Summary
우리는 혈전 형성을 폐쇄하는 시간을 모니터링하는 생체 내에 현미경을 사용하여 효율적 특징으로하는 정제 된 철 클로라이드 (50ml을) 경동맥 및 장간막 동맥에 유도 된 혈전증 모델의 절차뿐만 아니라 정맥을보고한다.
Introduction
동맥 혈전증 (혈전)는 죽상 동맥 경화증, 당뇨병, 비만, 암,자가 면역 만성 류마티스 질환을 포함한 만성 염증과 관련된 다양한 전신 질환의 일반적인 합병증이다. 부적절한 혈소판 활성화, 집계 이후 coagulatory 메커니즘에서 동맥 순환 줄기에 발생하며 혈전은 심장 마비, 뇌졸중 및 사지 손실에 연루되어있다. 혈관벽은 혈관벽에 혈액 세포, 호르몬 및 사이토킨뿐만 아니라 항산화 단백질의 발현을 순환하는 다수의 세포 유형을 포함하고, 전단 응력을 포함 외적 요인의 다수에 의해 영향 복잡한 시스템이다. 시험 관내 실험에서 복제 할 수없는 이 복잡한 환경 때문에 동물 모델을 이용한 생체 내 연구는 혈전 성 질환에 관여하는 메커니즘을 더 잘 이해할 수 있도록하는 것이 중요하다.
마우스는 SIM이 밝혀졌다혈전증, 동맥 경화, 염증과 당뇨병 1,2의 관점에서 인간 ILAR 메커니즘. 또한, 유전자 녹아웃 마우스는 복잡한 생리 학적 또는 병리학 적 환경에서 특정 유전자 산물의 기능을 테스트하기 위해 생성 될 수있다. 이러한 연구는 인간의 병리를 모방하고 새로운 경로 및 치료법의 발견에 관한 중요한 기계론의 정보를 제공 할뿐만 아니라 혈전증에 약물 효과를 특징 짓는 중요한 정보를 제공 할 수있다.
병적 동맥 혈전은 피하 매트릭스 3,4에 층을 손상 또는 기능 장애와 혈류의 노출을 내피로 인해 발생합니다. 다양한 혈전증 모델 기계적 손상, 광 반응성 화합물 로즈 벵갈 계 산화 적 손상 및 레이저 손상이 5로 내피 세포의 손상을 유도하기 위해 개발되었다. 이 스펙트럼에서는, 철 클로라이드 (50ml을 3) 혈관 손상은 혈전증 널리 사용 유도 된 모델이다. 이 시약 때용기의 외 측면에인가 된 혈소판 및 응고 캐스케이드의 요소를 순환에서 내피 세포의 보호 상실, 혈관 세포 6-8에 산화 손상을 유발한다. 50ml을 모델은 간단하고 모두 항응고제 및 항 혈소판 약물에 민감하고, 쥐, 쥐, 기니피그와 토끼 6-15에서 경동맥과 대퇴 동맥, 경정맥 및 장간막과 cremasteric 세동맥과 세정맥에 수행되었습니다.
이 모델에서 하나의 측정 매개 변수는 도플러 유량계 또는 생체 내에 현미경 6,7,9 직접 관찰에서 혈류의 중단으로 측정 혈관 폐색을 완료 부상에서 경과 된 시간입니다. 5 ~ 30 분 사이의 시간의 범위를 제안 C57BL6 마우스 7-10,16 다른 연구에서보고 된 50ml을 그 농도 마취 수술 기법 마우스 연령, 게놈 배경 B의 측정 방법의 종류흐름들 (100d), 및 기타 환경 변수는이 모델에서 중요한 효과를 가지고있다. 이 넓은 다양성 어려운 다른 연구 그룹에서 연구를 비교하고 미묘한 차이의 검출이 어려워 질 수 있습니다.
이러한 변화 성을 최소화하고 생체 내 모델 시스템에서 균일하게 재현을 확립하는 시각과 함께, 우리는 최소의 변형 6-10,16-19 매우 재현성있는 데이터를 만든다 50ml을 유도 된 경동맥 모델을 정제했다. 본 논문에서는 설명하고 기술을 공유하고이 모델에서 혜택을 누릴 수있는 몇 가지 대표적인 실험 예를보고한다.
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Protocol
모든 절차와 동물의 조작은 미국 공중 보건 서비스 동물 애호 관리에 대한 정책 및 동물의 사용 및 관리에 대한 NIH 가이드 및에 따라 클리블랜드 클리닉의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인되었습니다 실험 동물의 사용.
1. 준비 :
- 라벨 혈소판에 대한 형광 염료
- 식염수에, 로다 민 6G 솔루션, 0.5 ㎎ / ㎖를 준비하고 0.22 μm의 필터 솔루션을 소독.
- 50ml을 해결
- 30 % 50ml을의 신선한 원액 확인 순수한 물 (무수을, 1.85 M와 동일), 0.45 μm의 필터로 필터링 할 수 있습니다. 5 ml의 신선한 50ml을 원하는 농도로 3 솔루션 [예를 들어, 2.5 % (0.154 M), 5 % (0.308 M), 7.5 % (0.463 M), 10 % (0.617 M)와 12.5 % (0.771 M)]에 의해 준비 물 난으로 30 % 50ml을 솔루션을 희석NA 6cm 조직 배양 접시 뚜껑을 유지 폐쇄.
참고 : 배양 접시를 사용하여보다 쉽게 이러한 1.5 ml의 microcentrifuge 관으로, 좁은 컨테이너에서 그것을 선택하는 것보다 50ml을 용액으로 포화 여과지를 선택 할 수 있습니다. FeCl3를 매우 위험합니다 및 입고 장갑 등 실험실 코트, 개인 보호 장비 등의주의 사항은 항상주의해야한다있다.
- 30 % 50ml을의 신선한 원액 확인 순수한 물 (무수을, 1.85 M와 동일), 0.45 μm의 필터로 필터링 할 수 있습니다. 5 ml의 신선한 50ml을 원하는 농도로 3 솔루션 [예를 들어, 2.5 % (0.154 M), 5 % (0.308 M), 7.5 % (0.463 M), 10 % (0.617 M)와 12.5 % (0.771 M)]에 의해 준비 물 난으로 30 % 50ml을 솔루션을 희석NA 6cm 조직 배양 접시 뚜껑을 유지 폐쇄.
