Summary
Protokoller er beskrevet for fabrikation af nedbrydeligt thermoresponsive hydrogels baseret på hydrazone cross-linking af polymert oligomerer på bulk skala, individuel, og nanoskala, sidstnævnte for forberedelsen af både gel nanopartikler og nanofibers.
Abstract
Mens forskellige smart materialer har været undersøgt for en lang række biomedicinske anvendelser (f.eks.medicinafgivelse, vævsmanipulering, bioimaging, osv.), er deres endelige kliniske anvendelse blevet hæmmet af manglen på biologisk relevante nedbrydning observeret for mest intelligente materialer. Dette er især sandt for temperatur-responderende hydrogels, som er næsten ensartet baseret på polymerer, der er funktionelt ikke-nedbrydelige (f.eks.poly(N-isopropylacrylamide) (PNIPAM) eller poly (oligoethylene glycol methylmethacrylat) (POEGMA) ). Som sådan, hvis du vil effektivt oversætte potentialet i thermoresponsive hydrogels at udfordringer af fjernstyret eller stofskifte-regulerede medicinafgivelse, scaffolds celle med afstemmelige celle-materiale interaktioner, theranostic materialer med potentiale for både billedbehandling og medicinafgivelse, og andre sådanne ansøgninger er en metode forpligtet til at gøre hydrogels (hvis ikke fuldt nedbrydeligt) mindst i stand til at renal clearance efter den krævede levetid af materialet. Med henblik herpå beskriver denne protokol forberedelse af hydrolytically-nedbrydelige hydrazone-crosslinked hydrogels på flere længdeskalaer baseret på reaktionen mellem maleinhydrazid og aldehyd-functionalized PNIPAM eller POEGMA oligomerer med molekylær vægte under den renale filtration grænse. Specifikt, metoder til at fabrikere nedbrydelige thermoresponsive bulk hydrogels (ved hjælp af en dobbelt tønde sprøjte teknik), hydrogel partikler (på både individuel ved hjælp af en mikrofluidik platform at lette samtidige blanding og Emulgering af forløber polymerer og nanoskalaen ved hjælp af en termisk drevet samlesæt og danne tvaerbindinger metode), og hydrogel nanofibers (ved hjælp af en strategi for reaktiv electrospinning) er beskrevet. I hvert tilfælde hydrogels med temperatur-responderende egenskaber svarende til dem, der opnås via konventionel frie radikaler cross-linking processer kan opnås, men hydrazone krydsbundet netværk kan være nedbrudt over tid til re-form den oligomere forløber polymerer og muliggøre regnskabsafslutningen. Vi forventer som sådan, disse metoder (som kan være generisk anvendes på alle syntetiske vandopløselige polymer, ikke bare smart materialer) gør det muligt lettere oversættelse af syntetiske smart materialer til kliniske applikationer.
Introduction
Smart materialer har tiltrukket stor opmærksomhed på grund af deres muligheder til reversible "on-demand" svar til eksterne og/eller miljømæssige signaler. Temperatur-responsive materialer har tiltrukket sig særlig interesse på grund af deres lavere kritisk løsning temperatur (LCST) adfærd, hvilket resulterer i temperatur-drevet nedbør ved temperaturer T > LCST1,2. I forbindelse med thermoresponsive hydrogels, denne lavere kritisk løsning temperatur adfærd er manifesteret ved reversibel hævelse/deaktivere-swelling begivenheder der resultere i temperatur-afstemmelige bulk størrelser (større på T < LCST)3, pore størrelser (større på T < LCST)4og interfacial egenskaber (mere hydrofile på T < LCST)5. Sådanne overgange er blevet bredt anvendt i medicinafgivelse (for eksterne eller miljømæssigt triggerable stof frigive4,6,7), tissue engineering og celle kultur (for thermoreversible celle vedhæftning / delaminering8,9,10), separationer (til switchable membran glasårer og permeabiliteter eller termisk genanvendelige diagnostiske understøtter11,12, 13), mikrofluid processer (for tænd-sluk ventiler regulerer strømmen14,15), og rheologiske modifikatorer (for temperatur-afstemmelige viskositeter16). De hyppigst undersøgte thermoresponsive hydrogels er baseret på poly(N-isopropylacrylamide) (PNIPAM)17, selv om store (og voksende) arbejde har også gennemført på poly (oligoethylene glycol methylmethacrylat) (POEGMA)2 ,18 og poly(vinylcaprolactam) (PVCL)19,20. POEGMA har tiltrukket sig særlig nylige interesse givet sin forventede forbedrede biokompatibilitet21,22og sin facile til tune LCST adfærd, i hvilke lineært forudsigelig blandinger af monomerer med forskellige antal ethylen oxid gentage enheder i deres sidekæder kan ændre LCST fra ~ 20 ° C til > 90 ° C2,23. Men hver af disse polymerer er udarbejdet af frie radikaler polymerisation og indeholder således en kulstof-kulstof rygrad, betydeligt begrænser potentielle nytte og translatability af sådanne polymerer i forbindelse med biomedicinske anvendelser, hvor nedbrydning (eller i det mindste kapacitet for regnskabsafslutning gennem renale filtration) er typisk et krav.
Som svar på denne begrænsning, vi har for nylig rapporteret udførligt om anvendelsen af hydrazone kemi (dvs., reaktionen mellem maleinhydrazid og aldehyd-functionalized før polymerer) til at forberede nedbrydeligt analoger af thermoresponsive hydrogels24,25,26,27,28,29. Den hurtige og reversibel reaktion mellem maleinhydrazid og aldehyd grupper ved blanding af functionalized forløber polymerer30 giver mulighed for både i situ gellation (aktivering facile injektion af disse materialer uden behov for kirurgisk implantation eller nogen form for ekstern polymerisering stimulus såsom UV bestråling eller kemiske indledning) samt hydrolytisk nedbrydning af nettet på en sats, der er kontrolleret af kemi og tæthed af crosslinking websteder. Derudover ved at fastholde de pre-polymerer, der anvendes til at forberede hydrogels under den renale filtration grænse molekylvægt, nedbrydes hydrogels lavet ved hjælp af denne fremgangsmåde tilbage til oligomere forløber polymerer, der kan blive fjernet fra kroppen25 ,27,28. Kombineret med lav cytotoksicitet og lav inflammatorisk væv respons induceret af disse materialer25,26,27, tilbyder denne tilgang en potentielt oversætbare metode for anvendelse af thermoresponsive Smart hydrogels i medicin, især hvis velkontrollerede nedbrydeligt analoger af sådanne hydrogels på alle længde skalaer (bulk, micro og nano) kan være opdigtet.
I denne protokol beskriver vi metoder til fremstilling af syntetiske thermoresponsive pre polymerer functionalized med kontrolleret antal maleinhydrazid og aldehyd grupper samt metoder til at anvende disse polymerer til at oprette hydrogels med veldefinerede dimensioner på forskellige længdeskalaer. Især dette manuskript beskrives fire forskellige metoder vi har udviklet for at styre blanding af reaktive maleinhydrazid og aldehyd-functionalized før polymerer og dermed skabe thermoresponsive hydrogel netværk med veldefinerede geometrier og morfologier:
Hvis du vil oprette nedbrydeligt bulk hydrogels med definerede størrelser, en templating strategi er beskrevet som de reaktive pre polymerer er indlæst i separate tønder af en dobbelt-tønde sprøjten udstyret på sin outlet med en statisk mixer og efterfølgende Co-extruderede i en silikone formen med den ønskede hydrogel form og dimensioner21,27 (figur 1).
Figur 1 : Skematisk af bulk hydrogel dannelse. Maleinhydrazid og aldehyd-functionalized polymer løsninger (med vand eller vandige buffer) er indlæst i separate tønder af en dobbelt tønde sprøjte og derefter Co-extruderede gennem en statisk mixer i en cylindrisk silikone støber. Hurtig i situ gellation efter blanding former en hydrazone crosslinked hydrogel, der er fritstående (når formen er fjernet) inden for få sekunder til minutter afhængigt af koncentrationen og funktionelle gruppe tæthed af forløber polymerer. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Hvis du vil oprette nedbrydeligt gel partikler på mikro-skalaen, en reaktiv mikrofluidik metode er beskrevet i hvilket prækursor polymer løsninger er samtidig blandet og emulgeret ved hjælp af en blød litografi-skabelonbaserede mikrofluid chip design, gør det muligt for den dannelsen af blandet reaktive polymer dråber der efterfølgende gel i situ til form gel mikropartikler med størrelser skabelonbaserede af emulsion (figur 2)31,32.
