Summary
توضح هذه المخطوطة بروتوكول مفصلة للحث الحاد تجديد الهيكل العظمي والعضلات في الفئران البالغة والتلاعب اللاحقة للعضلات، مثل التشريح، وتجميد، قطع، وتلطيخ الروتيني، وليف عضلي تحليل منطقة مستعرضة.
Abstract
الهيكل العظمي تجديد العضلات هي عملية الفسيولوجية التي تحدث في العضلات والهيكل العظمي الكبار في الاستجابة لإصابة أو مرض. حاد الإصابة الناجمة عن تجديد العضلات والهيكل العظمي هو يستخدم على نطاق واسع وقوي نظام نموذجي لدراسة الأحداث تشارك في تجديد العضلات وكذلك الآليات ومختلف اللاعبين. في الواقع، معرفة مفصلة من هذه العملية ضرورية لفهم أفضل للظروف المرضية التي تؤدي إلى ضمور العضلات والهيكل العظمي، وأنها تساعد في تحديد استراتيجيات علاجية جديدة هادفة. يصف هذا العمل بروتوكول مفصلة وقابلة للتكرار للحث الحاد تجديد الهيكل العظمي والعضلات في الفئران عن طريق الحقن العضلي واحد من cardiotoxin (CTX). CTX ينتمي إلى عائلة من السموم سم الأفعى ويسبب تحلل العضل من myofibers، الذي يؤدي في نهاية المطاف إلى أحداث تجديد. يتم تقييم ديناميات تجديد الهيكل العظمي والعضلات عن طريق التحليل النسيجي للأقسام العضلات. البروتوكول أيضايوضح الإجراءات التجريبية للتشريح، وتجميد، وقطع العضلات قصبة الساق الأمامية، فضلا عن الروتيني الهيماتوكسيلين ويوزين تلطيخ التي يتم استخدامها على نطاق واسع للتحليل الصرفي والمورفولوجية لاحق.
Introduction
تتشكل الكبار الثدييات العضلات والهيكل العظمي من قبل مجموعات من fascicules من خلايا العضلات متعددة النوى (myofibers) التي تخصصت للانكماش. كل ليف عضلي هو مخلى ممدود، وتحيط بها غمد الليف العضلي (غشاء PLASMATIC) والتي تحتوي على اللييفات العضلية، والتي تتكون من البروتينات مقلص نظمت بشكل منتظم ومتكرر (الأكتين والميوسين خيوط). في حياة الكبار وفي ظروف الراحة والعضلات والهيكل العظمي لها دوران منخفض جدا من myonuclei من 1؛ في الواقع، وmyonuclei، والتي تقع في محيط ليف عضلي، تحت غمد الليف العضلي، وألقي القبض عليه في مرحلة G0 من دورة الخلية وغير قادر على التكاثر 1،2.
عضلات الهيكل العظمي لديها القدرة على التجدد غريبة التالية الضرر، ليصل إلى التوازن بعد عدة أحداث إعادة تشكيل الأنسجة التي ترتبط ارتباطا وثيقا بعضها البعض. بعد الإصابة الحادة أو الصدمة، وبفعل انحطاط، تليها عمليات تجديدالتي تشارك فيها أعداد مختلفة من الخلايا، بما في ذلك عدد السكان المقيمين في خلايا العضلات والخلايا الأقمار الصناعية (المنبوذة). في الواقع، في غياب أي محفزات البيئية، والخلايا الأقمار الصناعية في حالة هادئة وتقع في محراب المتخصصة بين غمد الليف العضلي و3،4 الصفيحة القاعدية. بعد الإصابة أو المرض، المنبوذة تصبح تفعيلها، وتتكاثر، الهجرة إلى المناطق المتضررة، وأخيرا تمييز، مما أدى إلى تشكيل حديثا myofibers 5. المنبوذة تنشيط تؤسس عبر الحديث مع السكان خلية مختلفة، وذلك أساسا الخلايا الالتهابية، والتي يتم تعيينهم في الموقع من الصدمة 6-8. هذا عبر الحديث يسمح للخلايا لمتابعة نموذج التنظيم التي الإشارات الجزيئية بالسيارة التعديلات الهيكلية، مما يؤدي في النهاية إلى توازن 9. إلى جانب المنبوذة، الخلايا الالتهابية والخلالي، عمليات عائية، وأحداث إعادة تعصيب-ويشارك فيه ايضا، يتصرف بطريقة منسقة لإصلاح هذه درجة عالية من التنظيم والصورةهيكل pecialized.