- 필터 논문
- 1mm X 2mm 크기로 필터 종이를 잘라. 같은 접시에 50ml을 용액에 차단 필터 종이의 충분한 조각을 만끽 해보세요.
- 파파 베린 염산염 솔루션
- 물 파파 베린 하이드로 클로라이드 용액 (25 ㎎ / ㎖)을 준비하고, 0.22 μm의 필터로 살균 용액.
- 아가로 오스 젤
- 6 웰 조직 배양 플레이트에서 2 % 아가 로스 겔에서 PBS 또는 식염수를 준비 ~ 1cm 두께 및 C~ 3cm 지름 반원에 유타.
2. 50ml을 유도 경동맥 동맥 손상 혈전증 모델
- 혈전증 모델에 대한 외과 적 치료
- 12 주 오래 된 C57BL6 마우스 (또는 다른 균주 필요) - 8을 사용합니다. 복강 내 주사를 통해 케타민 (100 ㎎ / ㎏) / 자일 라진 (10 ㎎ / ㎏)의 혼합물로 쥐를 마취. 발가락 끼에 의한 마취의 깊이를 확인합니다.
참고 : 케타민 / 자일 라진의이 금액은 최소 1 시간 동안 안정 마취에서 동물과 고통 (곤란 발끝까지 응답)을 유지하기에 충분하다. - 작은 동물 전기 깎기와 목, 가슴 위쪽에 모피를 제거합니다. 탈모 크림은 필요하지 않습니다. 마취 동안 건조를 방지하기 위해 눈에 중립 석유 눈 연고를 적용합니다.
- 15cm 조직 배양 접시의 뚜껑에 부정사 위치에 마우스를 고정합니다. 힌을 확보하기 위해 하나의 긴 테이프 (~ 10cm)를 사용D 사지와 하체, 그리고 앞다리를 확보하기 위해 작은 테이프 (2 cm X 0.5 cm)의 두 조각. , 앞니의 주위에 포장을 4-0 봉합사를 사용하여 마우스 목 직선 (그림 2)을 유지하기 위해 뚜껑에 봉합의 두 끝을 테이프.
- 수술 광원에서 작업자 방향으로 마우스 머리 판을 놓습니다.
- 알코올 패드로 수술 부위를 소독. 피부를 유지하기 위해 마이크로 Adson 집게를 사용하여 작은 절개하기 위해 수술 가위를 사용 (2-3mm)를.
- 포셉과 절개의 피부를 잡고 턱은 절개로 폐쇄와 수술 가위를 삽입합니다. 피하 층으로부터 피부를 무료로 가위를 열고 다음 흉골 또는 턱으로 피하 가위를 밀어합니다.
- 설골의 수준 (그림 3a 및 3b)에 흉골에서 중간 선 절개를하는 수술 가위로 피부를 잘라. 퉁명스럽게 얇은 근막 (점선에서 해부
참고 : 흉골 (그림 3C에서 검은 색 화살표) 및 기관 (그림 3C에서 T)이이 단계 이후에 볼 수 있습니다. - 를 무료로 지혈의 턱을 열고 (그림 3C 노란색 점선) 2시 방향을 향해 근막 아래에 지혈을 삽입, 연조직 및 Graefe 씨 집게로 흉골의 오른쪽에 보이는 피부를 잡아 주변 조직으로부터 경정맥.
- 오른쪽 경정맥 (그림 3D, 화살표)를 노출시키는 수술 가위와 2시 방향 (그림 3C)을 향해 근막, 연부 조직과 피부를 잘라.
- 다음 22 G 바늘, 변화와 1 ML의 주사기를 사용하여 300 μL의 로다 민 6G 솔루션 - 약 200 그리기그것은 30 G 바늘.
참고 :이 그 좋은 팁의 손상으로부터 30 G 바늘을 보호합니다. 직접 팁을 손상되지 않습니다 30 G 바늘로 로다 민 6G 솔루션을 그리기; 그러나 주입하지 않을 수 있습니다 손상을 일으킬 것입니다 실수로 용기 벽을 터치. - 천천히 로다 민 6G 솔루션을 밀어 30 G 바늘을 세척, 공기 방울이 주사기 나 바늘에 남아 있는지 확인하십시오. 주입을위한 100 μL의 로다 민 6G 솔루션을 유지합니다.
- 벤드 2 - 경정맥에 너무 깊이 삽입 바늘을 방지하고보다 용이하게 (도 3D)을 제어 분사하게된다 니들 홀더 90 ° 각도로 바늘 3mm 팁.
- 라벨 혈소판에 대한 권리 경정맥에 로다 민 6G 솔루션을 주입한다. injection.Af 동안 다른 손으로 Graefe 씨 집게와 한 손으로 주사기와 바늘을 잡고 주사기를 안정 위치에 바늘을 유지하려면터 주입은 출혈을 방지하기 Graefe 씨 집게로 주사 부위 클램프.
- 지혈의 턱을 열고 주사 부위의 혈관 벽을 고정하기 위해 Graefe 씨 집게 아래에 삽입 한 다음 6-0 봉합과 주사 부위를 결찰.
주의 : 단계 2.1.15의 대안으로서, 출혈을 중지 2 분간 손가락으로 주사 부위에 압력을인가하는 단계; 그러나,이 방법은 또한 유발 주사 부위에서의 응고 실수 제거되면 출혈의 위험이있다. - 퉁명스럽게 지혈과 Graefe 씨 집게와 왼쪽 턱밑 글 랜드 주변의 연부 조직 및 근막을 해부하고 왼쪽 흉쇄 근육 (그림 3E에서 파란색 화살표)를 노출 7시 위치 (그림 3E) 방향으로 선을 빼냅니다.
- 퉁명스럽게 왼쪽 흉쇄 근육과 omohyoid 근육 또는 sternohy 사이의 근막 (그림 3E, 점선)를 해부지혈과 기관의 왼쪽 사이트에있는 OID 근육 (그림 3E, 녹색 화살표).
- 흉쇄 근육 (그림 3E에서 파란색 화살표)의 중간에서 6-0 실크 봉합사 (약 15cm 길이)로 바늘을 통과, 함께 봉합의 두 끝을 넣고 10시 방향으로 옆으로 봉합사를 당겨 .
