Introduction
Protéines liant l'ARN (RBP) représentent environ 10% de S. protéines cerevisiae 1,2 et environ 15% de protéines de mammifères 3-5. Ils sont impliqués dans de nombreux processus cellulaires tels que le traitement de l'ARNm post-transcriptionnelle et de régulation, la traduction, la biogenèse des ribosomes, ARNt aminoacylation et modification, remodelage de la chromatine, et plus encore. Un sous - groupe important de la RBP est les protéines d'ARNm de liaison (mRNP) 6,7. Au cours de l' ARNm maturation, différentes RBP lient la transcription et la médiation de son traitement nucléaire, l' exportation hors du noyau, la localisation cellulaire, la traduction et la dégradation 6-8. Ainsi, l'ensemble distinct de pratiques commerciales restrictives liées à une transcription particulière à tout point de temps détermine son traitement et, finalement, son sort.
L'identification des pratiques commerciales restrictives associées à un ARNm pourrait améliorer considérablement notre compréhension des processus qui sous-tendent leur régulation post-transcriptionnelle. Diverse génétique,, Les méthodes bio - informatiques biochimiques et microscopiques ont été utilisées pour identifier des protéines impliquées dans la régulation de l' ARNm (revu dans 9-11). Cependant, seulement quelques-unes de ces méthodes ne permettent l'identification de protéines associées à un ARNm cible particulier. Il est à noter la levure Trois système hybride (Y3H), qui utilise l'ARNm d'intérêt comme appât pour cribler une banque d'expression dans les cellules de levure. Les clones positifs sont généralement observés à travers une expression de sélection de croissance ou reporter 12-14. Le principal avantage de cette méthode est le grand nombre de protéines qui peuvent être scannés dans un environnement cellulaire et la capacité de mesurer la force de l'interaction ARN-protéine. Les inconvénients comprennent le nombre relativement élevé de résultats faussement positifs en raison de la liaison non spécifique, et le potentiel élevé de résultats faussement négatifs dus, en partie, à repliement de la proie de protéine de fusion ou l'ARN appât.
Une alternative à l'approche génétique est purifi affinitécation de l'ARN avec ses protéines associées. Poly A contenant des ARNm peut être isolé en utilisant des colonnes d'oligo dT et de leurs protéines associées sont détectées par spectrométrie de masse. L'interaction ARN-protéine est conservée dans son contexte cellulaire par réticulation, ce qui rend à courte portée des liaisons covalentes. L'utilisation de la colonne oligo dT donne une vue globale de l'ensemble du protéome qui est associé à une poly A-ARNm contenant 3,5,15. Toutefois, cela ne constitue pas une liste des protéines qui sont associées à un ARNm particulier. Très peu de méthodes sont disponibles pour accomplir une telle identification. La méthode PAIRE implique la transfection d'acide nucléique avec la complémentarité à l'ARNm cible 16,17. L'acide nucléique est également attaché à un peptide, ce qui permet de réticuler RBP à proximité immédiate du site d'interaction. Après réticulation, l'acide RBP-peptide-nucléique peut être isolé et soumis à une analyse protéomique. Récemment, une méthodologie fondée sur aptamère étaitappliquée avec succès à des extraits de lignées cellulaires de mammifères 18. Un aptamère d'ARN avec une meilleure affinité pour la streptavidine a été développée et fusionnée à une séquence d'intérêt (élément riche en AU (ARE) dans ce cas). L'aptamère-ARE L'ARN a été fixé à des billes de streptavidine et on le mélange avec le lysat cellulaire. Les protéines qui est associée à la séquence sont ont été purifiés et identifiés par spectrométrie de masse (MS). Bien que cette méthode a détecté des associations qui se produisent en dehors des paramètres cellulaires ( par exemple, in vitro), il est susceptible d'être modifiée ultérieurement , de manière à introduire les aptamères dans le génome et permettre ainsi l'isolement des protéines associées à l'ARNm tandis que dans le milieu cellulaire ( par exemple in vivo). Dans la levure, où les manipulations génétiques sont bien établies, la méthode RaPID (développé dans le laboratoire du professeur Jeff Gerst) fournit une vue des associations in vivo 19. RaPID combine la MS2- spécifique et forte liaison de la protéine d'enveloppe de MS2 (CP) à la séquence d'ARN de MS2 et du domaine de liaison à la streptavidine (SBP) à la streptavidine billes conjuguées. Cela permet une purification efficace des ARNm MS2-marqués par des billes de streptavidine. En outre, l'expression de 12 copies de MS2 boucles permet jusqu'à six MS2-CPs se lier simultanément à l'ARN et d'accroître l'efficacité de son isolement. Ce protocole a donc été proposé pour permettre l'identification de nouvelles protéines d'ARNm associé à la fois les échantillons éluées sont soumises à une analyse protéomique par spectrométrie de masse.
