Introduction
RNA 결합 단백질 (RBPs)는 S.의 약 10 %를 차지 cerevisiae의 단백질 2 및 포유 동물 단백질의 약 3 ~ 15 %. 그들은 이러한 mRNA의 전사 후 처리 및 규제, 번역, 리보솜 생물 발생, tRNA의의 aminoacylation 및 수정, 크로 마틴 리모델링, 그리고 더 많은 세포 과정에 연루되어있다. RBPs의 중요한 하위 그룹은 mRNA에 결합 단백질 (mRNPs) 6,7입니다. mRNA의 성숙의 과정에서, 다른 RBPs은 성적 증명서를 결합하여 핵, 세포 현지화, 번역 및 열화 6-8에서 핵 처리, 수출을 중재. 따라서, 어느 시점에서 특정 성적 증명서에 바인딩 RBPs의 고유 한 세트의 처리 및 궁극적으로 운명을 결정합니다.
의 mRNA와 관련된 RBPs의 식별은 크게 자신의 전사 후 조절을 기본 프로세스에 대한 우리의 이해를 향상시킬 수 있습니다. 유전 다양한현미경, 생화학 및 생물 정보학 방법 (9-11 검토) mRNA의 조절에 관여하는 단백질을 식별하는 데 사용되어왔다. 그러나, 이들 방법의 일부는 특정 대상의 mRNA와 관련된 단백질의 식별을 가능하게한다. 참고로 효모 세포에서 발현 라이브러리를 화면에 미끼로 관심의 mRNA를 이용하는 효모 세 하이브리드 시스템 (Y3H)입니다. 양성 클론은 일반적으로 성장 선택 또는 리포터 식 12-14를 통해 관찰된다. 이 방법의 핵심 이점은, 셀룰러 환경과 RNA - 단백질 상호 작용의 강도를 측정 할 수있는 능력으로 스캔 할 수있는 단백질의 큰 수이다. 단점으로 인한 비특이적 결합에 위양성 결과의 상대적으로 큰 수 및 융합 단백질 먹이 또는 미끼 RNA의 미스 폴딩으로 인해 일부 위음성 결과에 대한 높은 가능성을 포함한다.
유전자 접근 방식에 대한 대안은 친 화성 purifi입니다관련 단백질과 RNA의 양이온. 폴리 A를 함유하는 mRNA를 올리고 DT 컬럼을 사용하여 분리 될 수 있고, 그와 관련된 단백질을 질량 분석에 의해 검출된다. RNA의 단백질 상호 작용은 단거리 공유 결합을하게 가교하여 그 세포 문맥에 보존된다. 올리고 DT 컬럼의 사용은 mRNA의 3,5,15를 A-포함 된 폴리와 관련된 전체 프로테옴의 글로벌 뷰를 얻을 수 있습니다. 그러나 이것은 특정의 mRNA와 관련된 단백질의 목록을 제공하지 않는다. 아주 몇몇 방법은 식별을 수행 할 수 있습니다. 한 쌍의 방법은 표적 mRNA의 16, 17에 상보성 핵산의 트랜 스펙 션을 수반한다. 핵산은 또한 상호 작용 부위에 가까운 부근에 가교 RBPs 허용하는 펩티드에 부착된다. 가교 후, RBP-펩티드 핵산을 분리 할 수 있고, 단백질 체학 분석을 실시한. 최근에, 앱타 머가 기반 방법이었다성공적으로 포유류 세포 선 (18)로부터 추출에 적용. 스트렙 타비 딘에 향상된 친 화성을 갖는 RNA 앱 타머 개발하고 (이 경우, AU 부유 요소 (ARE)) 관심의 서열에 융합되었다. 앱타 머는 ARE-RNA는 스트렙 타비 딘 비드에 부착 된 세포 용 해물과 혼합 하였다. ARE 시퀀스와 연관된 단백질을 정제하고, 질량 분석 (MS)에 의해 확인되었다. 이 방법은 셀룰러 설정 (즉, 생체 외) 외부에서 발생하는 연결을 검출되지만, 상기의 mRNA와 관련된 단백질의 분리를 게놈에 앱 타머를 도입함으로써 가능하도록 미래에 수정 될 가능성이있는 반면 셀룰러 환경 (즉, 생체 내). 유전자 조작이 잘 확립되어 효모에서, (교수 제프 Gerst의 실험실에서 개발) 빠른 방법은 생체 협회 (19)의 전망을 제공합니다. 급속한은 (특정과 MS2 코트 단백질의 결합 강한 MS2-을 결합등) 스트렙 타비 딘 - 결합 도메인 (SBP의 MS2의 RNA 서열 CP)는 공액 비드를 스트렙 타비 딘. 이 스트렙 타비 딘 비즈를 통해 MS2 - 태그의 mRNA를 효율적으로 정화 할 수 있습니다. 또한, MS2 루프 12 카피의 발현은 RNA에 동시에 결합 및 분리의 효율을 높이기 위해 여섯 MS2-CP를 최대 허용한다. 이 프로토콜에 따라서 용출 샘플을 질량 분석기에 의해 단백질 체학 분석을 실시한되면 신규 mRNA에 관련된 단백질의 식별 가능하도록 제안 하였다.