참고 :이 절차는 흉쇄 근육의 외부에있는 왼쪽 경정맥의 부상을 방지하기 위해주의 깊게 수행해야합니다. - 퉁명스럽게 얇은 sternohyoid 근육 및 / 또는 흉쇄 근육을 떼어 후 경동맥 (CA) (그림 3 층 화살표)를 노출 omohyoid 근육을 구분합니다. 필요에 따라 sternohyoid 근육 및 / 또는 omohyoid 근육을 잘라. CA를 건드리지 않고 CA의 부드러운 조직을 분리 지혈을 사용하여
참고 : CA는 미주 신경을 동반, 흰색 구조에서 볼 - 미주 신경과 CA를 피하면서 CA 주변의 측면 밴드를 데리러 좋은 팁 집게를 사용하여 는 CA와 미주 신경 사이의 근막에 구멍을 펀치 또 다른 좋은 팁 집게를 사용합니다.
- 구멍을 통해 후크를 전달하고 부드럽게 CA를 들어 올린 후 캘리포니아에서 미세 팁 집게를 배치 외막 연부 조직을 제거하기 위해 CA 따라 반대 방향으로 후크와 집게를 이동합니다. 주변 조직에서 CA (그림 3H, 파란색 화살표)의 무료 적어도 ~ 5mm 길이.
- 평면에 검은 색 플라스틱 커피 교반기의 끝을 눌러 배경 형광을 차단하기 위해, 3mm 조각에 커피 교반기를 샛길 한 다음 "U"모양 플라스틱 (그림 3H, 녹색의 두 조각을 얻을 수있는 배 가장자리를 따라 길이 방향으로 절단 ) 화살표.
- 12 주 오래 된 C57BL6 마우스 (또는 다른 균주 필요) - 8을 사용합니다. 복강 내 주사를 통해 케타민 (100 ㎎ / ㎏) / 자일 라진 (10 ㎎ / ㎏)의 혼합물로 쥐를 마취. 발가락 끼에 의한 마취의 깊이를 확인합니다.
- 10 배의 물을 렌즈에 따라 적절한 위치에 현미경 무대와 장소에 함께 마우스와 접시 뚜껑을 전송합니다. 10 배 렌즈와 식염수와 CA 사이의 공간을 채 웁니다.
- 디지털 비디오 레코딩 소프트웨어 응용 프로그램을 시작하고 새 파일을 실행하고 그에 따라 이름을 지정합니다. 정상 혈관 영상을 녹화하고 녹화 정지시의 프레임 번호를 기록.
주 : 기록 용 컴퓨터에 녹화 소프트웨어를 참조. 우리는 디지털 비디오 기록 소프트웨어를 사용하여 다음의 설명은 본 출원에 기초한다.
참고 : 기계 TRA 이후UMA는 내피 손상 및 혈전 형성 (20)으로 이어질 수 있으며, 50ml을 부상 전에 용기 벽에는 외과 적 손상이 없다는 것을 확인하는 것이 필요하다. 50ml을 유도 된 손상의 효과가 장벽을 형성하고있다 감쇠 CA 주위에 남아있는 조직이 없다는 것을 확인할 필요가있다. 쉽게 후 경과 시간에 따라 동영상을 분석 할 수 있도록 할 레코드의 프레임 번호를 기록합니다. - 10 배 렌즈에서 접시 뚜껑 마우스를 이동합니다. 얇고 미세한 끝을 조심스럽게 CA 주변의 식염수를 지워하는 데 사용하는 종이 타월의 모서리를 접어 수술 분야에서 다른 장소뿐만 아니라 (CA 손이 닿지 않도록). 이것은 사용의 FeCl3 용액의 희석을 방지하는 것이 중요하다.
- 좋은 팁 집게를 사용하여 50ml을 용액으로 포화 필터 종이를 픽업하여 CA에 직접 배치하고 1 분 동안 사이트에 보관하십시오.
참고 : TO 혈류 수확 정확한 데이터의 처치 시각화, 근접 노출 CA (도 3I)의 선단부에 여과지를 놓고 후반에서 혈액 흐름을 관찰 (도 3I 녹색 화살표) 근위 부위에 짧은 세그먼트를 남겨 단계 (아래 참조). - 여과지를 제거 (이 시점을 시작으로 정의 "손상 후") 및 식염수 (적어도 2 ㎖)와 CA를 헹군다.
- 다시 10 배 렌즈 플레이트 뚜껑 마우스를 넣어; 혈관을 관찰하고 기록 영상으로 시작합니다. 기록 제 분의 마지막 비디오 프레임 번호를 기록.
주 : 혈전 형성은 컴퓨터 스크린이나 현미경 실시간 영상에서 관찰되는 형광 혈소판의 축적에 의해 식별된다. 녹화 영상 바로 현미경 위로 마우스를 붙여서. f를 제거한 후 상기 제 분의 말미에 기록 유지ilter 종이. 부상에 대한 정보를 얻기 위해 근위 사이트 선단부에서 전체 용기를 관찰하고 관심 영역에 초점을 상기 촬상 용 (일반적으로 손상된 영역의 중심). - 10 초 처음 10 분 실험이 끝날 때까지 (예를 들어, 3시 5분부터 2시 55분까지) 후 10 초마다 다른 분 분마다 녹음 영상. 각 기록이 중단 될 때 프레임 번호를 기록합니다.
참고 모델의 마지막 포인트는 1)의 혈류가> 30 초 동안 중단 된 경우; 2) 폐쇄는 손상 후 30 분에 볼 수없는 경우. 이러한 경우, 통계적 분석을 위해 30 분을 사용한다. 처음에 10 밀리 초와 같은 동영상 기록의 노출 시간을 설정하므로는 혈전을 통해 혈액의 흐름을 관찰하기 쉬운 것이다. 혈전이 커질 및 형광 카메라의 센서를 포화 할 때, 혈전을 통해 혈류를 식별하기 어려워진다. 이 문제를 해결하기 위해, 촬상 CE 이동혈액의 흐름이 아직 명확하게 관찰 할 수 근위 손상되지 않은 사이트 (그림 3I, 녹색 화살표)에 nter. 근위 않은 부상 사이트에 초점을 때 혈액의 흐름이보다 명확하게 관찰 할 수 있도록 우리는 또한, 15 또는 20 밀리 초에 노출 시간을 증가시킨다. 혈류가 중단 할 때, 더 많은 세포 (백혈구) 혈전의 근위 부위에 혈관 벽에 롤 시작한다. 큰 세포의 모양 후 3 분 - 흐름은 보통 2에서 멈 춥니 다. 이 변경된 경우, 기록 시트 상에 노광 시간 써라. 통상 야생형 C57BL6 마우스가 사용 된 경우는 일반적으로, 실험의 끝에 마취에서 약 30 분 걸린다.
