Summary
私たちは、塩化第二鉄（FeCl 3を）の洗練された手順は、頸動脈や腸間膜動脈ならびに静脈に血栓症モデルを誘発血栓形成を閉塞性までの時間を監視するために生体顕微鏡を用いて、効率的特徴を報告しています。
Introduction
動脈血栓症（血の塊）は、アテローム性動脈硬化症、糖尿病、肥満、癌および慢性自己免疫リウマチ性疾患などの慢性炎症に関連する多くの全身性疾患の一般的な合併症です。不適切な血小板活性化、凝集及びその後の凝固機構から動脈循環ステムで発生し、血栓は、心臓発作、脳卒中及び四肢の喪失に関与しています。血管壁は、血管壁内の血液細胞、ホルモンおよびサイトカイン、ならびに抗酸化タンパク質の発現を循環する、複数の細胞型を含み、剪断応力を含む外因性の要因の多くに影響される複雑なシステムである。 インビトロ実験は複製できませんこの複雑な環境、従って、動物モデルを用いたin vivo試験では、血栓性疾患に関与するメカニズムのより良い理解を可能にするために重要です。
マウスは、シムを有することが示されています血栓症、アテローム性動脈硬化症、炎症および糖尿病1,2の点でヒトへのILARメカニズム。さらに、トランスジェニックおよびノックアウトマウスは、複雑な生理学的または病理学的環境の特定の遺伝子産物の機能をテストするために作成することができます。このような研究は、ヒト病理を模倣し、新たな経路および治療法の発見に関連する重要な機構的情報を提供するだけでなく、血栓症に対する薬物の効果を特徴づける重要な詳細を提供することができます。
病的な動脈血栓は、内皮下マトリックス3,4への血流の層損傷または機能不全と露出を内皮に起因起こります。種々の血栓症モデルは、機械的損傷、光反応性化合物ローズベンガルベースの酸化損傷およびレーザー損傷5として内皮損傷を誘導するために開発されてきました。このスペクトルでは、塩化第二鉄（FeCl 3を）は、血管損傷は血栓症の広く使用されているモデルである誘発しました。この試薬とき容器の外側の側面に適用され、血小板および凝固カスケードの成分を循環から内皮細胞の保護の損失、血管細胞6-8の酸化的損傷を誘発します。 FeCl 3モデルは、単純かつ抗凝固剤および抗血小板薬の両方に対して敏感であり、マウス、ラット、モルモット及びウサギ6-15に頸動脈及び大腿動脈、頸静脈、および腸間膜および精巣挙筋細動脈と細静脈上で実行されています。
このモデルにおける一つの測定可能なパラメーターは、ドップラー流量計または生体顕微鏡の6,7,9と直接観察下血流停止として測定し、血管閉塞を完了するために損傷からの経過時間です。 5〜30分の間の時間の範囲は、FeCl 3を濃度が、麻酔、外科技術、マウスの年齢の種類、ゲノム背景、Bを測定する方法を示唆し、C57BL6マウス7-10,16異なる研究で報告されていますloodフロー、および他の環境変数は、このモデルにおいて有意な効果を有します。この広い可変性は、それが困難な異なる研究グループからの研究を比較することになり、微妙な差異の検出が困難になることができます。
このような変動性を最小化し、 生体内のモデル系で均一に再現性を確立するためのビジョンでは、我々は最小限の変動6-10,16-19と再現性の高いデータを作成するのFeCl 3 -誘発性頚動脈モデルに磨きをかけてきました。本稿では説明し、スキルを共有し、このモデルの恩恵を受けることができるいくつかの代表的な実験例を報告しています。
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Protocol
動物のすべての手順や操作は、 動物の愛護管理と使用上のアメリカ公衆衛生局政策 、およびケアのための NIH ガイドに従ってクリーブランドクリニックの施設内動物管理使用委員会（IACUC）によって承認されており、実験動物の使用 。
1.準備：
- ラベリング血小板のための蛍光色素
- 生理食塩水で、ローダミン6G溶液を、0.5 mg / mlとを準備し、0.22μmフィルターで溶液を滅菌します。
- FeCl 3溶液
- 30％のFeCl 3の新鮮なストック溶液を作る（無水、1.85 Mに等しい）、純水であり、0.45μmのフィルターでろ過します。により5ミリリットルを所望の濃度の新鮮なのFeCl 3溶液[ 例えば、2.5％（0.154 M）、5％（0.308 M）、7.5％（0.463 M）、10％（0.617 M）、12.5％（0.771 M）]を準備します水の私と30％のFeCl 3溶液を希釈6cm組織培養皿NA及び蓋を保つを閉じます。
注：培養皿を使用しては、簡単にそのような1.5mlの微小管として、狭いコンテナからそれを拾うするよりものFeCl 3溶液で飽和濾紙をピックアップすることができます。 FeCl 3は非常に危険であり、そのような手袋や白衣などを身に着けているような予防措置、保護具は、常に注意しなければならないこと。
- 30％のFeCl 3の新鮮なストック溶液を作る（無水、1.85 Mに等しい）、純水であり、0.45μmのフィルターでろ過します。により5ミリリットルを所望の濃度の新鮮なのFeCl 3溶液[ 例えば、2.5％（0.154 M）、5％（0.308 M）、7.5％（0.463 M）、10％（0.617 M）、12.5％（0.771 M）]を準備します水の私と30％のFeCl 3溶液を希釈6cm組織培養皿NA及び蓋を保つを閉じます。
- フィルターペーパー
- 1ミリメートル×2ミリメートルの大きさにろ紙をカットします。同じ皿の中のFeCl 3溶液中でカットフィルタ紙の十分な部分を浸します。
- パパベリン塩酸ソリューション
- 水にパパベリン塩酸塩溶液（25 mg / mlで）を調製し、0.22μmのフィルターで溶液を滅菌します。
