Introduction
RNA-bindende proteiner (RBP'er) udgør omkring 10% af S. cerevisiae-proteiner 1,2 og ca. 15% af pattedyrproteiner 3-5. De er impliceret i mange cellulære processer såsom mRNA post-transkriptionel bearbejdning og regulering, oversættelse, ribosom biogenese, tRNA aminoacylering og modifikation, kromatin remodeling, og mere. En vigtig undergruppe af RBP'er er mRNA-bindende proteiner (mRNPs) 6,7. I løbet af mRNA modning, forskellige RBP'er binder udskrift og mægle sit nukleare forarbejdning, eksport ud af kernen, cellulære lokalisering, oversættelse og nedbrydning 6-8. Således distinkt sæt af RBP'er bundet til en bestemt transkript på noget tidspunkt bestemmer dets forarbejdning og i sidste ende dens skæbne.
Identifikationen af RBP'er forbundet med en mRNA i væsentlig grad kan forbedre vores forståelse af processer bag deres post-transkriptionel regulering. forskellige genetiske, Mikroskopiske, biokemiske og bioinformatik metoder er blevet anvendt til at identificere proteiner involveret i mRNA regulering (gennemgået i 9-11). Men kun nogle få af disse metoder muliggør identifikation af proteiner associeret med en bestemt mål-mRNA. At bemærke er den Gær Tre hybridsystem (Y3H), som anvender mRNA'et af interesse som lokkemad til screening et ekspressionsbibliotek i gærceller. Positive kloner sædvanligvis iagttages gennem en vækst markering eller reporterekspression 12-14. Den vigtigste fordel ved denne fremgangsmåde er det store antal proteiner, der kan scannes i et cellulært miljø og evnen til at måle styrken af RNA-protein-interaktion. Ulemper omfatter det forholdsvis store antal af falsk positive resultater som følge af ikke-specifik binding, og det store potentiale for falske negative resultater, fordi, delvis kommer misfoldning af fusionsproteinet bytte eller lokkemaden RNA.
Et alternativ til den genetiske fremgangsmåde er affinitet purifierkation af RNA med associerede proteiner. Poly A-holdig mRNA'er kan isoleres ved anvendelse af oligo-dT søjler, og deres associerede proteiner detekteres ved massespektrometri. RNA-protein-interaktion er konserveret i dets cellulære kontekst ved tværbinding, hvilket gør kortrækkende kovalente bindinger. Anvendelsen af oligo dT-søjle giver et samlet overblik over hele proteom som er forbundet med nogen poly A-holdige mRNA 3,5,15. Det betyder dog ikke give en liste over proteiner, som er associeret med en særlig mRNA. Meget få metoder til rådighed til at udføre en sådan identifikation. Den PAIR metode indebærer transfektion af nukleinsyre med komplementaritet til mål-mRNA 16,17. Nukleinsyren er ligeledes forbundet med et peptid, der tillader tværbinding til RBP'er i tæt nærhed til samspillet site. Efter tværbinding kan RBP-peptid-nukleinsyre isoleres og underkastes proteomics analyse. For nylig, en aptamer-metode varudmærket anvendes på ekstrakter fra pattedyr cellelinier 18. Et RNA aptamer med forbedret affinitet til streptavidin blev udviklet og fusioneret til en sekvens af interesse (AU-rige elementer (ARE) i dette tilfælde). Den aptamer-ARE RNA blev bundet til streptavidin-perler og blandet med cellelysat. Proteiner, der er forbundet med ARE-sekvensen blev oprenset og identificeret ved massespektrometri (MS). Selv om denne metode har registreret associationer, der opstår uden for de cellulære indstillinger (dvs. in vitro), er det sandsynligt at blive ændret i fremtiden for at introducere de aptamerer i genomet og således muliggøre isoleringen af proteiner associeret med mRNA'et, mens i cellulære milieu (dvs. in vivo). I gær hvor genetiske manipulationer er veletablerede, den hurtige metode (udviklet i Prof. Jeff Gerst laboratorium) giver et billede af in vivo foreninger 19. Rapid kombinerer den specifikke og stærke binding af MS2-kappeprotein (MS2-CP) til MS2-RNA-sekvensen, og streptavidin-bindende domæne (SBP) til streptavidin konjugerede perler. Dette muliggør effektiv oprensning af MS2-mærkede mRNA'er gennem streptavidinkugler. Desuden udtryk for 12 eksemplarer af MS2 sløjfer tillader op til seks MS2-CP'er at binde samtidigt til RNA og øge effektiviteten af sin isolation. Protokollen blev derfor foreslået at muliggøre identifikation af hidtil ukendte mRNA-associerede proteiner, når de eluerede prøverne underkastes proteomics analyse ved massespektrometri.