주의 참고 : 정확한 데이터를 제공하지 않습니다 혈액 흐름 중단의 표시로 흰색 집계 된 혈소판 응고를 사용하지 마십시오과는 노출 시간에 의해 영향을 받는다. 흰색 응고하십시오 (대표 비디오 1) 중단 혈액의 흐름을 의미하지 않는다 혈관 내강이 덮여있다.
3. 50ml을 유도 장간막 동맥 / 정맥 혈전증 모델
- 섹션 2.1.1에서 언급 한 바와 같이 12주 오래된 C57BL6 마우스 - 8 마취. 마취 동안 건조를 방지하기 위해 눈에 수의사 연고를 적용합니다.
- 복강 내 창자의 연동 운동을 억제하는 파파 베린 솔루션 (총 0.4 밀리그램 / 마우스)를 주입한다.
- 동물 전기 깎기와 목과 복부에 모피를 제거합니다. 탈모 크림은 필요하지 않습니다.
- 15cm 조직 배양 접시의 뚜껑에 부정사 위치에 마우스를 고정합니다. 모든 다리를 보호하는 작은 테이프 (2 cm X 0.5 cm)의 네 가지를 사용합니다. 앞니의 주위에 포장 4 -0 봉합사를 사용하여 목 직선 (그림 2)을 유지하기 위해 뚜껑에 봉합의 두 끝을 테이프.
- 절차 2.1.4를 따라 -2.1.15 라벨 혈소판에 로다 민 6G의 주입을위한 경정맥을 노출.
- 수술 가위 (그림 4A)를 사용하여 복부 이하로 칼 모양으로부터 피부를 통해 중간 선 절개를 수행합니다. (또한 원격 교육 알바는 그림 4A, 화살표) 명확하고 더 혈관이없는 Graefe 씨의 집게로는, 약 2 올려 중간 복막 픽업 - 절단 선 아래에는 대장을 확인하지 3mm 높은 오픈 복막을 잘라 길이 방향으로 미세 가위 (그림 4B)와 함께.
- 오른쪽 측면 위치로 마우스를 다시 고정합니다. 복부에 가까운 반원 아가로 오스 겔을 배치하고 부드럽게 장을 외면 화하다하고 Graefe 씨 집게 (그림 4C)와 젤의 상단에 확산. 혈전증 실험 (그림 4C, 화살표)에 대한 두 번째 지점을 사용합니다.
참고 : 창자를 외면 화하다하는 데 도움이 지혈 또는 마이크로 Adson의 집게를 사용합니다. 을 아프게하지 마십시오장 및 용기. - 창자와 용기의 수분을 유지하기 위해 6 방울 식염수 - 5를 놓습니다. 현미경 스테이지에 함께 접시 뚜껑 마우스를 전송하고 10 배 건조 렌즈에 따라 적절한 위치에 배치합니다.
참고 : jejunoileal 막 식염수 솔루션을 보유 할 수 없기 때문에 마른 렌즈를 사용합니다. 습기를 유지하기 위해 노출 된 조직에 생리 식염수를 삭제해야합니다. - 치료 전 장간막 동맥과 정맥 주위의 식염수를시킨다.
- 12.5 % 50ml을 용액으로 포화 필터 종이를 선택하고 1 분 (그림 4D)에 대한 장간막 동맥과 정맥에 직접 배치 좋은 팁 집게를 사용합니다. 여과지를 분리하고 식염수로 부상 장간막 동맥 및 정맥 린스 (적어도 2 mL) 중 (이 시점 "은 손상 후"의 시작으로서 정의된다).
- 다시 10 배 건조 렌즈 아래 판 뚜껑 마우스를 넣어; 혈관을 관찰하고 레크 리 에이션 시작2.2에서 언급 ORD 영상).
참고 :이 실험의 엔드 포인트는 1) 혈액의 흐름은> 30 초 동안 중단 한 경우; 또는 2)의 폐색은 손상 후 30 분에서 볼 수없는 경우,이 경우 통계 분석을 사용하여 30 분. - 실험의 끝에, 생기 및 심장 박동이 확인되지 않은 후에 경부 전위이어서 과량 케타민 / 자일 라진 (20분의 200 ㎎ / ㎏)을 사용하여 마우스를 안락사.
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Representative Results
경동맥의 동맥 혈전증 모델
C57BL6 배경으로 마우스에서 우리는 출발점으로 1 분 동안 혈관을 치료하기 위해 7.5 % 50ml을 사용하는 것이 좋습니다. 7.5 %의 치료 50ml을에서 부상 영역과 정상 혈관 벽의 경계는 쉽게 (참조 온라인 비디오 1) 현미경으로 식별, 내피 층이 크게 손상되었음을 시사한다. 혈전은 50ml을 처리 즉시 형성하고, 손상 후 모든 WT C57BL6 마우스 1 분에서 관찰된다. 초기 형성된 혈전이 불안정하며, 그 부분은 일반적으로 얻어 혈류 세정되므로, 형성된 혈전을 2 작아짐 - 손상 후 3 분. 필터 용지를 제거한 후 4 분,이 이후 형성된 혈전은 안정적이며 일반적으로 씻어되지 않습니다 - 혈전 3에서 확대하기 시작합니다. 평균 폐색 시간 (N = 14)을 C57BL6 마우스에서 11.3 ± 3.16 분 때 7.5 % FECL 3 6,7,19 (그림 5a 및 온라인 비디오 1)이 사용됩니다. 이전의 연구에서는 감소시키고 50ml을 농도의 증가 모두가 항 혈전 마우스 균주 및 WT 마우스 (6) 사이의 차이를 감소하는 것이 증명; 우리의 경험에서, 1 분 동안 7.5 %의 FeCl3과 경동맥 처리는 우리의 목적을 모두 만족하기에 충분하다. 또한이 모델을 사용하여 사 대표 실험은 다음, 녹아웃 마우스 7,8,16,19,21를 사용하여 특정 유전자의 기능을 테스트합니다 :
조직 형 플라스 미노 겐 활성제 중재 혈전의 정맥 관류
조직 형 플라스 미노 겐 활성제 (TPA)는 미국 (22)의 혈전 용해 치료에 대한 FDA 승인 약물 중 하나입니다. 따라서 우리는 경동맥 혈전증 모델에서 TPA를 매개 혈전을 관찰 하였다. 혈전증이었다50ml을 7.5 %로 초기화와 tPA의 전 5 분 동안 형성 수 (1 mg의 / 체중 kg)을 경정맥 카테터 (22GA)를 통해 관류 하였다. 도 5b 및 온라인 비디오 2에 도시 된 바와 같이, 혈전 계속 확대 부상 후에 루멘 5 분의 약 50 %를 차지. 혈전은 단자 위치 보장 관류는 tPA의 혈소판 활성화 및 응집에 영향을 미치지 않음을 시사 후 확대하는 것을 계속했다. 혈전은 단자 위치 보장 주사 후 약 4 분 시작했다. 형성된 혈전을 30 분의 관찰 기간이 경우없이 일어난 혈관 폐색 동안 반복적 크기 변화를 겪는 것으로 밝혀졌다. 이러한 데이터는 명확 tPA를 완전히는 혈전 용해제로 연결 되더라도 매개 혈소판 혈전 형성을 억제 할 수 있음을 보여 주었다. 따라서, 우리의 FeCl3 유도 된 동맥 혈전증 모델을 이용하여 미래의 실험 두드러진 이전 가질 수 혈전 및 기타 부속 요법을 평가하는데 이용 될 수 있다는 것을 구상혈전 형성에 entative 효과.