- アガロースゲル
- 、6ウェル組織培養プレートに2％アガロースPBS中のゲルまたは生理食塩水を調製〜1cmの厚さ、およびc2〜3センチ径の半円形にユタ。
2.のFeCl 3誘発性頚動脈動脈損傷血栓症モデル
- 血栓症モデルのための外科的処置
- 12週齢のC57BL6マウス（または他の系統必要に応じて） - 8を使用してください。腹腔内注射を介して、ケタミン（100ミリグラム/キログラム）/キシラジン（10mg / kg）の混合物を用いてマウスを麻酔。つま先のピンチによって麻酔の深さを確認してください。
注：ケタミン/キシラジンのこの量は、少なくとも1時間安定した麻酔で動物と痛みなし（ピンチつま先への応答）を保持するのに十分です。 - 小動物電気バリカンで首と胸の上部に毛皮を削除してください。脱毛クリームは必要ありません。麻酔中の乾燥を防ぐために、目に中立石油眼軟膏を適用します。
- 15cmの組織培養プレートの蓋の上仰臥位でマウスを固定します。ヒンを確保するために、1つの長いテープ（約10センチ）を使用しますD手足や下半身、そして前足を確保するために小さなテープ（2センチメートル×0.5センチ）の2枚。切歯を包み込む4-0縫合糸を使用し、マウスの首をまっすぐ（ 図2）を維持するために蓋に縫合糸の両端をテープで固定します。
- 外科的な光源下でオペレータに向かってマウスヘッドとプレートを置きます。
- アルコールパッドで手術部位を滅菌します。 （ - 3ミリメートル2）皮膚を保持し、小さな切開を作るために手術用ハサミを使用するマイクロAdson鉗子を使用してください。
- 鉗子で切開部の皮膚を持ち、ジョーが切開部に閉じた状態で手術用はさみを挿入します。胸骨柄やあごに向かって皮下にはさみを押し、皮下層から肌を解放するためにハサミを開きます。
- 舌骨のレベル（ 図3Aおよび3B）に胸骨柄から正中切開を作るために手術用ハサミで皮膚をカット。ぶっきらぼうに細い筋膜（点線を、解剖
注：胸骨柄（ 図3C中の黒矢印）と気管（ 図3CにおけるT）は、この工程の後に見られます。 - 軟組織とグレーフェの鉗子で胸骨柄の右側に見られる皮膚を持ち、2時位置（ 図3C中の黄色の点線 ）に向けて筋膜下に止血剤を挿入し、解放するために止血鉗子の顎を開きます周辺組織から頸静脈。
- 右頸静脈（ 図3D、矢印 ） を露出させる手術用ハサミで2時の位置（ 図3C）に向かって筋膜、軟組織および皮膚をカット。
- 22 G針で1ミリリットル注射器を用いて300μlのローダミン6G溶液、およびその後の変化 - 約200を描きますそれに30 G針。
注：これは、その微細な先端の損傷から30 G針を保護します。直接チップを損傷することはありません30 G針を有するローダミン6Gソリューションを描きます。しかし、誤って容器の壁をタッチすると、注入が困難になる可能性がある、破損の原因となります。 - ゆっくりとローダミン6G液を押し出すことにより、30 G針をフラッシュし、空気の泡が注射器や針に残っていないことを確認してください。注射のための100μlのローダミン6Gのソリューションをしてください。
- ベンド2 -頸静脈への深すぎる針を挿入防止し、より容易に制御（ 図3D）の注入を行います針ホルダと90°の角度に針の3ミリメートルの先端。
- 血小板を標識するために、右頸静脈にローダミン6G液を注入します。 injection.Af中に別の手でグレーフェの鉗子で片手での注射器と針を保持し、注射器を安定させた位置に針を維持するために、ター注入、出血を避けるためにグレーフェの鉗子で注射部位をクランプします。
- 止血剤の顎を開き、注射部位の血管壁をクランプするグレーフェ鉗子の下でそれを挿入し、6-0縫合糸で注射部位を連結。
注：ステップ2.1.15の代替として、出血を停止します2分間指で注射部位に圧力を加えます。しかしながら、この方法は、さらに、原因注射部位における凝血塊が誤って削除された場合、出血の危険性を有しています。 - ぶっきらぼうに止血剤とグレーフェの鉗子で左顎下腺の周りの軟部組織および筋膜を分析し、左胸鎖乳突筋（ 図3Eの青い矢印）を露出させるために7時の位置（ 図3E）に向かって腺を引きます。
- ぶっきらぼうに左胸鎖乳突筋と肩甲舌骨筋またはsternohy間の筋膜（ 図3E、点線）を解剖止血剤と気管の左サイトにあるoidの筋肉（ 図3E、緑の矢印 ）。
- 胸鎖乳突筋（ 図3Eの青い矢印）の中央下に6-0絹縫合糸（約15センチ）で針を渡し、一緒に縫合糸の両端を入れて、10時の位置に向かって横方向に縫合糸を引っ張ります。
注：この手順は、胸鎖乳突筋の外側に配置されている左頸静脈の損傷を避けるために慎重に行われるべきです。 - ぶっきらぼうに胸鎖乳突筋を引き離した後、頸動脈（CA）（ 図3Fの矢印）を露出させるために、薄い胸骨舌骨筋および/ または肩甲舌骨筋を分離します。必要に応じて胸骨舌骨筋および/または肩甲舌骨筋をカット。 CAを触れることなく、CAから軟組織を分離するために止血剤を使用して、
注：CAは、迷走神経を伴っている、に見られる白い構造 - 迷走神経およびCAを回避しながら、CAの周りに横方向の筋膜を拾うために先端の細いピンセットを使用してCAと迷走神経の間の筋膜に穴をパンチするために、別の先端の細いピンセットを使用してください。
- 穴からフックをパスし、優しくCAを持ち上げ、その後、CAの下に先端の細い鉗子を置きます外膜軟部組織を除去するためにCAに沿って反対方向にフック鉗子を移動します。周囲の組織からのCA（ 図3H、青い矢印 ）の無料少なくとも〜5ミリメートルの長さ。