Vi har for nylig udnyttet RAPID at identificere hidtil ukendte proteiner der er forbundet med gær PMP1 mRNA 20. PMP1 mRNA blev tidligere vist at være associeret med ER-membranen og dens 3'-utranslaterede område (UTR) viste sig at være en afgørende determinant i denne forening 21. Således RBP'er der binder PMP1 3'UTR sandsynligvis spille en vigtig rolle i dens lokalisering. Rapid efterfulgt af væskekromatografy-massespektrometri / massespektrometri (LC-MS / MS) resulterede i identifikationen af mange nye proteiner, der interagerer med PMP1 20. Heri, vi giver en detaljeret protokol af de hurtige metode til vigtige kontroller, der har brug gøres, og tekniske tips, der kan forbedre udbyttet og specificitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bemærk: Indsæt en sekvens bestående af 12 MS2-bindingssteder (MS2 sløjfer; MS2L) til den ønskede genomiske locus, sædvanligvis mellem den åbne læseramme (ORF) og 3'UTR. En detaljeret protokol for denne integration tilbydes andre steder 22. Kontroller korrekt isætning og udtryk ved PCR, northern analyse eller RT-PCR 20,23. Det er vigtigt at kontrollere, at integrationen ikke greb ind med syntesen af 3'UTR. Desuden bør et plasmid-udtrykkende MS2-CP fusioneret til SBP under ekspressionen af en inducerbar promotor (methionin udtømning) også indføres i cellerne 24. En identisk stamme, eksklusive de indførte MS12 loops, bør anvendes som en kontrol til påvisning af ikke-specifikke signaler.
1. hurtig oprensning
- Grow 500 ml gærceller (bruge 250-1,000 ml gærceller afhængigt ekspressionsniveauet af genet af interesse), der udtrykker MS2-mærkede mRNA 20 ogMS2-CP-GFP-SBP fusionsprotein 24 til OD600 0,8 - 1,0 ved 30 ° C i den passende vækstmedium (f.eks Syntetisk Dextrose (SD) selektivt medium).
- Centrifuger cellerne ved 3000 xg i 4 minutter ved stuetemperatur og kassér supernatanten.
- Vask cellerne i 1x phosphatpufret saltvand (PBS), centrifuge som før (trin 1.2), resuspender i et tilsvarende volumen (trin 1.1) i SD uden methionin, og der inkuberes i 45 - 60 minutter ved 30 ° C for at inducere ekspression af MS2 -CP-GFP-SBP fusionsprotein.
Bemærk: Længere induktion tid kan forårsage aggregering af GFP. - Set bort 10 ml celler og udtrække RNA fra denne prøve ved hjælp af simple "hot phenol" metode 25. Advarsel: Phenol er meget giftigt og skal håndteres i henhold til dens sikkerhedsinstruktioner.
Bemærk: Dette RNA er en god reference for kvaliteten af isoleret RNA (figur 1A). - For 500 ml celler, tilsættes 1,35 ml 37% formaldehyd til en endelig concentration på 0,1% til tværbinde RNA-protein-komplekser. Fortsæt inkubation ved 30 ° C i 10 min. Advarsel: Formaldehyd er meget giftigt og skal håndteres i henhold til sine sikkerhedsinstruktioner.
- Tilsættes 26,5 ml 2,5 M glycin til en slutkoncentration på 0,125 M og inkuberes i 3 min for at stoppe tværbinding. Fra dette trin på, sætte alt på is for at minimere RNA nedbrydning.
- Centrifuger cellerne ved 3000 x g i 4 min ved 4 ° C og vaskes med 45 ml kold 1x PBS.
- Resuspender celler i 1 ml RAPID lysepuffer pr 100 ml initial cellekultur.
- Opdelt i portioner af 500 pi i skruelåg mikrocentrifugerør og tilføje ~ 400 mg kølet glasperler til hver portion (ca. en fuld 0,2 ml PCR-rør).
- Lyserer cellerne i en perle piskeren i 3 minutter. Omgående sætte lysatet på is.
Bemærk: cellelyse udgivelser cellulære RNaser, som er den største årsag til RNA-nedbrydning. Rapid Lysis buffer indeholder en høj koncentration af RNase inhikommende messe, såsom den uspecifikke RNase inhibitoren heparin og specifikke inhibitorer. Arbejde hurtigt og holde alt koldt anbefales også. - Overfør lysatet til nye rør. Pierce et lille hul i bunden af hvert mikrofugerør med en varm nål (0,8 mm x 40 mm) og anbringe de mikrocentrifugerør på toppen af 15 ml rør. Brug hovedet af en 5 ml sprøjte som adapter mellem mikrocentrifugerør og 15 ml rør. Centrifugeres rørene samling ved 3.000 x g i 1 min ved 4 ° C.
- Overfør gennemløbet fra 15 ml rør til et nyt 1,5 ml rør og centrifugeres ved 10.000 xg i 10 min ved 4 ° C for at slette cellerester.
- Pool supernatanter fra alle 1,5 ml rør til en enkelt 15 ml rør, og der er afsat 1/50 og 1/100 volumen af lysatet for RNA og protein isolering hhv.
Bemærk: Disse vil fungere som "Input" prøver til efterfølgende analyse (figur 1). - Tilsæt 300 ug avidin pr 500 ml initial gærkultur og inkuberes i 30 minutter (dette kan reduceres til 10 min) ved 4 ° C under konstant rullende (10 rpm).
Bemærk: Avidin blokke biotin og biotinyleret proteiner i at binde til streptavidinperlerne. - Forvask streptavidinperlerne før inkubering med cellelysatet.