마우스에 PAR4 항체의 관류는 혈전증을 억제
단백질 분해 효소 활성화 수용체 4 (PAR4)는 자사의 N 말단 exodomain (23)의 단백질 분해 절단에 의해 활성화 및 이후 혈소판 활성화의 단계에 이르게된다 혈소판에 G 단백질 결합 수용체 (GPCR)입니다. 니만 연구소는 염소 폴리 클로 날 PAR4 항체 PAR4의 음이온 클러스터를 대상으로하여 PAR4 매개 혈소판 활성화 24 중요한 단계에 영향을 미치는, PAR4 절단 지연 (CAN12)를 생성했습니다. 1 mg을 관류하여 /를 C57BL6 마우스에이 항체의 kg, 우리는 PAR4 절단의 억제 크게 연장 시간은 7.5 % 50ml을 유도 경동맥 동맥 혈전증 모델에서 혈전 형성을 폐쇄하는 것으로 나타났습니다 (그림 5C 및 온라인 비디오 3). 이것은 50ml을 혈전증 모델 C 유도 된 것을 보여는 항 혈소판제의 효과를 평가하고, 잠재적 인 치료 전략을 특성화하기 위해 이용 될 수있다.
나노 입자 매개 혈전 별 타겟팅
혈액의 흐름을 다시 설정하는 빠른 혈전 제거는 허혈성 뇌졸중과 심근 경색을 포함한 폐색 혈관 질환의 치료에 매우 중요하다. 이러한 tPA를 같은 혈전 용해 약물의 전신 배달 형성된 혈전을 용균 수 위 보였으 나 완전히 혈소판 활성화 및 재 집계 / 폐색을 방지 할 수 없습니다. 또한, 이러한 세린 프로테아제 에이전트의 전신 직접 배달 출혈 등 주요 부작용으로 이어지는, 무차별 오프 대상 활동으로 이어질 수 있습니다. 센 굽타 연구소는 혈역학 전단 흐름 25-27에서 응고 관련 활성화 된 혈소판 및 단백질에 결합 할 수있는 혈소판 영감을 나노 입자 기반의 합성 배달 차량을 설계했다. 따라서 우리는 시험이 나노 입자 할 수 있는지 여부동맥에서 적극적으로 형성 혈전에 결합한다.
tPA의 관류 실험에서 설명한 바와 같이, 카테터를 경정맥에 삽입하고 균일 한 유량으로 나노 입자를 주입하기위한 주입 펌프에 연결 하였다. 이 실험에서, 형광 염료는 혈소판에 레이블을 마우스에 주입되지 않았다. 대신 나노 입자는 Rohdamine B로 표지 하였다 따라서 그들은 생체 내에 현미경으로 관찰 할 수 있었다. 앞서 언급 한 바와 같이 혈전증은 1 분 동안 7.5 %의 FeCl3 치료를 개시 하였다. WT 쥐에서 혈전 상당량 손상 후 5 분을 형성하는 것으로하고 있기 때문에, 우리는 나노 입자가 활발히 혈전 형성에 효율적으로 결합하는 경우 검출 된 나노 입자를 주입이 시점을 선택했다. 도 5d 및 온라인 비디오 4에 도시 된 바와 같이 형광 나노 입자를 주입 한 후, 우리는 산형을 확인할 수 있었다점진적으로 형광 입자에 의해 덮여있어 혈전. 이러한 연구들은 응고 타겟 입자 약물 전달 시스템의 표적화 능력 (및 후속 치료 효능)을 평가하기 50ml을 유도 된 혈전 모델의 유용성을 입증한다.
혈전 형성의 혈소판 이외의 붉은 혈액 세포의 역할.
최근의 연구는 적혈구 (적혈구)을 50ml을 유도 혈전증 모델 (28)에 중요한 역할을한다는 것을 제안 이들은 손상된 혈관 벽 (29, 30)에 부착 제 혈액 성분이다. 이 현상을 탐구하기 위해, 우리는 1,1'- 디 옥타 데실 3,3,3- ', 3'-Tetramethylindocarbocyanine 과염소산 염 (DIL, 10 μM 최종 농도)와 적혈구를 표시. DIL 표지 된 RBC를 PBS로 2 회 세척하고, 35 % 혈소판과 염수에 재현 탁 하였다. DIL 표지 RBC 현탁액 (마우스 당 100 μL)를 분사했다치명적 오일 실험 (19) 전에 조사 된 혈소판 쥐에 에디션. 이러한 혈소판 마우스는 중요한 그들이 할 경우, 혈관 벽에 기다리고 RBC의 기회를 증가 혈소판 감소 있습니다. 형광 표지 된 소판 (도 5)를 사용하여 실험과 대조적으로, 형광 세포의 뚜렷한 축적 혈관벽에서 발견되었다 혈관 손상 (도 6A, 온라인 브이 IDEO 5) 후. 그러나, 혈소판 풍부 혈전의 형성과 함께, 적혈구가 응고 (도 6a)의 형상을 도시 혈전에 축적하기 시작했다. 부상 경동맥의 면역 형광 염색법은 DIL 표지 적혈구는 주로 혈전 (그림 6B & C) 내에 갇혀있는 동안 혈관 벽에 부착 된 주요 세포 (CD41 양성, 녹색) 혈소판 있음을 보여 주었다. 이러한 연구는 것을 입증50ml을 유도 된 혈전 모델은 혈전 형성, 세포 및 분자 구성 요소 및 시공간 이벤트에 기계적 통찰력을 얻기에 이용 될 수있다.
