptid) till gelerna i steg 2,2.
- Bild på ett fluorescensmikroskop. Ett konfokalmikroskop kan användas här för att ta z-stack bilder av gelén så att mönstret kan observeras i x-, y- och z-plan.
OBS: Med fluorescens måste geler skyddas från ljus för att säkerställa stabiliteten i AF488 fluoroforen och maximal fluorescens. Geler behöver inte omedelbart avbildas eftersom fluorescerande peptiden är ganska stabil, om skyddat mot ljus (förvara i en behållare inslagna i folie vid 4 ° C).
4. Cell Inkapsling i Hydrogeler och Photopatterning
- Att samla in och förbereda celler för inkapsling.
- Efter standard sterila däggdjurscellodlingsförfaranden trypsinize och samla cellerna av intresse från plattorna. Släck trypsin med tillväxtmedium efter lösgör inträffar (t.ex. för en T-75-kolv, 5 ml trypsin, avbryt reaktionen med 5 ml medium, skölj plattan med 5 ml medium för totalt 15 ml).
OBS: trypsinering tider kan variera mellan olika celltyper men vanligtvis ske mellan 5 och 15 min. Alternativa cell detachment medel (t ex, Versene) kan användas för att samla upp celler, om så önskas. - Räkna celler (minst 100 eller per tillverkarens protokoll) från alikvoter av trypsiniserades cellsuspensionen med hjälp av en hemocytometer eller annan cellräkning enhet medan centrifugering av bulk cellsuspensionen (90-110 xg, 5 min). Återsuspendera cellpelleten efter centrifugering i en minimal volym av PBS eller tillväxtmedium och åter räkna om den initiala trypsinerades cellsuspensionen för utspätt.
- Återsuspendera celler i en minimal volym av PBS och alikvoter för varje gel tillstånd och in i mikrocentrifugrör, så att det kommer att finnas 5000 celler / | il, då de blandas med gelén lösning (före polymerisation).
OBS: Typiska cell alikvoter innehåller 300,000-500,000 celler och är tillräckligt för att göra 60 till 100 | j, l av gel / cellsuspension, som kan användas i 3-5 x 20 pl geler med 5000 celler / ul. Högre eller lägre celltätheter kan användas för inkapsling, beroende på mängden av cell-cellkontra cell-matrix kontakt önskas, respektive, och bör bestämmas för varje applikation. - Centrifug cell / PBS portioner (90-110 xg, 5 min).
- Försiktigt aspirera PBS från cellpelleten i mikrocentrifugrör precis innan inkapsling.
OBS: Om celler är känsliga för skjuvkrafter, kan det andra centrifugeringssteget elimineras genom räkning (t.ex. hemocytometer) och därefter aliquotting den trypsinerades cellsuspensionen (trypsin + media + celler) i delar som behövs för varje gel tillstånd. Dessa alikvoter centrifugeras en gång (90-110 xg, 5 min) och trypsin + media sugs av och lämnar en cellpellet för inkapsling.
- Efter standard sterila däggdjurscellodlingsförfaranden trypsinize och samla cellerna av intresse från plattorna. Släck trypsin med tillväxtmedium efter lösgör inträffar (t.ex. för en T-75-kolv, 5 ml trypsin, avbryt reaktionen med 5 ml medium, skölj plattan med 5 ml medium för totalt 15 ml).
- Inkapslande celler i icke-mönstrade hydrogel.
- Omedelbart efter aspire PBS, suspendera pelleterade celler i PEG4SH, Pep2Alloc, Pep1Alloc, LAP, och PBS + PS + FZ som beräknats i kalkylbladet till en slutlig koncentration av 5000 celler / l.
- Mögel och polymerisera hydrogeler som described i steg 2.1.2 till 2.1.6.
OBS: När inkapsling celler i glasskiva formar, måste man vara försiktig när du tar bort den övre glid efter polymerisation för att förhindra skjuvning av gel, vilket kan leda till celldöd. Att hjälpa till med avlägsnande av gelén från formen, kan glidformar placeras i sterilt PBS eller tillväxtmedium efter polymerisation för att väta packningen och hydrogel, vilket gör det lättare att ta bort den övre sliden. En metod för att förhindra denna skjuvning altogether är genom användning av sprutformar. - Skölj geler 3 x 10 min i tillväxtmedium för att avlägsna oreagerade arter och överskott LAP.
- Inkubera geler i tillväxtmedium vid 37 ° C och 5% CO2 tills önskad tidpunkt för ytterligare analys. Fyll medel varje 48 timmar eller som bestämd för tillämpningen (t.ex. typiskt matningsintervallet för specifik celltyp och medium).
- Kapsla in celler och Photopatterning i närvaro av celler.