هناك اهتمام كبير في دراسة الجوانب المختلفة لتجديد الهيكل العظمي والعضلات، وليس فقط لفهم علم وظائف الأعضاء من العضلات، ولكن أيضا لتحسين الاستراتيجيات العلاجية التي تتطلب معرفة أعمق للعملية برمتها. عدة طرق التجريبية متوفرة لدراسة الهوية وظيفة من مختلف السكان الخلية، ومسارات الإشارات، والآليات الجزيئية التي تشارك حاليا. نماذج الماوس من الإصابة الحادة تمثل أداة قوية لتحقيق العديد من جوانب هذه العملية. مختلفة تستخدم عادة تقنيات للحث على تلف العضلات الحاد تسمح للباحثين لمتابعة عملية تجديد في الجسم الحي، من المراحل المبكرة جدا من نهاية العملية. يصف هذا البروتوكول على بعد خطوات من طريق الحقن العضلي من cardiotoxin المستمدة سم ثعبان (CTX)، والتي يدفع تحلل العضل ويطلق عملية تجديد، وصولا إلى تحليل عينات الأنسجة. بعد الحقن CTX، ميلم يمكن التضحية في نقاط زمنية مختلفة اعتمادا على متطلبات التجريبية، والعضلات والهيكل العظمي يمكن تشريح ومعالجتها لمزيد من التحليل. وأخيرا، نحن تصف البروتوكول تلطيخ أقسام الأنسجة لأداء الملاحظات الشكلية والتحليلات الكمية الأساسية. يسمح هذا البروتوكول لدراسة الحاد تجديد الهيكل العظمي والعضلات في الجسم الحي بطريقة استنساخه للغاية (10).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وأجريت جميع التجارب بما يتفق تماما مع المبادئ التوجيهية المؤسسية للبحوث الحيوانية والموافقة عليها من قبل وزارة الصحة العامة وصحة الحيوان والتغذية وسلامة الأغذية من الوزارة الإيطالية للصحة وفقا للقانون التجارب على الحيوانات. قد تختلف إجراءات الخلع عنق الرحم من مؤسسة لأخرى بناء على IACUC أو متطلبات ما يعادلها.
1. حقن Cardiotoxin في العضلات قصبة الساق الأمامية
- إعداد 10 ميكرومتر حل cardiotoxin (CTX) التي تعمل عن طريق تمييع الحل الأسهم cardiotoxin في الفوسفات مخزنة معقم المالحة (PBS) أو في الماء قبل البدء في إجراء.
ملاحظة: CTX قابل للذوبان في الماء في 1 ملغ / مل. إعداد محلول المخزون 70 ميكرومتر. قسامة ومخزن في -20 درجة مئوية. CTX المستخدمة لهذا البروتوكول هو خليط من cardiotoxins وجود الوزن الجزيئي لحوالي 7000 دا.
تنبيه: ويقترح لارتداءقفازات مزدوج، قناع النظافة، ونظارات السلامة (بدلا من ذلك إلى نظارات السلامة، فمن المستحسن أن تعمل تحت غطاء) وأن نكون حذرين للغاية لتجنب أي اتصال مع حل، حتى لو المخفف. - تخدير الفئران عن طريق الحقن داخل الصفاق من الكيتامين وزيلازين (80 ملغ / كغ و 10 ملغم / كغم من كتلة الجسم) أو غيرها من مخدر متاح المعتمدة.
- مع الماوس مكشوفة، رش أطرافه الخلفية مع 70٪ من الإيثانول. لتصور المكان المحدد للعضلة قصبة الساق الأمامية (TA)، مع مساعدة من مشرط، وقطع الشعر بعيدا في الجزء الأمامي من الجزء الأسفل من الساق تحت الركبة.
ملاحظة: عضلة TA تنشأ من الجسم القريبة من الساق، نزول الوحشي لعظم وتنتهي في الكاحل. في وتر طويل يمتد إلى القدم عبر الكاحل (انظر الشكل 1A). - رسم ~ 100 ميكرولتر من الحل في حقنة عن طريق سحب المكبس إلى الوراء ببطء.
- إزالة فقاعات الهواء، وعقد حقنة تستقيم (مع الإبرة إلى أعلى). برفق على المكبس إلى أسفل واضغط على جانب من حقنة لمساعدة أي فقاعات الهواء التي تعلق على الجزء الداخلي للأنبوب تأتي صعودا. اضغط ببطء المكبس للافراج عن فقاعات الهواء الكبيرة. وهناك عدد قليل قطرات من السائل يخرج من إبرة. عند هذه النقطة، تأكد من اختيار السائل مرة أخرى إلى الأنبوب وليس تفريق ذلك، نظرا لسمية cardiotoxin.
- سحب الحل في حقنة حتى يتم التوصل إلى الجرعة المطلوبة. ضخ 20 ميكرولتر من محلول CTX لكل عضلة TA.
- ادخال الإبرة في وسط TA باتباع موقف عظم الساق والتوجيه، من وتر نحو الركبة. منذ TA هو الأنسجة رقيقة، وإجراء الحقن من دون الذهاب عميقة جدا (ادخال الإبرة 2/3 مم العميقة، في ما يقرب من 10 درجة إلى 20 درجة زاوية)، وتجنب الذهاب أبعد من العضلات نفسها (الشكل 1A).