- フラットに黒いプラスチック製のコーヒースターラーの端を押して、バックグラウンド蛍光をブロックするには、3ミリメートル片にコーヒー攪拌機をクロスカットを入れ、その後、「U」字状のプラスチック（ 図3H、緑の2枚を取得するために倍の縁に沿って縦方向に切断矢印 ）。
- 12週齢のC57BL6マウス（または他の系統必要に応じて） - 8を使用してください。腹腔内注射を介して、ケタミン（100ミリグラム/キログラム）/キシラジン（10mg / kg）の混合物を用いてマウスを麻酔。つま先のピンチによって麻酔の深さを確認してください。
- 顕微鏡ステージに一緒にマウスとプレート蓋を移し、10×水レンズの下で適切な位置に配置します。 10Xレンズと生理食塩水とCAとの間の空間を満たします。
- デジタルビデオ録画ソフトウェアアプリケーションを起動し、新しいファイルを起動し、それに応じて名前を付けます。正常な血管の画像を記録し、録画が停止されたときにフレーム番号を書き留めます。
注：記録のために、コンピュータにビデオ録画ソフトウェアを参照します。我々は、デジタルビデオ記録ソフトウェアを使用して、以下の説明は、本出願に基づいています。
注：機械TRAので、UMAは、内皮を損傷し、血栓形成20をもたらすことができる、前のFeCl 3損傷に対する血管壁への外科的損傷がないことを確認する必要があります。障壁を形成し、のFeCl 3誘発性損傷の影響を弱めることができるCAの周りに残存組織が 存在しないことを確認することも必要です。それは簡単に後からの経過時間に従ってビデオを分析することになりますレコードのフレーム番号を書き留めます。 - 10Xレンズのうち、プレートのふたでマウスを移動します。薄くて微細なチップを作り、慎重にCAの周囲に生理食塩水（CAには手を触れないでください）ならびに外科的分野の他の場所でブロットするためにそれを使用するためにペーパータオルの角を折ります。これは、使用のFeCl 3溶液の希釈を回避することが重要です。
- 先端の細いピンセットを使用してのFeCl 3溶液で飽和フィルター紙をピックアップし、CA上で直接それを置き、1分間のサイトにそれを維持します。
注：TO血流や収穫正確なデータの援助の可視化は、近くに露出したCA（ 図3I）の先端部にろ紙を置き、後半で血液の流れを観察する（ 図3Iの緑色の矢印 ） が近位のサイトで短いセグメントを残します相（下記参照）。 - ろ紙を取り外します（この時点を「損傷後」の開始として定義される）および食塩水（少なくとも2ミリリットル）でCAをすすぎます。
- バック10Xレンズへのプレートのふたでマウスを置きます。血管を観察したビデオ画像を記録し始めます。記録の最初の分の終わりにビデオフレーム番号を書き留めます。
注：血栓形成は、コンピュータ画面上または顕微鏡下でリアルタイムビデオ画像で観察される蛍光性血小板の蓄積によって識別されます。録画ビデオ画像すぐに戻って顕微鏡下でマウスを入れました。 Fを除去した後に最初の分の最後に記録を保管してくださいILTER紙。さらにイメージングのために（通常は損傷領域の中心である）傷害に関する情報を取得するために、遠位から近位のサイトに容器全体を観察し、その後、関心のある領域に焦点を当てます。 - 10秒最初の10分の実験の終了まで（ 例えば、3時05分に午前2時55分）した後、10秒ごとに他の分毎分のレコードビデオ画像。各記録が停止されたときにフレーム番号を書き留めます。
注：モデルのエンドポイントは、1）血流が> 30秒間停止したとき。または2）閉塞は損傷後30分で見られていない場合。この場合には、統計分析のために30分を使用します。初めに10ミリ秒のようにビデオ記録の露光時間を設定するので、血栓の上の血流を観察することが容易になります。血栓が大きくなると蛍光は、カメラのセンサーを飽和させる場合には、血栓上の血流を特定することが困難になります。この問題を解決するために、撮像CEを移動血流がまだ明確に観察することができる近位無傷のサイト（ 図3I、緑の矢印）にNTER。近位の非損傷部位に着目すると血流がより鮮明に観察することができるように、我々はまた、15または20ミリ秒に公開する時間を増やします。血流が停止する場合には、多数のより大きな細胞（白血球）は、血栓の近位の部位で血管壁に転がり始めます。大きな細胞の出現後3分 - フローは通常2以内に停止します。それが変更された場合、記録用紙に時間を公開書き留めます。正常な野生型C57BL6マウスを使用した場合には、通常、麻酔から実験の最後に約30分を要します。
注意注記：正確なデータを与えることはありません、それは露光時間によって影響され、血流停止の印として白集約血小板血栓を使用しないでください。白い血塊は血管内腔を覆っ血流が（代表ビデオ1を参照）を中止したという意味ではありません。
3.のFeCl 3誘発性腸間膜動脈/静脈血栓症モデル
- セクション2.1.1で述べたように12週齢のC57BL6マウス - 8を麻酔。麻酔中の乾燥を防ぐために、目に獣医軟膏を適用します。
- 腹腔内に腸の蠕動運動を抑制するためにパパベリン溶液（合計0.4ミリグラム/マウス）を注入します。
- 動物電気バリカンで首と腹部に毛皮を削除してください。脱毛クリームは必要ありません。
- 15cmの組織培養プレートの蓋の上仰臥位でマウスを固定します。すべての足を確保するために、小さなテープ（2センチメートル×0.5センチ）の4個を使用してください。切歯を包み込むように4 -0縫合糸を使用し、ネックストレート（ 図2）を維持するために蓋に縫合糸の両端をテープで固定します。
- 手順2.1.4に従ってください -2.1.15ラベル血小板へローダミン6Gの注入のための頸静脈を露出させます。