Figur 2 : Skematisk af gel microparticle dannelse via reaktive mikrofluidik. (A, B) Maleinhydrazid og aldehyd-functionalized polymer løsninger (med vand eller vandige buffer) fodres af sprøjten pumpe i separate reservoirer, der er tilsluttet nedstrøms på tværs af en zig-zag række kanaler designet til at skabe en trykgradient, at forhindre tilbagestrømning. Polymerer er derefter blandes lige før at blive klippet af paraffinolie flyder fra begge sider (også drevet af et sprøjten pumpe) og tvunget gennem en dyse, hvilket resulterer i strøm-fokusere produktion af vandig (polymer løsning) dråber i en kontinuerlig paraffin olie fase (Se (B) en illustration af området dyse og slipværktøj dannelsen processen). En yderligere to paraffin olie fjorde er placeret efter dyse til yderligere separat dråber i samling kanalen giver mulighed for komplet gellation inden partikel fjernelse fra laminar flow, hvorefter den resulterende microparticulate geler er indsamlet i en magnetisk stirred bæger; C billede af droplet generation proces på dysen (Bemærk at maleinhydrazid polymer er mærket som blå til at illustrere blanding)
Oprette nedbrydeligt gel partikler på nanoskala, en termisk drevet reaktive samlesæt metode er beskrevet som en løsning på én af reaktive forløber polymerer ("seed" polymer) er opvarmet til over sin LCST til at danne en stabil nanoaggregate, der er efterfølgende crosslinked ved tilsætning af supplerende reaktive forløber polymer ("crosslinking" polymer); den resulterende hydrazone crosslinked nanogel har en størrelse skabelonbaserede direkte af nanoaggregate (figur 3)28.
Figur 3 : Skematisk af nanogel dannelse via termisk drevet reaktive samlesæt. En vandig opløsning indeholdende (thermoresponsive) maleinhydrazid-functionalized polymer er opvarmet over sin lavere kritisk løsning temperatur til at skabe en stabil uncrosslinked nanoaggregate. Efter, en aldehyd-functionalized polymer føjes til bitmapgenkendelse nanoaggregate via hydrazone bond dannelse og dermed stabilisere nanogel partikel ved afkøling under LCST. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Hvis du vil oprette nedbrydelige nanofibers, er en reaktiv electrospinning teknik beskrevet som en dobbelt tønde sprøjten udstyret med en statisk mixer på sin outlet (som anvendes til fremstilling af bulk hydrogels) er knyttet til en standard electrospinning platform (figur 4 )33.
Figur 4 : Skematisk af hydrogel nanofiber dannelse via reaktive electrospinning. En dobbelt tønde sprøjte med en statisk mixer (indlæst som beskrevet for bulk hydrogels men også herunder en brøkdel af høj molekylvægt poly(ethylene oxide) som hjælpemiddel electrospinning) er monteret på en sprøjten pumpe, med nålen i slutningen af sprøjten forbundet til en høj spænding strømforsyning. Hydrazone crosslinking opstår under fiber spinning proces, således at når streamen rammer collector (enten aluminiumsfolie eller en roterende aluminium disk) nanofibrous morfologi bevares. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Anvendelsen af sådanne metoder til oprettelse af nedbrydeligt smart hydrogel netværk er påvist i denne protokol, ved hjælp af enten PNIPAM eller POEGMA som polymer af interesse; men de grundlæggende metoder beskrevet kan oversættes til enhver vandopløselige polymer, omend med passende justeringer for viskositet og (i tilfælde af den samlesæt nanogel fabrikationsanlæg metode) stabiliteten i pre-polymeren til at danne frø nanoaggregate.
Protocol
1. Sammenfatning af maleinhydrazid-functionalized polymerer
Bemærk: Følgende særlige opskrift er fastsat PNIPAM-mimetiske thermoresponsive POEGMA forløber polymer (PO10) med 30 mol % maleinhydrazid functionalization. PNIPAM og POEGMA forløber polymerer med forskellige fase overgang temperaturer kan forberedes ved hjælp af dette samme generelle metode men ændre type og forholdet mellem core monomerer anvendes (Se afsnit 1.2 til ændringer for forskellige POEGMA polymerer)21 , 25 , 27.
- Afvejes 37 mg af 2,2'-azobis(2-methylpropionate) (AIBMe, initiativtager), 3.1 g af diethylenglycol glycol methacrylat (M(EO)2MA), 0,9 g af oligoethyleneglycol methacrylat (OEGMA475, 475 g/mol n = 7-8 ethylen oxid gentage enheder), 523 µL acrylsyre (AA, comonomer), og 7,5 µL af thiolglycolic syre (TGA, kæde transfer agent) i en 20 mL hætteglas scintillation.
- PO0 (stuetemperatur overgang temperatur POEGMA), at bruge 4,0 g af M(EO)2MA (ingen OEGMA475). PO100 (ingen overgang temperatur POEGMA), at bruge 4,0 g af OEGMA475 (ingen M(EO)2MA).
Bemærk: Mellemliggende fase overgang temperaturer kan opnås baseret på brugen af mellemliggende blandinger af M(EO)2MA og OEGMA475, ifølge Lutz et al. 23 - Opløse alle reagenser i dioxan (5 mL/g samlede monomer) i en rund bund kolbe med en eller flere halse.
- Rense reaktion med kvælstof (UHP grade) flow i 30 min.
- Når renset, kolben anbringes i en forvarmet oliebad vedligeholdes ved 75 ° C i 4 timer under kvælstof og 400 rpm magnetiske omrøring.
- Efter 4 h, fjerne opløsningsmiddel ved hjælp af en rotationsfordamper indstillet til 50 ° C og 200 rpm.
- Opløse det resulterende polymer produkt i 150 mL deioniseret vand.
- Tilføje adipinsyre syre dihydrizide (ADH) på et fem gange kindtand overskud til antallet af AA restkoncentrationer indarbejdet i polymeren (i dette eksempel er AA omfatter 29 mol % af monomere enheder i polymerer fremstilles, som pr conductometric titrering).
- Justere pH af løsningen på pH 4,75 ved hjælp af 0,1 M HCl.
- Når pH-værdien har stabiliseret, tilføje N-(3-dimethylaminopropyl) -N'-ethylcarbodiimide (EDC) på en 5-fold kindtand overskydende til antallet af AA rester til stede).
- Opretholde reaktion pH 4,75 med dråbevis tilsætning af 0,1 M HCl over 4 h.
- Forlade reaktion at røre natten over.
- Hæld opløsningen produkt i tre ~ 30 cm lang dialyse rør (3500 Da molekylvægt cut-off, 1 inch tykkelse), ved hjælp af en tragt til at minimere spild. Brug en knivspids klemme til at lukke i bunden af røret inden fyldet ved at folde en lille (~ 2 cm) segment af rør til at forbedre klemme integritet; Gentag øverst (presser på for at fjerne luftbobler) når fyldet er fuldført. Sted rør inde i en 100-fold overskydende mængde deioniseret vand og henstår i mindst 6 h, fuldt ud erstatte vandet over seks cyklusser af dialyse at opnå ønskede renhed.
- Lyophilize dialyzed prøven for at opnå en endelig tørrede polymer produkt.
2. Sammenfatning af aldehyd-functionalized polymerer
- Syntese af aldehyd-forløber Monomer N-(2,2-Dimethoxyethyl) methacrylat (DMEMA)
- Sted 200 mL af en 20% w/v NaOH opløsning i en kolbe på 500 mL 3 hals runde-bunden.
- Cool løsning i isbad og opretholde en temperatur på 0 ° C med isen under reaktionen.
- Der tilsættes 50 mL af aminoacetyl aldehyd dimethyl acetal til den afkølede natriumhydroxidoploesning.
- Tilføj i 0,1 g af TEMPO ((2,2,6,6-Tetramethylpiperidin-1-yl) oxyl) og omrøres ved 400 omdrejninger i minuttet ved hjælp af en magnetisk røre bar indtil TEMPO er fuldt opløst.
- Tilføje 48 mL methacryloyl chlorid dråbevis ved hjælp af en burette over 2 h.
- Efter 2 h, dække reaktion fartøj med aluminiumsfolie og orlov til rør natten over.
- Ekstrakt produkt ved at tilføje reaktionsprodukt 75 ml petroleumsether i en 1 liter skilletragt, ryster, afgasning og kassere det øverste lag.
- Gentag trin 2.1.7 tre gange ved at føje det nederste lag produkt fra hver ekstraktionstrinet som den rå vare til den næste udvinding cyklus.
- Fjerne den endelige nederste lag produkt og overførsel til et 100 mL bægerglas.
- Tilføje ~ 5 g magnesium sulfat (Mg2SO4) til bægerglasset med monomer indtil en "snekugle" effekt er observeret.
- Der filtreres gennem et 100 mL Buchner tragt til at fjerne Mg2SO4.
- Skyl bægerglasset to gange med ~ 75 mL af tert-butyl methylether, hælde renseopløsningen gennem tragten hver gang.
- Overføre produktet til en 500 mL runde-bunden kolbe og fordampe opløsningsmiddel ved hjælp af en roterende fordamper ved stuetemperatur 200 RPM at indsamle det endelige produkt.
- Syntesen af polymerer, aldehyd-Functionalized
Bemærk: Følgende særlige opskrift er fastsat PNIPAM-mimetiske POEGMA forløber polymer (PO10) med 30 mol % aldehyd functionalization. PNIPAM og POEGMA forløber polymerer med forskellige fase overgang temperaturer kan forberedes ved hjælp af de samme generelle metode men ændre type og forholdet mellem core monomerer anvendes (Se afsnit 1.2 til ændringer for forskellige POEGMA polymerer)21 , 25 , 27.- Afvejes 37 mg af 2,2'-azobis(2-methylpropionate) (AIBMe), 3.10 g af diethylenglycol glycol methacrylat M(EO)2MA, 0,1 g af oligo ethylenglycol methacrylat (OEGMA475, 475 g/mol, n = 7-8 ethylen oxid gentage enheder), 1,30 g N-(2,2- dimethoxyethyl) acrylamid (DMEMA) og 7,5 µL af thiolglycolic syre (TGA) ind i en 20 mL hætteglas scintillation.