우리는 최근에 효모 PMP1의 mRNA (20)와 관련된 새로운 단백질을 식별하기 위해 빠른을 이용했다. PMP1 mRNA의 이전 ER 막과 연관 될 및 3 '번역되지 않은 지역 (UTR)이이 협회 21의 주요 결정 요인 인 것으로 밝혀졌다 줬습니다. 따라서 PMP1 3 'UTR 바인딩 RBPs은 자국어에 중요한 역할을하는 것으로 보인다. 빠른 액체 크로마토 그래프 다음Y 질량 분석 / 질량 분석기 (LC-MS / MS)은 PMP1 (20)와 상호 작용하는 많은 새로운 단백질의 동정 결과. 여기서, 우리는 빠른 방법에 대한 자세한 프로토콜을 제공해야 할 중요한 컨트롤을 수행하고, 수율 및 특이성을 향상시킬 수있다 기술적 인 조언한다.
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Protocol
참고 : 12 MS2 결합 부위로 이루어진 시퀀스를 삽입 (MS2 루프; MS2L)를 원하는 게놈 로커스로, 일반적으로 오픈 리딩 프레임 (ORF) 및 3 'UTR 사이. 이 통합을위한 상세한 프로토콜은 다른 곳에서 (22)가 제공된다. PCR, 북부 분석 또는 RT-PCR 20,23하여 적절한 삽입 및 발현을 확인합니다. 통합이 3'UTR의 합성에 개입하지 않았는지 확인하는 것이 중요합니다. 또한, 유도 성 프로모터 (메티오닌 고갈)의 식에 따라 SBP 융합 플라스미드 발현 MS2-CP는 셀 (24)에 도입한다. 도입 MS12 루프 제외한 동일한 균주, 비특이적 신호의 검출을위한 대조군으로 사용한다.
1. 빠른 정화
- 효모 세포를 500 ㎖ (관심의 유전자의 발현 수준에 따라 효모 세포 250-1,000 용액 사용) mRNA의 20-MS2 태그를 발현 성장적절한 성장 배지 (예, 합성 덱스 트 로즈 (SD) 선택 배지)에 30 O C에서 1.0 - MS2-CP-GFP-SBP 융합 단백질 24 600 0.8 중독한다.
- 원심 분리기 세포 RT에서 4 분 3,000 XG에 상층 액을 버린다.
- 메티오닌없이 SD의 동일한 볼륨 (단계 1.1)에서 (단계 1.2)에 resuspend 이전과 같이 1 배 인산 완충 식염수 세포 (PBS), 원심 분리기를 세척하고, 45 부화 - MS2의 발현을 유도하기 위해 60 분 (30)에서 O를 C -CP-GFP-SBP 융합 단백질.
참고 : 긴 유도 시간이 GFP의 응집의 원인이 될 수 있습니다. - 세포의 옆으로 10 mL로 설정하고 간단한 "뜨거운 페놀"방법 (25)를 사용하여이 샘플에서 RNA를 추출합니다. 주의 : 페놀은 매우 독성 및 안전 지침에 따라 처리해야합니다.
참고 :이 RNA는 고립 된 RNA (그림 1A)의 품질에 대한 좋은 참조입니다. - 500㎖의 셀들에 대한 최종 C 1.35 ml의 37 % 포름 알데히드를 추가0.1 % oncentration RNA는 단백질 복합체를 가교. 10 분 동안 30 ℃로 배양을 계속합니다. 주의 : 포름 알데히드가 높은 독성과 안전 지침에 따라 처리해야합니다.
- 0.125 M의 최종 농도 2.5 M 글리신의 26.5 ML을 추가하고 가교를 중지 3 분 동안 품어. 이 단계에서 RNA 저하를 최소화하기 위해 얼음에 다 넣어.
- 4 O C에서 4 분 3,000 XG에 원심 분리기 세포와 45 ml의 차가운 1X PBS로 세척.
- 초기 세포 배양 물 100 ㎖ 당 1 ㎖의 신속한 용해 완충액에 재현 탁 된 세포.
