Introduction
RNA结合蛋白（限制性商业惯例）表示S的约10％ 酵母蛋白1,2和哺乳动物蛋白质3-5的约15％。它们被牵连在许多细胞过程如mRNA转录后加工和调节，翻译，核糖体合成，tRNA的氨酰化和修饰，染色质重塑，以及更多。限制性商业做法的一个重要子群mRNA的结合蛋白（mRNPs）6,7。 mRNA中的成熟的过程中，不同的限制性商业惯例结合转录并介导其核加工，出口出来的细胞核，细胞定位，翻译和降解6-8。因此，不同的组在任何时间点绑定到特定的成绩单的限制性商业惯例决定了它的加工和最终的命运。
与基因相关的限制性商业惯例的识别可以显著提高我们的基本的转录后调控过程的了解。不同遗传，微观，生化和生物信息学方法已经用于鉴定参与mRNA调节（在9-11中综述）蛋白。然而，只有少数的这些方法能够与特定的靶mRNA相关的蛋白质的鉴定。值得注意的是，酵母三杂交系统（Y3H），它利用的利益为诱饵mRNA的筛选在酵母细胞中的表达文库。阳性克隆通常是通过培养来选择或记者表达12-14观察。该方法的主要优点是大量可在细胞环境和测量RNA的蛋白质相互作用的强度的能力被扫描的蛋白质。缺点包括相对大量的由于非特异性结合假阳性结果，而对于由于假阴性结果，部分地融合蛋白猎物或诱饵的RNA的错折叠的高电位。
遗传方式的替代方法是亲和力洁净工作台其相关的蛋白的RNA的阳离子。聚A含的mRNA可以通过使用寡聚dT柱进行分离，并且它们的相关的蛋白质通过质谱法进行检测。的RNA-蛋白质相互作用是通过交联的细胞环境，这使得短程共价键是保守的。使用寡聚dT柱产生了与任何含有聚A-mRNA的3,5,15相关的整个蛋白质组的全局视图。但是，这并不能提供与特定的mRNA相关蛋白质的列表。很少方法可用来实现这种识别。该对方法需要核酸与互补性与靶mRNA 16,17的转染。核酸也附连到的肽，其允许交联到限制性商业惯例中紧挨着的相互作用位点。交联后，RBP肽 - 核酸可以分离并进行蛋白质组分析。最近，基于适体的方法是成功地应用到从哺乳动物细胞系18中提取。用链霉改善的亲和力的RNA适体的开发和融合于（在这种情况下，富含AU的元件（ARE））感兴趣的序列。适体 - ARE的RNA附着在链霉抗珠粒并用细胞裂解物混合。与该ARE序列相关联的蛋白质纯化，并通过质谱（MS）来识别。虽然这种方法检测的蜂窝设置（ 即 ， 在体外 ）外面发生关联，则很可能在将来被修改，以便引入适体到基因组中，从而使蛋白质与表达相关的隔离，而在细胞环境（ 即 体内 ）。在酵母中，其中的遗传操作已经非常成熟，快速的方法（以教授杰夫·Gerst的实验室开发）提供了在体内协会19的观点。快速融合了专用性强的MS2外壳蛋白的结合（MS2-CP）的MS2 RNA序列，和的链霉抗结合结构域（SBP）到链霉偶联珠。这使MS2标记mRNA的高效净化通过链霉珠。此外，的MS2环12份表达式允许多达六个MS2-CP的同时结合到RNA和提高其隔离的效率。因此该协议建议，使新颖的mRNA相关蛋白的鉴定一次洗脱的样品通过质谱法进行蛋白组学分析。
我们最近利用快速识别与酵母PMP1 mRNA的20相关联的新的蛋白质。PMP1 mRNA的先前显示与ER膜相关联，并且其3'非翻译区（UTR）被认为是在此关联21的主要决定因素。因此，结合PMP1 3'非编码区限制性商业惯例有可能在其定位可发挥重要的作用。快速接着液相色谱的y质谱/质谱（LC-MS / MS）导致与PMP1 20相互作用的许多新的蛋白质的鉴定。在此，我们提供的快速方法的详细的协议，做需要的重要的控制，这可能提高产量和特异性的技术技巧。
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Protocol
注意：插入由12 MS2结合位点的序列（MS2循环; MS2L）成所需的基因组基因座，通常是开放读框（ORF）和3'非编码区之间。这种集成的详细协议，其他22提供。验证通过PCR，Northern分析或RT-PCR 20,23正常插入和表达。它以验证该积分不与3'UTR的合成干预是重要的。此外，诱导型启动子（蛋氨酸耗竭）的表达下熔合到SBP的质粒表达MS2-CP也应导入细胞24。相同的菌株，不含所引入的MS12回路，应作为用于检测非特异性信号的控制。
1.快速纯化