- لا تسحب الإبرة مباشرة بعد الحقن، ولكن الانتظار 2-3 على منع تسربسن CTX قطرات من العضلات.
- بعد العملية، ووضع القفص على لوحة ساخنة (37 درجة مئوية) حتى الفئران في اليقظة، منذ مخدر والإيثانول المستخدم تقليل درجة حرارة الجسم.
2. قصبة الساق الأمامية عزل
ملاحظة: العضلات يمكن أن تكون معزولة في نقاط زمنية مختلفة بعد الحقن cardiotoxin وفقا لمتطلبات التجريبية.
- التضحية الماوس عن طريق خلع عنق الرحم.
- رش hindlimbs مع 70٪ من الإيثانول. خلال هذا الإجراء، الحيوان يمكن أن تكون ثابتة لدعم عقد عليه.
- قطع الجلد على مستوى وتر الداني (فوق القدم)، إدراج واحدة من ريش من المقص تحت الجلد، وقطع الجلد صعودا في اتجاه الركبة. بمساعدة ملقط، سحب ما يصل إلى الجلد وفضح العضلات تماما. إزالة بعناية كل من الجلد والشعر من منطقة الفائدة.
- القضاء على لفافة من قبل معسر ببطء أو قطع (مع الفي طرف الملقط أو مع الصغيرة الجميلة تشريح مقص) محيط الشديد للعضلة على الجانب الآخر من الساق (الشكل 1B). كسر مرة واحدة، وإزالة بلطف لفافة مع مساعدة من ملاقط رقيقة طرف. تجنب إتلاف العضلات الأساسية.
ملاحظة: كما هو الحال مع العضلات وغيرها من الأجهزة، يتم تغطية TA بواسطة رباط (اللفافة العميقة في الساق)، ورقة رقيقة من الأنسجة الضامة التي تقع عميقا تحت الجلد والتي تحتاج إلى إزالتها بسهولة لعزل العضلات الأساسية. - تصور وتر TA القاصي ووتر باسطة فوق القدم، والتي جنبا إلى جنب. يقع في وتر العضلة الباسطة الطويلة للأصابع (EDL) أقل قليلا من وتر TA. الأوتار من فئران بالغة مرئية للعين المجردة.
- إزالة العضلات TA التالية احد من اثنين من الأساليب التالية:
- قطع كل من الأوتار مع الدقيقة غرامة مقص تشريح وسحب منها نحو الجانب القريب، على holdinز الأوتار بالملقط. فصل الأوتار اثنين، وسحب منهم بلطف في اتجاهين متعاكسين لفصل العضلات.
- مع مساعدة من ملاقط رقيقة طرف، فصل وتر TA البعيدة من باسطة وتر بتمرير معلومات سرية تحت وتر نفسه (الشكل 1C، الصورة العليا). حرك بلطف ملاقط تحت TA لفصلها عن العضلات الكامنة (الشكل 1C، أسفل الصورة).
- عقد ملاقط تحت العضلات لإبقائها مرتفعة قليلا، وقطع وتر TA، وسحب بلطف صعودا حتى فقط في منطقة تحت الركبة ويرد (1D الشكل، الصورة اليسرى). قطع TA تحت الركبة، وبعد حافة العضلات مع مقص (1D الشكل، الصورة اليمنى).
ملاحظة: إذا كان لا يزال في العضلات المرفقة قليلا على الجانبين، استخدم الصغيرة على ما يرام تشريح المقص لمساعدة سلخه.
ملاحظة: إذا كان ملقط لا تناسب بسهولة تحت TA،فمن الممكن أن اللفافة لم يتم إزالتها تماما، وأنها يمكن أن تكون لا تزال واضحة على أعلى العضلات. في هذه الحالة، إزالة اللفافة قبل المتابعة.
3. الطازجة المجمدة تقنية العضلات
- ضع كمية صغيرة من صمغ الكثيراء أو مادة لاصقة تجميد مجمع مماثل (على سبيل المثال، الأمثل قطع درجة الحرارة (أكتوبر) مركب) على شريحة من الفلين. تسمية شريحة من الفلين على الجانب العكسي قبل التجميد، إذا لزم الأمر (الشكل 2A).
- من أجل الحصول على المقاطع العرضية للعضلات، وإغراق TA في اللثة الكثيراء عن طريق إدراج وتر القاصي وترك حوالي 3/4 من العضلات خارج، والتأكد من أن العضلات في وضع عمودي فيما يتعلق الفلين (الشكل 2A).
- ملء علبة الألمنيوم (بدلا من ذلك، فنجان المعدن أو كوب زجاج)، مع نظير البنتان. تعليق علبة نظير البنتان في ديوار التي تحتوي على LIQUIد النيتروجين، وعدم السماح النيتروجين السائل للدخول في العلبة.