- Overfør ca. 300 pi af streptavidin perler opslæmningen til et 1,5 ml mikrocentrifugerør og fjerne den øverste supernatant. Dette vil resultere i 250 pi perler. Vask perlerne to gange med 1 ml RAPID lysisbuffer. Centrifuger streptavidinkugler ved 660 xg i 2 min ved 4 ° C mellem hvert trin.
- Blokere perlerne ved inkubering i 1 time med 0,5 ml RAPID lysepuffer, 0,5 ml 10 mg / ml BSA og 10 pi 10 mg / ml gær-tRNA. Perler kan efterlades O / N i blokerende opløsning ved 4 ° C med rotation om nødvendigt.
- Vask to gange med 1 ml RAPID Lysis buffer.
Bemærk: Magnetiske perler kan også bruges til at reducere tid og background. Disse er imidlertid har lavere kapacitet end sepharoseperler.
- Tilsættes 250 pi af de forvaskede streptavidinkugler til avidin-lysat (fra trin 1.14) og inkuber 1 time ved 4 ° C under konstant rotation (10 rpm).
Bemærk: Denne Inkubationstiden er et kompromis mellem at give tilstrækkelig binding tid og minimere chancerne for RNA-nedbrydning. - Centrifuger ved 660 xg i 2 min ved 4 ° C for at slette streptavidinperlerne og overføre supernatanten til et nyt 15 ml rør. Afsæt 1/50 og 1/100 volumen af lysat i RNA og protein isolering hhv.
Bemærk: Disse vil være de "Unbound" prøver. - Vask perlerne med 1 ml RAPID Lysis buffer, ryst forsigtigt, overførsel til en ny 1,5-ml mikrocentrifugerør, og centrifuger som i trin 1.17. Gentag dette trin tre gange.
- Vask perlerne med 1 ml RAPID vaskebuffer, og denne gang rotate (10 rpm) i 5 minutter ved 4 ° C. Gentag dette trin to gange. Vask perlerne med 1 ml 1x PBS og centrifugeres som ovenfor.
- Vask perlerne igen med 120 pi 1x PBS. Centrifuge som ovenfor, og tage hele supernatant for RNA og protein ekstraktion som "Wash" prøve.
Bemærk: Denne sidste vask prøve vil indikere strengheden af vaskene og bør være af det samme volumen som elueringen prøven. Dette vil forenkle behandling og belastning i efterfølgende analyser. - Til eluering RNA og RNA-associerede proteiner fra søjlen, tilsættes 120 pi 6 mM biotin i 1x PBS og inkuberes i 45 minutter ved 4 ° C under konstant rotation (10 rpm).
- Centrifuger perlerne som ovenfor, og overføre det eluerede materiale til et nyt 1,5 ml rør. Spin den eluerede prøve igen og overføre den øvre fase til et nyt 1,5 ml rør, så der ikke fremførsel af perler.
- Tag prøver til RNA eller protein ekstraktion.
Bemærk: Mængden taget bør afhænge af følgende assay og ekspressionsniveauet af RNA eller protein af interesse. Som retningslinie for det nordlige analyse 26, tage 80% af prøven, for Western blot 23,27 eller RT-PCR 28, tage 20%, og for massespektrometri 29 at opdage nye proteiner, tage hele prøven.
2. RNA-ekstraktion
- Tilsættes et lige stort volumen af 2X Tværbinding Reversal Buffer og inkuberes i 45 minutter ved 65 ° C. Fortsæt direkte til RNA ekstraktion.
Bemærk: Tværbinding Reversal Buffer indeholder ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA), som i væsentlig grad forbedrer RNA-ekstraktion 20. - Brug standard phenol: chloroform metode 26 at udtrække RNA fra "input" og "ubundne" prøver (trin 1,13 og 1,17).
Bemærk: Disse prøver indeholder en stor mængde af RNase inhibitoren heparin, som kan hæmme efterfølgende bagside Transcriptase- (RT) under anvendelse af assays (fx RT-PCR), derfor, LiCI udfældning 30 tilrådes at fjerne det. Den "wash "og" eluering "prøver (trin 1,21 og 1,24) indeholder små mængder af RNA og udfældes gennem følgende trin. - Tilsættes samme mængde af 8M guanidinium-HCI (GuHCI) og to volumener 100% ethanol til "vask" og "elueringsbetingelser" prøver. Inkuber ved -80 ° C i mindst 2 timer.
Bemærk: guanidinium vil effektivt denaturere proteiner og derved inhibere RNaser og proteaser i prøven. - Centrifuger ved 20.000 xg, 4 ° C i 30 minutter og kassér supernatanten. Vask pelleten med kold 80% ethanol og centrifugeres igen ved 20.000 xg, 4 ° C i 15 min.
- Opløs RNA pellet i 400 pi RNase-frit vand og udfældes igen for at fjerne alle rester GuHCI eller andre forureninger. Tilsæt 40 pi 3 M natriumacetat, pH 5,2 og 800 pi 100% ethanol, inkuberes ved -20 ° C i mindst 1 time.
- Centrifuge og vask som i trin 2.4 og fjerne alle ethanol med en 10 pi tip. Resuspender RNA hulteret i 10 pi RNase-frit vand. Vær ekstra forsigtig, da RNA pellet er normalt ikke synlige.