Nous avons récemment utilisé RaPID pour identifier de nouvelles protéines associées à la levure PMP1 ARNm 20. PMP1 ARNm a été montré précédemment à être associée à la membrane du RE et de sa région 3 'non traduite (UTR) a été trouvé pour être un déterminant majeur dans cette association 21. Ainsi, les pratiques commerciales restrictives qui lient PMP1 3 'UTR sont susceptibles de jouer un rôle important dans sa localisation. Rapide suivie chromatographe liquidey-spectrométrie de masse / spectrométrie de masse (LC-MS / MS) a abouti à l'identification de nombreuses nouvelles protéines qui interagissent avec PMP1 20. Ici, nous fournissons un protocole détaillé de la méthodologie RaPID, des contrôles importants qui doivent être faites, et des conseils techniques qui peuvent améliorer le rendement et la spécificité.
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Protocol
Remarque: Insérez une séquence composée de 12 MS2 sites de liaison (boucles MS2; MS2L) dans le locus génomique désiré, habituellement entre le cadre de lecture ouvert (ORF) et 3 'UTR. Un protocole détaillé pour cette intégration est prévue ailleurs 22. Vérifier une insertion correcte et à l' expression par PCR, analyse de Northern ou par RT-PCR 20,23. Il est important de vérifier que l'intégration ne sont pas intervenus avec la synthèse du 3'UTR. En outre, un MS2-CP plasmide exprimant fusionné à SBP sous l'expression d'un promoteur inductible (depletion de methionine) devrait également être introduit dans les cellules 24. Une souche identique, à l'exception des boucles de MS12 introduit, doit être utilisé en tant que contrôle pour la détection des signaux non spécifiques.
1. RaPID Purification
- Cultiver 500 ml de cellules de levure ( en utilisant 250-1,000 ml de cellules de levure en fonction du niveau du gène d'intérêt de l' expression) exprimant l' ARNm MS2 marqués 20 etMS2-CP-GFP-SBP protéine de fusion 24 à OD 600 de 0,8 à 1,0 à 30 ° C dans le milieu de croissance approprié (par exemple, synthétique dextrose (SD) milieu sélectif).
- Centrifuger les cellules à 3000 g pendant 4 min à température ambiante et jeter le surnageant.
- Laver les cellules dans 1 x tampon phosphate salin (PBS) centrifuger comme précédemment (étape 1.2), remettre en suspension dans un volume égal (étape 1.1) de SD sans méthionine et laisser incuber pendant 45-60 min à 30 ° C pour induire l' expression de la MS2 -CP-GFP-SBP protéine de fusion.
Remarque: plus long temps d'induction peut provoquer une agrégation de la GFP. - Mettre de côté 10 ml de cellules et extraire l' ARN à partir de cet échantillon en utilisant la méthode simple "de phénol chaud" 25. Attention: Phénol est très toxique et doit être manipulé en fonction de ses consignes de sécurité.
Note: Cet ARN est une bonne référence pour la qualité de l' ARN isolé (figure 1A). - Pour 500 ml de cellules, ajouter 1,35 ml 37% de formaldéhyde à une c finaleoncentration de 0,1% pour réticuler les complexes ARN-protéine. Continuer l' incubation à 30 ° C pendant 10 min. Attention: Formaldéhyde est très toxique et doit être manipulé en fonction de ses consignes de sécurité.
- Ajouter 26,5 ml de 2,5 M de glycine à une concentration finale de 0,125 M et on incube pendant 3 minutes pour arrêter la réticulation. De cette étape, tout mettre sur la glace pour minimiser la dégradation de l'ARN.
- Centrifuger les cellules à 3000 g pendant 4 min à 4 ° C et lavage avec 45 ml froid 1x PBS.
- Resuspendre les cellules dans 1 ml de tampon de lyse RaPID par 100 ml de culture cellulaire initiale.