- Omedelbart efter aspire PBS,suspendera pelleterade celler i PEG4SH, Pep2Alloc, LAP, och PBS + PS + FZ som beräknats i kalkylbladet till en slutlig koncentration av 5000 celler / l. Lämna en lämplig koncentration av fria tioler (t ex 2 mm) för senare reaktion med Pep1Alloc.
- Mögel, polymerisera, och mönster hydrogeler som beskrivs i steg 2.2.2 till 2.2.8.
- Skölj geler 3 x 10 min i tillväxtmedium efter mönstring att avlägsna oreagerade arter och överskott LAP.
- Inkubera geler i tillväxtmedium vid 37 ° C och 5% CO2 tills önskad tidpunkt för ytterligare analys. Fyll medel varje 48 timmar eller som bestämd för programmet.
5. Fastställande av livskraft och metabolisk aktivitet hos inkapslade celler
- Utför Live / Dead Cytotoxicitet analys för att bestämma Encapsulated cellviabilitet (Figur 4A).
- Ta bort odlingsmedium från geler och skölj 3 x 15 min med PBS för att tillåta diffusion av medium från gels.
- Tina Live / Dead cytotoxicitet analyslösningar (etidium homodimer-1 och kalcein AM).
- Tillsätt 2 l av 2 mM etidium homodimer-1 och 0,5 pl av 4 mm kalcein AM lösningar till 1 ml steril PBS. Vortex för säkerställande av fullständig blandning.
- Tillsätt 300 pl färglösningen till varje spruta form gel i 48-brunnars plattor, eller tillräckligt för att täcka ytan av gelén på en glasplatta i en steril skål, och inkubera i 45 min.
- Ta bort överflödigt färglösningen och skölj ta bort överflödig färg från gelerna (3 x 15 min med PBS).
- Bild på en konfokalmikroskop (z-stack bilder) eller på ett epi-fluorescensmikroskop med z-stack kapacitet vid 10X och 488/525 nm Ex / Em. Kvantifiera antalet livskraftiga celler genom att projicera z-stackar och räkna antalet levande (grönt hela cellkroppen) och döda (röda kärnor) celler med bildbehandlingsprogram.
- Utför metabolisk aktivitet analys för att bestämma cellaktivitet efter inkapsling (Figure 4B).
- 24 h före analys, foder inkapslade celler med färskt tillväxtmedium.
OBS: Lägg medium till ett par extra brunnar (som inte innehåller några geler eller geler med inga celler) som kontroll (bakgrundsavläsningar). - Vid tidpunkten av intresse, tina MTS reagenslösning.
OBS: För att bestämma metabolisk aktivitet över tid, är en initial tidpunkt (12-24 h efter inkapsling) rekommenderas som en referens för jämförelse med senare tidpunkter. - Lägga MTS-reagens till varje brunn (20 pl per 100 pl odlingsmedium).
- Inkubera prover för 1-4 h vid 37 ° C och 5% CO2, enligt tillverkarens instruktioner.
OBS: Inkubationstider bör vara tillräcklig för celler att reducera MTS och tillåta diffusion av formazanprodukten ut från gelén. Följaktligen kan tjockare geler såsom sprutspetsen geler kräver längre inkubationstider (~ 4 h) för tillräcklig MTS reduktion och diffusion. - Pipett 100 ul minskas MTS / Mediumtill rena brunnar i en 96-brunnars platta och spela in absorbans vid 490 nm på en plattläsare.
- Subtrahera bakgrundsabsorbansen för brunnar utan celler från prov absorbansvärden att generera baselined absorbansvärden.
- 24 h före analys, foder inkapslade celler med färskt tillväxtmedium.
Representative Results
Installationen och förfarande för att photoencapsulate celler och därefter photopattern geler innehållande inkapslade celler avbildas i figur 1, och ett exempel för beredning av förrådslösningar för att bilda en 10 vikt-% gel finns i tabell 1. Med hjälp av tabell 1, mängden av monomerer (PEG4SH , Pep2Alloc, ± Pep1Alloc) och fotoinitiator (LAP) som krävs för att polymerisera hydrogeler beräknas. Baserat på dessa beräkningar, är stamlösningar av PEG4SH, Pep1Alloc, Pep2Alloc och LAP beredd och blandas med och utan Pep1Alloc för formning och photopatterning geler, respektive (Figur 1A). Därefter celler uppsamlades från plattor, räknades och centrifugerades i lämpliga mängder för inkapsling (Figur 1B). Cellpelleten återsuspenderas i gelbildande lösningen (peptid / polymer / LAP i PBS) och cell / monomerblandningar överförs till glas eller spruta molds. Cellerna är inkapslade i hydrogel vid tillämpning av ljus (1-5 minuter av 10 mW / cm2 vid 365 nm) (Figur 1C). För photopatterning (figur 1D), är geler indränkt med Pep1Alloc och LAP för 30 min till 1 h och 30 min, vilket tillåter diffusion av peptid och initiator i den polymeriserade matrisen. Dessa peptidladdade geler är täckta med fotomasker med önskade mönster och exponeras för en andra dos av ljus (1 min) för att konjugera peptiderna till fria tioler inom matrisen. Vidhängande tjuder endast kovalent bunden till gelén i regioner som utsätts för ljus, vilket underlättar lämpliga cell-matrix-interaktioner och härma viktiga mekaniska och biokemiska egenskaperna hos den nativa cellmikromiljö mot sonderingscellfunktion och ödet in vitro.