Bemærk: Prøver kan anvendes til northern analyse som beskrevet i 23 (figur 1).
3. Protein Forberedelse til Western Blot eller massespektrometri Analyse
- Tilføj 1/3 volumen på 4x Laemmli prøvebuffer (LSB) til proteinprøver og inkuberes 45 minutter ved 65 ° C for at vende tværbinding af RNA og proteiner.
Bemærk: Prøver kan opbevares ved -20 ° C. - Kør proteiner på en SDS-polyacrylamidgel (SDS-PAGE) 31. Juster procentdelen af gelen efter størrelsen af proteiner, der skal analyseres.
Bemærk: 10% acrylamidgel giver en bred vifte af separation og er godt som en første tilnærmelse. - Overfør proteiner til membranen som i standard immunoblotanalyse 27 til styring af isolation effektivitet (figur 1C). Pletten med enten Coomassie Blue R250 eller sølvfarve før massespektrometrianalyse.
Bemærk: Sølvfarvning er det foretrukne valg, fordi det er mere følsom og giver en bedre detektion (Figur 1B). Farvning kan ske med enten manuelt fremstillede opløsninger eller kommercielle kit. Inkubationstiden af gelen i den endelige farveopløsning skal bestemmes ved forsøg. Lange inkubationstid kan afsløre lave rigelige proteiner, men kan forårsage højt udtrykte proteiner, såsom MS2-CP-SBP-GFP at være over farves og kan maskere omgivende proteiner i deres nærhed. Derudover kan der opstå en høj baggrund. Følg reaktionen omhyggeligt, og tilføje Stop Solution på et passende tidspunkt. - Klip bands fra gelen og overføre dem til 1,5 ml rør. Opbevar prøver ved -20 ° C, eller sende for protein udvinding og trypsin fordøjelse efterfulgt af LC-MS / MS-analyse 32.
- Som alternativ proteom tilgang at udelukke gel separationstrinnet, fordøje eluerede materiale fra trin 1.24, for sålution hjælp trypsin og underlagt LC-MS / MS-analyse 33.
Bemærk: Udeladelse af SDS-PAGE separation forenkler protokollen og øger udbyttet. Dog kan prøver indeholde spor af detergentet NP-40, som inhiberer massespektrometrianalyse. For at overvinde dette problem ved at udføre følgende trin:- Kør protein på SDS-PAGE 31 for 10 - 15 min.
- Skåret ud hele portionen af lane (dvs. hvor proteinerne er placeret).
Bemærk: proteinprøve kan omfatte en signifikant mængde af MS2-CP-SBP protein, der kan sløre signaler af lav hyppighed proteiner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Rapid muliggør isolering af en specifik mål-RNA med dens associerede proteiner. Kritisk for dens succes er at holde RNA intakt så meget som muligt, hvorved der opnås en tilstrækkelig mængde af proteiner. For at bestemme isolation effektiviteten og kvaliteten af RNA, er northern analyse udført (figur 1A). Northern analyse har den fordel, refererer direkte effektiviteten og kvaliteten af hurtige. Således kan de relative mængder af fuld længde og nedbrydningsprodukter bestemmes på en enkelt kørsel. Ribosomale RNA'er (rRNA'er) detekteres let i ethidiumbromidfarvning og manglen på rRNA'er i elueringen prøven fremgår strengheden af oprensning. Den stringens og specificitet oprensningen er yderligere demonstreret ved manglen på et signal af en umærket mRNA i eluering prøver (AKT1 nederste panel). Den tilsyneladende signal i FPR1 lane, der ikke er af størrelsen af AKT1, er et efterladenskab fra præforrige hybridisering med MS2L proben. Den nordlige analyse afslører også, at input-RNA er noget mere nedbrudt i forhold til RNA, der blev oprenset ved varm phenol-protokol (c / o AKT1 probe panel). Dette tilskrives den længerevarende og mere kompliceret Rapid protokol. Desto mindre er en signifikant mængde af fuld længde, mærkede RNA isoleres specifikt som afsløret af det stærke signal i elueringsfraktionen (MS2L probe).
Proteinprøver kan køres på SDS-PAGE og farvet ved sølvfarvning før proteomics analyse (figur 1B). En prøve isoleret fra kontrol, umærkede celler (-MS2L) er nyttigt i skelne uspecifikke foreninger fra RNA-afhængige dem. Derfor er kun bands der er stærkere i den mærkede prøve (+ MS2L) skåret ud af gelen og udtaget til LC-MS / MS. Western-analyse med generelle RBP'er anbefales også at angive effektiviteten af protein co-oprensning (figur1C). Heri anvendte vi Yef3, som er kendt for at interagere med PMP1 20, eller GFP, som angiver den samlede effektivitet og specificitet af isolationen. Interessant effektivitet Yef3 isolation synes at variere mellem PMP1 og FPR1, og er meget lavere i forhold til GFP.