- 生长500毫升酵母细胞（使用250-1000毫升的酵母细胞依赖于感兴趣的基因的表达水平），表示MS2标记的mRNA 20和在适当的生长培养基（ 如合成葡萄糖（SD）选择性培养基）1.0在30 摄氏度 - MS2-CP-GFP-SBP融合蛋白24至600 OD 0.8。
- 离心细胞以3000 xg离心在RT 4分钟并弃上清。
- 洗在1×磷酸盐缓冲盐水细胞（PBS）中，离心之前（步骤1.2），重悬在SD等体积（步骤1.1）无蛋氨酸，并孵育45 - 60分钟，在30℃下以诱导MS2的表达-CP-GFP-SBP融合蛋白。
注：较长的诱导时间可能会造成的GFP的聚集。 - 预留1,000萃取池，并用简单的“热酚”的方法，从25这个样本中提取RNA。注意：苯酚是剧毒，应根据其安全指示进行处理。
注：此RNA是孤立的RNA（ 图1A）的质量有很好的借鉴。 - 500萃取池，1.35毫升37％的甲醛添加到决赛C的0.1％oncentration以交联RNA-蛋白质复合物。在30℃下10分钟继续孵化。注意：甲醛是高毒，应根据其安全指示进行处理。
- 加26.5毫升的2.5M的甘氨酸到0.125微米的最终浓度和孵育3分钟以停止交联。从这个步骤上，雪藏的一切，以尽量减少RNA降解。
- 离心机的细胞在3000 XG 4分钟，4℃，洗用45毫升冷1X PBS。
- 悬浮细胞在每100毫升初始细胞培养1毫升迅速裂解缓冲液。
- 分成500微升等分试样在螺旋盖微量离心管并加入〜400毫克的冷却玻璃珠每个等分试样（大约全0.2毫升PCR管）。
- 裂解的细胞在珠打浆机3分钟。立即把裂解液冰上。
注：细胞裂解释放细胞RNA酶，它们是RNA降解的主要原因。快速裂解液中含有RNA酶INHI高浓度bitors，如非特异性RNA酶抑制剂肝素和特定的抑制剂。还建议迅速工作，藏在心里冷。 - 转移裂解液到新管。皮尔斯在每个离心管的用热针（1.2毫米×40毫米）中底部的小孔，然后将离心管的15ml试管的顶部。使用5ml的注射器的头部作为微量离心管并15毫升管之间的适配器。离心管装配在3000 XG 1分钟，4℃。
- 传送从15毫升管流通到一个新的1.5毫升管和离心机以10,000×g离心10分钟， 在 4℃以清除细胞碎片。
- 池上清液所有1.5毫升管放入一个15毫升管，并预留1/50，并分别RNA和蛋白分离，1/100体积的裂解液。
注意：这些将作为用于随后的分析（ 图1）的“输入”样品。 - 加入抗生物素蛋白300微克每500毫升我的nitial酵母培养和孵化30分钟以恒定滚动（10转）在4℃（这可以减少到10分钟）。
注意：抗生物素蛋白生物素块和生物素化蛋白质从结合到链霉抗珠。 - 与细胞裂解物孵育之前预洗链霉珠。
- 转约300微升链霉珠浆料到1.5ml微量离心管中，并除去上层清液。这将导致在250微升的珠。用1ml迅速裂解缓冲液洗珠两次。离心链亲和素珠在660 XG在每个步骤之间摄氏四度 2分钟。
- 通过用0.5ml快速裂解缓冲液，0.5毫升10毫克/毫升BSA和10微升10毫克/毫升酵母tRNA的1小时温育阻断珠。珠可以留给O / N在必要时在摄氏 4 度与旋转阻止解决方案。
- 用1ml迅速裂解缓冲液洗两次。
注意：磁珠也可用于减少时间和background。然而，这些具有比琼脂糖珠容量低。
- 加入250微升的洗涤的预链霉珠与含抗生物素蛋白裂解物（来自步骤1.14），并在4℃下以恒定旋转（10rpm下）孵育1小时。
注意：此温育时间是提供足够的结合的时间和减少对RNA降解的机会之间的折衷。 - 离心机在4℃下660×g离心2分钟以清除链霉珠并将上清液转移到一个新15ml试管。分别拨出1/50和1/100体积的裂解液RNA和蛋白分离的。
注：这些将是“未绑定”的样本。 - 用1ml迅速裂解缓冲液洗珠，轻轻摇动，转移至新的1.5毫升微量离心管中，并离心分离在步骤1.17。重复此步骤三次。
- 用1ml快速洗涤缓冲液中，并在4℃5分钟此时旋转（10rpm下）洗涤珠。重复此步骤两次。 与上述1毫升1×PBS中并离心洗涤珠。
- 与120微升1×PBS再次洗珠。离心机如上，并采取RNA和蛋白提取整个上清液作为“洗”样品。
注意：此最后的洗涤样本将指示洗涤的严格性，应该是相同的卷作为洗脱样品。这将简化在随后的分析处理和装载。 - 以洗脱的RNA和RNA相关蛋白从柱中，添加120微升6毫生物素的在1×PBS中并在4℃下以恒定旋转（10rpm下）孵育45分钟。
- 离心机珠如上和洗脱材料转移到一个新的1.5毫升管。再次旋洗脱样品和上层相转移至新的1.5毫升管，以确保没有珠结转。