ملاحظة: نظير البنتان يحتاج للوصول إلى درجة الحرارة المناسبة (من -150 إلى -160 درجة مئوية) لتجميد الأمثل للأنسجة. يتم الوصول إلى درجة الحرارة الصحيحة عندما تشكل بعض الجسيمات الصلبة البيضاء في الجزء السفلي من العلبة ونظير البنتان يصبح لزج قليلا.
ملاحظة: لا تجميد العينة قبل تشكيل الجزيئات الصلبة، كما أنها يمكن أن تؤدي إلى التحف التجميد. من ناحية أخرى، إذا أصبح نظير البنتان صلبة تماما، وترك في درجة حرارة الغرفة حتى يتم إذابة ذلك، والتأكد من أن بعض الجسيمات البيضاء لا تزال موجودة. - باستخدام ملقط ميكستر، وتراجع بسرعة الفلين مع العضلات في نظير البنتان، والحفاظ على العضلات وضعه أسفل، وتأكد للافراج عن الفلين عند مغمورة تماما في السائل. في هذه الطريقة، في حين تطفو عينة، إلا أن الجانب الآخر من الفلين يجب أن يكون مرئيا في السائل.
- مغادرة ساmple في نظير البنتان لمدة 1 دقيقة.
- باستخدام ملقط ميكستر (أو ملقط مماثلة)، واتخاذ العضلات وتزج به في النيتروجين السائل لمدة 2 دقيقة على الأقل.
- التفاف العينات بشكل فردي في رقائق الألومنيوم وصفت ووضعها مباشرة في الثلج الجاف (-70 درجة مئوية)، أو مباشرة تخزينها في الفريزر -80 درجة مئوية.
ملاحظة: في جميع أنحاء الداخلي، من الخطوات 3،4-3،7، فمن المهم للغاية للحفاظ على درجة الحرارة الصحيحة ومنع عينات من ذوبان (على سبيل المثال، أثناء نقل إلى -80 درجة مئوية الفريزر). ارتفاع النتائج درجة الحرارة في ذوبان غير المنضبط وإعادة تجميد للmicrocrystals المياه التي تكون موجودة داخل الأنسجة وتسبب في نهاية المطاف في تشكيل القطع الفنية أو انهيار الألياف العضلية (تصور على أقسام الأنسجة كما ثقوب بيضاء كبيرة في وسط من الألياف).
4. ناظم البرد باجتزاء من العضلات المجمدة
- تعيين غرفة ناظم البرد درجة حرارة رس -20 إلى -22 درجة مئوية.
- وضع كعب عينة، والنصل، والعينة في غرفة ناظم البرد، والسماح لهم لكي تتوازن لمدة 30 دقيقة على الأقل.
- ضع كمية صغيرة من تجميد مجمع (على سبيل المثال، أكتوبر المركبة) على كعب عينة وتزج الفلين مع العينة قبل يتصلب مجمع التجميد. في غضون ذلك، وضع شفرة في حامل شفرة.
- محاذاة العينة وشفرة باستخدام مسامير المقدمة لتوجيه صاحب العينة مع حامل شفرة (الشكل 2B).
- تعيين سمك الباب إلى 10 ميكرون. انتقل إلى قطع الأنسجة. لكل مطلع الدفع الرباعي، صاحب العينة السلف مسافة تسيطر نحو النصل.
- وضع المقاطع على (8-10 قسم لكل شريحة) (الشكل 2C) شريحة الاستقطاب.
- بعد باجتزاء، تخزين الشرائح في -80 درجة مئوية.
ملاحظة: يمكن تخزين العينات في الفريزر -80 درجة مئوية وإعادة استخدامها لابعد من ذلكص باجتزاء، إذا ما تم تناوله وتخزينها بشكل صحيح.
5. الروتينية النسيجية تلطيخ (الهيماتوكسيلين ويوزين البقع)
ملاحظة: لا يمكن أن يؤديها عدة البقع النسيجية على أقسام العضلات وفقا لهذا التحليل. وصمة عار النسيجية الروتينية للتحليل الصرفي والمورفولوجية هي الهيماتوكسيلين ويوزين (H & E) وصمة عار bichromic. والهيماتوكسيلين بقع نوى الأرجواني العميق. وcounterstained تلطيخ النووي مع يوزين (الوردي / الأحمر)، التي بقع بنية يوزيني، مثل myofibers في السيتوبلازم.
- تماما الهواء الجاف الشرائح المجمدة مع أقسام لل10-15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، نبيت الشرائح في علبة التلوين، ووضع صينية في حوض تلطيخ.
- وصمة عار لمدة 1 دقيقة مع الهيماتوكسيلين.
- وضع الحوض تلطيخ تحت ضعيفة نوعا ما طائرة ماء الصنبور لمدة 10 دقيقة لتغسل الهيماتوكسيلين.