Ellmans analys ger en enkel och billig metod för att kvantifiera gel modifiering och peptid inkorporering inom photopatterned substrat. Mönstrad och icke-mönstrade geler (dvs geler med eller utan peptid modifiering) är dränkta i Ellman reaktion buffert efter polymerisation. Därefter cystein standarder och gelerna blötlagda i buffert placerades i 48-brunnars plattor och inkuberades med Ellmans reagens (figur 2A, vänster). Efter 1 timme 30 minuter, alikvoter av proverna placerades i individuella brunnar i en 96-brunnars platta, och absorbansen registreras vid 405 nm. En kalibreringskurva (figur 2A, höger) från cystein standarderna plottas (absorbans mot koncentration, linjär passform), och mängden av fria tioler i geler kan bestämmas baserat på deras utspädningsfaktor. Dessa fria tiol koncentrationer för olika polymerisationsbetingelser och photopatterning betingelser av en 10 vikt-% gel visas i figur 2B. Geler polymeriserade i ett eller 5 minuter utan Pep1Alloc (blå staplar, I = 1 min och II = 5 min) har statistiskt liknande fria tiol koncentrationer, vilket indikerar thatt en snabb reaktion inträffar och gelning är fullständig inom en minut (tvåsidigt t-test, p> 0,05). Således innebär ytterligare exponering för ljus (2-5 minuter) inte leda till ytterligare omvandling av funktionella grupper. Geler polymeriserade i 1 min utan Pep1Alloc indränktes med Pep1Alloc (3 mg / ml) och LAP (2,2 mM) under 30 och 90 min (gröna staplar, II = 30 min och IV = 90 min) och utsattes för en andra dos av ljus under 1 min. Minskningen av fria tioler (60-80% med avseende på den 1 min skick) indikerar effektiv modifiering av geler med vidhängande cues under dessa betingelser. Om högre modifiering önskas, kan ökade koncentrationer av Pep1Alloc lösningen användas som tillgänglighet Pep1Alloc till fria tioler i mer utspädda peptidlösningar kan begränsa omvandling; till exempel, har vi funnit att koncentrationer upp till 20 mg / ml Pep1Alloc producera> 90% omvandling av fria tioler.
Unikt, mönster av peptider till hydrogelen fårsnabbt avbildas med Ellmans reagens (Figur 3A, under 5 min). Emellertid är visualisering av mönster förlorade med tiden (mer än 5 min) på grund av diffusion av den gula TNB 2- dianjon genom gelén. För att förbättra avbildning upplösning och observera mönster i tre dimensioner (X-, Y- och Z-plan) och i närvaro av celler, kan fluorescerande peptid tillsats (AF488Pep1Alloc) utnyttjas. I figur 3B x-, y- och z-projektioner av bildstaplar tagna med ett konfokalmikroskop visas, vilket visar mönsterupplösning (xm skala).