- Diviser en aliquotes de 500 pi dans des tubes de microcentrifugation bouchons à vis et ajoutez ~ 400 mg de perles de verre réfrigéré à chaque aliquote (environ 0,2 ml de plein tube PCR).
- Lyse des cellules dans un cordon batteur pendant 3 min. Immédiatement mettre le lysat sur la glace.
Remarque: la lyse des cellules de presse RNases cellulaires, qui sont la principale cause de la dégradation de l'ARN. tampon RaPID Lysis contient une forte concentration de RNase INHIexpo-, tels que l'héparine non spécifique de l'inhibiteur de RNase et d'inhibiteurs spécifiques. Travailler rapidement et garder tout froid est également recommandé. - Transférer le lysat à de nouveaux tubes. Percer un petit trou dans le fond de chaque tube de centrifugeuse avec une aiguille chaude (0,8 mm x 40 mm) et placez les tubes de microcentrifugation au-dessus des tubes de 15 ml. Utilisez la tête d'une seringue de 5 ml d'adaptateur entre les tubes de microcentrifugation et les tubes de 15 ml. Centrifuger l'assemblage de tubes à 3000 xg pendant 1 min à 4 o C.
- Transférer l'écoulement du tube de 15 ml dans un nouveau tube de 1,5 ml et on centrifuge à 10 000 g pendant 10 min à 4 ° C pour éliminer les débris cellulaires.
- surnageants Piscine de tous les tubes de 1,5 ml dans un seul tube de 15 ml, et mis de côté 1/50 et 1/100 volume du lysat pour l'ARN et de l'isolement de la protéine, respectivement.
Note: Ceux - ci serviront les échantillons "d'entrée" pour une analyse ultérieure (Figure 1). - Ajouter 300 pg d'avidine par 500 ml de iculture de levure et incuber pendant préside d' abord 30 minutes (ce qui peut être réduit à 10 min) à 4 ° C sous roulement constant (10 rpm).
Remarque: les blocs avidine biotine et protéines biotinylées de se lier aux billes de streptavidine. - Pré-laver les billes de streptavidine avant l'incubation avec le lysat cellulaire.
- Transférer environ 300 pi de la streptavidine perles suspension à un tube de 1,5 ml et retirer le surnageant supérieur. Cela se traduira par 250 ul de billes. Laver les billes deux fois avec 1 ml de tampon de lyse rapide. Centrifuger les billes de streptavidine à 660 g pendant 2 min à 4 ° C entre chaque étape.
- Bloquer les billes par incubation pendant 1 heure avec 0,5 ml de tampon de lyse rapide, 0,5 ml de 10 mg / ml de BSA et 10 ul de 10 mg / ml d'ARNt de levure. Les perles peuvent être laissées O / N dans une solution de blocage à 4 ° C avec rotation si nécessaire.
- Laver deux fois avec 1 ml de tampon de lyse rapide.
Nota: Les billes magnétiques peuvent également être utilisés pour réduire le temps et background. Ceux-ci, cependant, ont une capacité inférieure à celle des billes de sépharose.
- Ajouter 250 ul des billes de streptavidine prélavés au lysat contenant de l'avidine (étape 1.14) et incuber pendant 1 heure à 4 ° C avec une rotation constante (10 rpm).
Remarque: Ce temps d'incubation est un compromis entre la fourniture de temps de liaison suffisante et en minimisant les chances de dégradation de l'ARN. - Centrifuger à 660 g pendant 2 min à 4 ° C pour effacer les billes de streptavidine et transférer le surnageant dans un nouveau tube de 15 ml. Mettez de côté 1/50 et 1/100 volume du lysat pour l'ARN et de protéines d'isolement, respectivement.
Remarque: Ce seront les échantillons "non consolidé". - Laver les billes avec 1 ml de tampon Lysis RaPID, secouer doucement, transférer dans un nouveau tube de microcentrifugation de 1,5 ml, et centrifuger comme dans l'étape 1.17. Répétez cette étape trois fois.
- Laver les billes avec 1 ml de tampon RaPID Wash, et cette fois-rotation (10 rpm) pendant 5 min à 4 ° C. Répéter deux fois cette étape. Laver les billes avec 1 ml de 1 x PBS et centrifugation comme ci-dessus.