- 就拿RNA或蛋白质提取样品。
注意：采取的体积应取决于所述RNA或蛋白质的下列测定的表达水平和。作为指导原则，对于北方分析26，取样品的80％，对于Western印迹23,27或RT-PCR 28，取20％，和用于质谱29发现新的蛋白质，取全部样品。
2. RNA提取
- 加2倍交联逆转缓冲液的等体积并在65℃下孵育45分钟。继续直接提取RNA。
注意：交联逆转缓冲液含有乙二胺四乙酸（EDTA），其显著提高RNA提取20。 - 使用标准的酚：氯仿法26从“输入”和“绑定”的样本（步骤1.13和1.17）提取RNA。
注意：这些样品中含有大量的RNase抑制剂肝素，它可以抑制随后的反向Transcriptase-（RT）利用测定（ 例如 ，RT-PCR），因此，氯化锂沉淀30建议将其删除。该“WASH“和”洗脱“样品（步骤1.21和1.24）含有少量的RNA，并通过以下的步骤中沉淀。 - 8M胍盐酸（盐酸胍）和100％的乙醇的两卷等体积添加到“洗涤”和“洗脱”样品。孵育在-80℃下为至少2小时。
注意：胍将有效地使蛋白质变性，从而抑制核糖核酸酶和蛋白酶于样品中。 - 离心机以20,000 xg离心，4℃30分钟，并弃去上清液。以20,000 xg离心，4℃15分钟洗一遍用冷80％乙醇，离心沉淀。
- 溶解于400μl无RNA酶的水的RNA沉淀并再次沉淀以除去任何剩余的盐酸胍或其它污染物。添加40微升3M乙酸钠，pH 5.2和800微升的100％乙醇，孵育在-20℃下至少1小时。
- 离心洗按照步骤2.4，并删除所有乙醇10微升提示。重悬RNA佩尔ET的10微升核糖核酸酶自由水。要格外小心为RNA沉淀通常是不可见的。
注意：如在23（ 图1）中所描述的样品可用于Northern分析。
3.蛋白制品为Western印迹或质谱分析
- 加1/3体积4倍的Laemmli样品缓冲液（LSB）的蛋白质的样品和在65°C孵育45分钟以扭转的RNA和蛋白质的交联。
注：样品可以储存在-20℃。 - 在SDS聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）31运行的蛋白质。根据蛋白质的大小要分析调节凝胶的百分比。
注：10％丙烯酰胺凝胶给出了广泛的分离和良好作为第一近似。 - 转移蛋白的膜作为用于分离效率（ 图 1C）控制的标准免疫印迹分析27。无论使用哪种考马斯亮蓝R染色质谱分析前250或银染。
注意：银染是优选的选择，因为它是更敏感，并且允许更好的检测（ 图1B）。染色可与手动制备溶液或市售试剂盒进行。在最终的染料溶液中的凝胶的温育时间应通过试验确定。潜伏期长可能揭示低丰度蛋白，但可引起高表达的蛋白，如MS2-CP-SBP-GFP是在染色和可能掩盖周围的蛋白质在其附近。此外，则可能出现高背景。认真遵循反应，并加入终止液在适当的时候。 - 从凝胶中切出条带，并将它们传送到1.5毫升管。在-20℃储存的样品，或发送用于蛋白质提取和胰蛋白酶消化，随后用LC-MS / MS分析32。
- 作为替代蛋白质组学方法排除凝胶分离步骤，在这样从步骤1.24消化洗脱材料lution使用胰蛋白酶和受至LC-MS / MS分析33。
注意：省略SDS-PAGE分离简化了协议并增加产量。然而，样品可能包含洗涤剂NP-40，从而抑制质谱分析的踪迹。为了克服这个问题，执行以下步骤：- 15分钟-在SDS-PAGE 31 10上运行的蛋白质。
- 切出的车道（ 即 ，其中该蛋白质的位置）的整个部分。
注：蛋白质样品可能包含可能掩盖低丰度蛋白的信号的MS2-CP-SBP蛋白的显著量。
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Representative Results
迅速使与其相关的蛋白质的特定的靶RNA的分离。临界其成功是保持所述RNA完整尽可能，由此获得的蛋白质的足够量。为了确定RNA的分离效率和质量，Northern分析进行（ 图1A）。 Northern分析具有直接向快速的效率和质量的优点。因此，全长和降解产物的相对量可以在单次运行来确定。核糖体RNA（个rRNA）是在溴化乙锭染色容易地检测，和洗脱样品中的缺少个rRNA的指示纯化的严格性。纯化的严格性和特异性是由缺乏洗脱样品中的未标记的mRNA的信号（ACT1底部面板）进一步证实。在FPR1车道，这是ACT1的尺寸不表观信号，是从预先一个剩vious杂交与MS2L探头。北部分析还表明，相比于由热酚协议纯化的RNA输入的RNA是稍微降低（C / O ACT1探针面板）。这归因于更长和更复杂的快速协议。然而，全长的显著量，标记的RNA特异性分离，通过在洗脱级分（MS2L探头）的强信号所揭示。