Ungefär (94 ± 2)% och (94 ± 1)% av hMSCs inkapslade inom nedbrytbara geler (Pep2Alloc = GPQG ↓ WGQ) förblir livskraftiga (gröna cellkroppar) 1 och 6 dagar efter inkapsling, respektive, med några döda celler (röda kärnor ) observerades (Figur 4A). Vidare hMSC spridning observeras vid 6 dagar efter inkapsling (
2fig1.jpg "/>
Figur 1:. Inställning för inkapsling av celler i hydrogeler och därefter photopatterning med biokemisk cue (A) Stamlösningar av makromerer och fotoinitiator bereds och blandas (PEG4SH = ryggrad, Pep2Alloc = tvärbindning, Pep1Alloc = hängande vidhäftande delen (RGDS), LAP = fotoinitiator ). (B) Celler uppsamlas för inkapsling. (C) Celler blandades med makromer lösningar utan eller med integrin-bindande peptider (PEG4SH / Pep2Alloc / LAP eller PEG4SH / Pep2Alloc / Pep1Alloc / LAP, respektive) och är inkapslade vid exponering för ljus. (D) Geler som innehåller överskott av tiolgrupper under gelbildning (här, PEG4SH / Pep2Alloc / LAP, utformat med 2 mM överskott tiol) kan vara mönstrad med biokemiska signaler genom efterföljande tillsats av peptider funktionaliserade med en enda alloc grupp (Pep1Alloc, t.ex. RGDS, IKVAV, etc.) för att gynna cellvidhäftninginom specifika områden av gelén. Här, mönstring av geler med fluorescensmärkta RGDS visas. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2:. Kvantitativ Ellmans analys inställning och resultat för att utvärdera modifiering av mönstrade hydrogeler (A) geler och cystein standarder inkuberas i 48-brunnsplattor med Ellmans reagens. En linjär standardkurva plottas för att bestämma cystein koncentration i gel prover. (B) Överskott fria tioler införlivas i hydrogeler under gelbildning och konsumeras vid mönstring med ett hänge alloc-peptid (I = 1 min polymerisation; II = 5 min polymerisation; III = 30 min inkubation med Pep1Alloc, IV = 90 min inkubation wi th Pep1Alloc; både III och IV polymeriseras och mönstrad med ljus under 1 min). De data som visas illustrerar medelvärdet (n = 3) med felstaplar visar standardfelet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3:. Ellmans analys och fluorescerande bilder för att visualisera photopatterned hydrogeler (A) Ellmans reagens kan användas för att snabbt upptäcka mönster (linjer) i X- och Y-plan (gul = omönstrad region, Skalstreck = 1 mm). (B) Fluorescerande peptider kan användas för att observera mönster i x-, y-, och z-plan (grön = mönstrad region; 200 | j, m skala bar; 10X vatten-doppning mål; Ex / Em 488/525 nm).large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
. Figur 4: livskraft och metabolisk aktivitet av celler i icke-nedbrytbara photopatterned hydrogeler (A) Exempel konfokal z-stack (z-projektion, 10X vattendopp mål) av livskraftiga (grön, Ex / Em 488/525 nm) och död hMSCs (röd, Ex / Em 543/580 nm) inkapslad i hydrogeler 24 timmar efter inkapsling (Skalstreck = 200 nm). Celler sprids inom dessa hydrogeler 6 dagar efter inkapsling (infälld bild, Skala bar = 50 pm). (B) Celler är metaboliskt aktiv 1 och 3 dagar (mörka och ljusa barer, respektive) efter inkapsling för olika polymerisation (I = 1 min polymerisation; II = 5 min polymerisation) och mönstring förhållanden (III = 30 min inkubation med Pep1Alloc ; IV = 90 min incubation med Pep1Alloc; både polymeriserade och mönstrad med ljus under 1 min). De data som visas illustrerar medelvärdet (n = 3) med felstaplar visar standardfelet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Tabell 1: Exempel setup för att beräkna volymer av stamlösningarna för att göra hydrogeler celler i kalkylbladet som är markerade blå indikerar användardefinierade parametrar;. de andra kvantiteter beräknas baserade på dessa inställningar. De slutliga volymerna för varje stamlösning för att göra en gel med orange. De vita blodkroppar innehåller formler används för att beräkna de slutliga volymerna baserade på användardefinierade parametrar. Observera att en koncentration av 2,2 mM LAP är ekvivalent med 0,067 vikt-%.
Discussion
Förfarandet som presenteras här visar tekniker för att photoencapsulate celler i hydrogeler bildas av tiol-en klick kemi och därefter photopattern gelerna med biokemiska signaler. Användningen av ljus att initialt bilda hydrogeler möjliggör homogen blandning och suspension av celler i polymerlösningen före polymerisation. Snabb polymerisation "låser" gelén i form av den definierade formen och kapslar upphängda celler i hydrogel nätverket. Geler även kan gjutas in i talrika former (t.ex. glasskivor eller sprutspetsarna) beroende på den önskade slutliga tillämpningen. Till exempel kan celler inkapslade för 3D kultur i hydrogeler fästa till glasskivor är särskilt användbara för avbildningstillämpningar som ljusdämpning är begränsad inom ett tunt prov. Sprutformar kan användas för snabb inkapsling av celler, vilket gör att ett större antal prover som framställas i en kort tid (jämfört med glasskivas) som kan användas för experiment som kräver ett stort antal celler, såsom flödescytometri eller qPCR. Därefter dessa geler kan sedan mönstras med biokemiska signaler för att framkalla önskade cellulära svar såsom differentiering eller invasion. 30,31