- تزج الشرائح لمدة 5 دقائق في 95٪ من الإيثانول، إذا كان سيتم استخدام محلول كحولي ليوزين (تخطي رخطوته في حالة وجود حل يوزين مائي).
- مباين لمدة 1 دقيقة مع الحل يوزين.
- يشطف بالماء للقضاء على حل يوزين المفرط.
ملاحظة: يجب أن تحدد توقيت الأمثل لتلطيخ مع أي الهيماتوكسيلين أو يوزين لكل دفعة جديدة. - يذوى العينات في سلسلة الإيثانول متدرج: 50٪ و 70٪ (بضع ثوان لكل منهما). تزج بسرعة في الايثانول 95٪، تليها 2 تغييرات في الإيثانول بنسبة 100٪، 5 دقائق لكل منهما.
- اضحا في 2 التغيرات في زيلين، كل 5 دقائق أو أكثر. يجب أن تتم هذه الخطوة في إطار غطاء الكيميائية.
- تركيب الشرائح مع تصاعد المتوسط على أساس زيلين، وتطبيق بضع قطرات من تصاعد المتوسطة على الشريحة وتغطي مع ساترة. ويمكن أيضا أن تصاعد المتوسط تطبيقها على ساترة وساترة وضعت على الشريحة.
- تجنب تشكيل فقاعات الهواء بين الشرائح وساترة. للقضاء على فقاعات الهواء، والحفاظ على الشريحة الرأسية (بعد التركيب) واخراج مو الزائدفقاعات الهواء المتوسطة unting وعن طريق الضغط بلطف على ساترة مع ملقط حادة (أو أداة حادة مماثلة).
- الحفاظ على الشرائح تحت غطاء محرك السيارة لبضع ساعات أو طوال الليل للسماح للزيلين تتبخر تماما قبل الشروع في التحليل.
- إجراء التحليل الصرفي والمورفولوجية ملون E-H & تجديد أقسام العضلات باستخدام الصور المتسلسلة غير متداخلة من قسم العضلات كله واحد على الأقل في الماوس. التقاط الصور مع المجهر مشرق الميدان، مع 20X التكبير.
ملاحظة: ينصح الحد الأدنى من 5 الفئران للحصول الدلالة الإحصائية للقياسات.
ملاحظة: برنامج تحليل الصور متاح لهذا الغرض، مثل تحميل برنامج ImageJ (http://imagej.nih.gov/ij/).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
H & E تلطيخ يسمح لتقييم التشكل لعملية تجديد في نقطة زمنية محددة خلال تجديد الهيكل العظمي والعضلات. ويبين الشكل 3 تحليل الوقت بالطبع أجريت على عضلات TA الجرحى من الفئران نوع البرية. وقد تم عزل العضلات في 3 و 7 و 15، و 30 أيام بعد الحقن CTX، كما schematized في الشكل 3A. صور تمثيلية من المقاطع العرضية H & E الملون وتظهر دينامية إصلاح الهيكل العظمي والعضلات على مر الزمن (الشكل 3B-E). في يوم 3 بعد الإصابة، يتم تدمير بنية الهيكلية للالعضلات تماما، وسواء تحولت myofibers (منطقة الميتة) وmononucleated خلايا مرئية (الشكل 3B) بشكل واضح. هذه مجموعة غير متجانسة من الخلايا يتكون أساسا من خلايا عابرة الفضائية تضخيم (myoblasts)، الخلايا الالتهابية المعينين من الدم 11، وبيني والخلايا البطانية التي الحزبcipate في عملية التجديد، والتي يتم تشغيلها في موقع الإصابة. في هذا السياق، يتم إنشاء myofibers تجديد الجديدة عن طريق الانصهار والتفريق بين myoblasts. السمة الرئيسية للمنطقة تجديد هي وجود myofibers مستقعد الصغيرة مع نوى موقعا مركزيا والسيتوبلازم الملون الداكن (الشكل 3C). في هذه المرحلة، والتهاب لا تزال واضحة، على الرغم من أنه يقلل تدريجيا. حجم myofibers تجديد يزيد مع مرور الوقت، مما أدى إلى myofibers يوزيني مجدد يتميز نوى موقعا مركزيا (الشكل 3D، E). وmyofibers مجدد واضحة في مراحل لاحقة من التجدد وحتى نهاية العملية. وmyofibers صحية تظهر المنظمة للغاية وقريبة من بعضها البعض، مع السيتوبلازم الوردي ومع وضعت نواة في محيط من الألياف، تحت غمد الليف العضلي. هذه myofibers وعادة ما تكون موجودة بعيدا عن موقع الحقن CTX والإصابات، وأنهم أكثر نادرةتمثل لاي المناطق التي تكون فيها تجديد اكتمال نهائيا. في الواقع، وتتميز ألياف مجدد من وجود نوى موقعا مركزيا التي تتحرك إلى المحيط إلا بعد عدة أشهر بسبب الاصابة.