蛋白质样品可以在SDS-PAGE蛋白质组学分析（ 图1B）之前被运行，并通过银染染色。从控制分离的样品，未标记的细胞（-MS2L）是从依赖于RNA的那些区分非特异性关联有帮助的。因此，仅是被标记的样品（+ MS2L）在强带被切出凝胶，并采取用于LC-MS / MS。还建议用一般限制性商业惯例Western分析，以指示蛋白质共纯化的效率（ 图1C）。这里，我们使用Yef3，这是众所周知的与PMP1 20，或绿色荧光蛋白，这表明在隔离的整体效率和特异性相互作用。有趣的是，Yef3隔离的效率似乎PMP1和FPR1之间不同，并且相比于GFP低得多。
即经受快速（PMP1和FPR1）MS2L标记的RNA和相关蛋白的鉴定。两种不同的RNA的结果 图1. 隔离的具体呈现。（A）从快速纯化实验RNA样品的Northern blot分析。的RNA在琼脂糖凝胶上运行，并用溴化乙锭（上图）染色。将该凝胶印迹到尼龙膜上并进行杂交与指示探针（下图）。分析的样品包括：快速细胞裂解（热酚[步骤1.4]）中，RaPID细胞裂解（输入[步骤1.13]），并用生物素洗脱后（洗脱[步骤1.24]）。（B）中与MS2标记和未标记的细胞快速蛋白质银染。从MS2标记PMP1（+ MS2L）或未标记（-MS2L）控制的洗脱级分的蛋白的样品在SDS-PAGE和银染色进行运行。差分强度带（由星号指示）切出凝胶，并通过质谱分析确定。箭头指示的MS2-CP-GFP-SBP融合蛋白，这表明相等蛋白质加载。不相干泳道裁剪出清晰度。（C）的阳性对照的Western分析。与该识别MS2-CP融合蛋白的Yef3或GFP的部分抗体通过Western印迹进行。不相干的泳道上剪裁出清晰。 请点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
各种方法使用特定的mRNA的分离，以确定它们相关的蛋白质11,34 35。这些方法适用于体外和体内的策略来探测RNA-蛋白的相互作用。 体外方法孵育外生转录的RNA与细胞裂解物来捕获限制性商业惯例和隔离RNP复合物36,37。这种类型的一个有效的方法最近被提出，这使能结合一个调控RNA基序18新蛋白质的鉴定。这些方法的缺点是非特异性限制性商业惯例的结合，因为关联发生在蜂窝环境之外， 在体内方法，其中蛋白质是交联的，而在其天然设置，可以提供RNA-蛋白质关联的更好的视野。此外，交联允许隔离期间严格较高，因此较高的特异性。这对17的方式利用反义转染序列与靶RNA以直接的肽部分与限制性商业惯例的附近。然后肽限制性商业惯例可以是交联的，并通过链接到的序列是与反义序列互补的珠子分离。在一对的方法是非常有利的，因为它简单应用到许多类型的细胞，而不需要复杂的基因组的操作。然而，这是，依赖于转染的效率，并且其中细胞的低百分比接受反义例将具有低功效。此外，通过被耦合以与反义核酸互补的生物素化寡核苷酸的磁性链霉亲珠粒得到的RBP肽 - 反义序列的分离。相互作用（磁珠，链霉抗生物素和碱基配对）的多重性可以限制在隔离的严格性和效率。这里介绍的方法，迅速提供了24几个方面对这些限制的替代品。首先，T他整合MS2的循环进入基因组位点，确保所有细胞表达出来，从而提高其产量。第二，它使用的MS2-CP-GFP-收缩压到十二MS2环序列的高亲和力相互作用，并允许他们在体内结合。第三，RNA-蛋白质相互作用的固定能够更严格洗涤，并减少非特异性结合的蛋白质的鉴定。最后，收缩压域结合以高亲和力蛋白链菌素珠粒，并且很容易与无生物素洗脱。
MS2的循环入RNA的插入是的ORF和3'非编码区之间最好以最小化的翻译扰动，并确保所有循环的表达。六至24 MS2循环重复进行用于mRNA本地化38-40的可视化以前使用。然而，MS2的长序列的插入环可能导致在加工和RNA的结构变化;它可能会破坏谈话或改变限制性商业惯例的约束剧目给它。在我们的经验，12环路足以得到MS2-标记的RNA 20的高效洗脱。在这方面，我们注意到，我们通常在我们的Northern杂交观察到额外的短成绩单。北方分析用不同的探针表明，这些短形式包括MS2L和3'非编码区20的一部分，表示过早转录终止的。这种情况下，很可能会降低与3'非编码区相关的蛋白质的分离的效率。因此，插入的环的RNA内的数目和它们的位置应高效率下拉和转录物稳定性之间的平衡。