Analyser för livskraft och metabolisk aktivitet indikerar överlevnad av celler för materialsystemet och mönstring villkor presenteras. Observera att metabol aktivitet övervakades till dag 3 i icke-nedbrytbara geler (RGKGRK peptid tvärbindning) för att bedöma de initiala effekterna av polymerisationsbetingelser och mönstringsvillkor på cellfunktionen. Dessutom kan en membranintegritet analys (Live / Dead viabilitet / cytotoxicitet färgning) av hMSCs vid 1 och 6 dagar efter inkapsling i geler formulerade med en nedbrytbar peptidtvärbindning (GPQGIWGQ) stöder att cellerna förblir livskraftiga och spridas på en vecka i kultur. Livskraft ytterligare cellinjer har rapporterats för photopatterning förhållanden 32 som liknar demanvänds här och kan utvärderas för den beskrivna hydrogelen systemet med Live / Dead färgning och metabola aktivitetsanalyser. Även om vi inte har observerat problem med cellviabiliteten med hjälp av denna materialsystem och tillhörande förfaranden (4.2 och 4.3), kan vissa celltyper vara känsliga för fria radikaler och / eller ljusexponering. I detta fall kan användare överväga att använda icke-fotoinitierad materialsystem, såsom azid-alkyn, 12 FXIII, 31 eller Diels Alder-baserade hydrogel bildningskemi. 33
Facile tekniker för att detektera och kvantifiera mönstring av biokemiska signaler inom geler också presenteras (3,1 och 3,2). Ellmans analys är av särskilt intresse eftersom de reagens är kommersiellt tillgängliga och inga extra syntetisk behandlingssteg eller mer dyra reagens (t.ex. fluorescensmärkt peptid) som krävs. Ellmans analys kan användas för att exakt bestämma den modifiering av fria tioler med biokemiska signaler enligt different photopatterning förhållanden samt att snabbt visualisera mönster. För att kvantifiera peptid inkorporering, tiol funktionella gruppen koncentration före och efter mönstring, som ett kvantitativt mått på peptid införlivande är direkt bedöms med Ellmans analys. Även om denna typ av kvantifiering kan göras med fluorescensmärkta peptider, kräver 34 avbildning baserad kvantifiering mer tidskrävande hanterings- och analysstegen (t.ex. syntes av en fluorescensmärkt peptid och generering av en kalibreringskurva för att relatera fluorescens till peptidkoncentration användning av bildanalys). För avbildning peptid inkorporering kan Ellman reagens appliceras direkt på prov och omedelbart visualiseras. Medan begränsat till x- och y-plan för mönster visualisering, kan tekniken användas som ett enkelt, rutinmetod för att bestämma om matriser innehållande fria tiolgrupper har mönstrad. Det är viktigt att notera att Ellmans analys är inte considered cytocompatible, så även om det kan användas för att observera och kvantifiera photopatterns, kan det inte ske i närvaro av celler. För avbildning mönster i tre dimensioner och i närvaro av celler, konjugering av fluorescerande peptider inom hydrogel matriser fortfarande en kraftfull och allmänt använd metod. Upplösning av mönster kan utvärderas i x-, y-, och z-plan med hjälp av konfokalmikroskopi, och denna metod är cytocompatible så att celler inom mönstrade regioner eller icke-mönstrade regioner kan identifieras. Sammantaget Ellmans analys och bildbaserade tekniker är kompletterande verktyg för forskare att bedöma både kvantitativt och kvalitativt photopatterning av biokemiska signaler inom materialsystem.
Photoclick, eller mer allmänt fotoinitierad, kemiska för bildandet och modifiering av hydrogeler i närvaro av celler är många. Form, inkapsling, och mönstring tekniker som presenteras här är inte limsad till det beskrivna materialsystem och kan tillämpas på alternativa ljusbaserade kemier, såsom tiol-alkyn, 35 azid-alkyn, 4 och andra tiol-en kemier (t.ex., tiol-norbornen), 10,13 samt med olika fotoinitiatorer, såsom Irgacure 2959, Eosin Y och kamferkinon. Observera, kan användare behöva justera procedurparametrar (t.ex. inkubationstider, polymerisationstider, celltäthet) för att se till att villkoren förblir cytocompatible för dessa andra system. Eftersom mönstringsprocessen kräver diffusion av alloc-modifierad peptid (er) i hydrogelen (2.2.3-2.2.5), kan denna process visa sig vara mycket användbara för tillsats av integrin-bindande delar (t.ex. peptider eller extracellulärt matrisprotein fragment) till hydrogelen, där det krävs fastsättning av liganden till nät för generering av dragkrafter från cellen och full integrin-aktivering. 36 Not, för biomolekyler som kanvara lika aktiva i lösning eller vid immobilisering (t.ex., tillväxtfaktorer eller cytokiner) kan inkuberingssteget för del diffusion (~ 1 timme) i hydrogelen leda till signalering händelser som convolute mönstring resultat. Andra metoder har fastställts för tillväxtfaktor immobilisering eller lokal sekvestrering för deras mönstring. 37-39 Dessutom är mönsterupplösning dikteras av kontroll över ljusexponering. Här, fotomasker tillåter skapande av mönster genom gelén djup och i x- och y-plan; emellertid kan större rymd kontroll över mönstring av biokemiska signaler inom geler uppnås med alternativa metoder för bestrålning, såsom användning av en två-foton-konfokalt mikroskop för att generera mönster i X-, Y-, och Z-plan. 34,40 Slutligen är det viktigt att notera att medan materialet systemet utnyttjas inom detta förfarande är endast initialt modifierad med biokemiska signaler, kunde ortogonala photoclick kemier användas för att medge alteransoner i matris egenskaper över tiden. 