- 剣状突起から手術用はさみ（ 図4A）を使用して、腹部下に皮膚を通して正中切開を行います。 （とも呼ばれる白線は、 図4A、矢印）が明らかであるとない血管を持っていないグレーフェのピンセットでは、約2持ち上げる途中腹膜を拾う- 、切断線下では腸を確認しない、3ミリメートル高いとオープン腹膜をカット縦方向に微細なハサミ（ 図4B）で。
- 右側臥位にマウスを再固定します。腹部に近い半円形のアガロースゲルを置き、静かに腸を体外に出すとグレーフェ鉗子（ 図4C）でゲルの上に広げました。血栓症の実験（ 図4C、矢印 ）のための第二の枝を使用してください。
注：腸を体外に出すのを助けるために止血鉗子やマイクロAdson鉗子を使用してください。傷つけないでください腸や血管。 - 腸や血管の水分を保つために6滴の生理食塩水 - 5を配置します。顕微鏡のステージに一緒にプレートの蓋でマウスを移し、10×ドライレンズの下の適切な位置に配置します。
注：空回腸膜は生理食塩水を保持することはできませんので、ドライレンズを使用してください。湿ったそれらを保つためにさらされた組織に生理食塩水をドロップすることを確認します。 - 治療前腸間膜動脈と静脈の周囲に生理食塩水を吸い取ります。
- 12.5％のFeCl 3溶液で飽和フィルター紙をピックアップし、1分（ 図4D）のための腸間膜動脈と静脈の上に直接に配置する先端の細いピンセットを使用します。ろ紙を削除し、生理食塩水で負傷した腸間膜動脈と静脈をすすぎ（少なくとも2ミリリットル）（この時点は、「傷害後」の開始として定義されます）。
- 10X乾燥レンズの下背板のふたでマウスを置きます。血管を観察し、RECを開始ORD映像2.2で述べたように）。
注：この実験のエンドポイントは、1）血流が> 30秒間停止したとき。または2）閉塞が損傷後30分では見られない場合は、この場合、統計分析のために30分を使用します。 - 実験の最後に、息と心臓の鼓動が確認されていない後に頸椎脱臼に続いて過剰摂取ケタミン/キシラジン（20分の200ミリグラム/キログラム）を使用して、マウスを安楽死させます。
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Representative Results
頸動脈血栓症モデル
C57BL6背景を持つマウスでは、我々は出発点として、1分間血管を治療するために、7.5％のFeCl 3を使用することをお勧めします。 7.5％のFeCl 3の治療の下で、負傷したエリアと通常の血管壁の境界を容易に内皮層が著しく破損していたことを示唆している、（ オンラインビデオ1を参照してください）顕微鏡下で識別されます。血栓は、FeCl 3を治療直後に形成され、1分損傷後のすべてのWT C57BL6マウスにおいて観察されます。最初に形成された血栓は不安定であり、それらの部品は、通常、血流によって洗い流さ、このように形成された血栓が2で小さくなっている - 損傷後3分。ろ紙を除去した後、4分およびこれらの後に形成された血栓は安定しており、通常は洗い流されていません - 血栓は3からすると拡大し始めます。平均閉塞時間は、ときに7.5％FのC57BL6マウス（n = 14）で11.3±3.16分ですECL 3は、6,7,19（ 図5Aおよびオンラインビデオ1）に使用されています。以前の研究では減少とのFeCl 3濃度の増加の両方が抗血栓マウス株およびWTマウス6の違いを減少させることを実証しました。私たちの経験から、1分間7.5％のFeCl 3と頸動脈の治療は、我々の目的のすべてを満たすのに十分です。ノックアウトマウスを7,8,16,19,21を使用して、特定の遺伝子のテスト機能に加えて、以下では、このモデルを使用して、4つの代表的な実験です。
組織型プラスミノーゲン活性化因子媒介血栓溶解療法の静脈内灌流
組織型プラスミノーゲン活性化因子（tPA）は、米国22における血栓溶解治療のためのFDA承認薬の一つです。そこで我々は、頸動脈血栓症モデルでのtPA媒介血栓溶解を観察しました。血栓症はありました7.5％のFeCl 3で開始し、のtPA（1ミリグラム/ kg体重）を5分間形成させ、頚静脈カテーテル（22GA）を介して灌流しました。 図5（b）とオンラインビデオ2に示すように、血栓が継続的に拡大し、損傷後の内腔5分の約50％を占めていました。血栓はTPAは、血小板活性化および凝集に影響を及ぼさないことを示唆したtPA灌流後に拡大し続けました。血栓溶解は、約4分のtPA注入後に開始しました。形成された血栓を、30分間の観察期間中に繰り返し寸法変化を受けることが見出され、いかなる血管閉塞は、この場合には起こりませんでした。これらのデータは、TPAは完全には血栓溶解につながる場合であっても、血小板媒介血栓形成を阻害することができないことを示しました。したがって、我々は、FeCl 3を誘導動脈血栓症モデルを用いた将来の実験は顕著PREVを有することができ、血栓溶解及び他の補助的療法を評価するために利用され得ることを想定します血栓形成にentative効果。
マウスへのPAR4抗体の灌流は、血栓症を阻害します
プロテアーゼ活性化受容体4（PAR4）のN末端 細胞外ドメイン23のタンパク質分解切断によって活性化し、続いて血小板活性化のステップにつながる血小板上のGタンパク質共役受容体（GPCR）です。ニーマンラボは、ヤギポリクローナルPAR4抗体PAR4のアニオンクラスターを対象とし、それによってPAR4媒介血小板活性化24のための重要なステップに影響を与え、PAR4切断を遅らせる（CAN12）を生成しました。 C57BL6マウスにこの抗体1mg /キロの灌流によって、我々は、PAR4切断の阻害有意に延長時間は、7.5％のFeCl 3誘導される頸動脈血栓症モデル（ 図5Cおよびオンラインビデオ3）に血栓形成を閉塞性することがわかりました。これは、FeCl 3を誘発性血栓症モデルCことを実証しています抗血小板剤の効果を評価し、潜在的な治療戦略を特徴付けるために利用されます。