所述RNA具有在整个协议保持不变，以使结合蛋白的最大阵列的高效分离和检测。可以通过戴手套，保证清洁的工作区，准备用无RNA酶的水溶液，简洁的工作可以减少对外部RNase污染的机会并有效地减少协议的时间。然而，我们发现最大的贡献者RNA降解是细胞RNA酶，以在细胞裂解的裂解物的释放。有人提议酵母细胞的低温研磨，在改进的RNA纯化41一个机械碾磨机的结果。这可以在显著下降与此协议观察病例进行审判。
下拉测定法的共同缺点是，非特异性结合到列众多蛋白质的分离。因此，使用带未标记的RNA的酵母菌株的是一个重要的控制。该菌株表达的MS2-CP-GFP-SBP融合蛋白中以进一步排除结合于所述融合蛋白和不与靶RNA的蛋白质。我们注意到，这并不排除可能结合MS2循环本身的蛋白质，而这些都需要与蛋白质pull-down实验进一步验证。 图1B示出的是，我们能够鉴定结合几种蛋白具体地PMP1的mRNA，部分随后通过共IP测定20验证。
快速的方法目前仅限于酵母系统中，利用其成熟的定点整合方法。位点特异性整合的协议，目前正在使用CRISPR-CAS系统42,43在其他系统中的基因的发展。这将是非常重要的快速扩张的利用率，附加系统。未来的快速的另一种应用是用于与感兴趣的mRNA相关的RNA的隔离。这可以容易地实现，通过使分离的物质的RNA-SEQ而非LC-MS / MS分析。考虑在调节基因表达的小RNA的重要作用，这种应用可能是非常重要的。最后，在质谱的改进（MS）分析和使用定量质谱方法如SILAC会导致mRNA的结合protei的定量测量在不同条件下纳秒。可迅速用酵母生长在与重同位素富集媒体相比，不同条件（ 如 ，应力）与未标记的媒体44,45下生长的细胞中。定量质谱分析起来运用快速的方法将产生与特定基因相关的RBP剧目的变化准确地计量。
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Acknowledgments
我们感谢教授杰夫·Gerst和鲍里斯Slobodin在建立快速协议，并提供必要的质粒的有益的建议。我们也感谢Avigail ATIR-兰德博士为她建立从Smoler蛋白质组学中心这个协议和添马舰谢夫博士她与LC-MS / MS分析帮帮忙。我们感谢TG Kinzy教授（罗格斯）为YEF3抗体。这项工作是由来自两国科学基金资助2011013支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tris | sigma | T1503 | |
| SDS | bio-lab | 1981232300 | |
| DTT | sigma | D9779 | |
| Acidic Phenol (pH 4.3) | sigma | P4682 | |
| Acidic Phenol: Chloroform (5:1, pH 4.3) | sigma | P1944 | |
| Chloroform | bio-lab | 3080521 | |
| Formaldehyde | Frutarom | 5551820 | |
| Glycine | sigma | G7126 | |
| NP-40 | Calbiochem | 492016 | |
| Heparin | Sigma | H3393 | |
| Phenylmethylsulfonyl Flouride (PMSF) | Sigma | P7626 | |
| Leupeptin | Sigma | L2884 | |
| Aprotinin | Sigma | A1153 | |
| Soybean Trypsin Inhibitor | Sigma | T9003 | |
| Pepstatin | Sigma | P5318 | |
| DNase I | Promega | M610A | |
| Ribonuclease Inhibitor | Takara | 2313A | |
| Glass Beads | Sartorius | BBI-8541701 | 0.4-0.6mm diameter |
| Mini BeadBeater | BioSpec | Mini BeadBeater 16 | |