- PO0 (stuetemperatur overgang temperatur POEGMA), at bruge 4,0 g af M(EO)2MA (ingen OEGMA475). PO100 (ingen overgang temperatur POEGMA), at bruge 4,0 g af OEGMA475 (ingen M(EO)2MA).
Bemærk: Mellemliggende fase overgang temperaturer kan opnås baseret på brugen af mellemliggende blandinger af M(EO)2MA og OEGMA475, ifølge Lutz mfl. 23 - Opløse alle reagenser i dioxan (5 mL/g samlede monomer) i en rund bund kolbe med en eller flere halse.
- Rense reaktion med kvælstof (UHP grade) flow i 30 min.
- Når renset, sted kolbe i en forvarmet oliebad vedligeholdes ved 75 ° C i 4 timer under kvælstof og 400 rpm magnetiske omrøring.
- Efter 4 h, fjerne opløsningsmiddel ved hjælp af en rotationsfordamper indstillet til 50 ° C og 200 rpm.
- Opløse det resulterende polymer produkt i 100 mL deioniseret vand H2O.
- Der tilsættes 50 mL 1 M HCL i det opløste løsning og rør under magnetiske omrøring (400 RPM) i 24 timer til fuldt hydrolyserer acetal funktionaliteter i DMEMA.
- Efter færdiggørelsen af reaktion, polymer opløsningen overføres til dialyse slanger, som pr trin 1.13.
- Lyophilize dialyzed prøven for at opnå en endelig tørrede polymer produkt.
3. fabrikation af Hydrazone Crosslinked Bulk Hydrogels
- Opløse maleinhydrazid og aldehyd functionalized polymerer separat i 10 mM fosfatbufferet saltopløsning (PBS) eller nogen ønskede vandig buffer, til at skabe løsninger af ønskede koncentrationer.
Bemærk: Masse fusioner mellem 5-40 wt % anvendes typisk, med gellation ved lavere koncentrationer muligt hvis højere funktionsgruppe fraktioner er til stede på polymerer. - Ved hjælp af en enkelt tønde sprøjte til transfer løsninger, indlæse hver forløber løsning (~ 1 mL hver) til separat tønder af en dobbelt tønde sprøjte (2,5 mL volumen, forholdet 1:1 sprøjte) knyttet til en statisk mixer (1,5" længde) og (valgfrit) en sprøjte (typisk 18 G, 1,5" længde for in vitro-undersøgelser) og (valgfrit) en sprøjte (typisk 18 G, 1,5" længde for in vitro-undersøgelser).
- Forberede forme af ønskede tykkelse, form og diameter af stansning huller i en silikone gummi ark.
Bemærk: I en typisk eksperiment, en standard punch sæt bruges til punch et 7 mm diameter cylindrisk hul indeni en 1/16" tykke silikone gummi ark (samlede reservoir ~ 300 µL). - Mount silikone formen på en standard glas mikroskop skub, så hullerne knytnæveslag i formen er helt bakkes op af glas. En 0,1 M HCl vask af glasset er anbefalede men ikke nødvendig før montering af silikone formen.
- Co presse dobbelt tønde sprøjte indhold via statisk mixer helt fylde (eller lidt for meget, med en menisken øverst) silikone formen.
Bemærk: Flere prøver kan forberedes i løbet af én ekstrudering prøve, forudsat gellation tid er på den samme størrelsesorden eller længere end den totaltid krævede at fylde flere forme. - Placer en anden standard glas objektglas oven på formen og afvente gellation at fuldføre.
Bemærk: De standard opskrifter beskrevet i syntesen afsnit gel inden for < 1 minut; langsommere gellation gange (og dermed længere kræves ventetider) er observeret ved lavere funktionsgruppe tætheder, lavere polymer koncentrationer og/eller højere brøkdele af OEGMA475 i forhold til M(EO)2MA (for POEGMA hydrogels). - Fjern den øverste objektglas og brug en spatel til at skubbe hydrogel fra silikone gummi skimmel.
- Løft mug fra lavere objektglas til at genoprette hydrogels for yderligere test.
4. fabrikation af Hydrazone Crosslinked Gel mikropartikler
- Fabrikation af mikrofluid Chip
- Dehydrere en silicium wafer (D = 76.2 mm, 380 µm tykkelse, P-dopede, < 100 > orientering) ved opvarmning på en kogeplade ved 200 ° C i 5 min.
- Center wafer på et spin coater og frakke en ~ 100 µm tykt lag af SU-8 100 photoresist ved at anvende ~ 7 mL af SU-8 modstå, ramping spin hastighed op til 3000 rpm med en hastighed på 500 rpm/s, og derefter holde hastigheden ved 3000 rpm i 30 sekunder.
- Pre bage belægning på 65 ° C i 10 min og derefter soft-bage belægning på 95 ° C i 30 min.
- Udskrive en photomask på en transparent med mikrofluid mønster defineret af figur 2A, således at de gennemsigtige sektioner er det ønskede mønster af polymeriseret photoresist lag.
- Indsæt photoresist-belagt silicium wafer og photomask i en maske aligner og udsætte wafer at 365 nm lys til 95 s (6.5 W eksponering magt).
- Bage den mønstrede wafer i 10 min. ved 95 ° C, først ved at placere det på en kogeplade på 65 ° C og efterfølgende varme kogeplade til 95 ° C ved 10 ° C/min..
- Fjerne wafer fra kogeplade og sted i et 500 mL bægerglas indeholdende 100 mL SU-8 udvikleren i mindst 10 min, hvirvlende wafer langsomt i opløsning i hele til at fjerne ikke-eksponerede photoresist. Efter 10 min., skyl den mønstrede wafer med isopropanol og tør luft. Gemme den mønstrede wafer i et køligt og tørt miljø væk fra lys når den ikke er i brug for blød litografi replika støbning.
- Sted mønstrede mikrofluid skimmel i en petriskål. Position ~ 10 mm længder af L/S 13 silikoneslanger på indgange og udgange af chippen.
- Hæld ~ 10 mL af poly (dimethyl siloxan) (PDMS; fremstilles ved at blande silikoneelastomer Base og silikoneelastomer hærdning Agent i forholdet 10:1) på toppen af chip, omhyggeligt undgår indarbejde eventuelle PDMS inden for den indsatte silikoneslanger.
- Placere en petriskål i et vakuumkammer i ~ 10 min at fjerne luftbobler fremturer i og omkring den mønstrede struktur under hærdning.
- Helbrede PDMS ved at placere petriskålen indeholdende mønstrede mug og uhærdet PDMS på en kogeplade på 85 ° C i 2-3 timer.
- Omhyggeligt skrælle den hærdede PDMS fra mønstrede silicium wafer at udsætte den bløde Litografisk mønstrede PDMS replika af formen mikrofluid.
- Sted den mønstrede PDMS og et glas dias på hovedet i en high-power plasma renere med en luft feed. Anvende plasma på 200 mTorr og 45 W for 90 s obligation PDMS til glas diaset og oprette den endelige mikrofluid chip.
- Syntese af Gel mikropartikler
- Forberede maleinhydrazid-functionalized PNIPAM (PNIPAM-Hzd) ved at opløse NIPAM (4,5 g), acrylsyre (0,5 g - 15 mol % total monomer), thioglycolic syre (TGA, 80 µL) og 2,2-azobisisobutyric syre dimethyl ester (AIBME, 0.056 g) i 20 mL af vandfri ethanol og efterfølgende følge trin 1.4-1.14 at udfylde syntesen, selv om skiftende reaktion temperaturen til 56 ° C i trin 1,5.
- Forberede aldehyd-functionalized PNIPAM (PNIPAM-Ald) ved at opløse NIPAM (4 g), N-(2,2-dimethoxyethyl) methacrylat (DMEMA, 0,95 g - 13.4 mol % total monomer), thioglycolic syre (TGA, 80 µL), og 2,2-azobisisobutyric syre dimethyl ester (AIBME, 0.056 g) i 20 mL ethanol og derefter følge trin 2.2.4-2.2.10 for at udfylde syntesen, selv om skiftende reaktion temperaturen til 56 ° C i trin 2.2.5.
- Opløses PNIPAM-Hzd og PNIPAM-Ald på 6 wt % i deioniseret vand og belastning i separate standard 5 mL sprøjter.
- Opløs 1 wt % nonionisk overfladeaktivt stof (fx Span 80) i tunge paraffinolie og indlæse løsningen i en standard 60 mL sprøjte.
- Tilsluttes to separate polymer inlet kanaler på mikrofluid chip og paraffin olie løsningen olie inlet kanal på mikrofluid chip via 1/32" ID silikone slanger (~ 30 cm længde pr. indgang, to forløber polymer løsning sprøjter individuelt ~ 45 cm længde pr. outlet).
- Ved hjælp af to separate infusion sprøjte pumper (et for olie opstrøms, en for olie tilføjet efter dysen), levere olien i chip med en væskehastighed mellem 1,1 mL og 5,5 mL/h uden at starte polymer flow til at prime chippen og sikre chippen er fejlfri og operationelle vedligeholdes (typisk over en periode på 30 min).