ナノ粒子媒介血栓特異的標的
血流を再確立するための迅速な血餅除去は、虚血性脳卒中および心筋梗塞などの閉塞性血管疾患の治療に重要です。などのtPAのような血栓溶解薬の全身送達は、形成された血栓を溶解することができ、上記示したが、完全に血小板活性化および再凝集/閉塞を防ぐことはできません。さらに、このようなセリンプロテアーゼ薬剤の全身直接送達は、出血を含む主要な副作用につながる、無差別オフターゲットアクションにつながることができます。セングプタラボは、血行動態のせん断流動25-27の下で、血餅関連活性化血小板およびタンパク質に結合することができ、血小板風のナノ粒子系合成送達媒体を開発しました。そこで我々は、これらのナノ粒子ができるかどうかを調べ動脈における積極的に形成する血栓に特異的に結合します。
tPAの灌流のための実験で述べたように、カテーテルを頸静脈に挿入し、均一な流速でナノ粒子を注入するための注入ポンプに接続しました。この実験では、何の蛍光色素は、血小板を標識するために、マウスに注入しませんでした。代わりに、ナノ粒子はRohdamine Bで標識しました。したがって、それらは、生体顕微鏡下で観察することができました。前述のように血栓症を1分間、7.5％のFeCl 3処置で開始しました。 WTマウスでは、血栓のかなりの量を損傷後5分を形成することが見出されたので、我々は、ナノ粒子が活発に形成する血栓を効率的に結合するかどうかを検出するためにナノ粒子を注入するため、この時点を選択しました。 図5Dおよびオンラインビデオ4に示すように、蛍光ナノ粒子の注入後、我々は山型を同定することができました次第に蛍光粒子で覆われてしまった血栓。これらの研究は、血餅標的粒子状薬物送達システムのターゲティング能力（およびその後の治療効果）を評価するためのFeCl 3誘発性血栓症モデルの有用性を実証します。
血栓形成における血小板以外の赤血球の役割。
最近の研究では、赤血球（RBC）のFeCl 3を誘発さ血栓症モデル28において重要な役割を果たし、それらが損傷した血管壁29,30に第一接着性の血液成分であることを示唆しています。この現象を探るために、我々は、1,1'-ジオクタデシル-3,3,3 '、3'-テトラメチル過塩素酸塩（ディル、10μMの最終濃度）で赤血球を標識しました。 DiI標識赤血球をPBSで2回洗浄し、35％のヘマトクリットを有する生理食塩水に再懸濁しました。 DiI標識したRBC懸濁液（マウスあたり100μl）を注入しました致死量の5日間、実験19の前に照射された血小板減少症のマウスにエド。これらの血小板減少症のマウスは、彼らが行う場合には、血管壁にRBCの期待の機会を増やすであろう、血小板を大幅な減少しています。蛍光標識血小板（ 図5）を用いた実験とは対照的に、蛍光細胞の明らかな蓄積は血管損傷（ 図6A、 オンラインのV IDEO 5）の後に血管壁に見られませんでした。しかし、多血小板血栓の形成に伴って、赤血球、血餅（ 図6A）の形状を示して血栓内に蓄積し始めました。損傷した頸動脈の免疫蛍光染色は、ディル、標識された赤血球は、主に血栓（ 図6BおよびC）内に捕捉されている間、血管壁に付着した主要な細胞は、血小板（ポジティブCD41、緑）であることを実証しました。これらの研究はことを示していますFeCl 3誘発性血栓症モデルは、血栓形成における細胞および分子成分及び時空間イベントに機械的洞察を得るに利用することができます。
腸間膜血栓症モデル
腸間膜血栓症モデルでは、FeCl 3を高濃度-容器は、通常、脂肪組織に囲まれているように（10 12.5％）が血管壁に向かってのFeCl 3拡散を妨げ、したがってのFeCl 3 -誘発性から容器を防止することができる、お勧めしますけが7。このモデルは、静脈血栓症の研究に適しています。 オンライン動画6に示すように、血栓は、約見られた〜腸間膜静脈における15秒間局所12.5％のFeCl 3溶液で飽和した濾紙を適用した後、しかし、血栓形成を劇的に腸間膜動脈に遅延されます。血栓形成を閉塞性までの平均時間は〜17±7.2メートルで分（N = 11）腸間膜動脈におけるesenteric静脈と約23±9.9分（N = 10）12.5％のFeCl 3を 7使用されています。
図1. 手術ツール。マウスの手術のための最小限の必要なツールが示されています。より詳細な情報のための材料リストを参照してください。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図外科2.マウス固定。頸動脈血栓症モデルのためまたは腸間膜血栓症モデルのローダミン6G色素を注入するための15cmの培養皿の蓋の上にマウスを固定します。= "_空白」を取得>この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3.頸動脈血栓症モデル。頸静脈を露出させる手順、ローダミン6Gの注入は、左頸動脈の血液系と暴露への色素の蛍光示されています。 （A）では、行は舌骨のレベルに胸骨柄から切開部を示しています。 （B）において、青色矢印は、顎下腺を示し、黄色の点線は、顎下腺との間の筋膜を表します。 （C）において、青色矢印は顎下腺を示し、黒の矢印は、胸骨柄を示し、点線の黄色の線は、頸静脈を露出するように切 断位置を示しています。 （D）において、青色矢印は、頸静脈を示します。 （E）に、黄色の矢印が左顎下腺、青い矢印indicatを示し、ESは胸鎖乳突筋を残し、点在黄色の線は、筋膜を示し、緑色の矢印が肩甲舌骨筋や胸骨舌骨筋を示しています。 （F）に、青色の矢印が黄色の点線は薄い胸骨舌骨筋および/ または肩甲舌骨筋を示し、頸動脈を示しています。 （G）で 、青い矢印は、頸動脈を示し、緑色の矢印は、迷走神経を示しています。 （H）で、青い矢印は、頸動脈を示し、緑色の矢印は、プラスチック製の「U字型」のコーヒースターラーを示しています。および（I）において、青色矢印のFeCl 3溶液で位置濾紙を示し、緑の矢印は、頸動脈を示します。 Tは、気管を示している。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図4.腸間膜動脈と静脈血栓症モデル。腸間膜血管の露出だけでなく、FeCl 3を処理が示されています。 （A）では、青い矢印は白線、容器のない白い繊維組織を示しています。 （B）では、切開は白線が示されたのみでカット。 （C）に、青色の矢印は、腸間膜動脈と静脈の第2アーチを示しています。 （D）で、青い矢印はのFeCl 3溶液で位置ろ紙を示している。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
頸動脈血栓症モデルを用いて、図5の代表的な実験 。（A）。theC57Bl / 6マウスにおける血栓形成は7で処理されました0.5パーセントのFeCl 3。（B）。tPAを媒介血栓溶解効果。（C）。血栓症のマウストロンビン受容体PAR4を標的とする抗体の注入は示された。（D）。血栓-サイトターゲットnanovehicles特に積極的に血栓が示された形成に特異的に結合します。 INJ。 Pは、粒子の注入を示します。そして、ピークBは、血栓への粒子のピークバンドを示しています。全ての画像は同じ倍率で撮影しました。スケールバー=300μmの。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
血栓形成に対するRBCの図6.役割。（A）7.5％のFeCl後に頸動脈血栓症モデルとイメージに供したのDiI標識RBCの灌流を受けた血小板マウス
ビデオ1：野生型（WT）マウスにおける頸動脈血栓症モデルの代表的なビデオ。 （右クリックしてダウンロードすること。）このビデオでは、局所的に位置するろ紙を適用することにより誘導されるWTマウスの頸動脈内の代表的な血栓形成を示しています7.5％のFeCl 3溶液で。血小板は、ローダミン6Gの静脈内注射によって標識し、そして映像をモノクロモードで撮影されました。白い塊が凝固した血小板です。
動画2：頸動脈血栓症モデルによって検出さ組織プラスミノーゲンアクチベーター（tPA）媒介血栓溶解効果。 （右クリックしてダウンロードしてください。）ビデオ1で述べたように血小板標識および血栓形成を開始した、とのtPAは、7.5％のFeCl 3傷害後静脈内に5分を注入しました。
ビデオ3：抗血小板薬、ナ mely抗プロテアーゼ活性化受容体4（PAR4）抗体、頸動脈血栓症モデルによって検出された媒介抗血栓効果。血栓形成を局所的に、7.5％のFeCl 3と位置濾紙を適用することによって開始される前（右クリックしてダウンロードする。）この実験では、マウスは、PAR4抗体およびローダミン6G注射10分を与えました。
ビデオ4：ナノ粒子媒介血栓特異的標的。 （右クリックしてダウンロードすること。）この実験では、頸動脈血栓形成は、標識血小板なしで7.5％のFeCl 3で開始しました。ナノ粒子は、ローダミンBで標識し、静脈損傷後にマウスを5分間注入しました。
ビデオ5 "SRC =" /ファイル/ ftp_upload / 54479 / 54479video5.jpg "/>
ビデオ5：頸動脈血栓症モデルによって検出赤血球の結合。 （ダウンロードするには右クリックします。）赤血球（RBC）は、1,1'-ジオクタデシル-3,3,3 '、3'-テトラメチル過塩素酸塩（ディル、10μMの最終濃度）、および100μlの標識しましたDIL標識されたRBC（35％ヘマトクリット）血小板マウスに注射しました。いいえ血小板の標識はこの実験では行いませんでした。 with7.5％のFeCl 3を上記のように血栓を開始しました。
ビデオ6：WTマウス上腸間膜動脈と静脈血栓症モデルの代表的なビデオ。 （右CLIダウンロードしCK）血小板は、ローダミン6Gの静脈内注射によって標識し、そして血栓を、1分間、12.5％のFeCl 3溶液をろ紙一枚を適用した後に局所的に開始しました。容器は10倍、乾燥レンズで観察しました。
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Discussion
FeCl 3 -誘発モデルは、血小板機能および血栓症7,8,16,19,31-33上の遺伝子改変に関する貴重な情報を提供することができるだけでなく、貴重なツールとなりうる最も広く使用されている血栓症モデルの一つであり、アテローム血栓性疾患11,17,34-37の治療および予防のための治療化合物および戦略を評価するため。ここでは、私たちの修正と、このモデルの改良を示し、抗凝固因子（tPA）および抗血小板薬（PAR4抗体）の効果を決定するのに十分に敏感であり、この技術の有用性の追加の証拠を示しています。血栓症の機序研究に加えて、モデルは、ナノテクノロジーベースの血栓標的薬物送達を研究するために利用することができます。また、蛍光ROSインジケータ21の注射による血管壁の反応性酸素種（ROS）形成の検出に使用することができます。