- 나사 덮인의 microfuge 튜브에 500 μL의 분취 량으로 분할하고 각 나누어지는 (대략 전체 0.2 ㎖의 PCR 튜브)에 ~ 냉장 유리 구슬 400 mg을 추가합니다.
- 비드에 세포를 Lyse 3 분간 패는. 즉시 얼음에 해물을 넣어.
주 : 세포 용해 방출을 RNA 분해의 주요 원인이되는 세포를 RNases. 급속 용해 완충액의 RNase INHI의 높은 농도를 포함같은 비특이적의 RNase 억제제 헤파린 특정 억제제로서 bitors. 신속하게 작업 차가운 모든 것을 유지하는 것은 추천합니다. - 새로운 튜브에 해물을 전송합니다. 피어스 핫 바늘 (0.8 mm × 40 mm)을 가진 각 미세 원심 분리 튜브의 바닥에있는 작은 구멍은 15ml의 튜브 위에 미세 원심 분리 튜브를 배치했다. 의 microfuge 튜브 및 15 ml의 튜브 사이의 어댑터로 5 ML의 주사기의 머리를 사용합니다. O 4 ℃에서 1 분 동안 3,000 XG에 튜브 조립체를 원심
- 세포 파편을 취소 4 ℃로 10 분 동안 10,000 XG에서 새로운 1.5 ML 튜브와 원심 분리기에 흐름을 통해 15 ML 튜브에서 전송합니다.
- 풀 한 15 ML 튜브에 모두 1.5 ml의 튜브에서 상층 액 및 1/50 곁에 각각 RNA 및 단백질 분리에 대한 해물의 1/100 볼륨.
참고 :이 후속 분석 (그림 1)에 대한 "입력"샘플 될 것입니다. - 내가 500 ml의 당 아비딘 300 μg의 추가nitial 효모 문화와 일정 압연 (10 회전)에서 4 ℃로 (이 10 분으로 감소 될 수있다) 30 분 동안 품어.
참고 : 스트렙 타비 딘 비드에 결합에서 아비딘 차단 비오틴과 바이오틴 단백질. - 세포 용 해물과 배양 전 스트렙 타비 딘 비드 사전 세척 하였다.
- 구슬이 1.5 ml의 microcentrifuge 관에 슬러리 스트렙 타비 딘의 약 300 μl를 전송하고 상단에 뜨는을 제거합니다. 이 구슬 250 μL가 발생합니다. 빠른 용해 완충액 1 ㎖로 두 번 구슬을 씻으십시오. 각 단계 사이에 4 ℃로 2 분 동안 660 XG에 스트렙 타비 딘 구슬을 원심 분리기.
- 0.5 신속한 용해 완충액 ㎖, 10 ㎎을 0.5 ㎖ / ml의 BSA, 10 ㎎ / ㎖의 효모 tRNA는 10 μL로 1 시간 동안 인큐베이션하여 구슬 차단. 비드 O / N 필요한 경우 회전을 4 ℃로 차단 용액에 남아있을 수있다.
- 빠른 용해 버퍼 1 ㎖로 두 번 씻으십시오.
자성 비드는 또한 시간, 배경을 감소시키기 위해 사용될 수있다 : 참고아 운드. 이러한 그러나, 세 파로스 구슬보다 더 낮은 용량을 가지고있다.
- (단계 1.14에서) 아비딘 함유 해물로 미리 세척 된 스트렙 타비 딘 비즈 250 μl를 추가하고 일정한 회전 (10 회전)와 4 ° C에서 1 시간을 품어.
참고 :이 배양 시간이 충분 바인딩 시간을 제공하고 RNA의 분해 가능성을 최소화 사이의 타협이다. - 4 O를 C에서 2 분 동안 660 XG에 원심 분리기는 스트렙 타비 딘 비즈를 지우고 새로운 15 ML 튜브에 뜨는을 전송합니다. 각각 따로 1/50 및 RNA와 단백질 분리 용 해물의 1/100 볼륨을 설정합니다.
참고 : 다음은 "언 바운드"샘플 될 것입니다. - 단계 1.17에서와 같이 부드럽게 흔들어 신속하게 용해 버퍼의 1 ml의 구슬을 씻으 새로운 1.5 ml의 microcentrifuge 관에 전송하고 원심 분리기. 이 단계를 세 번 반복합니다.
- 1 빠른 세척 버퍼 ml의, 4 ℃에서 5 분 동안이 시간 회전 (10 회전)으로 구슬을 씻으십시오. 두 번이 단계를 반복합니다. 위와 같이 1 1X PBS ㎖의 원심 분리기로 구슬을 씻으십시오.