- Ved hjælp af en separat infusion sprøjten pumpe levere hver af vandige polymer løsninger til chip med en væskehastighed på 0,03 mL/h.
- Efter en indledende stabiliseringsperiode skal sikre, at strømmen har ekvilibreres og ensartede partikler dannes (30 min - 1 h), indsamle partikler i en magnetisk stirred rund bund kolbe.
- Indsamle partiklerne, indtil alle olie er forbrugt (12-55 h, afhængigt af flow). Stop sprøjte pumper, og hvis det ønskes, straks pumpe vand i stedet for forløber polymer løsninger gennem chip til at rense. Men da den hurtige in situ gellation af disse materialer, når strømmen afbrydes, det anbefales at bruge en ny chip for hvert særskilt eksperiment.
- Slukke den magnetiske omrøring og lad gel mikropartikler at bilægge. Dekanteres off alle tilgængelige paraffinolie ved hjælp af en pipette.
- For at fjerne de resterende paraffinolie, vaske gel mikropartikler med pentan (anvendt på en volumen på 10 mL for hver 0,5 mL af microparticle volumen), energisk mix emulsion for ~ 1 minut, tillade gel mikropartikler at genetablere sig for ~ 1-2 timer, og dekanteres den resterende organiske fase ved hjælp af en pipette. Gentag mindst 5 gange for at sikre fuld paraffin olie fjernelse.
- Resuspend gel mikropartikler i 10 mL deioniseret vand inde i en 20 mL hætteglas scintillation og rense hætteglas med kvælstof natten til at fjerne enhver resterende pentan.
5. fabrikation af Hydrazone Crosslinked Nanogels
- Opløse stamopløsninger af PNIPAM-Hzd (1 w/v%) og PNIPAM-Ald (1 w/v%) i ionbyttet vand. Forberede PNIPAM-Hzd og PNIPAM-Ald, som beskrevet i afsnit 4.2.1 og 4.2.2, henholdsvis.
- Opvarme en 5 mL alikvot af PNIPAM-Hzd stamopløsningen til 70˚C ved hjælp af et oliebad under magnetiske omrøring (350 RPM) inde i en 20 mL hætteglas scintillation.
Bemærk: Løsningen bliver uigennemsigtigt (dvs. temperaturen overstiger den lavere kritiske løsning temperatur af PNIPAM-Hzd), men ingen synlige bundfald bør være dannet. - Tilføje en 0,25 mL alikvot af PNIPAM-Ald (5-20 wt % af massen af PNIPAM-Hzd findes i opløsningen frø) drop-wise oploesningen opvarmet PNIPAM-Hzd over en periode på 5-10 s.
- Fortsætte blanding løsning i scintillation hætteglas for yderligere 15 minutter, efter hvilke fjerne udsnit fra den oliebad og tillade produkt køle af til rumtemperatur natten over.
- Dialyze den resulterende nanogels over 6 x 6 timers cyklusser (ved hjælp af en 3500 kDa MWCO dialyse membran) mod deioniseret vand for at fjerne eventuelle ikke-krydsbundet polymer. Hvis det ønskes, lyophilize til opbevaring.
6. fabrikation af Hydrazone Crosslinked Nanofibers
- Forberede maleinhydrazid-functionalized POEGMA (POEGMA-Hzd) ved at opløse 37 mg dimethyl 2,2'-azobis(2-methylpropionate) (AIBMe), 4,0 g oligoethyleneglycol methacrylat (OEGMA475, 475 g/mol, n = 7-8 ethylen oxid gentage enheder), og 0,25 g acrylsyre (AA) i 20 mL dioxan og efter trin 1.3-1.14 at udfylde syntesen.
- Forberede aldehyd-functionalized POEGMA (POEGMA-Ald) ved at opløse 50 mg dimethyl 2,2'-azobis(2-methylpropionate) (AIBMe), 4,0 g oligoethyleneglycol methacrylat (OEGMA475, 475 g/mol, n = 7-8 ethylen oxid gentage enheder), og 0,60 g N-(2,2- dimethoxyethyl) methacrylat (DMEMA) i 20 mL dioxan og følgende trin 2.2.3-2.2.10 til at udfylde syntesen.
- Opløse POEGMA-Hzd (15 wt %) og POEGMA-Ald (15 wt %) i separate deioniseret vand løsninger.
- Opløse poly (ethylenoxid) (PEO, Mw= 600 x 103 g/mol, 5 wt %) i ionbyttet vand. Mix 1 mL af PEO med hver reaktive POEGMA løsning parat i trin 6.3 til at oprette endelige forløber løsninger af 7,5 wt % POEGMA forløber polymer og 2,5 wt % PEO.
- Læg de to løsninger i separate tønder af samme dobbelt-tønde sprøjten beskrevet i punkt 3 (herunder også de 1,5" statisk mixer) og montere dobbelt tønde sprøjten på en infusion sprøjten pumpe.
- Knytte en statisk mixer og en stump-tip 18G nåle til dobbelt-tønde sprøjten.
- Tilslut en høj spænding strømforsyning til blunt-spids nål, funderet på collector.
Bemærk: Samlere består enten af en 10 mm x 10 mm kvadrat af aluminiumsfolie eller en ~ 10 mm diameter aluminium disk spinning med en hastighed på 200 rpm, begge monteret vinkelret på nålen i en afstand af 10 cm fra enden af nålen. - Start sprøjten pumpe med en sats på 0,48 mL/h, og samtidigt tænde en høj spænding på 8,5 kV til at udføre electrospinning og skabe nanofibers.
- Fortsæt electrospinning som ønskede at gøre stilladser af forskellige tykkelser, eller indtil inlet løsninger er opbrugt.
- Hvis du vil fjerne PEO electrospinning støtte, suge de indsamlede stilladser for 24 h i ionbyttet vand.
Representative Results
Bulk hydrogels ekstruderes fra en dobbelt tønde sprøjte i en silikone støber svarer til dimensioner af mug og blive fritstående efter skimmel fjernelse; gellation opstår typisk sekunder til minutter følgende Co ekstrudering afhængigt af polymer prækursorer anvendes. Typiske karakterisering via hævelse (målt ved gravimetrisk analyse ved hjælp af en celle kultur indsætte nemt fjerne hydrogel fra den hævelse løsning), thermoresponsivity (målt ved hjælp af samme teknik men cykling inkubation temperatur ovenfor og under fase overgang temperatur) viser nedbrydning (målt ved hjælp af den samme teknik, men over længere perioder), og shear eller trykstyrke modulus (målt ved hjælp af 2 mm tyk og 7 mm diameter støbt prøver) tunability af hydrogel svar afhængig af kemi forløber polymer (specifikt for POEGMA, forholdet mellem korte til lange kæde OEGMA monomerer bruges til at forberede hydrogel), muldvarp brøkdel af funktionelle grupper på forløber polymerer, og koncentrationen af dem forløber polymerer (figur 5)27.
Mikrofluidik fører til dannelsen af veldefinerede gel mikropartikler på størrelse skala fra 25-100 µm, med den størrelse kan styres baseret på strømningshastigheder af olie og/eller kombinerede vandig polymer faser (figur 6A)31. Hot scene Optisk mikroskopi bekræfter at gel mikropartikler opretholde thermoresponsive karakteren af bulk hydrogels, viser reversible temperatur-afhængige hævelse-deswelling med kun en lille hysterese på cyklus 1 (kan henføres til irreversibel brint bond dannelse mellem tilstødende akrylamid grupper i sammenklappet tilstand34) i overensstemmelse med den konstaterede i bulk PNIPAM hydrogels (fig. 6B)32. Desuden forringe gel mikropartikler tilbage til deres oligomere prækursorer over tid, gør det muligt for renal clearance (figur 6 c)32.
Samlesæt drevet af nanoaggregation af en maleinhydrazid-functionalized PNIPAM polymer i en opvarmet løsning efterfulgt af crosslinking med en aldehyd-functionalized PNIPAM polymer resulterer i meget monodisperse nanogels (polydispersity < 0,1) på den størrelse anvendes 180-300 nm, afhængigt af processen (figur 7A)28. Nanogels bevare den typiske thermoresponsive funktionsmåde af konventionelle frie radikaler crosslinked PNIPAM nanogels, med lavere grader af termiske deswelling observeret som mere tværbindingsmidler polymer blev tilføjet (fig. 7B). Nanogels kan frysetørret og redispersed uden en ændring i partikelstørrelse (figur 7C) og nedbrydes med tiden via hydrolyse til re-form oligomere forløber polymerer, der anvendes til at formulere nanogels (figur 7D).
Reaktive electrospinning skaber en nanofibrous hydrogel struktur (fig. 8A), nanofiber diametre på rækkefølgen ~ 300 nm opnåeligt uden synlige electrosprayed partikler præsentere33. Iblødsætning af POEGMA-baseret nanofibers i vand resulterer i hurtige hydrering (omtrent to størrelsesordener hurtigere end opnået med en bulk gel af samme sammensætning, figur 8B), men fastholder nanofibrous morfologi over 8-10 uger forud for hydrolytisk nedbrydning på fysiologiske tilstande; hurtigere nedbrydning er observeret i syre-katalyseret miljøer, som forventet på grund af potentialet for syre-katalyseret hydrazone bond nedbrydning (fig. 8C). Nanofibrous strukturer er også mekanisk robust i både tørre og hævede staterne over flere cyklusser, muliggør nem håndtering og gentagne dræning (figur 8D).