12 Förfarandet och tekniker som presenteras här lägga mångfald till nuvarande metoder för att skapa syntetiska matriser med väl definierade och spatiotemporally kontrollerade egenskaper. I synnerhet kommer den kommersiella tillgängligheten av reagenser och material som används inom detta förfarande vara till nytta för ett stort antal forskare som är intresserade av att använda hydrogel-baserade biomaterial för användning inom kontrollerad cellkultur.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av Delaware Cobre program i Drug Discovery och i avancerade Biomaterials finansieras av institutionell utveckling Awards från National Institute of Generals medicinska vetenskaper vid National Institutes of Health (P20GM104316 och P30 GM110758-01, respektive), de Pew Charitable Trusts (00026178), en National Science Foundation Karriär Award (DMR-1.253.906), Burroughs Wellcome Fund (1.006.787) och National Science Foundation IGERT SBE2 programmet vid University of Delaware (gemenskap L. Sawicki). Författarna tackar Delaware Biotechnology Institute Bioimaging Center vid University of Delaware för utbildning och tillgång till konfokalmikroskopi, Ms Katherine Wiley för assistans under videoinspelning, Mr Matthew Rehmann för generöst ge hMSCs isolerade från benmärg, professor Christopher J . Kloxin och Mr Stephen Ma för generöst ger fotomasker, och Prof. Wilfred Chen för användning av den automatiserade plattläsare.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Custom Peptides | Various Vendors | ---- | Peptides may also be synthesized via standard SPPS techniques with materials from vendors including ChemImpex and ChemPep. |
| 4-arm PEG Thiol, MW 20k | JenKem USA | 4ARM-SH | Listed under Multi-arm Homofunctional PEGs. PEG4SH may also be synthesized as previously referenced. |
| Lithium Phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate | Colorado Photopolymer Solutions | Li-TPO | |
| Dimethyl Phenylphosphonite | Sigma Aldrich | 149470 | Caution, causes severe skin burns and eye damage. Wear protective gloves, clothing, and eye protection. |
| 2,4,6-Trimethylbenzoyl Chloride | Sigma Aldrich | 682519 | Caution, causes severe skin burns and eye damage. Wear protective gloves, clothing, and eye protection. |
| Lithium Bromide | Sigma Aldrich | 213225 | |
| 2-Butanone | Sigma Aldrich | 360473 | |
| Flask, Round Bottom, 100 ml | Chemglass | CG-1506-05 | |
| 80 ml Filter Funnel, Buchner, Medium Frit | Chemglass | CG-1402-L-02 | Filter paper inside a regular glass funnel may be used if desired. |
| Magnetic Stir Bars | Various Vendors | ---- | |
| Magnetic Stirring and Hot Plate | Various Vendors | ---- | |
| Vacuum Dessicator | Various Vendors | ---- | |
| Deuterium Oxide | Acros Organics | 16630 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | ThermoFisher Scientific | 14190-250 | |
| Penicillin Streptomycin | ThermoFisher Scientific | 15070-063 | |
| Fungizone | ThermoFisher Scientific | 15290-018 | |
| Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red | ThermoFisher Scientific | 15400-054 | Select appropriate medium and trypsin depending on cell type. |
| Microcentrifuge tubes | Various Vendors | ---- | 1.5 or 2 ml sizes, sterile. |
| BD Syringe with Slip (Luer) Tips (Without Needle) | Fisher Scientific | 14-823-16H | Product number listed here is for a 1 ml syringe (16H), Various sizes are available (14-823-XX). |
| Fisherfinest Premium Plain Glass Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-544-1 | |
| High-Purity Silicone Rubber, 0.010" Thick, 6" x 8" Sheet, 55A Durometer (Gasket) | McMaster Carr | 87315K62 | |
| Ethanol, 200 Proof | Decon Labs | 2701 | |
| RainX, Original | Amazon | 800002243 | May be purchased from other vendors. |
| Sigmacote | Sigma Aldrich | SL2 | |
| Photomasks | Advance Reproductions Corporation | ---- | Photomask Division, different designs may be printed as desired. |
| DTNB; Ellman's Reagent; 5,5-dithio-bis(2-nitrobenzoic acid) | ThermoFisher Scientific | PI-22582 | |
| Sodium Phosphate Dibasic | Sigma Aldrich | S5136 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma Aldrich | E6758 | |
| Sodium Hydroxide, Pellets/Certified ACS | Fisher Scientific | S318 | |
| Orthophosphoric Acid | Alfa Aesar | 33266 | |
| Cysteine Hydrochloride Monohydrate | Sigma Aldrich | C7880 | |
| LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit, for mammalian cells | ThermoFisher Scientific | L-3224 | |
| CellTiter 96 Aqueous One Solution Assay | Promega | G3582 | |
| Centrifuge | Various Vendors | ---- | Capable of speeds at 90-110 x g. |
| Multiwell Plate Reader | Various Vendors | ---- | Capable of reading absorbance at 405 nm in a 96-well plate. |
| Epifluorescent or Confocal Microscope | Various Vendors | ---- | To visualize peptide patterns and cells within hydrogels. |
| Omnicure Exfo Series 2000 | Excelitas Technologies | ---- | Alternate light systems may be used to polymerize hydrogels. |
| Zeiss Zen Lite Software | Zeiss | ---- | Available at zeiss.com; compatible with images taken on Zeiss microscopes |
| ImageJ | NIH | ---- | Available at imagej.nih.gov; applicable for general image analysis |
References
- Kolb, H. C., Finn, M. G., Sharpless, K. B. Click Chemistry: Diverse Chemical Function from a Few Good Reactions. Angew Chemie - Int Ed. 40 (11), 2004-2021 (2001).