- Laver les billes à nouveau avec 120 ul de PBS 1x. Centrifugeuse comme ci-dessus, et prendre la totalité du surnageant pour l'ARN et l'extraction des protéines que l'échantillon "Wash".
Note: Ce dernier échantillon de lavage indiquera la rigueur des lavages et devrait être du même volume que l'échantillon d'élution. Cela simplifiera le traitement et le chargement dans des essais ultérieurs. - Éluer l'ARN et des protéines associées à ARN de la colonne, ajouter 120 pl de 6 mM de biotine dans 1 x PBS et on incube pendant 45 min à 4 ° C avec une rotation constante (10 rpm).
- Centrifuger les perles comme ci-dessus et le transfert du matériel élue dans un nouveau tube de 1,5 ml. Spin l'échantillon élue à nouveau et transférer la phase supérieure dans un nouveau tube de 1,5 ml pour assurer qu'aucun report de perles.
- Prélever des échantillons pour l'ARN ou l'extraction des protéines.
Remarque: Le volume prélevé doit dépendre de l'essai et le niveau d'expression de l'ARN ou protéine d'intérêt suivant. À titre indicatif, pour l' analyse du Nord 26, prendre 80% de l'échantillon, pour Western blot 23,27 ou RT-PCR 28, prendre 20%, et pour la spectrométrie de masse 29 pour découvrir de nouvelles protéines, prendre la totalité de l' échantillon.
2. Extraction de l'ARN
- Ajouter un volume égal de 2x Réticulation Reversal tampon et incuber pendant 45 min à 65 ° C. Continuer directement pour l'extraction de l'ARN.
Remarque: Le Réticulation Reversal Buffer contient de l' acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA), ce qui améliore considérablement l' extraction d'ARN 20. - Utilisez le standard au phénol: méthode de chloroforme 26 pour extraire l' ARN à partir de la "entrée" et des échantillons "non liés" (étapes 1.13 et 1.17).
Note: Ces échantillons contiennent une grande quantité de l'héparine inhibiteur de RNase, qui peut inhiber la suite inverse Transcriptase- (RT) des essais utilisant (par exemple, RT-PCR), par conséquent, LiCl précipitations 30 est conseillé de l' enlever. Le "wash "et" "échantillons d'élution (étapes 1.21 et 1.24) contiennent de faibles quantités d'ARN et sont précipités à travers les étapes suivantes. - Ajouter un volume égal de 8M guanidinium-HCl (GuHCl) et deux volumes d'éthanol à 100% pour le «lavage» et «échantillons d'élution". Incuber à -80 ° C pendant au moins 2 heures.
Remarque: guanidinium va efficacement dénaturer les protéines, et ainsi inhiber les RNases et protéases dans l'échantillon. - Centrifuger à 20 000 x g, 4 ° C pendant 30 minutes et éliminer le surnageant. Laver le culot avec de l'éthanol à 80% froid et centrifuger de nouveau à 20 000 x g, 4 ° C pendant 15 min.
- Dissoudre le culot d'ARN dans 400 ul de RNase eau libre et précipiter à nouveau pour enlever tout GuHCl restes ou d'autres contaminants. Ajouter 40 ul d'acétate de sodium 3 M, pH 5,2 et 800 ul d'éthanol à 100%, on incube à -20 ° C pendant au moins 1 h.
- Centrifugeuse et laver comme à l'étape 2.4 et de supprimer tous les éthanol avec une pointe de 10 pi. Reprendre le pell ARNet dans 10 ul d'eau libre de RNase. Prendre des précautions supplémentaires comme le culot d'ARN est généralement pas visible.
Nota: Les échantillons peuvent être utilisés pour une analyse de Northern , comme décrit dans 23 (figure 1).
3. Protéines Préparation de Western blot ou analyse de spectrométrie de masse
- Ajouter 1/3 volume de tampon d'échantillon Laemmli 4x (Pf) pour les échantillons de protéines et incuber 45 min à 65 ° C pour inverser la réticulation de l'ARN et des protéines.
Note: Les échantillons peuvent être conservés à -20 ° C. - Les protéines sur un gel de polyacrylamide - SDS (SDS-PAGE) 31. Ajuster le pourcentage de gel en fonction de la taille des protéines à analyser.
Remarque: gel d'acrylamide 10% donne une large gamme de séparation et est bonne en première approximation. - Transfert des protéines sur la membrane comme dans l'analyse par immunoblot standard 27 pour le contrôle de l' efficacité d' isolement (figure 1C). Colorer soit avec le bleu de Coomassie R250 ou argent tache avant l'analyse par spectrométrie de masse.