- 1X PBS 120 μl를 다시 구슬을 씻으십시오. 원심은 위와 같이하고, "세척"시료로 RNA와 단백질 추출을위한 전체 상층 액을.
참고 :이 마지막 세척 샘플이 세척의 엄격 성을 나타냅니다 및 용출 샘플과 동일한 볼륨이어야합니다. 이 이후의 분석에서 처리 및 로딩을 단순화합니다. - 열에서 RNA와 RNA 관련 단백질을 용출 1X PBS에서 6 밀리미터 비오틴 120 μl를 추가하고 일정한 회전 (10 회전)으로 4 ° C에서 45 분 동안 품어합니다.
- 원심 분리기는 구슬 위와 같이 새로운 1.5 ML 튜브에 용출 자료를 전송합니다. 다시 용출 샘플을 스핀과 구슬의 어떤 이월 없도록 새로운 1.5 ML 튜브에 위의 위상을 전송합니다.
- RNA 또는 단백질 추출을위한 샘플을 채취.
주 : 촬영 볼륨이 RNA 또는 관심 단백질의 다음 분석 및 발현 수준에 의존한다. 북부 분석 (26)에 대한 가이드 라인으로서, 웨스턴 블롯 (23,27) 또는 RT-PCR (28)에 대해, 샘플의 80 %을 20 %을, 그리고 질량 분석 (29)에 대해, 새로운 단백질을 발견 전체 샘플을 채취 할 수 있습니다.
2. RNA 추출
- 배 가교 반전 버퍼의 동일한 볼륨을 추가하고 65 ° C에서 45 분 동안 품어. RNA 추출을 위해 직접 진행합니다.
참고 : 가교 반전 버퍼가 크게 RNA 추출 (20)을 향상 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA)를 포함한다. - 표준 페놀을 사용하여 클로로포름 방법 (26)를 "입력"및 "언 바운드"샘플 (1.13 및 1.17 단계)에서 RNA를 추출 할 수 있습니다.
주 : 이들 샘플은 (예를 들어, RT-PCR)을 따라서, LiCl이 침전 (30)을 제거하기 위해 권고되는 후속 역방향 Transcriptase- (RT)를 이용 분석을 억제 할 수있는 RNA 분해 효소 억제제, 헤파린 많은 양을 함유한다. 은 "WASH "및"용출 "샘플 (1.21 및 1.24 단계) RNA의 소량을 함유하고 다음 단계로 석출된다. - 은 "세척"와 "용출"샘플 8M 구 아니 디늄 염산 (GuHCl) 100 % 에탄올 두 권의 동일한 볼륨을 추가합니다. 적어도 2 시간 동안 -80 ℃에서 인큐베이션.
참고 : 구 아니 디늄 효율적으로 단백질을 변성시켜 샘플에서 RNases 및 단백질 분해 효소를 억제한다. - 20,000 XG, 30 분 동안 4 ° C에서 원심 분리하고 상층 액을 버린다. 20,000 XG, 15 분 동안 4 ° C에서 다시 차가운 80 % 에탄올과 원심 분리기와 펠렛을 씻으십시오.
- 의 RNase없는 물 400 μL의 RNA 펠렛을 용해하고 남은 GuHCl 또는 기타 오염 물질을 제거하기 위해 다시 침전. 3 M 아세트산 나트륨, pH가 5.2 ~ 100 % 에탄올 800 μL의 40 μL를 추가 적어도 1 시간 동안 -20 ℃에서 배양한다.
- 원심 분리기 단계 2.4에서와 같이 씻어 10 μl를 끝으로 모든 에탄올을 제거하고. RNA의의 펠을 재현 탁10 μL의 RNase 무료 물 등. RNA의 펠렛은 일반적으로 볼 수 없습니다로 추가주의하십시오.
참고 : 23 (도 1)에 기술 된 바와 같이 샘플 노던 분석을 위해 사용될 수있다.
3. 단백질 서쪽 오점 또는 질량 분광법 분석을위한 준비
- 단백질 시료에 4 배 램 믈리 샘플 버퍼 (LSB)의 1/3 볼륨을 추가하고 RNA와 단백질의 가교 역 65 ° C에서 45 분을 품어.
참고 : 시료는 -20 ° C에서 저장 될 수있다. - SDS 폴리 아크릴 아미드 겔 (SDS-PAGE) (31)에 실행 단백질. 분석 될 단백질의 크기에 따라, 겔의 비율을 조정한다.