- Xi, W., Scott, T. F., Kloxin, C. J., Bowman, C. N. Click Chemistry in Materials Science. Adv Funct Mater. 24 (18), 2572-2590 (2014).
- Azagarsamy, M. A., Anseth, K. S. Bioorthogonal click chemistry: An indispensable tool to create multifaceted cell culture scaffolds. ACS Macro Lett. 2 (1), 5-9 (2013).
- Adzima, B. J., Tao, Y., Kloxin, C. J., DeForest, C. A., Anseth, K. S., Bowman, C. N. Spatial and temporal control of the alkyne-azide cycloaddition by photoinitiated Cu(II) reduction. Nat Chem. 3 (3), 256-259 (2011).
- Hoyle, C. E., Bowman, C. N. Thiol-ene click chemistry. Angew Chemie - Int Ed. 49 (9), 1540-1573 (2010).
- Fan, Y., Deng, C., Cheng, R., Meng, F., Zhong, Z. In situ forming hydrogels via catalyst-free and bioorthogonal "tetrazole-Alkene" photo-click chemistry. Biomacromolecules. 14 (8), 2814-2821 (2013).
- Burdick, J. A., Murphy, W. L. Moving from static to dynamic complexity in hydrogel design. Nat Commun. 3, 1269 (2012).
- Rehmann, M. S., Kloxin, A. M. Tunable and dynamic soft materials for three-dimensional cell culture. Soft Matter. 9 (29), 6737-6746 (2013).
- Yang, T., Long, H., Malkoch, M., Gamstedt, K. E., Berglund, L., Hult, A. Characterization of well-defined poly(ethylene glycol) hydrogels prepared by thiol-ene chemistry. J Polym Sci Part A Polym Chem. 49 (18), 4044-4054 (2011).
- Fairbanks, B. D., et al. A versatile synthetic extracellular matrix mimic via thiol-norbornene photopolymerization. Adv Mater. 21 (48), 5005-5010 (2009).
- Roberts, J. J., Bryant, S. J. Comparison of photopolymerizable thiol-ene PEG and acrylate-based PEG hydrogels for cartilage development. Biomaterials. 34 (38), 9969-9979 (2013).
- DeForest, C. A., Polizzotti, B. D., Anseth, K. S. Sequential click reactions for synthesizing and patterning three-dimensional cell microenvironments. Nat Mater. 8 (8), 659-664 (2009).
- Lin, C. C., Ki, C. S., Shih, H. Thiol-norbornene photoclick hydrogels for tissue engineering applications. J Appl Polym Sci. 132 (8), (2015).
- Sawicki, L. A., Kloxin, A. M. Design of thiol-ene photoclick hydrogels using facile techniques for cell culture applications. Biomater Sci. 2 (11), 1612-1626 (2014).
- Patterson, J., Hubbell, J. A. Enhanced proteolytic degradation of molecularly engineered PEG hydrogels in response to MMP-1 and MMP-2. Biomaterials. 31 (30), 7836-7845 (2010).
- Fairbanks, B. D., Singh, S. P., Bowman, C. N., Anseth, K. S. Photodegradable, photoadaptable hydrogels via radical-mediated disulfide fragmentation reaction. Macromolecules. 44 (8), 2444-2450 (2011).
- Fairbanks, B. D., Schwartz, M. P., Bowman, C. N., Anseth, K. S. Photoinitiated polymerization of PEG-diacrylate with lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate: polymerization rate and cytocompatibility. Biomaterials. 30 (35), 6702-6707 (2009).