Figur 5 : Egenskaberne for in situ -geldannende bulk nedbrydelige thermoresponsive hydrogels. (A) repræsentant POEGMA gel netværk mikrostrukturer og bulk hydrogel billeder med tilsvarende gellation gange som en funktion af mole % indarbejdelse af OEGMA475 i forløber polymerer; (B-C) Opbevaring modulus af PO100 hydrogels af varierende (B) forløber polymer koncentration og (C) mole % funktionelle gruppe vedtægter pr. forløber polymer; (D-F) Lægemiddels egenskaber af POEGMA hydrogels som en funktion af OEGMA475 mole % iblanding: (D) opbevaring modulus (E) nedbrydning profil i 1 M HCl og (F) volumen fase overgang temperatur i reaktion temperatur ændre over området 20-60 ° C. Alle fejllinjer udgør n standardafvigelse = 4 gentagne målinger. Tilpasset fra reference27 med tilladelse fra Elsevier. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6 : Egenskaberne for nedbrydeligt gel mikropartikler fra reaktiv mikrofluidik. (A) effekt af paraffin olie flow på (renset) gel microparticle størrelse i vand; B Thermoresponsivity af renset gel mikropartikler i vand efter en enkelt varmecyklus ovenfor og nedenfor volumen fase overgang temperatur; (C) visuel vurdering (fotos) og gel gennemtrængning kromatografi spor (graf) bekræfter nedbrydning af gel mikropartikler tilbage til deres forløber polymer komponenter (her, i 1 M HCl at lette accelereret nedbrydning på tidsskalaen Imaging); skalalinjen = 100 µm. Adapted fra reference32. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7 : Egenskaberne for nedbrydelige nanogels fra reaktiv samlesæt. (A) partikel størrelse fordelinger af nanogels tilberedt med forskellige aldehyd: maleinhydrazid polymer masse nøgletal fra dynamisk lysspredning (indsatser: transmissions elektron Mikrograf bekræfter den sfæriske karakter af nanogels); B Thermosensitivity af selvsamlede partikler som funktion af massen forholdet mellem aldehyd: maleinhydrazid polymer, der anvendes til at forberede nanogels (fra dynamisk lysspredning), med fejllinjer repræsenterer n standardafvigelse = 4 replikater; (C) visuel bekræftelse af manglen nanogel sammenlægning både før og efter ingot; (D) visuel bekræftelse af syre-katalyseret nedbrydningen af nanogels (her i 1 M HCl i overensstemmelse med andre studier ovenfor); (E) gel gennemtrængning chromatografen spor af nanogel nedbrydningsprodukter med angivelse af deres lighed med maleinhydrazid og aldehyd-functionalized forløber polymerer. Tilpasset med tilladelse fra reference28. Copyright 2015, American Chemical Society. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 8 : Egenskaberne for nedbrydelige nanofibers fra reaktive electrospinning. (A) scanning elektronmikroskopi billeder af nanofibers i tør tilstand (venstre), halvdelen dyppet i vand (midterste, tynd film), og helt gennemblødt i vand natten over (lige, tyk stillads); B hævelse af nanofibrous hydrogel (rød) i forhold til en bulk hydrogel (blå) af samme sammensætning, med fejllinjer repræsenterer n standardafvigelse = 4 replikater; (C) Scanning Elektron Mikroskopi og (indsatser) visuelle billeder sporing af syre-katalyseret nedbrydning af nanofibers i 1 M HCl; (D) trækstyrke cykling af tørt (80 cyklusser, 20% brudforlængelse/cyklus) og hævede (325 cyklusser, 10% brudforlængelse/cyklus i 10 mM PBS) electrospun nanofibrous hydrogels. Figur ændres fra reference33 og gengivet med tilladelse fra Royal Society of Chemistry. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Vi har med succes anvendt alle disse fabrication teknikker til flere polymer systemer ved hjælp af kun små variationer af metoderne beskrevet i detaljer ovenfor for PNIPAM og POEGMA; brugere af disse protokoller skal dog være bevidste om de potentielle problemer, der kan opstå, når andre polymerer erstattes i disse processer. Forøge viskositeten af forløber polymerer kan navnlig negativ indflydelse både processibility (især i metoden mikrofluid) samt effektiviteten af blanding af to forløber polymerer. Derudover skal gellation tidspunktet for polymerer kontrolleres på en sats, der er afhængige af morfologi målrettet for at undgå for tidlig gellation, der tjener til at hæmme flow eller forhindre interdiffusion de reaktive pre polymerer, afgørende for at danne den ønskede homogen gel strukturer. De specifikke begrænsninger af hver strategi, såvel som metoder vi har brugt til at tilpasse disse tilgange til at løse sådanne begrænsninger på hver fabrikation længde skala, er beskrevet nedenfor.
Bulk hydrogels via dobbelt tønde sprøjte Co ekstrudering
Gellation tid er den centrale variabel til kontrol for at sikre effektiviteten af en dobbelt tønde sprøjte teknik for at danne bulk hydrogels. Polymerer, der gel for hurtigt ved kontakt (< 1-2 s) kan blokere en statisk mixer, enten stoppe strømmen helt eller resulterer i ikke-støkiometriske mængder af to forløber polymerer er ekstruderet fra sprøjten. Vi har fundet, at gellation gange > 5 s foretrækkes (men ikke påkrævet) for brug af denne teknik; Dette er især vigtigt, hvis Repliker hydrogels er at være støbt til fysiske eller mekaniske analyser til at sikre, at hver hydrogel stemmer har samme sammensætning. Gellation tid kan nemt ændres ved at ændre tæthed af reaktive funktionelle grupper på en eller begge forløber polymerer (lavere funktionsgruppe tæthed fører til langsommere gellation) eller ændre koncentrationen af forløber polymerer bruges til at danne gel ( lavere koncentrationer fører til langsommere gellation)21. Skiftevis, erstatter gruppen (mere reaktiv) aldehyd med gruppen (mindre reaktiv) keton som electrophile i den anvendte agars par betydeligt reducerer tid, gellation uden væsentligt ændring af sammensætningen af den resulterende hydrogel35 ; polymerer tilberedt med blandinger af aldehyd og keton monomere prækursorer kan bruges til at tune gellation tid som ønskede uden at ændre koncentrationen af forløber polymerer, der anvendes (og dermed den masse procentdel af faste stoffer i den resulterende gel dannet).
Vi bemærker også, at de første hydrogel stemmer ikke altid har de samme egenskaber som efterfølgende hydrogels stemmer, en observation tilskrives mindre forskelle i den hastighed, hvormed indholdet af to tønderne faktisk nå en statisk mixer. Som et resultat, vi typisk prime dobbelt tønde sprøjten ved strengpresning en lille (< 0,3 mL) brøkdel af gel før indlede trykstøbning proces for at minimere sådanne variabilitet. Endelig, mens ikke normalt problematisk, når du bruger oligomere syntetiske pre polymerer, viskositet af én eller flere forløber polymer løsninger kan udgøre en udfordring i forbindelse med denne teknik, både for at lette strømmen ved hjælp af simple tommelfinger depression samt fremme af effektiv blanding inden for en statisk mixer. Dog lidt overraskende, selv forløber polymer løsninger med stærkt forskellige viskositeter stadig danne relativt homogene hydrogels ved hjælp af de statisk mixer vedhæftede filer, der er beskrevet i listen over dele (f.eks. PNIPAM med en høj Molekylær vægt kulhydrat26), tyder på, der drejer sig om ineffektive blanding som følge af mis matchede viskositeter kan ikke være væsentlig mindst på bulk-skalaen. Hvis det kræves, kan brugen af en sprøjten pumpe (i stedet for thumb) drev strømmen og/eller brug af en større gauge kanyle ved afgangen hjælpe med at overvinde spørgsmål i forbindelse med presbarhed i disse systemer.
Individuel hydrogels via reaktive mikrofluidik
Det vigtigste skridt tilknyttet mikrofluidik tilgang til gel microparticle fabrikation er priming af mikrofluidik chip med de to reaktive polymerer. Hvis polymerer leveres med forskellige belastninger eller til forskellige priser i chippen, at forskellen i tryk kan køre tilbagestrømning af en forløber polymer løsning i reservoiret (eller i det mindste mod reservoiret) af andre forløber polymer. Dette resulterer i gellation opstrøms fra partikel dannelse, effektivt blokerer strømmen og dermed kræver chip bortskaffelse. Stien torturous præget mellem hver reservoir og blanding skaber en betydelig modstand mod tilbagestrømning; selv en uddannet operatør vil lejlighedsvis gel en chip før en stabil flow regime er opnået. Baseret på vores erfaringer, er mellem 1-2 min typisk forpligtet til at stabilisere strømme efter indledningen af droplet dannelse (som tidens forholdsvis polydisperse gel mikropartikler er produceret); Hvis der ingen problemer er observeret inden for de første 5-10 minutter af operation, er det sandsynligt, at flere timers kontinuerlig monodisperse partikel produktion kan opnås. Brugen af forløber polymerer med relativt godt matchede viskositeter samt ikke-øjeblikkelige gellation gange (mindst > 15 s at foretrække) høj grad hjælper med at undgå sådanne problemer og fremme dannelsen af stabil strømme.