참고 : 10 % 아크릴 아미드 겔 분리 폭넓게 제공하고 제 근사치 좋다. - 분리 효율 (그림 1C)의 제어를위한 표준 면역 분석 (27)과 막 단백질을 전송합니다. 쿠마시 블루 R 중 하나와 얼룩질량 분석 분석 전에 250 실버 얼룩.
참고 : 더 민감하고 더 나은 감지 (그림 1B)를 할 수 있기 때문에 실버 스테인이 선호하는 선택입니다. 염색은 수동으로 준비 솔루션 또는 상업적 키트 중 하나를 수행 할 수 있습니다. 최종 염료 용액에 겔의 배양 시간은 실험적으로 결정되어야한다. 긴 배양 낮은 풍부한 단백질을 밝힐 수 있지만, 이러한 MS2-CP-SBP-GFP로 높은 발현 된 단백질이 넘는 스테인드 질 수 있습니다 자신의 주변에 주변의 단백질을 마스크 수 있습니다. 또한, 높은 배경이 발생할 수 있습니다. 조심스럽게 반응을 수행하고, 적절한시기에 중지 솔루션을 추가합니다. - 겔에서 밴드를 잘라 1.5 ml의 튜브로 전송. -20 ° C에서 보관 샘플, 또는 LC-MS / MS 분석 (32) 다음에 단백질 추출 및 트립신 소화 보냅니다.
- 겔 분리 단계를 제외하는 다른 단백체 접근함에 따라, 단계 1.24의 용출 물질 다이제스트LC-MS / MS 분석 (33)에 트립신과 피사체를 사용 lution.
참고 : SDS-PAGE 분리를 생략하는 프로토콜을 단순화하고 수율을 증가시킨다. 그러나, 샘플은 질량 분석 분석을 억제 세제 NP-40의 흔적을 포함 할 수 있습니다. 이 문제를 극복하기 위해 다음 단계를 수행- 15 분 - 10 SDS-PAGE (31)에서 단백질을 실행합니다.
- (단백질이있는 예) 차선의 전체 부분을 잘라.
주 : 단백질 샘플 낮은 풍부한 단백질의 신호를 모호하게 할 수있다 MS2-CP-SBP 단백질의 상당한 양을 포함 할 수있다.
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Representative Results
급속한은 관련 단백질과 특정 대상 RNA의 분리 할 수 있습니다. 성공에 중요하여 단백질의 충분한 양을 얻을 최대한 그대로 RNA를 유지한다. RNA의 분리 효율과 품질을 확인하려면, 북부 분석 (그림 1A)를 수행한다. 노던 분석을 직접 신속의 효율성과 품질을보고하는 이점을 갖는다. 따라서, 전체 길이 및 분해 생성물의 상대적인 양 번의 실행에서 결정될 수있다. 리보솜의 RNA (rRNAs)는 에티 디움 브로마이드 염색으로 용이하게 검출되고, 용출 샘플 rRNAs 부족 정제의 엄격함을 나타낸다. 정제의 엄격도 및 특이성을 더욱 용출 시료에서 태그되지 않은 mRNA는 신호의 부재 (ACT1 하단 패널)에 의해 입증된다. ACT1의 크기에 있지 않은 FPR1 차선에서 명백한 신호는 사전에서 남은이고MS2L 프로브 vious 하이브리드. 북쪽 분석은 또한 입력 RNA 핫 페놀 프로토콜에 의해 정제하여 RNA에 비해 다소 저하되는 것을 알 (/ O ACT1 프로브 패널 C). 이것은 더 긴 더 복잡 빠른 프로토콜에 기인한다. 그럼에도 불구하고, 전체 길이의 상당한 양이 용출 분획 (MS2L 프로브)의 강한 신호에 의해 계시 된 RNA는 특별히 격리 태그.
단백질 샘플은 이전 프로테오믹스 분석 (그림 1B)에 SDS-PAGE에서 실행 및 실버 얼룩으로 얼룩진 할 수 있습니다. 컨트롤에서 고립 된 샘플 태그가 지정되지 않은 세포 (-MS2L)는 RNA에 의존하는 것과 구별이 아닌 특정 단체에 도움이됩니다. 따라서, 태그 샘플 (+ MS2L)에 강한에만 밴드는 겔의 잘라 및 LC-MS / MS에 대해 수행된다. 일반 RBPs과 서양의 분석은 또한 단백질의 공동 정화의 효율을 표시하는 것이 좋습니다 (그림1C). 여기서, 우리는 분리의 전체 효율 및 특이성을 나타내는 PMP1 20 또는 GFP와 상호 작용하는 것으로 알려져있다 Yef3을 사용했다. 흥미롭게도, Yef3 분리의 효율이 PMP1 및 FPR1 사이에 차이 나타나고 GFP에 비해 훨씬 낮다.