Remarque: la tache d' argent est le choix préféré car il est plus sensible et permet une meilleure détection (figure 1B). La coloration peut être réalisée soit avec des solutions préparées manuellement ou kits commerciaux. Le temps d'incubation du gel dans la solution finale de colorant doit être déterminée expérimentalement. incubation longue peut révéler des protéines de faible abondance, mais peut causer des protéines fortement exprimés tels que MS2-CP-SBP-GFP pour être plus colorées et peut masquer des protéines environnantes dans leur voisinage. De plus, un bruit de fond élevé peut se produire. Suivez la réaction avec soin, et ajouter la solution d'arrêt au moment opportun. - Découpez des bandes du gel et de les transférer à tubes de 1,5 ml. Conserver les échantillons à -20 ° C, ou envoient pour l' extraction de la protéine et digestion par la trypsine suivie d' une analyse LC-MS / MS 32.
- Comme autre approche protéomique pour exclure l'étape de séparation sur gel, la digestion matériau élue à partir de l'étape de manière à 1,24lution à l' aide de la trypsine et soumises à une analyse LC-MS / MS 33.
Remarque: Omettre la séparation SDS-PAGE simplifie le protocole et augmente le rendement. Cependant, les échantillons peuvent contenir des traces de détergent NP-40, qui inhibe l'analyse par spectrométrie de masse. Pour surmonter ce problème, procédez comme suit:- Exécutez la protéine sur SDS-PAGE 31 10 - 15 min.
- Découper la partie entière de la voie ( à savoir où se trouvent les protéines).
Remarque: L'échantillon de protéine pourrait inclure une quantité importante de la protéine MS2-CP-SBP qui peuvent masquer les signaux de protéines de faible abondance.
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Representative Results
RaPID permet l'isolement d'un ARN cible spécifique avec ses protéines associées. Critique pour son succès est de garder l'ARN intact, autant que possible, de façon à obtenir une quantité suffisante de protéines. Pour déterminer l'efficacité de l' isolement et de la qualité de l' ARN, on effectue une analyse de Northern (figure 1A). analyse Northern a l'avantage de rendre compte directement l'efficacité et la qualité des RaPID. Ainsi, les quantités relatives de produits pleine longueur et de dégradation peuvent être déterminés en un seul passage. Les ARN ribosomal (ARNr) sont détectées facilement dans la coloration au bromure d'éthidium, et le manque d'ARNr dans l'échantillon d'élution indique que la sévérité de la purification. La rigueur et la spécificité de la purification sont en outre mis en évidence par l'absence d'un signal d'un ARNm non marqué dans les échantillons d'élution (panneau inférieur ACT1). Le signal apparent dans la voie FPR1, ce qui est de la taille de RET1, est un vestige de préprécé- hybridation avec la sonde MS2L. L'analyse révèle également que le nord de l'ARN de départ est un peu plus dégradées par rapport à l'ARN qui a été purifié par le protocole de phénol chaud (c / o ACT1 panneau de sonde). Ceci est attribué au protocole RaPID plus long et plus compliqué. Néanmoins, une quantité importante de pleine longueur, étiqueté ARN est isolé spécifiquement, comme révélé par le signal fort dans la fraction d'élution (sonde MS2L).
Les échantillons de protéines peuvent être exécutés sur SDS-PAGE et colorées par coloration à l'argent avant l'analyse protéomique (figure 1B). Un échantillon isolé de contrôle, les cellules non marquées (de -MS2L) est utile dans les associations non spécifiques distinguer de ceux d'ARN-dépendante. Par conséquent, seules des bandes qui sont plus forts dans l'échantillon marqué (+ MS2L) sont découpées dans le gel et pris pour LC-MS / MS. L' analyse Western avec RBP général est également recommandé d'indiquer l'efficacité de la protéine co-purification (Figure1C). Ici, on a utilisé Yef3, qui est connu pour interagir avec PMP1 20 ou la GFP, ce qui indique l'efficacité et la spécificité de l'isolement. Fait intéressant, l'efficacité de l'isolement Yef3 semble varier entre PMP1 et FPR1, et elle est beaucoup plus faible par rapport à la GFP.