Bemærk at forskellige flow priser spænder fra 0,01-0,1 mL/h i den vandige fase og 1,1-5.5 mL/h i fasen for olie er blevet testet ved hjælp af denne chip design, fører til fabrikation af partikler på størrelsesområde ~ 25-100 µm ifølge shear anvendes på den strøm-fokusere junction; hurtigere strømningshastigheder svare til højere shear og dermed mindre partikler dannet31,32. Varierende olie flow-hastighed samtidig med at holde den samlede vandige strømningshastighed lav (~0.03 mL/h, som nævnt i protokollen) blev fundet for at være mest effektivt at styre gel microparticle størrelse uden at kompromittere enten monodispersity eller levetid på enheden, var som begge observeret at signifikant fald i den højere ende af de citerede samlede vandig strømningshastigheder. Større olie strømningshastigheder (> 5,5 mL/h) til at oprette mindre partikler er mulige, men øget risiko for chip delaminering (en fælles begrænsning stødt med plasma-bonded PDMS mikrofluid chips). Limning chips ved hjælp af en anden metode kan aktivere hurtigere strømningshastigheder og dermed mindre gel microparticle produktion, en strategi, vi er i øjeblikket ved at undersøge. Reducere størrelsen på dysen kan også bidrage til at reducere størrelsen af mikropartikler, der kunne produceres, omend på en forhøjet risiko for for tidlig gellation inden partikel dannelse. Langsommere strømningshastigheder tendens til at føre til ustabilitet og dermed højere polydispersities og en øget risiko for chip gellation; denne begrænsning kan overvindes med en multikanal mikrofluid flow control system, der har højere stabilitet og højere opløsning end standard sprøjte pumper anvendes i denne protokol.
Valg af olie var afgørende for succes i denne protokol, som tungere olier (positiv med hensyn til at forebygge gel microparticle bymæssigt område efter samling) førte til meget mindre konsekvent partikel dannelse på dysen end lys silikone olie rapporteret i i protokollen. Vi hypotesen dette reduceret reproducerbarhed er et resultat af lavere konsistens af sprøjten pumpe tungere olier, fører til mere variabel shear på den blanding tidspunkt. Undgå gel microparticle sammenlægning i samling kolbe var også en udfordring, især straks ved afgangen fra den mikrofluid enhed på hvilket tidspunkt i situ gellation ikke var komplet og store antal af tilgængelige reaktive funktionelle grupper var til rådighed for form broer mellem kolliderede partikler i samling bad. Denne udfordring er rettet af: øge længden af exit-kanal på mikrofluid chip, selv, opretholde gel mikropartikler i laminar flow i en længere periode af tid til at fremme mere komplet gellation; tilføje side kanaler efter dyse til foder mere olie ind i chip og dermed bedre separat gel mikropartikler i denne post blanding kanal uden at det påvirker felterne shear på dysen, selv eller partikel produktion sats; og tilføje en magnetisk mixer samling kolben at undgå gel microparticle bundfældning og opretholde en større gennemsnitlig adskillelse mellem tilstødende partikler. Mens meget langsom geldannende polymerer ville sandsynligvis forbedre enhed stabilitet og minimere problemer med grunding, observeret sådanne systemer også til betydeligt øge risikoen for gel microparticle sammenlægning, som et større antal reaktive funktionelle grupper forbliver ureageret (og herigennem købedygtig form Inter partikel broer) over en længere periode. Som sådan, gellation gange på rækkefølgen af 15-60 s synes at være optimal for denne teknik: langsomt nok til at muliggøre priming men fast nok til at sikre mest reaktive funktionelle grupper der forbruges før gel mikropartikler spændende laminar flow-kanal ind i den samling kolbe.
Endelig er fjernelse af templating olie afgørende for at sikre, at de resulterende partikler egenskaberne smart forventede baseret på sammensætningen af de pre polymerer tilføjet og aktiverer brugen af disse partikler i en biomedicinsk kontekst. Pentan vask fremgangsmåden var meget effektiv i denne henseende til generelle gel microparticle produktion. Men anvendelsen af denne teknik i en direkte biomedicinsk sammenhæng (fx, på chip celle indkapsling) ville kræve fornyet evaluering af denne protokol. Vi har også udforsket brugen af olivenolie, foreslog for at være en mere inert olie i forbindelse med at kontakte celler36, som den dispergens. Mens partikel dannelse var muligt, var gel microparticle populationer væsentligt mere polydisperse end der kunne opnås med mineralsk olie, i det mindste med den aktuelle chip design. Således, mens chippen ser ud til at kunne tilpasses både syntetisk polymer og naturlige polymer gel microparticle dannelse31, et modificeret design kan være forpligtet til at udnytte denne teknik mere bredt på tværs af alle mulige materialer kombinationer.
Nanoskala hydrogels via reaktive samlesæt
Nanogels er blevet dannet ved hjælp af en meget bred vifte af forarbejdning betingelser, herunder forskellige koncentrationer af frø polymer (0,5-2 wt %), forskellige nøgletal for crosslinking:seed polymer (0,05-0,2), forskellige temperaturer (40-80 ° C), forskellige blanding hastigheder ( 200-800 rpm), og forskellige varme gange efter tilsætning af crosslinker polymer (2-60 min)28. Med hensyn til koncentrationer er tendenserne observeret generelt som ville blive forudsagt, som højere koncentrationer af frø polymer føre til større nanogels og højere andele af crosslinker:seed polymer føre til nanogels med højere bitmapgenkendelse tætheder og dermed lavere thermoresponsivities. Det skal understreges, at stigende frø polymer koncentration for høj i sidste ende fører til bulk sammenlægning i modsætning til nanoaggregation, i overensstemmelse med hvad er observeret i den konventionelle frie radikaler nedbør proces for at danne thermoresponsive nanogels3. Kortere varme gange fandtes også for at være gunstige for danner mindre og mere monodisperse partikler. Vi hypotesen om at holde nanoaggregate til længere tid på en temperatur over LCST ene eller begge af forløber polymerer øger sandsynligheden for sammenlægning efter nanogel kollision, med den øgede hydrophobicity af hydrazone bond forhold til enten forløber aldehyd eller maleinhydrazid funktionelle grupper gør denne sammenlægning mere sandsynligt som graden af crosslinking opnåede er øget. I sidste ende, kortere varme gange er gunstige fra en proces perspektiv, som en monodisperse nanogel befolkning kan dannes i så lidt som 2 min efter crosslinker polymer tilføjelse; 10 min blev fundet for at være den længste tid, der kunne konsekvent producerer monodisperse nanogels samtidig tillader til produktion af flere stærkt krydsbundet nanogels. Interessant, er metoden bemærkelsesværdigt ufølsom at blande med næsten identiske partikelstørrelser og partikel størrelse distributioner som følge af blanding med forskellige hastigheder eller endda skalering proces til større mængder. Mens i første omgang overrasket over dette resultat, taler det sandsynligvis til den primære rolle i termodynamik i reguleringen af nanogel produktion.
For at opnå lav polydispersities, synes kolloid stabilitet og graden af hydrering af nanoaggregate at være de vigtigste variabler. For eksempel, føre nanoaggregates tilberedt med mere hydrofile maleinhydrazid-functionalized polymerer som frø i modsætning til de mindre hydrofile aldehyd-functionalized polymerer til nanogels med betydeligt lavere polydispersities. Forskellen mellem den eksperimentelle forsamling temperatur og LCST frø polymer er også kritisk. Opererer ved en temperatur lige over frø polymer LCST ((T-LCST) < 5 ° C) tilbyder den højeste sandsynlighed for monodisperse nanogel dannelse; fungerer godt over LCST skaber flere hydrofobe og skjult nanoaggregates, der er mere tilbøjelige til samlede og mindre sandsynligt at bitmapgenkendelse, mens der opererer under LCST resultaterne i en relativt ikke-compact frø polymer, der ikke kan effektivt eller reproducerbar crosslinked. For den bedste forudsigelse af partikel monodispersity, anbefaler vi først udfører en UV/vis-scanning for at måle indsættende LCST frø polymer og efterfølgende udfører det samlesæt proces ved en temperatur på 1-2 ° C over LCST.
Bemærk at nanogels fremstillet ved hjælp af denne metode kunne frysetørret og redispersed uden nogen forandring i kolloid stabilitet, ofte ikke er muligt for selvsamlede strukturer og efter vores mening kan tilskrives vores crosslinking stabilisering metode. Vi forventer også, at kun frø polymeren skal være thermoresponsive for denne metode til at arbejde; Brug af cross-linking polymerer, der er enten ikke-responderende eller lydhøre over for andre stimuli kan yderligere udvide den ultimative anvendeligheden af denne teknik. Endelig, da blanding af de to reaktive forløber polymerer er i dette tilfælde passiv i modsætning til aktive, gellation tid er langt mindre betydning for proceskontrol i forhold til de andre fabrikation strategier beskrevet. Men selv i denne teknik, holde den samlede crosslinking tid < 30 min er ønskeligt at minimere risikoen for partikel sammenlægning.