| Guanidinium | Sigma | G4505 | |
| Avidin | Sigma | A9275 | |
| Streptavidin Beads | GE Healthcare | 17-5113-01 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A7906 | |
| Yeast tRNA | Sigma | R8508 | |
| Biotin | Sigma | B4501 | |
| Yeast extract | Bacto | 288620 | |
| peptone | Bacto | 211677 | |
| Glucose | Sigma | G8270 | |
| 1x Phosphate-Buffered saline (PBS) | |||
| 0.2 M NaOH | |||
| 4x Laemmli Sample Buffer (LSB) | 0.2 M Tris-Hcl pH 6.8, 8% SDS, 0.4 M DTT, 40% glycerol, 0.04% Bromophenol-Blue. | ||
| Hot phenol lysis buffer | 10 mM Tris pH 7.5, 10 mM EDTA, 0.5% SDS | ||
| 3 M Sodium Acetate pH 5.2 | |||
| 100% and 70% Ethanol (EtOH) | |||
| RNase-free water | |||
| RaPID lysis buffer | 20 mM Tris pH 7.5, 150 mM NaCl, 1.8 mM MgCl2, 0.5% NP-40, 5 mg/ml Heparin, 1 mM Dithiothreitol (DTT), 1 mM Phenylmethylsulfonyl Flouride (PMSF), 10 µg/ml Leupeptin, 10 µg/ml Aprotinin, 10 µg/ml Soybean Trypsin Inhibitor, 10 µg/ml Pepstatin, 20 U/ml DNase I, 100 U/ml Ribonuclease Inhibitor. | ||
| 2x Cross-linking reversal buffer | 100 mM Tris pH 7.4, 10 mM EDTA, 20 mM DTT, 2 % SDS. | ||
| RaPID wash buffer | 20 mM Tris-HCl pH 7.5, 300 mM NaCl, 0.5% NP-40 | ||
| 0.5 M EDTA pH 8 | |||
| Silver Stain Plus Kit | Bio-Rad | 161-0449 | For detecting proteins in polyacrylamide gels |
| SD selective medium | 1.7 g/l Yeast nitrogen base with out amino acids and ammonium sulfate, 5 g/l Ammonium sulfate, 2% glucose, 350 mg/l Threonine, 40 mg/l Methionine, 40 mg/l Adenine, 50 mg/l Lysine, 50 mg/l Tryptophan, 20 mg/l Histidine, 80 mg/l Leucine, 30 mg/l Tyrosine, 40 mg/l Arginine | ||
| Anti-eEF3 (EF3A,YEF3) | Gift from Kinzy TG. (UMDNJ Robert Wood Johnson Medical School) | 1:5,000 | |
| Anti GFP antibody | Santa Cruz | sc-8334 | 1:3,000 |
| Anti rabbit IgG-HRP conjugated | SIGMA | A9169 | 1:10,000 |
References
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