장간막 혈전증 모델
장간막 혈전증 모델, 50ml을 고농도 - 용기는 일반적으로 지방 조직에 의해 둘러싸인로 (10 12.5 %)이 권장 혈관 벽쪽으로의 FeCl3의 확산을 방해 할 수있는, 따라서 50ml을 유도 된에서 용기 방지 부상 7. 이 모델은 정맥 혈전증 연구에 더 적합합니다. 온라인 비디오 6에 도시 된 바와 같이, 혈전 약 보였다 ~ 장간막 정맥에서 15 초 국소 12.5 %의 FeCl3 용액하지만 혈전 형성 포화 여과지를 적용한 후 극적 장간막 동맥 지연된다. 혈전 형성을 폐쇄하는 평균 시간은 ~ 17 ± 7.2 분 (N = 11) m에 esenteric 정맥 및 장간막 동맥에 약 23 ± 9.9 분 (N = 10) 12.5 % 50ml을 7 사용된다.
그림 1. 수술 도구. 마우스 수술에 대한 최소한의 필요한 도구가 표시됩니다. 자세한 내용은 재료의 목록을 참조하십시오. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
수술에 대한 그림 2. 마우스 고정은. 경동맥 혈전증 모델 또는 장간막 혈전증 모델에 대한 로다 민 6G 염료의 주입을위한 15cm 배양 접시 뚜껑에 마우스를 고정합니다.= "_ 빈"을 얻을>이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 3 경동맥 동맥 혈전증 모델. 절차 로다 민 6G의 주입 표시된 혈관계 및 좌측 경동맥에 노출 형광 염료, 경정맥을 노출시킨다. (A)에서, 라인은 설골 수준으로 흉골의 절개를 나타내고; (B)에서, 파란색 화살표는 턱밑 샘을 나타내고, 노란색 점선은 턱밑 샘 사이의 근막을 나타냅니다; (C)에서, 청색 화살표 턱밑 샘을 나타내는 검은 화살표 흉골을 나타내고, 점선 황색 라인 경정맥을 노출 시키도록 절단하는 위치를 나타내고; (D)에, 파란색 화살표는 경정맥을 나타냅니다; (E)에, 노란색 화살표는 왼쪽 턱밑 글 랜드, 파란색 화살표 indicat을 나타냅니다ES는 흉쇄 근육을 왼쪽, 곳곳에 노란 선은 근막을 나타내고, 녹색 화살표는 omohyoid 근육 또는 sternohyoid 근육을 나타냅니다; (F)에서 파란색 화살표 옐로우 점선 얇은 sternohyoid 근육 및 / 또는 근육 omohyoid 표시, 경동맥을 나타내고; (G)에서, 파란색 화살표는 경동맥을 나타내며 녹색 화살표는 미주 신경을 나타냅니다; (H)에, 파란색 화살표는 경동맥을 나타내며 녹색 화살표는 플라스틱 "U 자형"커피 교반기를 나타냅니다; 및 (I)에서, 파란색 화살표는 50ml을 솔루션으로 자리 잡고 여과지를 나타내고, 녹색 화살표는 경동맥을 나타냅니다. T는기도를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4. 장간막 동맥 및 장간막 혈관의 정맥 혈전증 모델입니다. 노출뿐만 아니라 50ml을 처리 표시됩니다. (A)에서, 파란색 화살표는 원격 교육 알바, 용기가없는 백색 섬유 조직을 나타냅니다; (B)는, 절개 단독 컷에서 원격 교육의 알바 보였다; (C)에서, 청색 화살표 장간막 동맥 및 정맥 번째 아치를 나타내는; (D)에, 파란색 화살표는 50ml을 솔루션으로 자리 잡고 여과지를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
경동맥 혈전증 모델을 사용하여 그림 5. 대표 실험. (A). theC57Bl / 6 마우스의 혈전 형성은 7로 치료0.5 % 50ml을. (B). tPA의가 혈전 용해 효과를 매개. (C). 혈전증이 나타났다에 마우스 트롬빈 수용체 PAR4을 대상으로 항체의 주입. (D). 혈전 - 사이트 타겟 nanovehicles 특별히 적극적으로 형성 혈전이 나타났다 결합 . INJ. P는 입자의 주입을 나타냅니다; 및 피크 B는 혈전에 입자의 피크 밴딩을 나타냅니다. 모든 이미지는 동일한 배율에서 촬영되었다. 스케일 바 = 300 μm의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
혈전 형성에 RBC 그림 6. 역할. (A) 7.5 % 50ml을 한 후 경동맥 혈전증 모델과 이미지를 하였다 DIL 표지 적혈구의 관류를받은 혈소판 감소 마우스
비디오 1 : 야생형 (WT) 마우스의 경동맥 동맥 혈전증 모델의 대표 동영상. (다운로드 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭합니다.) 이 동영상에 위치한 국소 적용 여과지에 의해 유도 된 WT 쥐의 경동맥의 대표 혈전 형성을 보여줍니다50ml을 용액 7.5 %와. 혈소판은 로다 민 6G의 정맥 주사에 의해 표시하고, 영상은 흑백 모드에서 촬영했다. 흰색 질량은 응고 혈소판이다.
비디오 2 : 경동맥 동맥 혈전증 모델에 의해 검출 된 조직 플라스 미노 겐 활성제 (TPA) 매개 혈전 효과. (다운로드 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭합니다.) 비디오 1에서 언급 한 바와 같이 혈소판 표시 및 혈전 형성이 시작되었고, 만톤 정맥 5 분 7.5 % 이후 50ml을 부상을 주입 하였다.