Figur 1. Specifik Isolering af MS2L-mærkede RNA og Identifikation af proteiner. Resultaterne af to forskellige RNA'er, der blev udsat for hurtig (PMP1 og FPR1) præsenteres. (A) Northern blot-analyse af RNA-prøver oprenset fra en hurtig eksperiment. RNA blev kørt på en agarosegel og farvet med ethidiumbromid (øvre panel). Gelen blev blottet til nylonmembran og underkastet hybridisering med de angivne prober (lavere paneler). De analyserede prøver er: fast-celle lysis (varm phenol [trin 1.4]), RaPID cellelysis (input [trin 1.13]), og efter eluering med biotin (eluering [trin 1.24]). (B) Silver plet af proteiner fra Rapid med MS2-kodede og umærkede celler. Proteinprøver fra elueringsfraktioner af MS2-taggede PMP1 (+ MS2L) eller umærket (-MS2L) kontrol blev kørt i SDS-PAGE og sølvfarvet. Bands med differentiale intensitet (angivet med en asterisk) blev skåret ud af gelen og bestemmes ved massespektrometrianalyse. Pilen angiver MS2-CP-GFP-SBP-fusionsprotein, hvilket viser lig protein loading. Irrelevante baner blev beskåret ud for klarhed. (C) Western-analyse af positive kontroller. Western blot med antistoffer, der genkender den Yef3 eller GFP-delen af MS2-CP-fusionsproteinet blev udført. Irrelevante baner blev beskåret ud for klarhed. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Forskellige metoder bruger isolering af specifikke mRNA for at identificere deres associerede proteiner 11,34 35. Disse metoder anvendes in vitro og in vivo strategier til at probe RNA-protein interaktioner. In vitro metoder inkuber eksogent transkriberet RNA med cellelysat at indfange RBP'er og isolere RNP komplekser 36,37. En effektiv tilgang af denne type blev præsenteret for nylig, som gjorde det muligt at identificere nye proteiner, der binder en regulerende RNA motiv 18. En ulempe ved disse metoder er den binding af ikke-specifikke RBP'er fordi foreningen finder sted uden for det cellulære miljø. In vivo metoder, hvor proteiner er tværbundet mens i deres naturlige omgivelser, kan give et bedre billede af RNA-protein forening. Endvidere tværbinding tillader højere stringens under isolering og derfor højere specificitet. Den PAIR tilgang 17 udnytter transfektion af antisensesekvens til mål-RNA'et, for at lede en peptidgruppe til i nærheden af RBP'er. Peptid-RBP'er kan derefter tværbindes og isoleres gennem perlerne, der er knyttet til en sekvens, der er komplementær til antisense-sekvensen. Den PAIR metode er meget fordelagtig på grund af sin enkle anvendelse til mange celletyper uden behov for komplekse genomiske manipulationer. Det er imidlertid afhængig af effektiviteten af transfektion, og tilfælde, hvor en lav procentdel af celler accepterer antisense vil have lav effektivitet. Desuden er isoleringen af RBP-peptid-antisense-sekvens opnås ved magnetiske streptavidinperler, der er koblet med biotinyleret oligonukleotid komplementær til antisense-nukleinsyre. Mangfoldigheden af interaktioner (magnetiske perler, streptavidin-biotin og baseparring) kan begrænse stringens og effektivitet isolation. Den hurtige metode 24 beskrives her giver et alternativ til disse begrænsninger i flere aspekter. Første, than integration af MS2 sløjfer i det genomiske loci sikrer, at alle celler udtrykker det, og dermed øge udbyttet. For det andet, bruger den højaffinitetsinteraktion af MS2-CP-GFP-SBP til tolv MS2 sløjfesekvenser og tillader dem at binde in vivo. Tredje, optagelsen af RNA-protein-interaktion muliggør strengere vaske og reducerer identifikation af ikke-specifikt bundne proteiner. Endelig SBP domæne binder streptavidinkugler med høj affinitet og er let elueres med fri biotin.
Insertion af MS2 loop ind i RNA er tilrådeligt mellem ORF og 3'UTR at minimere translation perturbation og sikre ekspression af alle sløjfer. Seks til 24 MS2 loop repeats blev tidligere anvendt til visualisering af mRNA lokalisering 38-40. , Indsættelse af en lang sekvens af MS2 sløjfer Dog kan give ændringer i behandlingen og struktur af RNA; det kan destabilisere afskrift eller ændre repertoiret af RBP'er bundettil den. Det er vores erfaring, 12 loops er tilstrækkelige til at få en effektiv eluering af MS2-mærkede RNA 20. I den forbindelse kan vi konstatere, at vi normalt observeret yderligere kortere udskrifter i vore nordlige hybridiseringer. Northern analyser med forskellige prober afslørede, at disse kortere former omfattede MS2L og en del af 3'UTR 20, der indikerer for tidlig transkriptionsterminering. Sådanne tilfælde kan reducere effektiviteten af isoleringen af proteiner associeret med 3'-UTR. Derfor bør være afbalanceret antallet af indsatte loops og deres placering i RNA mellem høj effektivitet pull-down og udskrift stabilitet.
RNA'et skal forblive intakt i hele protokollen til muliggøre effektiv isolering og detektion af den maksimale array af bundne proteiner. Chancerne for forurening ekstern RNase kan reduceres ved at bære handsker, sikrer et rent arbejdsområde, forbereder løsning med RNase-frit vand, og arbejder præcistog effektivt at reducere protokol tid. Vi fandt ikke desto mindre, at den største bidragyder til RNA-nedbrydning er frigivelsen af cellulære RNaser til lysatet ved cellelysis. Det blev foreslået, at kryogen slibning af gærceller med en mekanisk mølle resulterer i forbedret RNA oprensning 41. Dette kan blive retsforfulgt i tilfælde, hvor en betydelig nedbrydning observeret med denne protokol.