Figure 1. Isolement spécifique des ARN MS2L-marqués et identification des protéines associées. Les résultats de deux ARNs différents qui ont été soumis à RaPID (PMP1 et FPR1) sont présentés. (A) Northern analyse par transfert d'échantillons d'ARN purifiés à partir d' une expérience RaPID. L'ARN a été exécuté sur un gel d'agarose et colorés au bromure d'éthidium (panneau supérieur). Le gel a été transféré sur une membrane de nylon et soumis à une hybridation avec les sondes (panneaux inférieurs) indiqués. Les échantillons analysés sont les suivants: la lyse rapide des cellules (phénol chaud [étape 1.4]), RaPID lyse cellulaire (entrée [étape 1.13]) et après élution avec de la biotine (élution [étape 1.24]). (B) Argent tache de protéines de RaPID avec des cellules MS2-marqués et non marqués. Les échantillons de protéines à partir de fractions d'élution de PMP1 MS2-tagged (+ MS2L) ou non marqué (-MS2L) contrôle ont été exécutés dans SDS-PAGE et coloré à l'argent. Bandes avec une intensité différentielle (indiquées par des astérisques) ont été découpées du gel et déterminées par analyse par spectrométrie de masse. La flèche indique la protéine de fusion MS2-CP-GFP-SBP, ce qui démontre la charge égale de protéines. Voies Irrelevant ont été coupées pour plus de clarté. (C) analyse Western des contrôles positifs. Western blot avec des anticorps qui reconnaissent le fragment ou Yef3 GFP de la protéine de fusion MS2-CP a été effectuée. Voies Irrelevant ont été coupées pour plus de clarté. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Diverses méthodes utilisent l'isolement des ARNm spécifiques pour identifier leurs protéines associées 11,34 35. Ces méthodes sont applicables in vitro et in vivo des stratégies pour sonder les interactions ARN-protéine. Incuber les méthodes in vitro avec l' ARN transcrit de manière exogène lysat cellulaire pour capturer RBP et isoler les complexes RNP 36,37. Une approche efficace de ce type a été présenté récemment, ce qui a permis l'identification de nouvelles protéines qui se lient un motif d'ARN réglementaire 18. Un inconvénient de ces méthodes est la liaison des pratiques commerciales restrictives non-spécifiques parce que l'association se produit en dehors de l'environnement cellulaire. Méthodes in vivo, dans laquelle les protéines sont réticulées alors que dans leur milieu naturel, peut fournir une meilleure vue de l' association ARN-protéine. En outre, la réticulation permet une stringence plus élevée pendant l'isolement et donc une spécificité plus élevée. L'approche PAIRE 17 utilise la transfection de l'antisensséquence à l'ARN cible afin de diriger un fragment peptidique au voisinage du RBP. Le peptide-RBP peuvent ensuite être réticulé et isolés par des billes qui sont liés à une séquence qui est complémentaire de la séquence anti-sens. La méthodologie PAIR est très avantageuse en raison de son application simple de nombreux types de cellules sans nécessiter de manipulations complexes génomiques. Il est, cependant, dépend de l'efficacité de la transfection, et les cas où un faible pourcentage de cellules de reconnaître l'anti-sens aura une faible efficacité. En outre, l'isolement de la séquence RBP-peptide anti-sens est obtenu grâce à des billes de streptavidine magnétiques qui sont couplées avec l'oligonucléotide biotinylé complémentaire de l'acide nucléique anti-sens. La multiplicité des interactions (billes magnétiques, streptavidine-biotine et l'appariement de base) peut limiter la rigueur et de l'efficacité de l'isolement. La méthode RaPID 24 décrit ici offre une alternative à ces limitations dans plusieurs aspects. Tout d'abord, le til intégration des boucles MS2 dans le locus génomiques assure que toutes les cellules expriment, en augmentant ainsi son rendement. En second lieu , il utilise l'interaction d'affinité élevée de la MS2-CP-GFP-MS2 SBP à douze séquences de boucle et leur permet de se lier in vivo. En troisième lieu, la fixation de l'interaction ARN-protéine permet des lavages plus strictes et réduit l'identification des protéines liées non spécifiquement. Enfin, le domaine se lie SBP billes de streptavidine avec une affinité élevée et peut être facilement élue avec de la biotine libre.