빠른 (PMP1 및 FPR1)을 실시 하였다 MS2L-태그 RNA를 및 관련 단백질의 식별. 두 개의 서로 다른 RNA를 결과 그림 1. 특정 격리. 선물 빠른 실험에서 정제 RNA 샘플 (A) 노던 블롯 분석된다. RNA는 아가 로스 젤에서 실행 에티 디움 브로마이드 (상판)로 염색 하였다. 겔 나일론 막에 블로 팅하여 나타낸 프로브 (하부 패널)로 혼성화 하였다. 분석 샘플은 다음과 같습니다 빠른 세포 용해 (핫 페놀 [단계 1.4), 라PID의 세포 용해 (입력 [단계 1.13])과 비오틴과 용출 (용출 [단계 1.24). MS2 - 태그 및 태그가없는 세포와 빠른에서 단백질의 (B) 실버 얼룩. MS2 태그가 PMP1 (+ MS2L) 또는 태그가없는 (-MS2L) 제어의 용출 분수에서 단백질 샘플 염색 SDS-PAGE와 실버에서 실행되었다. (별표로 표시) 차분 강도 밴드는 겔로부터 절단하고, 질량 스펙트럼 분석에 의해 측정 하였다. 화살표는 동일한 단백질 로딩을 보여줍니다 MS2-CP-GFP-SBP 융합 단백질을 나타냅니다. 무관 차선. 명확성을 위해 밖으로 자른 긍정적 인 컨트롤 (C) 서양 분석 하였다. MS2-CP 융합 단백질의 Yef3 또는 GFP 부분을 인식하는 항체로 웨스턴 블롯을 실시 하였다. 무관 레인 명확성을 위해 밖으로 잘립니다했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
다양한 방법 관련 단백질 11,34 (35)를 식별하는 특정의 mRNA의 분리를 사용한다. 이러한 방법은 RNA 단백질 상호 작용을 조사하기 위해 생체 외 및 생체 전략에 적용됩니다. 체외 방법은 외생 RBPs를 캡처 RNP 단지 (36, 37)을 분리하는 세포 용 해물과 RNA를 전사 품어. 이 유형의 효과적인 방법은 규제 RNA 모티프 (18)에 결합 신규 단백질의 식별 가능하게하는 최근에 발표되었다. 협회는 셀룰러 환경 외부에서 발생하기 때문에 이들 방법의 결점은 비특이적 RBPs의 결합이다. 자연 설정에서 RNA 단백질 협회 더보기를 제공하면서 단백질 가교 결합 된 생체 방법. 또한, 가교 분리 동안 높은 엄격하기 때문에 더 높은 특이성을 할 수 있습니다. 쌍 방식 (17)는 안티센스 형질을 이용RBPs 근방에 펩티드 부분을 지시하기 위해 표적 RNA에 서열. 펩티드 - RBPs는 가교 및 안티센스 서열과 상보적인 서열에 결합되는 비드를 통해 분리 될 수있다. 한 쌍의 방법으로 인해 복잡한 게놈 조작 없이도 여러 세포 유형으로 간단한 애플리케이션에 매우 유리하다. 이것은, 그러나, 형질 전환의 효율에 의존하고, 셀의 낮은 비율 안티센스 동의 경우 낮은 효능을 가질 것이다. 또한, RBP-펩타이드 안티센스 서열의 분리는 안티센스 핵산에 상보적인 올리고 뉴클레오티드와 비오틴 결합 스트렙 자기 비즈를 통해 얻어진다. 상호 작용 (자석 구슬, 스트렙 타비 딘 - 비오틴과 염기쌍)의 다수는 고립의 엄격 성 및 효율성을 제한 할 수 있습니다. 여기에 설명 된 신속한 방법 (24)은 몇 가지 측면에서 이러한 제한에 대한 대안을 제공한다. 첫째, t게놈 유전자좌 따라서는 수율을 증가 모든 셀이 표현되도록 MS2로의 통합은 그 루프. 둘째, 열두 MS2 루프 시퀀스에 MS2-CP-GFP-SBP의 선호도가 높은 상호 작용을 사용하고이를 생체 내에서 결합 할 수 있습니다. 셋째, RNA - 단백질 상호 작용의 고정이보다 엄격한 세척을 가능 비특이적으로 결합 된 단백질의 동정을 감소시킨다. 마지막으로, SBP 도메인은 높은 친 화성으로 스트렙 타비 딘 비드에 결합 쉽고 자유로운 비오틴으로 용출된다.