En fælles ulempe ved pull-down assays er isoleringen af adskillige proteiner, der binder ikke-specifikt til søjlen. Derfor er brugen af en gærstamme med ukodet RNA er en vigtig kontrol. Denne stamme udtrykker MS2-CP-GFP-SBP fusionsproteinet til yderligere udelukke proteiner, der binder til fusionsproteinet og ikke mål-RNA'et. Vi bemærker, at dette ikke udelukker proteiner, der kan binde MS2 loop selv, og disse må yderligere validering med proteinet pull-down assay. Figur 1B viser, at vi var i stand til at identificere adskillige proteiner, der binderspecifikt til PMP1 mRNA, og nogle blev efterfølgende valideret af en co-IP assay 20.
Den hurtige metode er i øjeblikket begrænset til gær-systemer, udnytte sine veletablerede stedspecifikke integration metoder. Stedspecifikke integration protokoller er i øjeblikket ved at blive udviklet til gener i andre systemer ved hjælp af CRISPR-Cas-system 42,43. Disse vil være af stor betydning i at udvide anvendelsen af RAPID til andre systemer. En anden fremtidig anvendelse af Rapid til isolering af RNA, der er forbundet med en mRNA af interesse. Dette kan let opnås, ved at underkaste den isolerede materiale til RNA-seq stedet LC-MS / MS. I betragtning af de vigtige roller af små RNA i regulering af mRNA-ekspression, denne ansøgning er sandsynligvis være af stor betydning. Endelig forbedringer i massespektrometri (MS) analyse og anvendelse af kvantitative MS-metoder såsom SILAC vil resultere i kvantitativt mål for mRNA-bundne Proteins under forskellige forhold. Rapid kan anvendes med gær dyrket i medier beriget med tunge isotoper og sammenlignet med celler dyrket under forskellige betingelser (f.eks stress) med umærkede medier 44,45. Anvendelse af den hurtige metode sammen med kvantitativ MS-analyse vil give nøjagtige mål for ændringer i RBP repertoire, der er forbundet med en bestemt mRNA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Vi takker professor Jeff Gerst og Boris Slobodin for deres nyttige råd i opsætning af den hurtige protokol og tilvejebringe de nødvendige plasmider. Vi takker også Dr. Avigail Atir-Lande for hendes hjælp med at etablere denne protokol og Dr. Tamar Ziv fra Smoler Proteomics Center for hendes hjælp med LC-MS / MS-analyse. Vi takker Prof. TG Kinzy (Rutgers) for YEF3 antistof. Dette arbejde blev støttet af bevilling 2011013 fra Binational Science Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tris | sigma | T1503 | |
| SDS | bio-lab | 1981232300 | |
| DTT | sigma | D9779 | |
| Acidic Phenol (pH 4.3) | sigma | P4682 | |
| Acidic Phenol: Chloroform (5:1, pH 4.3) | sigma | P1944 | |
| Chloroform | bio-lab | 3080521 | |
| Formaldehyde | Frutarom | 5551820 | |
| Glycine | sigma | G7126 | |
| NP-40 | Calbiochem | 492016 | |
| Heparin | Sigma | H3393 | |
| Phenylmethylsulfonyl Flouride (PMSF) | Sigma | P7626 | |
| Leupeptin | Sigma | L2884 | |
| Aprotinin | Sigma | A1153 | |
| Soybean Trypsin Inhibitor | Sigma | T9003 | |
| Pepstatin | Sigma | P5318 | |
| DNase I | Promega | M610A | |
| Ribonuclease Inhibitor | Takara | 2313A | |
| Glass Beads | Sartorius | BBI-8541701 | 0.4-0.6mm diameter |
| Mini BeadBeater | BioSpec | Mini BeadBeater 16 | |
| Guanidinium | Sigma | G4505 | |
| Avidin | Sigma | A9275 | |
| Streptavidin Beads | GE Healthcare | 17-5113-01 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A7906 | |
| Yeast tRNA | Sigma | R8508 | |
| Biotin | Sigma | B4501 | |
| Yeast extract | Bacto | 288620 | |
| peptone | Bacto | 211677 | |
| Glucose | Sigma | G8270 | |
| 1x Phosphate-Buffered saline (PBS) | |||
| 0.2 M NaOH | |||
| 4x Laemmli Sample Buffer (LSB) | 0.2 M Tris-Hcl pH 6.8, 8% SDS, 0.4 M DTT, 40% glycerol, 0.04% Bromophenol-Blue. | ||
| Hot phenol lysis buffer | 10 mM Tris pH 7.5, 10 mM EDTA, 0.5% SDS | ||
| 3 M Sodium Acetate pH 5.2 | |||
| 100% and 70% Ethanol (EtOH) | |||
| RNase-free water | |||