비디오 3 항 혈소판 약물, NA 경동맥 동맥 혈전증 모델에 의해 검출 된 항 혈전 효과를 매개 mely 항 - 프로테아제 활성 수용체 4 (PAR4) 항체. 혈전 형성은 국소 7.5 % 50ml을 함께 자리 잡고 종이 필터를 적용하여 시작하기 전에 (다운로드 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭합니다.)이 실험에서, 쥐 PAR4 항체와 로다 민 6G 주입 10 분을 받았다.
비디오 4 : 나노 입자 매개 혈전 별 타겟팅. (다운로드 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭합니다.) 이 실험에서는, 경동맥의 혈전 형성은 라벨 혈소판없이 50ml을 7.5 %로 시작되었다. 로다 민 B는 나노 입자로 표지 및 정맥 손상 후 마우스를 5 분간 주입 하였다.
비디오 5 "SRC ="/ 파일 / ftp_upload / 54479 / 54479video5.jpg "/>
비디오 5 : 경동맥 동맥 혈전증 모델에 의해 검출 된 적혈구의 바인딩. (다운로드 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭합니다.) 적혈구 (적혈구)의 1,1'- 디 옥타 데실 3,3,3- ', 3'-Tetramethylindocarbocyanine 과염소산 염 (DIL, 10 μM 최종 농도) 및 100 ㎕로 표지 된 DIL 표지 된 RBC (35 % 적혈구 용적률)는 혈소판 마우스에 주사 하였다. 어떤 혈소판 라벨이 실험을 수행하지 않았다. with7.5의 %의 50ml을 상술 한 바와 같이, 혈전을 개시 하였다.
비디오 6 : WT 쥐의 장간막 동맥 및 정맥 혈전증 모델의 대표적인 비디오. (마우스 오른쪽 CLICK 다운로드합니다.) 혈소판은 로다 민 6G의 정맥 주사에 의해 표시하고, 혈전은 1 분 동안 12.5 % 50ml을 솔루션 필터 종이 한 조각을 적용한 후 국소 시작되었다. 용기는 건조 10X 렌즈를 관찰 하였다.
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Discussion
50ml을 유도 된 모델은 혈소판 기능 및 혈전증 7,8,16,19,31-33의 유전자 변형에 대한 유용한 정보를 제공 할뿐만 아니라, 가장 널리 사용되는 혈전 모델의 하나이며, 또한 유용한 도구가 될 수있다 죽상 혈전증 질환 11,17,34-37의 치료 및 예방을위한 치료 화합물과 전략의 평가. 여기에서 우리는 우리의 수정이 모델의 개선을 표시하고 항응고제 (TPA) 및 항 혈소판 약물 (PAR4 항체)의 효과를 결정하기에 충분히 민감이 기술의 유틸리티의 추가 증거를 보여왔다. 혈전증의 기전 연구에 더하여,이 모델은 나노 기반 타겟팅 혈전 약물 전달을 연구하기 위해 이용 될 수있다. 또한 형광 ROS 표시기 (21)의 주사에 의해 혈관벽 활성 산소 종 (ROS) 형성의 검출에 사용될 수있다.
꼼꼼기술이 모델을 수행하는 데 필요한. 운영자는 충분한 수술 기술뿐만 아니라 혈관과 혈액 세포 생물학에 대한 깊은 이해가 있어야합니다. 50ml을 유도 경동맥 동맥 혈전증 모델의 몇몇 핵심 포인트는 6 : 1 여과지의 적용을 허용하고 후반 단계에서 생체 내에 현미경 하에서 혈액 흐름을 관찰하기위한 공간을 남겨 경동맥 (~ 5mm)의 충분한 길이를 노출 ; (2) 분명히 여과지 직접 혈관벽 문의 심지어 부상을 생성 할 수 있도록 경동맥 주위 외막 연조직을 제거; (3) 용기 벽의 FeCl3 포화 된 여과지 애플리케이션 외에는 혈전 형성에 기계적 손상을 확인하지; (4)는 배경 형광을 차단하고, 50ml을 3의 확산을 방지하기 위해, 주변 조직으로부터 분리 동맥 검은 플라스틱 모양 "U"의 조각 경동맥을 기초. 이러한 전략으로, 우리는 매우 생성 한야생형 C57BL / 6 마우스,이 마우스 변형에 7.5 % 50ml을 유도 혈전증 시간은 11.3 ± 3.16 분 (N = 14) 6,7,19이다와 재생 가능한 데이터. 로다 민 6G의 경정맥 주입 도전 할 수있다 세포를 순환 레이블을. 대안으로, 꼬리 정맥 주사가 15cm 접시 뚜껑에 마우스를 고정하기 전에 수행 될 수있다. 경동맥 모델과 비교에서, 장간막 동맥 및 정맥 모델보다 쉽고 수술 집약적이다. 인해 지방 조직에 의한 선박의 커버리지로, 결과 섹션에서 언급하지만, 장간막 혈전증 모델 정맥 혈전증을 연구 더하지만 다른 생쥐 사이의 오차를 최소화하기 위해 더 큰 샘플 크기를 필요로한다.
이 모델의 제한 메커니즘이 명확하지 여전히 논쟁 점이다. 처음에,이 모델의기구의 FeCl3 내피 세포의 생성 ROS 유도 삭박 한 SU의 그것 것으로 추정bsequently 혈소판 부착, 응집 및 혈전 형성 6,11를 렌더링은 혈전 내피 밑층 혈액 성분에 노출되었다. 혈소판 GPVI 생쥐 항체로 전처리 혈소판 재구성함으로써, 우리는의 FeCl3 모델 혈소판 GPVI에 의존한다는 것을 증명하고, 차단 혈소판 GPVI 극적 50ml을 유도 혈전 형성 (19)를 억제 하였다. 이 발견은 이전 보고서 (38)와 일치하고 50ml을 모델 혈전증 (6)를 매개로 인간의 동맥 경화성 플라크 파열의 병태 생리를 모방 할 가능성이있을 수 있음을 시사한다. 그러나, 몇몇 최근의 연구는 혈관 벽에 적혈구의 부착뿐만 아니라, 혈장 단백질 및 적혈구의 29, 30의 FeCl3 유도 응집 물리 효과 등의 새로운 메커니즘을 제안 하였다. 이러한 새로운 통찰력이 모델의 잠재적 인 메커니즘은 더 복잡 할 수 있습니다 제안합니다.