يتم التقاط الصور الرقمية الأقسام العضلات الملون بإضافة الحانات على نطاق وللمعايرة المكانية، وهو أمر ضروري لقياس دقيق لمجالات الاهتمام التي تحدد الخطوط العريضة للمناطق المعنية. قياس ليف عضلي منطقة مستعرضة (CSA) هو تحليل المورفومترية يمكن الاعتماد عليها، والذي يستخدم على نطاق واسع لقياس الفروق في اتجاه تجديد بين مجموعات مختلفة من الفئران. يتطلب هذا التحليل قياس مجالات myofibers الأنوية مركزيا، بينهم أكثر من 500 وحتى 1000 الألياف في القسم. كل من متوسط تجديد والمناطق ليف عضلي مجدد وتوزيع جاوس هذه المناطق هي مؤشرات بروك تجديدوفاق سطيف. يرتبط زيادة CSA ليف عضلي عموما مع استجابة التجدد تحسين و / أو التعجيل بها. على العكس من ذلك، ويرتبط فشل تجديد السليم مع انخفاض في وكالة الفضاء الكندية. هنا، أبلغنا تحليل ليف عضلي وكالة الفضاء الكندية، مشار إليه كل من المتوسط (الشكل 3F) وتوزيع (الشكل 3G) من ليف عضلي وكالة الفضاء الكندية في نقاط زمنية مختلفة. أبرز تحليل كيف يتغير توزيع المناطق ليف عضلي مع مرور الوقت، وكيف أن التحولات وكالة الفضاء الكندية نحو الألياف الكبيرة الحجم مثل عملية عائدات تجديد.
الشكل 1. العضل حقن وعزل العضلات قصبة الساق. حقن العضل A. من cardiotoxin في العضلات قصبة الساق الأمامية. ب. إزالة اللفافة العضلية. السهم الأبيض يشير إلى ملاقط رقيقة ذات الرؤوس التي قرصة العضلات لإزالة الالبريد رباط. C. يظهر في الصورة العليا للموقف التشريحي للوتر TA البعيدة. يظهر في الصورة السفلى كيفية رفع TA وإزالته في حين تجنب تلف العضلات. د. الصورة اليسرى: يتم رفع TA عن طريق سحب وتر البعيدة التصاعدي. يشير السهم الأبيض في مؤسسة كهرباء لبنان وتر البعيدة. الصورة الصحيحة: من خلال عقد وتر مع ملقط، يتم قطع الحافة العلوية للTA من تحت الركبة. يشير السهم الأبيض الموقع القطع. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. الطازجة العضلات التجمد وناظم البرد باجتزاء من العضلات المجمدة. ألف تقنيات الإدماج العضلات جديدة في اللثة الكثيراء. مغمورة عضلة TA في اللثة من الوتر، مع حوالي 3/4 خارج وحافظت في وضع عمودي فيما يتعلق الفلين. صور B. ممثل إجراء باجتزاء ناظم البرد. يتم وضع الفلين في كمية صغيرة من تجميد مجمع على كعب العينة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3. وقت تحليل دورة تجديد العضلات والهيكل العظمي. مخطط A. التجريبية من اصابة في العضلات والهيكل العظمي الحاد. BE. صور تمثيلية من أقسام الهيماتوكسيلين ويوزين الملون من cardiotoxin (CTX) المعالجة بالإثير العضلات في أيام المشار إليها بعد الاصابة. ب. على خط متواصل الأسود (على الجانب الأيسر من الصورة)، ويرفق زوجين من الألياف الميتة، من المحتمل للغزو من قبل الخلايا الالتهابية. خط متقطع (الجانب الأيمنمن في الصورة) يمثل مساحة تسلل خلايا mononucleated. يشار جيم وليف عضلي غير ناضج واحد مع نواة بموقع مركزي بالقرب من دائرة سوداء. DE. يتم وضع علامة myofibers يوزيني مجدد كبيرة، مع نوى موقعا مركزيا من قبل الدوائر السوداء. تمثل الحانات مقياس 100 ملم. واو متوسط قيم حجم ليف عضلي الأنوية مركزيا في أقسام عضلة TA. القيم يعني ± SEM، 5 الفئران / مجموعة. G. ليف عضلي مستعرضة توزيع منطقة (CSA) في 