- Yang, F., et al. The effect of incorporating RGD adhesive peptide in polyethylene glycol diacrylate hydrogel on osteogenesis of bone marrow stromal cells. Biomaterials. 26 (30), 5991-5998 (2005).
- Wacker, B. K., et al. Endothelial cell migration on RGD-peptide-containing PEG hydrogels in the presence of sphingosine 1-phosphate. Biophys J. 94 (1), 273-285 (2008).
- Wilson, M. J., Liliensiek, S. J., Murphy, C. J., Murphy, W. L., Nealey, P. F. Hydrogels with well-defined peptide-hydrogel spacing and concentration: impact on epithelial cell behavior. Soft Matter. 8 (2), 390-398 (2012).
- Qiong Liu, S., et al. Injectable biodegradable polyethylene glycol/ RGD peptide hybrid hydrogels for in vitro chondrogenesis of human mesenchymal stern cellsa. Macromol Rapid Commun. 31 (13), 1148-1154 (2010).
- Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix Elasticity Directs Stem Cell Lineage Specification. Cell. 126 (4), 677-689 (2006).
- Levental, I., Georges, P. C., Janmey, P. A. Soft biological materials and their impact on cell function. Soft Matter. 3 (3), 299-306 (2007).
- Lin, C. C., Raza, A., Shih, H. PEG hydrogels formed by thiol-ene photo-click chemistry and their effect on the formation and recovery of insulin-secreting cell spheroids. Biomaterials. 32 (36), 9685-9695 (2011).
- Khetan, S., Burdick, J. Cellular encapsulation in 3D hydrogels for tissue engineering. J Vis Exp. (32), e1590 (2009).
- Bryant, S. J., Nuttelman, C. R., Anseth, K. S. Cytocompatibility of UV and visible light photoinitiating systems on cultured NIH/3T3 fibroblasts in vitro. J Biomater Sci Polym Ed. 11 (5), 439-457 (2000).
- Burdick, J. A., Chung, C., Jia, X., Randolph, M. A., Langer, R. Controlled Degradation and Mechanical Behavior of Photopolymerized Hyaluronic Acid Networks Controlled Degradation and Mechanical Behavior of Photopolymerized Hyaluronic Acid Networks. Society. 6 (1), 386-391 (2005).
- Marsano, E., Gagliardi, S., Ghioni, F., Bianchi, E. Behaviour of gels based on (hydroxypropyl) cellulose methacrylate. Polymer (Guildf). 41 (21), 7691-7698 (2000).
- Bryant, S. J., Anseth, K. S. Photopolymerization of Hydrogel Scaffolds. Scaffolding Tissue Eng. , 71-90 (2005).
- Khetan, S., Burdick, J. A. Patterning hydrogels in three dimensions towards controlling cellular interactions. Soft Matter. 7 (3), 830-838 (2011).
- Mosiewicz, K. A., et al. In situ cell manipulation through enzymatic hydrogel photopatterning. Nat Mater. 12 (11), 1072-1078 (2013).
- Williams, C. G., Malik, A. N., Kim, T. K., Manson, P. N., Elisseeff, J. H. Variable cytocompatibility of six cell lines with photoinitiators used for polymerizing hydrogels and cell encapsulation. Biomaterials. 26 (11), 1211-1218 (2005).
- Nimmo, C. M., Owen, S. C., Shoichet, M. S. Diels - Alder Click Cross-Linked Hyaluronic Acid Hydrogels for Tissue Engineering. , 824-830 (2011).
- DeForest, C. A., Anseth, K. S. Cytocompatible click-based hydrogels with dynamically tunable properties through orthogonal photoconjugation and photocleavage reactions. Nat Chem. 3 (12), 925-931 (2011).
- Fairbanks, B. D., Sims, E. A., Anseth, K. S., Bowman, C. N. Reaction rates and mechanisms for radical, photoinitated addition of thiols to alkynes, and implications for thiol-yne photopolymerizations and click reactions. Macromolecules. 43 (9), 4113-4119 (2010).
- Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture. Biotechnol Bioeng. 103 (4), 655-663 (2009).
- Wylie, R. G., et al. Spatially controlled simultaneous patterning of multiple growth factors in three-dimensional hydrogels. Nat Mater. 10 (10), 799-806 (2011).
- Pompe, T., Salchert, K., Alberti, K., Zandstra, P., Werner, C. Immobilization of growth factors on solid supports for the modulation of stem cell fate. Nat Protoc. 5 (6), 1042-1050 (2010).
- Hudalla, G. A., Murphy, W. L. Biomaterials that regulate growth factor activity via bioinspired interactions. Adv Funct Mater. 21 (10), 1754-1768 (2011).
- Lee, S. H., Moon, J. J., West, J. L. Three-dimensional micropatterning of bioactive hydrogels via two-photon laser scanning photolithography for guided 3D cell migration. Biomaterials. 29 (20), 2962-2968 (2008).