細部まで行き届きました技術は、これらのモデルを実行するために必要です。オペレータは十分な外科的なスキルだけでなく、血管や血液細胞生物学の深い理解を持っている必要があります。 FeCl 3誘導された頸動脈血栓症モデルのいくつかの重要なポイントは、6：（1）ろ紙の適用を可能にし、後期で生体顕微鏡下での血流を観察するためのスペースを残すために頸動脈（〜5ミリメートル）のに十分な長さを露出させます; （2）明確にろ紙を直接血管壁に接触、さらには損傷を生成することを可能にするために頸動脈の周囲の外膜軟部組織を取り除きます。 （3）のFeCl 3 -飽和濾紙の適用前に、血管壁への機械的損傷なし血栓形成を確認しません。 （4）周囲組織から血管を分離するためのバックグラウンド蛍光をブロックする、及びFeCl 3を拡散を防止するために黒いプラスチックの「U」字状の部分と頚動脈の根底にあります。これらの戦略により、我々は非常に生成しています再現性の野生型C57BL / 6マウスを用いたデータ、およびこのマウスの歪み7.5％のFeCl 3誘発される血栓時間は11.3±3.16分（N = 14）6,7,19です。循環細胞を標識するローダミン6Gの頚静脈注射が困難な場合があります。代替として、尾静脈注射は、15cmのプレートの蓋の上にマウスを固定する前に行うことができます。頸動脈モデルに比較すると、腸間膜動脈と静脈のモデルは、より簡単に、より少ない外科的に集約的です。脂肪組織による血管の取材に、結果の項で述べたようにしかし、腸間膜血栓症モデルは、静脈血栓症を研究するための良いですが、別のマウスとの間の誤差を最小にするために、より大きなサンプルサイズが必要です。
このモデルの制限は、メカニズムは明らかで、まだ論争のではないということです。最初に、このモデルのメカニズムは、FeCl 3を、内皮細胞の生成ROS誘発性侵食、およびSUのものであると考えられていましたbsequently血小板付着、凝集および血栓形成6,11をレンダリングするために、血栓内皮下層への血液成分の露出につながりました。血小板減少症のマウスへのGPVI抗体で前処理された血小板の再構成により、我々は、FeCl 3をモデルは血小板GPVIに依存することを実証しており、遮断血小板GPVIは劇的のFeCl 3誘発性血栓形成19を阻害しました 。この知見は、以前の報告38と一致しているとのFeCl 3モデルが血栓6媒介性ヒト動脈硬化性プラーク破裂の病態生理を模倣する可能性が高いことを示唆しています。しかし、いくつかの最近の研究は、血管壁への赤血球の付着、並びに血漿タンパク質および血液細胞29,30のFeCl 3を誘発凝集の物理化学的効果などの新しいメカニズムを提案しています。これらの新しい洞察は、このモデルの潜在的なメカニズムはより複雑になり得ることを示唆しています。
血小板減少症のマウスへのDiI標識RBCの灌流およびその後のFeCl 3 -triggeredけが7.5％と頸動脈へのFeCl 3誘導することにより、私たちは傷ついた血管壁に付着した主要な細胞は、血小板（ 図6とオンラインビデオ5であることが判明しました）。私たちは、明白な赤血球の付着を見つけられませんでした、と血栓におけるRBCの蓄積は、トラッピングの結果である可能性が最も高いと思われました。我々の調査結果は、一次および二次止血39の概念と一致しています。これまでの報告から、我々の観察の違いは、走査型電子顕微鏡検査のためのFeCl 3負傷した頚動脈を左心室が以前ずに露出したマウスで調製したバールや同僚30、による研究のように低酸素症および血行動態の変化からのものであってもよいです機械ventillationの支援。血中酸素濃度及び血行動態を劇的に両方の肺に減少され、そして胸は機械換気せずにオープンされた後の心機能はすぐに影響を受けることになります。酸素欠乏は、長い凝血促進経路及び血栓症40のトリガーともRBCの密着性を高めることができると関連しています。別の最近の出版物は、5または10分間のFeCl 3の非常に高い濃度（20％）と頚動脈の治療は損傷した血管29の内腔で約50ミリモルでのFeCl 3の定常状態濃度をもたらすことが示されています。したがって、これらは直接小説、血栓形成29中のFeCl 3のアクションのための2相のメカニズムを提案するためにそれらを主導しており、様々な血液成分に50mMのFeCl 3をを注入し、凝集ex vivoで上のFeCl 3の効果を調べました。非常に興味深いが、この研究の結果は、それが一般的に使用されるのFeCl 3モデルを表していないよう注意して解釈する必要があります。 FECの高い濃度とは対照的にリットル3（論文に示されているように20％、1M）および長期治療（5または10分）、我々の以前の研究と同様には、バールら 。 1分間の10％のFeCl 3処置は7分6,30内頸動脈の急速な閉塞性血栓の形成を誘導するのに十分であることを実証しました。また、FeCl 3をモデルを用いた実験のほとんどで、のFeCl 3のさらに低濃度（5 - 7.5％）が使用されます。
このモデルのもう一つの制限は、内皮への深刻な酸化的損傷だけでなく、内皮削剥後にFeCl 3の治療に、このモデルは、内皮炎症関連血栓症を研究するための適切なツールではないかもしれないということです。しかしながら、蛍光標識された白血球の潅流と組み合わせて、頸動脈を準備するためにこれらの技術を用いることにより、我々は、炎症性内皮41の白血球の接着及びローリングをテストすることができます。