RNA를 MS2로 루프의 삽입 번역 교란을 최소화하기 위해 모든 루프의 발현을 확인하기 ORF와 3 'UTR 사이에 적당하다. 여섯 MS2 24 루프 반복은 mRNA의 현지화 38-40의 시각화를 위해 이전에 사용되었다. 그러나, MS2의 긴 시퀀스의 삽입 처리 및 RNA의 구조에 변화를 일으킬 수 루프; 이 바인딩 RBPs의 레퍼토리를 성적표를 불안정 또는 변경 될 수 있습니다그것. 우리의 경험에 의하면, 12 루프는 MS2 - 태그 RNA (20)의 효율적인 용출를 얻을 충분하다. 이러한 관점에서, 우리는 우리가 일반적으로 우리의 북부 혼성화의 추가 짧은 성적 증명서를 관찰 있습니다. 노던 다른 프로브는 이러한 짧은 형태 조기 전사 종결을 나타내는 MS2L 및 3 'UTR (20)의 일부를 포함하는 것이 밝혀으로 분석한다. 이러한 경우에는 3 'UTR과 연관된 단백질의 분리의 효율을 감소시킬 가능성이있다. 따라서, RNA 내에 삽입 된 루프들의 수와 위치는 높은 효율 풀다운 및 사체 안정성 사이에 균형을 이루어야.
RNA가 결합 단백질의 최대 배열을 효율적으로 분리 및 검출을 가능하게하는 프로토콜을 통해 그대로 유지한다. 외부의 RNase 오염 가능성은 깨끗한 작업 영역을 확보 장갑을 착용의 RNase가없는 물 용액을 제조하고 간결 작동에 의해 감소 될 수있다효율적 프로토콜 시간을 감소시킨다. 그럼에도 불구하고, 우리는 RNA 분해에 가장 큰 기여는 세포 용해시 해물에 휴대 RNases의 출시 것으로 나타났습니다. 이는 개선 된 RNA 정제 41 기계적 밀 결과로 효모 세포의 극저온 분쇄 제안되었다. 이것은 상당한 저하가이 프로토콜 관찰되는 경우에 시도 할 수 있습니다.
풀다운 분석의 일반적인 단점은 열에 비특이적 결합 수많은 단백질의 분리이다. 따라서, 태그가없는 RNA와 효모 균주를 사용하는 중요한 제어이다. 본 균주는, 상기 융합 단백질이 아니라 표적 RNA에 결합하는 단백질을 배제하는 MS2-CP-GFP-SBP 융합 단백질을 표현한다. 우리는이 MS2 루프 자체를 결합 할 수 단백질을 배제하지 않는다 있습니다,이 단백질 풀다운 분석과 추가 검증이 필요합니다. 그림 1B는 우리가 바인딩 여러 단백질을 확인할 수 있었다 보여줍니다구체적 PMP1의 mRNA에, 일부는 후속 공동 IP 분석 (20)에 의해 확인되었다.
빠른 방법은 현재의 잘 구축 된 사이트 별 통합 방법론을 활용, 효모 시스템으로 제한됩니다. 부위 - 특이 적 통합 프로토콜은 현재 CRISPR - 캐스 시스템 42, 43을 사용하는 다른 시스템들에서 유전자 개발되고있다. 다음은 추가 시스템에 대한 신속한의 이용 확대에 매우 중요 할 것이다. 급속한의 또 다른 미래의 응용 프로그램이 관심의 mRNA의와 관련된 RNA를의 분리입니다. 이것은 쉽게 RNA-SEQ보다는 LC-MS / MS에 절연 물질을 처리함으로써 달성 될 수있다. mRNA의 발현을 조절하는 소형의 RNA의 중요한 역할을 고려하면,이 애플리케이션은 매우 중요 할 것으로 예상된다. 마지막으로, 질량 분석기의 개선 (MS)의 분석과 같은 SILAC 정량적 MS 방법의 사용은 mRNA의 바인딩 PROTEI의 정량적 측정 값을 초래할 것이다다른 조건 NS. 빠른 효모 무거운 동위 원소가 풍부 미디어에서 성장과 레이블이없는 미디어 44, 45와 다른 조건 (예를 들면, 스트레스) 하에서 성장 세포에 비해 사용할 수 있습니다. MS 정량 분석과 함께 신속한 방법을 적용하면 특정의 mRNA와 관련된 RBP 레퍼토리의 변화를 정확하게 측정을 산출 할 것이다.