Nanofibrous hydrogels via reaktive electrospinning
Kontrollere gellation tid af de reaktive pre polymerer er igen afgørende for succes af gel nanofiber produktion. Især omkring matchende opholdstid forløber polymerer i statisk mixer (kontrolleret ved at ændre strømningshastigheden af løsning fra dobbelt-tønde sprøjte samt længde og tortuosity af en statisk mixer) med bulk gellation tiden forløber polymerer er vigtigt både at bevare spinnability samt sikre effektiv crosslinking af spundet fibre mellem nålen og samler. Hurtigere gellation fører til ineffektive Taylor kegle udvikling og dermed dårlige spinnability, mens langsommere gellation resultater i en vandig opløsning i stedet for en gel, der rammer solfangeren, hvilket resulterer i at sprede og den endelige dannelse af en tynd film gel i stedet for nanofibers. Arbejder på residence gange lidt nedenfor bulk gellation tid har også vist sig for at være effektive (og faktisk bedre til at reducere risikoen for nål tilstopning) da vand fordampning, så løsningen er spundet effektivt koncentrerer sig forløber polymerer i den streame og dermed fremskynder gellation kinetik under spinning-processen. I den samme retning, opererer ved højere nål til opkøber afstande (> 10 cm) er generelt gunstige i denne proces, som kortere afstande reducere den tid, der er tilgængelige for vand fordampning og dermed kræver strengere kontrol over forholdet mellem opholdstid og gellation tid for at bevare et nanofibrous produkt.
Bemærk, at brugen af PEO (eller en anden høj molekylvægt og let electrospun polymer) er afgørende i denne protokol til at fremme nanofiber dannelse, som de korte og stærkt forgrenede POEGMA oligomerer alene ikke kan nå en passende grad af entanglement at fremkalde electrospinning; i stedet behandle electrospray resultater på alle betingelser testet for POEGMA-kun formuleringer (selv om dette muligvis også programmer til at lave nedbrydeligt gel partikler ved hjælp af denne samme kemi). Et minimum PEO koncentration på 1 wt % (1 MDa molekylvægt) er forpligtet til at opretholde et fuldt nanofibrous morfologi. Bemærk at PEO kan fjernes fra fibrene efter en simpel opblødning procedure (deioniseret vand, 24 h) uden at forstyrre integriteten af nanofibrous netværk; på denne måde fungerer PEO mere som en forbigående electrospinning støtte end en væsentlig del af varens endelige nanofibrous. Bemærk også, at forskellige former for samlere, herunder simple aluminiumsfolie (til at oprette tyndt lag hydrogels, der kan delaminere fra solfanger ved iblødsætning) samt en roterende aluminium disk (til at oprette tykkere stilladser) kan bruges sammen med denne samme teknik, forudsat de andre processen variabler at kontrollere hastigheden af gellation, satsen for electrospinning og sats af vand fordampning under electrospinning forbliver uændret.
Interessant, afhængigt af metoden til at forberede de forskellige morfologier er betydelige forskelle blevet observeret i nedbrydning gange af hydrogels fremstillet af de samme hydrogel prækursorer. For eksempel, nedbrydes POEGMA nanofibrous hydrogels langsommere end bulk POEGMA hydrogels med den samme sammensætning trods deres betydeligt højere areal og dermed adgang til vand at hydrolysere hydrazone obligationer. Vi relatere disse forskelle til de iboende kontraster mellem de beskrevne protokoller i form af geometri blanding forløber polymerer, som kan føre til indre gel homogeneities/morfologier, der er væsentligt forskellige eller i situ koncentration af polymer prækursorer på den samme tidshorisont som gellation, særlig relevant i electrospinning på grund af samtidige vand fordampning og crosslinking observeret i denne proces. Mens dette kan noget komplicere valget af forløber polymerer, hvis en polymer er målrettet til brug i hver protokol, kan det også tilbyde en teknisk mulighed for at gøre hydrogels med en kemisk sammensætning, men meget forskellige fysiske egenskaber.
Samlet set de beskrevne metoder giver en strategi for at fabrikere nedbrydelige (eller i det mindste renally clearable) analoger af thermoresponsive polymerer på flere længdeskalaer (bulk, micro og nano) og med flere typer af interne strukturer (partikler eller fibre). Sådanne protokoller løse de vigtigste barrierer for vellykket oversættelse af konventionelt forberedt syntetiske thermoresponsive materialer til den biomedicinske felt: injektionsydelse og nedbrydelighed. Vi fortsætter med at undersøge anvendelsen af sådanne materialer i både medicinafgivelse og tissue engineering applikationer lige fra de fysiske målretning af kræft, transport af stoffer over blod - hjerne barrieren, den terapeutiske levering af proteiner på på bagsiden af øjet, retningsbestemt væksten af væv, thermoreversible vedhæftning og differentiering af celler, blandt andre applikationer.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Finansiering fra naturvidenskab og teknisk forskning Rådet i Canada (NSERC), NSERC Opret-IDEM (integreret Design af ekstracellulære matricer) program, 20/20: NSERC oftalmologiske biomaterialer Research Network og Ontario Ministry of Research og Innovation tidlige forsker Awards program er anerkendt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals | |||
| 2,2 - azobisisobutryic acid dimethyl ester | Wako Chemicals | 101138 | |
| Di(ethylene glycol) methyl ether methacrylate (M(EO)2MA) | Sigma Aldrich | 447927 | 188.2 g/mol, n=2 ethylene oxide repeat units |
| Oligo (ethylene glycol) methyl ether methacrylate (OEGMA475) | Sigma Aldrich | 447943 | 475 g/mol, n=8-9 ethylene oxide repeat units |
| Acrylic acid (AA), 99% | Sigma Aldrich | 147230 | |
| Thioglycolic acid (TGA), 98% | Sigma Aldrich | T3758 | |
| Dioxane, 99% | Caledon Labs | 360481 | |
| Nitrogen, UHP grade | Air Liquide | Alphagaz1 765A-44 | |
| Adipic acid dihydrazide (ADH), 98% | Alfa Aesar | A15119 | |
| N'-ethyl-N-(3- dimethylaminopropyl)-carbodiimide (EDC, x%) | Carbosynth | FD05800 | |
| Hydrochloric acid (HCl), 37% | Sigma Aldrich | 320331 | |
| Sodium hydroxide (NaOH), 97% | Sigma Aldrich | 221465 | |
| Aminoacetyl aldehyde dimethyl acetal, 99% | Sigma Aldrich | 121967 | |
| 4-Hydroxy-TEMPO, 97% | Sigma Aldrich | 176141 | |
| Methacryloyl chloride,97x% | Sigma Aldrich | 523216 | |
| Petroleum ether, 95% | Sigma Aldrich | 32047 | |
| Magnesium sulfate, 99.5% | Sigma Aldrich | M7506 | |
| tert-Butyl methyl ether, >99.0% | Sigma Aldrich | 443808 | |
| Phosphate buffered saline | BioShop | PBS405.1 | 1x, pH 7.3-7.5 |
| N-isopropylacrylamide, 99% | J&K Scientific | 258717 | Recrystallized from 60% hexanes/40% toluene |
| Ethanol, anhydrous | Commerical Alchols | P016EAAN | |
| Span 80 | Sigma Aldrich | S6760 | |
| Heavy paraffin oil | Caledon Labs | 1326197 | |
| Pentane, reagent grade | Caledon Labs | 1/10/7800 | |
| Poly (ethylene oxide) average Mv 600,000 | Sigma Aldrich | 182028 | |
| Supplies essential for synthesis and hydrogel fabrication | |||
| Rotary evaporator | Heidolph | G3 | |
| Dialysis tubing (3500 Da molecular weight cut-off) | Spectrum Labs | 28170-166 | Vol/length= 6.4mL/cm |
| Double barrel syringe | Medmix | L series | L series, 2.5 mL, 1:1 volume ratio |
| Static mixer | Medmix | L series | L series, 2.5 mL, 1:1 volume ratio, 1.5" length |
| Silicone rubber sheet, 1/16" thickness | McMaster-Carr | 9010K12, 30A Durometer (Super Soft) | |
| Syringe pump | KD Scientific | KDS Legato 200 | Infuse Only Dual Syringe Pump |
| High voltage power supply | Spellman | 230-20R | 0 to 20 kV |
| Microfluidic Chip Fabrication | |||
| Silicon wafer | University Wafer | 2080 | D = 76.2 mm; 380 µm thickness; P-doped; <100> orientation |
| SU-8 100 | MicroChem | Y131273 | |
| SU-8 Developer | MicroChem | Y020100 | |
| Custom 2.5" spincoater | Built in-house | N/A | |
| Mask Aligner | KARL SUSS | MJB3 UV400 (with a 276 W lamp) | |
| Masterflex L/S 13 Silicone Tubing | Cole Parmer | OF-96400-13 | Peroxide-cured |
| Dow Corning Sygard 184 Silicone Elastomer Base | Ellsworth Adhesives | 4019862 | |
| Dow Corning Sygard 184 Silicone Elastomer Curing Agent | Ellsworth Adhesives | 4019862 | |
| High Power Plasma Cleaner | Harrick | PDC-002-HP | |
| Characterization Instruments | |||
| Mach 1 micromechanical tester | Biomomentum | LB007-EN | |
| Cellstar tissue culture 12 well plate | Greiner Bio-one | 665 180 | |
| Cell culture insert for 12 well plate | Corning | 08-771-12 | 8 µm pore size |
| Optical microscope | Olympus BX51 optical microscope | BX51 | |
| Temperature-controlled microscope stage | Linkam Scientific | THMS600 | |
| Gel permeation chromatograph (GPC) | Waters | 590 HPLC Pump | Waters Styragel columns (HR2, HR3, HR4; 30 cm x 7.8 mm (ID); 5 mm particles), Waters 410 refractive index detector |
| Dynamic light scattering (DLS) | Brookhaven | 90Plus Particle Size Analyzer | |
| Transmission electron microscopy (TEM) | TEMSCAN | JEOL 1200EX | Accelerating voltage 100 kV |
| Scanning electron microscopy (SEM) | Tescan | Vega II LSU | Accelerating voltage 10 kV |
| Microsquisher | CellScale Biomaterials Testing | MS-50M-01 |
References
- Heskins, M., Guillet, J. E. Solution Properties of Poly(N-isopropylacrylamide). J. Macromol. Sci. A. 2 (8), 1441-1455 (1968).