6 و 15، و 30 أيام بعد الحقن CTX. القيم يعني ± SEM، 5 الفئران / مجموعة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هنا، نحن تصف بروتوكول للحث على إصابة حادة في العضلات والهيكل العظمي (أي الحقن العضلي من CTX). يستخدم على نطاق واسع على أنها أداة قوية لدراسة ديناميات تجديد الهيكل العظمي والعضلات في الجسم الحي. حقن CTX الحث على تحلل الألياف العضلية، والذي كان سببه الاستقطاب من غمد الليف العضلي وتقلص الألياف 12، ويتسبب في سلسلة من الأحداث التي تؤدي إلى تجديد العضلات. يتم تشريح عضلات الهيكل العظمي عند نقاط الوقت المطلوب بعد الحقن والإصابة، وفقا لمتطلبات التجريبية، وتستخدم لتحليل النسيجي لاحقة. إما أن عضلات تشريح يتم تجميد، بعد إدراجها في وسائل الإعلام البرد واق، أو تضمينها في البارافين. ومع ذلك، فإن هذه الإجراءات تتطلب خطوة ما قبل التثبيت مع امتصاص العرق، والتي يمكن أن تولد التحف ويمكن أن تؤثر في نهاية المطاف التحليلات اللاحقة. يمكن تجميد الأنسجة مباشرة منع حدوث هذه المشكلة. من المذكرة، وكثيرالأجسام المضادة الأولية تعمل حصرا أو بصورة أكثر فعالية من الطازج أقسام العضلات المجمدة 13، مما يجعل هذا الإجراء أكثر موثوقية. عادة ما يتم إجراء تحليل المورفومترية على التجارب دوام، والتي تسمح لتقييم الاختلافات في عمليات تجديد بين مجموعات من الفئران مع نفس العمر ومع الطفرات الجينية المحددة و / أو العلاجات الدوائية. على الرغم من أن بروتوكول الضرر الناجم عن CTX هو تكرار للغاية في حد ذاتها، ويرجع ذلك إلى التقلبات التي تعتمد على مشغل حقن CTX وإمكانية تحديد. للتغلب على هذا القيد، فمن الأفضل أن يتم تنفيذ كامل التجربة المرة بالطبع من قبل نفس المشغل.
مدى تجديد العضلات يمكن قياسها كنسبة مئوية من الألياف الصحية، والمناطق الميتة والتهاب، وتجديد والمناطق مجدد على مساحة إجمالية. ومع ذلك، يتم استخدام هذا النهج في الغالب عند دراسة أحداث تلف مزمن، مثل ميل MDX التصنعم، وليس في نماذج من الإصابات الحادة. في الواقع، في حين تتميز العضلات التصنع من أحداث متزامنة من انحطاط والتجدد، ويعقب الإصابة الحادة أحداث محددة جيدا والتبعية. واحد الحد من هذه التحليلات، التي تتطلب تحديد التجريبية من السمات المورفولوجية المذكورة أعلاه، هي أنها لا متحيز تماما. لدعم الاستنتاجات التجريبية، وينبغي دائما أن يكمل التحليل الصرفي مع مزيد من التحليل، مثل التحليل المناعي الواسمات الجزيئية محددة، لدعم الاستنتاجات التجريبية. لهذا السبب، يفضل استخدام تحليل مواز لتفسير لا لبس فيه النتائج. على سبيل المثال، هي ملطخة myofibers تجديد إيجابي لالميوسين الجنينية سلسلة ثقيلة (eMyHC) التي يعبر عنها تحديدا في myofibers شكلت حديثا. وهكذا، وتحديد حجم myofibers الملون eMyHC-لا يمكن أن يؤديها جنبا إلى جنب مع التحليل الصرفي.
تحليل وكالة الفضاء الكندية هو تحديد أكثر موثوقية ويمكن أن يؤديها إما على أقسام H & E الملون أو على أقسام العضلات ملطخة laminin، الذي يصادف حافة الألياف العضلية. يتم تنفيذ الكمي باستخدام وحدات الماكرو المناسبة من يماغيج، كما هو موضح أعلاه. في كلتا الحالتين، فمن الضروري دائما لتقييم لأول مرة الجودة من الأقسام واستبعاد المناطق من الأنسجة التي تظهر مشوهة أو كرة لولبية.