Insertion de la boucle MS2 dans l'ARN est souhaitable entre l'ORF et 3 'UTR pour minimiser la traduction perturbation et d'assurer l'expression de toutes les boucles. Six à 24 MS2 répétitions en boucle ont été utilisés précédemment pour la visualisation de la localisation des ARNm 38-40. Cependant, l'insertion d'une longue séquence de MS2 boucles peuvent provoquer des changements dans le traitement et la structure de l'ARN; il pourrait déstabiliser la transcription ou changer le répertoire de RBP liéà elle. Dans notre expérience, 12 boucles sont suffisantes pour obtenir une élution efficace de l' ARN MS2 marqués 20. À cet égard, nous notons que nous avons observé en général plus courtes transcriptions supplémentaires dans nos hybridations Nord. Les analyses du nord avec différentes sondes ont révélé que ces formes plus courtes comprenaient la MS2L et une partie de la région 3 'UTR 20, indiquant la terminaison de transcription prématurée. De tels cas sont susceptibles de réduire l'efficacité de l'isolement des protéines associées à l'UTR 3 '. Par conséquent, le nombre de boucles insérées et leur emplacement dans l'ARN devraient être équilibrés entre rendement élevé pull-down et la stabilité de la transcription.
L'ARN doit rester intact pendant le protocole pour permettre l'isolement et la détection efficace de l'ensemble maximal de protéines liées. Les chances de contamination de RNase externe peuvent être réduits en portant des gants, en assurant un espace de travail propre, la préparation de la solution avec de l'eau exempte de RNases, et de travailler de manière conciseet efficacement pour réduire le temps de protocole. Néanmoins, nous avons constaté que le plus grand contributeur à la dégradation de l'ARN est la libération de RNases cellulaires au lysat lors de la lyse cellulaire. Il a été proposé que le broyage cryogénique des cellules de levure avec un résultat de broyage mécanique à une meilleure purification de l' ARN 41. Cela peut être jugé dans les cas où une dégradation significative est observée avec ce protocole.
Un inconvénient commun des dosages pull-down est l'isolement de plusieurs protéines qui se lient de manière non spécifique à la colonne. Par conséquent, l'utilisation d'une souche de levure avec de l'ARN non marqué est un contrôle important. Cette souche exprime la protéine de fusion MS2-CP-GFP-SBP pour exclure en outre des protéines qui se lient à la protéine de fusion et non de l'ARN cible. Nous notons que cela n'exclut pas de protéines qui pourraient lier la boucle MS2 lui - même, et ceux - ci doivent encore être validés avec le dosage déroulant protéine. Figure 1B montre que nous avons pu identifier plusieurs protéines qui se lientspécifiquement PMP1 ARNm, et certains ont ensuite été validés par un test de co-IP 20.
La méthodologie RaPID est actuellement limitée à des systèmes de levure, en utilisant ses méthodes d'intégration spécifiques aux sites bien établis. Protocoles d'intégration spécifiques au site sont en cours d'élaboration pour les gènes dans d' autres systèmes utilisant le système CRISPR-Cas 42,43. Ceux-ci seront d'une grande importance dans le développement de l'utilisation des RaPID à des systèmes supplémentaires. Une autre application future rapide est pour l'isolement d'ARN qui sont associés à un ARNm d'intérêt. Ceci peut être facilement réalisé, en soumettant le matériel isolé à l'ARN-seq plutôt que LC-MS / MS. Considérant le rôle important des petits ARN dans la régulation de l'expression de l'ARNm, cette application est susceptible d'être d'une grande importance. Enfin, l'amélioration de la spectrométrie de masse (MS) analyse et l'utilisation des méthodes MS quantitatives telles que SILAC se traduira par la mesure quantitative de l'ARNm protei liéns dans des conditions différentes. RaPID peut être utilisé avec de la levure cultivée dans un milieu enrichi avec des isotopes plus lourds et par rapport aux cellules cultivées dans des conditions différentes (par exemple, le stress) avec des milieux non marqués 44,45. En appliquant la méthode RaPID ainsi que l'analyse quantitative de MS donnera des mesures précises de changements dans le répertoire de RBP qui sont associés à un ARNm particulier.