SUMMで進、我々は洗練と頸動脈に高度に再現可能な損傷を生じ、生体顕微鏡により正確に血流停止時間を定量するためのFeCl 3 -誘発性血管損傷モデルを標準化しています。このモデルは、抗凝固薬と抗血小板薬をテストするのに十分かつ敏感であり、また、血栓標的ナノメディシンの研究に適しています。骨髄移植、血小板減少症のマウスまたは候補薬物の直接血管内注入への血小板の注入との組み合わせでは、我々は、これは生体内で血栓症を研究するための、便利で簡単かつ敏感なツールであることが実証されている7-10,16,19,42,43 。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical Scissors - Tungsten Carbide | Fine Science Tools | 14502-14 | cut and hold skin |
| Micro-Adson Forceps - Serrated/Straight/12 cm | Fine Science Tools | 11018-12 | cut and hold skin |
| Metzenbaum Fino Scissors - Tungsten Carbide/Curved/Blunt-Blunt/14.5 cm | Fine Science Tools | 14519-14 | to dissect and separate soft tissue |
| Ultra Fine Hemostat - Smooth/Curved/12.5 cm | Fine Science Tools | 13021-12 | to dissect and separate soft tissue |
| Graefe Forceps - Serrated/Straight/10 cm | Fine Science Tools | 11050-10 | to dissect and separate soft tissue |
| Dumont #5 Fine Forceps - Biology Tips/Straight/Inox/11 cm | Fine Science Tools | 11254-20 | Isolate vessel from surounding tissue |
| Dumont #5XL Forceps - Standard Tips/Straight/Inox/15 cm | Fine Science Tools | 11253-10 | Isolate vessel from surounding tissue |
| Blunt Hook- 12 cm/0.3 mm Tip Diameter | Fine Science Tools | 10062-12 | Isolate vessel from surounding tissue |
| Castroviejo Micro Needle Holders | Fine Science Tools | 12061-02 | Needle holders |
| Suture Thread 4-0 | Fine Science Tools | 18020-40 | For fix the incisors to the plate |
| Suture Thread 6-0 | Fine Science Tools | 18020-60 | For all surgery and ligation |
| Kalt Suture Needles | Fine Science Tools | 12050-03 | |
| rhodamine 6G | Sigma | 83697-1G | To lebel platelets |
| FeCl3 (Anhydrous) | Sigma | 12321 | To induce vessel injury |
| Papaverine hydrochloride | Sigma | P3510 | To inhibit gut peristalsis. |
| Medline Surgical Instrument Sterilization Steam Autoclave Tapes | Medline | 111625 | To fix the mouse to the plate |
| Fisherbrand™ Syringe Filters - Sterile 0.22 µm | Fisher | 09-720-004 | For sterlization of solutions injected to mice |
| Fisherbrand™ Syringe Filters - Sterile 0.45 µm | Fisher | 09-719D | To filter the FeCl3 solution |
| Sterile Alcohol Prep Pad | Fisher | 06-669-62 | To sterilize the surgical site |
| Agarose | BioExpress | E-3120-500 | To make gel stage |
| Leica DMLFS fluorescent microscope | Leica | Intravital microscope | |
| GIBRALTAR Platform and X-Y Stage System with heating plate attached. | npi electronic GmbH | http://www.npielectronic.de/products/micropositioners/burleigh/gibraltar.html | |
| Streampix version 3.17.2 software | NorPix | https://www.norpix.com/ |
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