بجانب التحليلات المورفولوجية للأنسجة، تسمح أقسام ملطخة E-H & لتحديد ملامح محددة أخرى، مثل وجود تليف و / أو الأنسجة الدهنية. في الواقع، والتليف مستمد من التراكم المفرط للالمصفوفة خارج الخلية الذي يحدث إما إذا هو ضعف التجديد أو في الأمراض المزمنة 14. في الواقع، وتراكم المصفوفة خارج الخلية مرئيا كمادة شاحب أودعت بين myofibers مجدد في تلطيخ H & E-النسيجي. جولات متعددة من حقن CTX يمكن استخدام رس الأمراض المزمنة تقليد فيها myofibers تخضع موجات من انحطاط والتجدد وندبا يتراكم aberrantly. ومع ذلك، هي بروتوكولات أكثر موثوقية المتاحة للحث العضلات التليف 15، وتلطيخ النسيجي محددة يمكن القيام بها لتحديد وقياس هذه الهياكل، مثل ماسون ثلاثي الألوان أو سيريوس الأحمر تلطيخ. تشكيل الأنسجة الدهنية واضحة للعيان في أقسام H & E الملون وعن الهياكل البيضاء تقريب بين myofibers، وهو ما يعطي مؤشرا هاما على وجود الأنسجة الدهنية، والتي تم قياسها من الزيت الأحمر تلطيخ. وأخيرا، حصلت أقسام الهيكل العظمي والعضلات بعد بروتوكول وصف يمكن استخدامها لإجراء التحليل المناعي باستخدام الأجسام المضادة وبروتوكولات محددة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cardiotoxin from Naja mossambica mossambica | SIGMA ALDRICH | C9759 | |
| Syringe For Insulin BD Micro-Fine+ Needle 30 G x 8 mm - Da 0.3 mL | BD | 324826 | |
| Tragacanth Gum | MP BIOMEDICALS,LLC | 104792 | |
| 2-Methylbutane (Isopentane) | SIGMA ALDRICH | 78-78-4. | |
| OCT Killik Solution For Inclusion Cryostat | Bio-optica | 05-9801 | |
| Feather Microtome Blade S35 | Bio-optica | 01-S35 | |
| Glass Slide Superfrost Plus | Menzel-Gläser | 09-OPLUS | |
| Dumon #5 Mirror Finish Forceps | 2BIOLOGICAL INSTRUMENTS | 11251-23 | |
| Scissors Straight Sharp/Sharp | 2BIOLOGICAL INSTRUMENTS | 15024-10 | |
| Scissors Noyes Straight | 2BIOLOGICAL INSTRUMENTS | 15012-12 | |
| Fine Iris Scissors Straight Sharp/Sharp 10.5 cm | 2BIOLOGICAL INSTRUMENTS | 14094-11 | |
| Eukitt | Bio-optica | 09-00100 | |
| Slide Coverslip | BIOSIGMA | VBS651 | |
| Xylene | SIGMA ALDRICH | 214736 | |
| Ethanol 100% | sigma-Aldrich | 02860-2.5L | |
| Hematoxyline | J.T. BAKER | 3873 | |
| Eosin | SIGMA ALDRICH | HT110116 | |
| Cryostat | LEICA | CM3050 S |
References
- Morgan, J. E., Partridge, T. A. Muscle satellite cells. Int J Biochem Cell Biol. 35 (8), 1151-1156 (2003).
- Roca, I., Requena, J., Edel, M. J., Alvarez-Palomo, A. B. Myogenic Precursors from iPS Cells for Skeletal Muscle Cell Replacement Therapy. J Clin Med. 4 (2), 243-259 (2015).
- Cheung, T. H., Rando, T. A. Molecular regulation of stem cell quiescence. Nat Rev Mol Cell Biol. 14 (6), 329-340 (2013).
- Dumont, N. A., Wang, Y. X., Rudnicki, M. A. Intrinsic and extrinsic mechanisms regulating satellite cell function. Development. 142 (9), 1572-1581 (2015).
- Hawke, T. J., Garry, D. J. Myogenic satellite cells: physiology to molecular biology. J Appl Physiol. 91 (1985), 534-551 (1985).
- Saclier, M., et al. Differentially activated macrophages orchestrate myogenic precursor cell fate during human skeletal muscle regeneration. Stem Cells. 31 (2), 384-396 (2013).
- Pillon, N. J., Bilan, P. J., Fink, L. N., Klip, A. Cross-talk between skeletal muscle and immune cells: muscle-derived mediators and metabolic implications. Am J Physiol Endocrinol Metab. 304 (5), E453-E465 (2013).
- Bentzinger, C. F., Wang, Y. X., Dumont, N. A., Rudnicki, M. A. Cellular dynamics in the muscle satellite cell niche. EMBO Rep. 14 (12), 1062-1072 (2013).
- Costamagna, D., Costelli, P., Sampaolesi, M., Penna, F. Role of Inflammation in Muscle Homeostasis and Myogenesis. Mediators Inflamm. 2015, (2015).
- Charge, S. B., Rudnicki, M. A. Cellular and molecular regulation of muscle regeneration. Physiol Rev. 84 (1), 209-238 (2004).
- Arnold, L., et al. Inflammatory monocytes recruited after skeletal muscle injury switch into antiinflammatory macrophages to support myogenesis. J Exp Med. 204 (5), 1057-1069 (2007).
- Chang, C. C., Chuang, S. T., Lee, C. Y., Wei, J. W. Role of cardiotoxin and phospholipase A in the blockade of nerve conduction and depolarization of skeletal muscle induced by cobra venom. Br J Pharmacol. 44 (4), 752-764 (1972).
- Meng, H., et al. Tissue triage and freezing for models of skeletal muscle disease. J Vis Exp. (89), (2014).
- Mann, C. J., et al. Aberrant repair and fibrosis development in skeletal muscle. Skelet Muscle. 1 (1), (2011).
- Pessina, P., et al. Novel and optimized strategies for inducing fibrosis in vivo: focus on Duchenne Muscular Dystrophy. Skelet Muscle. 4 (1), 7 (2014).
