Induksjon av akutt Skeletal Muscle Regenerering av Cardiotoxin Injection

Summary

Dette manuskriptet beskriver en detaljert protokoll for å indusere akutt skjelett-muskel regenerering i voksne mus og etterfølgende manipulasjoner av muskler, såsom disseksjon, frysing, skjæring, rutine flekker, og myofiber tverrsnittsareal analyse.

Abstract

Skjelettmuskulatur regenerering er en fysiologisk prosess som forekommer hos voksne skjelettmuskulaturen som respons på skade eller sykdom. Akutt skade-indusert skjelettmuskulatur gjenfødelse er et mye brukt, kraftig modellsystem for å studere hendelser som er involvert i muskel regenerasjon samt mekanismer og ulike aktører. Faktisk en detaljert kunnskap om denne prosessen er avgjørende for en bedre forståelse av patologiske tilstander som fører til skjelettmuskulatur degenerasjon, og det bidrar i å identifisere nye målrettede terapeutiske strategier. Dette arbeidet beskriver en detaljert og reproduserbar protokollen for å indusere akutt skjelettmuskulatur regenerering hos mus gjennom en enkelt intramuskulær injeksjon av Cardiotoxin (CTX). CTX tilhører familien av slangegift toksiner og fører myolyse av myofibers, som til slutt utløser regenerering hendelser. Dynamikken i skjelettmuskulatur regenerering evalueres ved histologisk analyse av muskel seksjoner. Protokollen ogsåillustrerer de eksperimentelle prosedyrene for å dissekere, frysing, og kutting av tibialis anterior muskel, så vel som rutinemessig Hematoxylin-eosin-farging som er mye brukt for etterfølgende morfologisk og morfometrisk analyse.

Introduction

Pattedyr voksne skjelettmuskulatur er dannet av grupper av fascicules av multinucleated muskelceller (myofibers) som er spesialisert for sammentrekning. Hver myofiber er et langstrakt syncytium, omgitt av sarcolemma (plasmamembran) og inneholder myofibrils, som er tatt opp av regelmessig og gjentatte ganger organiserte kontraktile proteiner (aktin og myosin filamenter). I voksen livet og i hvilebetingelser, skjelettmuskulatur har en svært lav omsetning på deres myonuclei ^1; ja, de myonuclei, som er plassert ved periferien av den myofiber, under sarcolemma, blir arrestert i G0-fasen av cellesyklusen, og er ute av stand til å formere seg ^1,2.

Skjelettmuskler har den eiendommelige evne til å regenerere etter skade, og nådde homeostase etter flere hendelsene i vev-omforming som er tett forbundet med hverandre. Etter å ha en akutt skade eller traume, blir indusert degenerering, etterfulgt av regenereringsprosessersom involverer ulike cellepopulasjoner, inkludert en fastboende befolkning på muskelcellene, satellittceller (SCS). Faktisk, i fravær av miljømessige stimuli, satellitt cellene er i en hviletilstand og er plassert i en nisje mellom sarcolemma og basal lamina ^3,4. Etter en skade eller sykdom, SC'er blir aktivert, spre seg, migrere til de skadede områdene, og til slutt skille, noe som gir opphav til nye forming myofibers ^5. Aktivert SC'er etablere krysstale med forskjellige cellepopulasjoner, hovedsakelig betennelsesceller, som er rekruttert i stedet for traumer ^6-8. Dette cross-talk gjør at cellene til å følge et regulert paradigme der molekylære signaler drive strukturelle endringer, til slutt fører til homeostase ^9. Foruten SC'er, provoserende og interstitielle celler, angiogeneprosesser, og re-innerverte hendelser er også involvert, opptrer på en samordnet måte å reparere dette svært organisert og specialized struktur.