| RaPID lysis buffer | 20 mM Tris pH 7.5, 150 mM NaCl, 1.8 mM MgCl2, 0.5% NP-40, 5 mg/ml Heparin, 1 mM Dithiothreitol (DTT), 1 mM Phenylmethylsulfonyl Flouride (PMSF), 10 µg/ml Leupeptin, 10 µg/ml Aprotinin, 10 µg/ml Soybean Trypsin Inhibitor, 10 µg/ml Pepstatin, 20 U/ml DNase I, 100 U/ml Ribonuclease Inhibitor. | ||
| 2x Cross-linking reversal buffer | 100 mM Tris pH 7.4, 10 mM EDTA, 20 mM DTT, 2 % SDS. | ||
| RaPID wash buffer | 20 mM Tris-HCl pH 7.5, 300 mM NaCl, 0.5% NP-40 | ||
| 0.5 M EDTA pH 8 | |||
| Silver Stain Plus Kit | Bio-Rad | 161-0449 | For detecting proteins in polyacrylamide gels |
| SD selective medium | 1.7 g/l Yeast nitrogen base with out amino acids and ammonium sulfate, 5 g/l Ammonium sulfate, 2% glucose, 350 mg/l Threonine, 40 mg/l Methionine, 40 mg/l Adenine, 50 mg/l Lysine, 50 mg/l Tryptophan, 20 mg/l Histidine, 80 mg/l Leucine, 30 mg/l Tyrosine, 40 mg/l Arginine | ||
| Anti-eEF3 (EF3A,YEF3) | Gift from Kinzy TG. (UMDNJ Robert Wood Johnson Medical School) | 1:5,000 | |
| Anti GFP antibody | Santa Cruz | sc-8334 | 1:3,000 |
| Anti rabbit IgG-HRP conjugated | SIGMA | A9169 | 1:10,000 |
References
- Hogan, D. J., Riordan, D. P., Gerber, A. P., Herschlag, D., Brown, P. O. Diverse RNA-binding proteins interact with functionally related sets of RNAs, suggesting an extensive regulatory system. PLoS Biol. 6, e255 (2008).
- Tsvetanova, N. G., Klass, D. M., Salzman, J., Brown, P. O. Proteome-wide search reveals unexpected RNA-binding proteins in Saccharomyces cerevisiae. PloS One. 5, (2010).
- Castello, A., et al. Insights into RNA biology from an atlas of mammalian mRNA-binding proteins. Cell. 149, 1393-1406 (2012).
- Gerstberger, S., Hafner, M., Tuschl, T. A census of human RNA-binding proteins. Nat Rev Genet. 15, 829-845 (2014).
- Baltz, A. G., et al. The mRNA-bound proteome and its global occupancy profile on protein-coding transcripts. Mol Cell. 46, 674-690 (2012).
- Mitchell, S. F., Parker, R. Principles and properties of eukaryotic mRNPs. Mol Cell. 54, 547-558 (2014).
- Licatalosi, D. D., Darnell, R. B. RNA processing and its regulation: global insights into biological networks. Nat Rev Genet. 11, 75-87 (2010).
- Eliyahu, E., Lesnik, C., Arava, Y. The protein chaperone Ssa1 affects mRNA localization to the mitochondria. FEBS Lett. 586, 64-69 (2012).
- Ascano, M., Gerstberger, S., Tuschl, T. Multi-disciplinary methods to define RNA-protein interactions and regulatory networks. Curr Opin Genet Dev. 23, 20-28 (2013).
- Denman, R. B. mRNPs take shape by CLIPPING and PAIRING. BioEssays. 28, 1132-1143 (2006).
- McHugh, C. A., Russell, P., Guttman, M. Methods for comprehensive experimental identification of RNA-protein interactions. Genome Biol. 15, 203 (2014).
- Bernstein, D. S., Buter, N., Stumpf, C., Wickens, M. Analyzing mRNA-protein complexes using a yeast three-hybrid system. Methods. 26, 123-141 (2002).
- SenGupta, D. J., et al. A three-hybrid system to detect RNA-protein interactions in vivo. Proc Natl Acad Sci USA. 93, 8496-8501 (1996).
- Yosefzon, Y., et al. Divergent RNA binding specificity of yeast Puf2p. RNA. 17, 1479-1488 (2011).
- Mitchell, S. F., Jain, S., She, M., Parker, R. Global analysis of yeast mRNPs. Nat Struct Mol Biol. 20, 127-133 (2013).
- Zielinski, J., et al. In vivo identification of ribonucleoprotein-RNA interactions. Proc Natl Acad Sci USA. 103, 1557-1562 (2006).
- Bell, T. J., Eberwine, J. Live Cell Genomics: RNA Exon-Specific RNA-Binding Protein Isolation. Methods Mol Biol. 1324, 457-468 (2015).
- Leppek, K., Stoecklin, G. An optimized streptavidin-binding RNA aptamer for purification of ribonucleoprotein complexes identifies novel ARE-binding proteins. Nucleic Acids Res. 42, e13 (2014).
- Slobodin, B., Gerst, J. E. A novel mRNA affinity purification technique for the identification of interacting proteins and transcripts in ribonucleoprotein complexes. RNA. 16, 2277-2290 (2010).
- Samra, N., Atir-Lande, A., Pnueli, L., Arava, Y. The elongation factor eEF3 (Yef3) interacts with mRNA in a translation independent manner. BMC Mol Biol. 16, 17 (2015).