혈소판 마우스로 DIL 표지 적혈구의 관류 한 다음 50ml을 -triggered 부상 7.5 %와 경동맥에 50ml을 유도함으로써, 우리는 손상된 혈관 벽에 부착하는 주요 세포가 혈소판 (그림 6과 온라인 동영상 5 것을 발견 ). 우리는 명백한 적혈구 밀착성 발견되지 않았고, 혈전에 적혈구의 축적이 포획의 결과 일 가능성이 가장 같았다. 우리의 결과는 일차 및 이차 지혈 (39)의 개념과 일치. 이전 보고서에서 우리 관찰 차이는 저산소증 및 주사 전자 현미경 검사를위한 50ml을 부상 경동맥이 좌심실 이전 않고 노출 한 쥐에서 제조 한 바, 동료 (30)의 연구에서와 같이 혈역학 변화 일 수있다 기계 통기가의 도움을. 혈중 산소 농도 및 혈역학 극적 모두 폐으로 감소되며가슴이 기계 환기없이 열린 후 심장 기능이 즉시 영향을받습니다. 산소 부족은 오랫동안 RBC의 접착력을 향상시킬 수있다 또한 응고 경로 및 혈전증 (40)의 트리거링 및과 관련이있다. 또 최근 간행물 부상 용기 (29)의 루멘 ~ 50 mm 크기의 FeCl3의 정상 상태 농도를 5 또는 10 분의 리드에 대해 50ml을 20 %의 매우 높은 농도가 경동맥의 치료를 보여 주었다 . 따라서 이들은 직접 다양한 혈액 성분으로 50ml을 50 mm의 주입 및 혈전 형성 29의 FeCl3의 동작에 대한 신규 한 2- 단계 메카니즘을 제안하도록 이끄는 응집 생체에의 FeCl3의 효과를 조사 하였다. 아주 흥미 있지만, 본 연구의 결과는 일반적으로 사용되는 모델의 FeCl3를 나타내지 않으므로주의하여 해석되어야한다. FEC의 고농도 달리리터 3 (용지에 표시된대로 20 %, 1M) 및 장기 치료 (5 또는 10 분), 우리의 이전 연구뿐만 아니라이 바 등. 1 분 동안 10 % 50ml을 치료 7 분 6,30 내 경동맥의 급격한 폐색 혈전 형성을 유도하기에 충분 있음을 증명하고있다. 또한, 50ml을 모델의 FeCl3의 더 낮은 농도를 사용하는 대부분의 실험에서 (5-7.5 %) 사용된다.
이 모델의 또 다른 제한으로 인해 내피 세포에 심각한 산화 손상뿐만 아니라 내피 발가 벗김 포스트 50ml을 처리,이 모델은 내피 세포의 염증 관련 혈전증을 연구 할 수있는 적절한 도구가 아닙니다 될 수 있다는 것이다. 그러나, 형광 표지 백혈구 관류와 조합 경동맥을 제조하는 이러한 기술을 이용하여, 우리는 염증성 내피 (41)에 대한 백혈구의 부착 및 롤링을 테스트 할 수있다.
써머에서진, 우리는 정제 및 경동맥에 높은 재현성 부상 생산 및 생체 내에 현미경 정확한 혈류 중단 시간을 정량화하기 50ml을 유발 된 혈관 손상 모델을 표준화했다. 이 모델은 항 응고 및 항 혈소판 약물을 테스트하기에 충분하고 민감하고, 또한 혈전 타겟 나노 의학의 연구에 적합하다. 혈소판 마우스 또는 후보 약물의 직접 혈관 내 주입에 골수 이식, 혈소판 주입과 함께, 우리는이 생체 7-10,16,19,42,43에 혈전증을 연구 할 수있는, 편리한 간단하고 중요한 도구임을 증명하고있다 .
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical Scissors - Tungsten Carbide | Fine Science Tools | 14502-14 | cut and hold skin |
| Micro-Adson Forceps - Serrated/Straight/12 cm | Fine Science Tools | 11018-12 | cut and hold skin |
| Metzenbaum Fino Scissors - Tungsten Carbide/Curved/Blunt-Blunt/14.5 cm | Fine Science Tools | 14519-14 | to dissect and separate soft tissue |
| Ultra Fine Hemostat - Smooth/Curved/12.5 cm | Fine Science Tools | 13021-12 | to dissect and separate soft tissue |
| Graefe Forceps - Serrated/Straight/10 cm | Fine Science Tools | 11050-10 | to dissect and separate soft tissue |
| Dumont #5 Fine Forceps - Biology Tips/Straight/Inox/11 cm | Fine Science Tools | 11254-20 | Isolate vessel from surounding tissue |
| Dumont #5XL Forceps - Standard Tips/Straight/Inox/15 cm | Fine Science Tools | 11253-10 | Isolate vessel from surounding tissue |
| Blunt Hook- 12 cm/0.3 mm Tip Diameter | Fine Science Tools | 10062-12 | Isolate vessel from surounding tissue |
| Castroviejo Micro Needle Holders | Fine Science Tools | 12061-02 | Needle holders |
| Suture Thread 4-0 | Fine Science Tools | 18020-40 | For fix the incisors to the plate |
| Suture Thread 6-0 | Fine Science Tools | 18020-60 | For all surgery and ligation |
| Kalt Suture Needles | Fine Science Tools | 12050-03 | |
| rhodamine 6G | Sigma | 83697-1G | To lebel platelets |
| FeCl3 (Anhydrous) | Sigma | 12321 | To induce vessel injury |
| Papaverine hydrochloride | Sigma | P3510 | To inhibit gut peristalsis. |
| Medline Surgical Instrument Sterilization Steam Autoclave Tapes | Medline | 111625 | To fix the mouse to the plate |
| Fisherbrand™ Syringe Filters - Sterile 0.22 µm | Fisher | 09-720-004 | For sterlization of solutions injected to mice |
| Fisherbrand™ Syringe Filters - Sterile 0.45 µm | Fisher | 09-719D | To filter the FeCl3 solution |
| Sterile Alcohol Prep Pad | Fisher | 06-669-62 | To sterilize the surgical site |
| Agarose | BioExpress | E-3120-500 | To make gel stage |
| Leica DMLFS fluorescent microscope | Leica | Intravital microscope | |
| GIBRALTAR Platform and X-Y Stage System with heating plate attached. | npi electronic GmbH | http://www.npielectronic.de/products/micropositioners/burleigh/gibraltar.html | |
| Streampix version 3.17.2 software | NorPix | https://www.norpix.com/ |
References
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