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Acknowledgments
우리는 빠른 프로토콜을 설정하고 필요한 플라스미드를 제공하는 그들의 도움이되는 조언을 교수 제프 Gerst와 보리스 Slobodin 감사합니다. 우리는 또한 LC-MS / MS 분석과 그녀의 도움을 Smoler 단백질 체학 센터에서이 프로토콜 박사 타마 지브을 설정하는 그녀의 도움 박사 Avigail ATIR - 란데 감사합니다. 우리는 YEF3 항체에 대해 교수 TG Kinzy (럿 거스)을 감사드립니다. 이 작품은 Binational 과학 재단에서 보조금 2,011,013에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tris | sigma | T1503 | |
| SDS | bio-lab | 1981232300 | |
| DTT | sigma | D9779 | |
| Acidic Phenol (pH 4.3) | sigma | P4682 | |
| Acidic Phenol: Chloroform (5:1, pH 4.3) | sigma | P1944 | |
| Chloroform | bio-lab | 3080521 | |
| Formaldehyde | Frutarom | 5551820 | |
| Glycine | sigma | G7126 | |
| NP-40 | Calbiochem | 492016 | |
| Heparin | Sigma | H3393 | |
| Phenylmethylsulfonyl Flouride (PMSF) | Sigma | P7626 | |
| Leupeptin | Sigma | L2884 | |
| Aprotinin | Sigma | A1153 | |
| Soybean Trypsin Inhibitor | Sigma | T9003 | |
| Pepstatin | Sigma | P5318 | |
| DNase I | Promega | M610A | |
| Ribonuclease Inhibitor | Takara | 2313A | |
| Glass Beads | Sartorius | BBI-8541701 | 0.4-0.6mm diameter |
| Mini BeadBeater | BioSpec | Mini BeadBeater 16 | |
| Guanidinium | Sigma | G4505 | |
| Avidin | Sigma | A9275 | |
| Streptavidin Beads | GE Healthcare | 17-5113-01 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A7906 | |
| Yeast tRNA | Sigma | R8508 | |
| Biotin | Sigma | B4501 | |
| Yeast extract | Bacto | 288620 | |
| peptone | Bacto | 211677 | |
| Glucose | Sigma | G8270 | |
| 1x Phosphate-Buffered saline (PBS) | |||
| 0.2 M NaOH | |||
| 4x Laemmli Sample Buffer (LSB) | 0.2 M Tris-Hcl pH 6.8, 8% SDS, 0.4 M DTT, 40% glycerol, 0.04% Bromophenol-Blue. | ||
| Hot phenol lysis buffer | 10 mM Tris pH 7.5, 10 mM EDTA, 0.5% SDS | ||
| 3 M Sodium Acetate pH 5.2 | |||
| 100% and 70% Ethanol (EtOH) | |||
| RNase-free water | |||
| RaPID lysis buffer | 20 mM Tris pH 7.5, 150 mM NaCl, 1.8 mM MgCl2, 0.5% NP-40, 5 mg/ml Heparin, 1 mM Dithiothreitol (DTT), 1 mM Phenylmethylsulfonyl Flouride (PMSF), 10 µg/ml Leupeptin, 10 µg/ml Aprotinin, 10 µg/ml Soybean Trypsin Inhibitor, 10 µg/ml Pepstatin, 20 U/ml DNase I, 100 U/ml Ribonuclease Inhibitor. | ||
| 2x Cross-linking reversal buffer | 100 mM Tris pH 7.4, 10 mM EDTA, 20 mM DTT, 2 % SDS. | ||
| RaPID wash buffer | 20 mM Tris-HCl pH 7.5, 300 mM NaCl, 0.5% NP-40 | ||
| 0.5 M EDTA pH 8 | |||
| Silver Stain Plus Kit | Bio-Rad | 161-0449 | For detecting proteins in polyacrylamide gels |
| SD selective medium | 1.7 g/l Yeast nitrogen base with out amino acids and ammonium sulfate, 5 g/l Ammonium sulfate, 2% glucose, 350 mg/l Threonine, 40 mg/l Methionine, 40 mg/l Adenine, 50 mg/l Lysine, 50 mg/l Tryptophan, 20 mg/l Histidine, 80 mg/l Leucine, 30 mg/l Tyrosine, 40 mg/l Arginine | ||
| Anti-eEF3 (EF3A,YEF3) | Gift from Kinzy TG. (UMDNJ Robert Wood Johnson Medical School) | 1:5,000 | |
| Anti GFP antibody | Santa Cruz | sc-8334 | 1:3,000 |
| Anti rabbit IgG-HRP conjugated | SIGMA | A9169 | 1:10,000 |
References
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