- Loya, A., et al. The 3'-UTR mediates the cellular localization of an mRNA encoding a short plasma membrane protein. RNA. 14, 1352-1365 (2008).
- Haim-Vilmovsky, L., Gadir, N., Herbst, R. H., Gerst, J. E. A genomic integration method for the simultaneous visualization of endogenous mRNAs and their translation products in living yeast. RNA. 17, 2249-2255 (2011).
- Eldad, N., Yosefzon, Y., Arava, Y. Identification and characterization of extensive intra-molecular associations between 3'-UTRs and their ORFs. Nucleic Acids Res. 36, 6728-6738 (2008).
- Slobodin, B., Gerst, J. E. RaPID: an aptamer-based mRNA affinity purification technique for the identification of RNA and protein factors present in ribonucleoprotein complexes. Methods Mol Biol. 714, 387-406 (2011).
- Schmitt, M. E., Brown, T. A., Trumpower, B. L. A rapid and simple method for preparation of RNA from Saccharomyces cerevisiae. Nucleic Acids Res. 18, 3091-3092 (1990).
- Eldad, N., Arava, Y. A ribosomal density-mapping procedure to explore ribosome positions along translating mRNAs. Methods Mol Biol. 419, 231-242 (2008).
- Arava, Y., Seger, R., Fbeta Walker, M. D. GRFbeta, a novel regulator of calcium signaling, is expressed in pancreatic beta cells and brain. J Biol Chem. 274, 24449-24452 (1999).
- Arava, Y., Adamsky, K., Ezerzer, C., Ablamunits, V., Walker, M. D. Specific gene expression in pancreatic beta-cells: cloning and characterization of differentially expressed genes. Diabetes. 48, 552-556 (1999).
- Bavli-Kertselli, I., Melamed, D., Bar-Ziv, L., Volf, H., Arava, Y. Overexpression of eukaryotic initiation factor 5 rescues the translational defect of tpk1w in a manner that necessitates a novel phosphorylation site. FEBS J. 282, 504-520 (2015).
- Eliyahu, E., Melamed, D., Arava, Y. Genome-wide analysis of RNA extracted from isolated mitochondria. Methods Mol Biol. 714, 287-299 (2011).
- Brunelle, J. L., Green, R. One-dimensional SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (1D SDS-PAGE). Methods Enzymol. 541, 151-159 (2014).
- Gundry, R. L., et al. Preparation of proteins and peptides for mass spectrometry analysis in a bottom-up proteomics workflow. Current protocols in molecular biology. Chapter 10, Unit 10.25 (2009).
- Medzihradszky, K. F. In-solution digestion of proteins for mass spectrometry. Methods Enzymol. 405, 50-65 (2005).
- Bachler, M., Schroeder, R., von Ahsen, U. StreptoTag: a novel method for the isolation of RNA-binding proteins. RNA. 5, 1509-1516 (1999).
- Oeffinger, M. Two steps forward--one step back: advances in affinity purification mass spectrometry of macromolecular complexes. Proteomics. 12, 1591-1608 (2012).
- Ross, A. F., Oleynikov, Y., Kislauskis, E. H., Taneja, K. L., Singer, R. H. Characterization of a beta-actin mRNA zipcode-binding protein. Mol Cell Biol. 17, 2158-2165 (1997).
- Deshler, J. O., Highett, M. I., Schnapp, B. J. Localization of Xenopus Vg1 mRNA by Vera protein and the endoplasmic reticulum. Science. 276, 1128-1131 (1997).
- Bertrand, E., et al. Localization of ASH1 mRNA particles in living yeast. Mol Cell. 2, 437-445 (1998).
- Aizer, A., et al. Quantifying mRNA targeting to P-bodies in living human cells reveals their dual role in mRNA decay and storage. J Cell Sci. 127, 4443-4456 (2014).
- Gadir, N., Haim-Vilmovsky, L., Kraut-Cohen, J., Gerst, J. E. Localization of mRNAs coding for mitochondrial proteins in the yeast Saccharomyces cerevisiae. RNA. 17, 1551-1565 (2011).
- Lopez de Heredia,, M,, Jansen, R. P. RNA integrity as a quality indicator during the first steps of RNP purifications : a comparison of yeast lysis methods. BMC Biochem. 5, 14 (2004).
- Lee, J. S., Kallehauge, T. B., Pedersen, L. E., Kildegaard, H. F. Site-specific integration in CHO cells mediated by CRISPR/Cas9 and homology-directed DNA repair pathway. Sci Rep. 5, 8572 (2015).
- Auer, T. O., Duroure, K., De Cian, A., Concordet, J. P., Del Bene, F. Highly efficient CRISPR/Cas9-mediated knock-in in zebrafish by homology-independent DNA repair. Genome Res. 24, 142-153 (2014).
- Oda, Y., Huang, K., Cross, F. R., Cowburn, D., Chait, B. T. Accurate quantitation of protein expression and site-specific phosphorylation. Proc Natl Acad Sci USA. 96, 6591-6596 (1999).
- de Godoy, L. M. SILAC yeast: from labeling to comprehensive proteome quantification. Methods Mol Biol. 1156, 81-109 (2014).