Det er stor interesse for å studere ulike aspekter av skjelettmuskulatur regenerering, ikke bare for å forstå fysiologien i muskler, men også for å bedre terapeutiske strategier som krever dypere kunnskap om hele prosessen. Flere eksperimentelle tilnærminger er for tiden tilgjengelig for å studere identitet og funksjon av de forskjellige cellepopulasjoner, de signalveier, og de molekylære mekanismene som er involvert. Musemodeller av akutt skade representerer et kraftig verktøy for å undersøke mange aspekter av denne prosessen. Forskjellige teknikker som vanligvis brukes for å indusere akutt muskelskader tillate forskere å følge regenereringsprosessen in vivo, fra de meget tidlige stadiene til slutten av prosessen. Denne protokollen beskriver trinnene fra intramuskulær injeksjon av slangegift-avledet Cardiotoxin (CTX), som induserer myolyse og utløser regenereringen opp til analyse av vevsprøver. Etter CTX injeksjon, mice kan bli ofret ved ulike tidspunkt avhengig av eksperimentelle krav og skjelettmusklene kan dissekert og behandles for videre analyse. Til slutt beskriver vi farging protokollen av vevssnitt å utføre morfologiske observasjoner og grunnleggende kvantitative analyser. Denne protokollen tillater studiet av akutt skjelettmuskulatur regenerering in vivo i en meget reproduserbar måte ^10.

Protocol

Alle forsøkene ble utført i henhold til de institusjonelle retningslinjer for dyreforsøk og godkjent av Department of Public Health, Animal Health, ernæring og mattrygghet i den italienske helsedepartementet i samsvar med lov om dyreforsøk. Halshugging prosedyrer kan variere fra institusjon til institusjon basert på IACUC eller tilsvarende krav.

1. Cardiotoxin Injeksjon i tibialis anterior muskelen

1. Fremstille en 10 uM arbeidsløsning av Cardiotoxin (CTX) ved å fortynne den Cardiotoxin stamløsning i sterilt fosfatbuffret saltoppløsning (PBS) eller i vann før starter prosedyren.
   Merk: CTX er oppløselig i vann ved 1 mg / ml. Forbered en 70 mM stamløsning. Delmengde og oppbevares ved -20 ° C. CTX brukes for denne protokollen er en blanding av cardiotoxins med en molekylvekt på omtrent 7000 Da.
   OBS: Det er foreslått å bæredoble hansker, hygiene maske og vernebriller (alternativt vernebriller, anbefales det å arbeide under en hette), og for å være svært forsiktig med å unngå kontakt med løsningen, selv ved fortynning.
2. Bedøve mus ved intraperitoneal injeksjon av ketamin og xylazin (80 mg / kg og 10 mg / kg kroppsvekt) eller annet godkjent tilgjengelig bedøvelse.
3. Med musen forsiden opp, spray baklemmene med 70% etanol. For å visualisere den nøyaktige plassering av tibialis anterior (TA) muskel, ved hjelp av en skalpell, klippe håret bort på den fremre del av det nedre ben under kneet.
   Merk: TA muskel oppstår fra den proksimale kroppen av tibia, går ned sideveis til beinet og slutter ved ankelen. Den lange sene strekker seg inn i foten over ankelen (se figur 1A).
4. Tegn ~ 100 mL av løsningen inn i sprøyten ved å dra stempelet sakte.
5. Fjern luftbobler, holder sprøyten oppreist (med nålen oppover). Trekk stempelet ned og trykk på siden av sprøyten for å hjelpe eventuelle luftbobler festet til den indre del av røret kommer oppover. Trykk stempelet langsomt å frigjøre store luftbobler. Noen få dråper væske vil komme ut nålen. På dette punktet, må du sørge for å plukke den flytende opp igjen i røret og ikke spre det, gitt giftigheten av Cardiotoxin.
6. Trekk oppløsningen opp i sprøyten til ønsket dose er nådd. Injisere 20 mL av CTX løsning for hver TA muskel.
7. Sett nålen i sentrum av TA ved å følge posisjonen til Tibia ben som veiledning, fra den sene mot kneet. Siden TA er en tynn vev, utføre injeksjon uten å gå for dypt (stikk nålen 2/3 mm dypt, på ca 10 ° til 20 ° vinkel), og unngå å gå utover muskelen selv (figur 1A).
8. Ikke trekk ut kanylen umiddelbart etter injeksjonen, men vent 2 - 3 s for å hindre lekkasjealder av CTX dråper fra muskelen.
9. Etter prosedyren plassere buret på en oppvarmet plate (ved 37 ° C) inntil de er våkne mus, ettersom bedøvelse og etanolen som brukes redusere kroppstemperatur.

2. tibialis anterior Isolation

Merk: Muskler kan isoleres ved ulike tidspunkt etter Cardiotoxin injeksjon i henhold til eksperimentelle krav.