- Lutz, J. -F., Akdemir, Ö, Hoth, A. Point by Point Comparison of Two Thermosensitive Polymers Exhibiting a Similar LCST: Is the Age of Poly(NIPAM) Over. J. Am. Chem. Soc. 128 (40), 13046-13047 (2006).
- Pelton, R. H., Chibante, P. Preparation of Aqueous Lattices with N-Isopropylacrylamide. Colloids Surf. 20 (3), 247-256 (1986).
- Palasis, M., Gehrke, S. H. Permeability of Responsive Poly(N-Isopropylacrylamide) Gel to Solutes. J. Controlled Release. 18 (1), 1-11 (1992).
- Kawaguchi, H., Fujimoto, K., Mizuhara, Y. Hydrogel Microspheres .3. Temperature-Dependent Adsorption of Proteins on Poly-N-Isopropylacrylamide Hydrogel Microspheres. Colloid Polym. Sci. 270 (1), 53-57 (1992).
- Okuyama, Y., Yoshida, R., Sakai, K., Okano, T., Sakurai, Y. Swelling Controlled Zero-Order and Sigmoidal Drug-Release from Thermoresponsive Poly(N-Isopropylacrylamide-Co-Butyl Methacrylate) Hydrogel. J. Biomater. Sci. Polym. Ed. 4 (5), 545-556 (1993).
- Snowden, M. J. The Use of Poly(N-Isopropylacrylamide) Lattices as Novel Release Systems. J. Chem. Soc. - Chem. Comm. (11), 803-804 (1992).
- Haraguchi, K., Takehisa, T., Ebato, M. Control of cell cultivation and cell sheet detachment on the surface of polymer/clay nanocomposite hydrogels. Biomacromolecules. 7 (11), 3267-3275 (2006).
- Lee, B., et al. Initiated chemical vapor deposition of thermoresponsive poly(N-vinylcaprolactam) thin films for cell sheet engineering. Acta Biomater. 9 (8), 7691-7698 (2013).
- Cole, M. A., Voelcker, N. H., Thissen, H., Griesser, H. J. Stimuli-responsive interfaces and systems for the control of protein-surface and cell-surface interactions. Biomaterials. 30 (9), 1827-1850 (2009).
- Feil, H., Bae, Y. H., Feijen, J., Kim, S. W. Molecular Separation by Thermosensitive Hydrogel Membranes. J. Membrane Sci. 64 (3), 283-294 (1991).
- Kim, J., Park, K. Smart hydrogels for bioseparation. Bioseparation. 7 (4-5), 177-184 (1998).
- Yamashita, K., Nishimura, T., Nango, M. Preparation of IPN-type stimuli responsive heavy-metal-ion adsorbent gel. Polym. Adv. Tech. 14 (3-5), 189-194 (2003).
- Ziolkowski, B., Czugala, M., Diamond, D. Integrating stimulus responsive materials and microfluidics: The key to next-generation chemical sensors. J. Intelligent Mater. Syst. Struct. 24 (18), 2221-2238 (2013).
- Zhang, Y., Kato, S., Anazawa, T. A flap-type hydrogel actuator with fast responses to temperature. Smart Mater. Struct. 16 (6), 2175-2182 (2007).
- Suzuki, D., Taniguchi, H., Yoshida, R. Autonomously Oscillating Viscosity in Microgel Dispersions. J. Am. Chem. Soc. 131 (34), 12058-12059 (2009).
- Schild, H. G. Poly(N-isopropylacrylamide): Experiment, Theory and Application. Prog. Polym. Sci. 17, 163-249 (1992).
- Oh, J. K., Min, K., Matyjaszewski, K. Preparation of poly (oligo (ethylene glycol) monomethyl ether methacrylate) by homogeneous aqueous AGET ATRP. Macromolecules. 39 (9), 3161-3167 (2006).
- Vihola, H., Laukkanen, A., Tenhu, H., Hirvonen, J. Drug Release Characteristics of Physically Cross-Linked Thermosensitive Poly(N-vinylcaprolactam) Hydrogel Particles. J. Pharm. Sci. 97 (11), 4783-4793 (2008).
- Zhang, L. F., Liang, Y., Meng, L. Z. Thermo-sensitive amphiphilic poly(N-vinylcaprolactam) copolymers: synthesis and solution properties. Polym. Adv. Tech. 21 (10), 720-725 (2010).
- Smeets, N. M. B., Bakaic, E., Patenaude, M., Hoare, T. Injectable and tunable poly(ethylene glycol) analogue hydrogels based on poly(oligoethylene glycol methacrylate). Chem. Comm. 50 (25), 3306-3309 (2014).
- Lutz, J. -F. Polymerization of oligo (ethylene glycol)(meth) acrylates: toward new generations of smart biocompatible materials. J. Polym. Sci. A. 46 (11), 3459-3470 (2008).
- Lutz, J. -F., Hoth, A. Preparation of Ideal PEG Analogues with a Tunable Thermosensitivity by Controlled Radical Copolymerization of 2-(2-Methoxyethoxy)ethyl Methacrylate and Oligo(ethylene glycol) Methacrylate. Macromolecules. 39 (2), 893-896 (2006).
- Patenaude, M., Campbell, S., Kinio, D., Hoare, T. Tuning Gelation Time and Morphology of Injectable Hydrogels Using Ketone-Hydrazide Cross-Linking. Biomacromolecules. 15 (3), 781-790 (2014).
- Patenaude, M., Hoare, T. Injectable, Degradable Thermoresponsive Poly(N-isopropylacrylamide) Hydrogels. ACS Macro Lett. 1 (3), 409-413 (2012).
- Patenaude, M., Hoare, T. Injectable, Mixed Natural-Synthetic Polymer Hydrogels with Modular Properties. Biomacromolecules. 13 (2), 369-378 (2012).
- Smeets, N. M. B., Bakaic, E., Patenaude, M., Hoare, T. Injectable poly(oligoethylene glycol methacrylate)-based hydrogels with tunable phase transition behaviours: Physicochemical and biological responses. Acta Biomater. 10 (10), 4143-4155 (2014).
- Sivakumaran, D., Mueller, E., Hoare, T. Temperature-Induced Assembly of Monodisperse, Covalently Cross-Linked, and Degradable Poly(N-isopropylacrylamide) Microgels Based on Oligomeric Precursors. Langmuir. 31, 5767-5778 (2015).
- Bakaic, E., Smeets, N. M. B., Dorrington, H., Hoare, T. "Off-the-shelf" thermoresponsive hydrogel design: tuning hydrogel properties by mixing precursor polymers with different lower-critical solution temperatures. RSC Adv. 5 (42), 33364-33376 (2015).
- Bulpitt, P., Aeschlimann, D. New strategy for chemical modification of hyaluronic acid: Preparation of functionalized derivatives and their use in the formation of novel biocompatible hydrogels. J. Biomed. Mater. Res. 47 (2), 152-169 (1999).
- Kesselman, L. R. B., Shinwary, S., Selvaganapathy, P. R., Hoare, T. Synthesis of Monodisperse, Covalently Cross-Linked, Degradable "Smart" Microgels Using Microfluidics. Small. 8 (7), 1092-1098 (2012).
- Sivakumaran, D., Mueller, E., Hoare, T. Microfluidic production of degradable thermoresponsive microgels based on poly(N-isopropylacrylamide). Soft Matter. , (2016).
- Xu, F., Sheardown, H., Hoare, T. Reactive Electrospinning of Degradable Poly(oligoethylene glycol methacrylate)-Based Nanofibrous Hydrogel Networks. Chem. Comm. 52 (7), 1451-1454 (2016).
- Troll, K., et al. The collapse transition of poly(styrene-b-(N-isopropyl acrylamide)) diblock copolymers in aqueous solution and in thin films. Colloid Polym. Sci. 286 (8), 1079-1092 (2008).
- Patenaude, M., Campbell, S., Kinio, D., Hoare, T. Tuning Gelation Time and Morphology of Injectable Hydrogels Using Ketone-Hydrazide Cross-Linking. Biomacromolecules. 15 (3), 781-790 (2014).
- Kelly, T. A., Felder, M. S., Ollar, R. A. Inducing Apoptosis in a Mammalian Cell by Contacting with Paraffin or Agar. US Patent. , 6,274,377 (2001).