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Acknowledgments
Nous remercions le Professeur Jeff Gerst et Boris Slobodin pour leurs conseils utiles pour la mise en place du protocole RaPID et en fournissant les plasmides nécessaires. Nous remercions également le Dr Avigail Atir-Lande pour son aide dans l'établissement de ce protocole et le Dr Tamar Ziv du Smoler Proteomics Centre pour son aide dans l'analyse LC-MS / MS. Nous remercions le Professeur TG Kinzy (Rutgers) pour l'anticorps YEF3. Ce travail a été soutenu par la subvention 2011013 de la Fondation binationale Science.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tris | sigma | T1503 | |
| SDS | bio-lab | 1981232300 | |
| DTT | sigma | D9779 | |
| Acidic Phenol (pH 4.3) | sigma | P4682 | |
| Acidic Phenol: Chloroform (5:1, pH 4.3) | sigma | P1944 | |
| Chloroform | bio-lab | 3080521 | |
| Formaldehyde | Frutarom | 5551820 | |
| Glycine | sigma | G7126 | |
| NP-40 | Calbiochem | 492016 | |
| Heparin | Sigma | H3393 | |
| Phenylmethylsulfonyl Flouride (PMSF) | Sigma | P7626 | |
| Leupeptin | Sigma | L2884 | |
| Aprotinin | Sigma | A1153 | |
| Soybean Trypsin Inhibitor | Sigma | T9003 | |
| Pepstatin | Sigma | P5318 | |
| DNase I | Promega | M610A | |
| Ribonuclease Inhibitor | Takara | 2313A | |
| Glass Beads | Sartorius | BBI-8541701 | 0.4-0.6mm diameter |
| Mini BeadBeater | BioSpec | Mini BeadBeater 16 | |
| Guanidinium | Sigma | G4505 | |
| Avidin | Sigma | A9275 | |
| Streptavidin Beads | GE Healthcare | 17-5113-01 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A7906 | |
| Yeast tRNA | Sigma | R8508 | |
| Biotin | Sigma | B4501 | |
| Yeast extract | Bacto | 288620 | |
| peptone | Bacto | 211677 | |
| Glucose | Sigma | G8270 | |
| 1x Phosphate-Buffered saline (PBS) | |||
| 0.2 M NaOH | |||
| 4x Laemmli Sample Buffer (LSB) | 0.2 M Tris-Hcl pH 6.8, 8% SDS, 0.4 M DTT, 40% glycerol, 0.04% Bromophenol-Blue. | ||
| Hot phenol lysis buffer | 10 mM Tris pH 7.5, 10 mM EDTA, 0.5% SDS | ||
| 3 M Sodium Acetate pH 5.2 | |||
| 100% and 70% Ethanol (EtOH) | |||
| RNase-free water | |||
| RaPID lysis buffer | 20 mM Tris pH 7.5, 150 mM NaCl, 1.8 mM MgCl2, 0.5% NP-40, 5 mg/ml Heparin, 1 mM Dithiothreitol (DTT), 1 mM Phenylmethylsulfonyl Flouride (PMSF), 10 µg/ml Leupeptin, 10 µg/ml Aprotinin, 10 µg/ml Soybean Trypsin Inhibitor, 10 µg/ml Pepstatin, 20 U/ml DNase I, 100 U/ml Ribonuclease Inhibitor. | ||
| 2x Cross-linking reversal buffer | 100 mM Tris pH 7.4, 10 mM EDTA, 20 mM DTT, 2 % SDS. | ||
| RaPID wash buffer | 20 mM Tris-HCl pH 7.5, 300 mM NaCl, 0.5% NP-40 | ||
| 0.5 M EDTA pH 8 | |||
| Silver Stain Plus Kit | Bio-Rad | 161-0449 | For detecting proteins in polyacrylamide gels |
| SD selective medium | 1.7 g/l Yeast nitrogen base with out amino acids and ammonium sulfate, 5 g/l Ammonium sulfate, 2% glucose, 350 mg/l Threonine, 40 mg/l Methionine, 40 mg/l Adenine, 50 mg/l Lysine, 50 mg/l Tryptophan, 20 mg/l Histidine, 80 mg/l Leucine, 30 mg/l Tyrosine, 40 mg/l Arginine | ||
| Anti-eEF3 (EF3A,YEF3) | Gift from Kinzy TG. (UMDNJ Robert Wood Johnson Medical School) | 1:5,000 | |
| Anti GFP antibody | Santa Cruz | sc-8334 | 1:3,000 |
| Anti rabbit IgG-HRP conjugated | SIGMA | A9169 | 1:10,000 |
References
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