1. Offer musen ved halshugging.
2. Spray bakbena med 70% etanol. Under prosedyren, kan dyret være festet til en bærer for å holde den nede.
3. Kutt i huden på nivå med den proksimale sene (ovenfor foten), sette inn et av bladene i saksen under huden, og skjære huden oppover, i retning av kneet. Med hjelp av pinsett, trekke opp huden og utsette muskelen helt. Fjern forsiktig alle av huden og håret fra området av interesse.
4. Eliminer fascia ved sakte klemming eller kutting (med thi-tip pinsett eller med fine mikro disseksjonssaksen) ytterste periferi av muskelen på motsatt side av tibia (figur 1B). Når brutt fjern forsiktig konseptet ved hjelp av tynne tip pinsett; unngå å skade den underliggende muskel.
   Merk: Som ved andre muskler og organer, er den TA dekket av fascia (dyp fascia av benet), et tynt ark av bindevev som ligger dypt under huden, og som må fjernes for enkelt å isolere den underliggende muskel.
5. Visualisere distal TA sene og Extensor digitorum sene over foten, som er sidestilt. Den sene av Extensor digitorum longus (EDL) muskel ligger litt under TA sene. Sener av voksen mus er synlige for det blotte øye.
6. Fjern TA muskel etter en av de to følgende teknikker:
   1. Kutt begge sener med fin mikro dissekere saks og dra dem mot den indre side, holding sener med tang. Skill de to sener, trekke dem forsiktig i motsatt retning for å skille musklene.
   2. Med hjelp av tynn-tip pinsett, skille distal TA sene fra Extensor digitorum sene ved å føre tuppen under sene selv (figur 1C, øverste bildet). Skyv pinsett under TA for å skille den fra den underliggende muskler (figur 1C, nederste bildet).
   3. Hold pinsetten under muskelen for å holde det litt hevet, kutt TA sene, og trekk den forsiktig oppover til bare området nedenfor kneet er festet (figur 1D, venstre bilde). Skjær TA under kneet, etter kanten av muskelen med saksen (figur 1D, høyre bilde).
      Merk: Hvis muskelen forblir svakt festet til sidene, kan du bruke fint mikro dissekere saks for å hjelpe løsne den.
      Merk: Hvis pinsett ikke lett passer under TA,Det er mulig at fascia ikke har blitt helt fjernet, og det kan fortsatt være synlig på toppen av muskelen. I dette tilfellet, fjerne konseptet før du fortsetter.

3. Fresh Frozen Muscle Technique

1. Plasser en liten mengde tragantgummi eller lignende lim frysing forbindelse (f.eks Optimal Cutting Temperatur (OCT) compound) på et stykke kork. Merk korken sin skive på baksiden før frysing, om nødvendig (Figur 2A).
2. For å oppnå tverrgående seksjoner av muskelen, vask TA inn i tragantgummi ved å sette den distale sene og etterlater omtrent 3/4 av muskelen utsiden, å sørge for å ha muskel i en vinkelrett stilling i forhold til korken (figur 2A).
3. Fyll i en aluminiumboks (alternativt en metallkopp eller et glassbeger), med isopentan. Heng kan av isopentan i en Dewar inneholder LIQUId nitrogen, ikke slik at det flytende nitrogen å komme inn i boksen.
   Merk: Isopentan behov for å oppnå riktig temperatur (-150 til -160 ° C) for optimal frysing av vevet. Den riktige temperatur er nådd når noen hvite faste partikler som dannes på bunnen av boksen og det isopentan blir noe tyktflytende.
   Merk: Ikke frys prøven før dannelsen av de faste partikler, da det kan føre til frysing gjenstander. På den annen side, hvis den isopentan blir helt fast, lar den ved værelsestemperatur inntil den er tint, å sørge for at noen hvite partikler er fremdeles til stede.
4. Ved hjelp MIXTER tang, raskt dyppe korken med muskelen inn i isopentan, holde muskel plassert nedover, og sørg for å slippe kork når det er helt oppslukt i væsken. På denne måte, når prøve flyter, bare baksiden av korken skal være synlig i væsken.
5. La SAmple i isopentan i 1 min.
6. Bruke MIXTER pinsett (eller lignende tang), ta muskler og dyppe den i flytende nitrogen i minst 2 min.
7. Pakk prøvene individuelt i merket aluminiumsfolie og umiddelbart plassere dem i tørris (-70 ° C), eller direkte lagre dem i en -80 ° C fryser.
   Merk: Gjennom hele prosedyren, fra trinn 3.4 til 3.7, er det ekstremt viktig å opprettholde riktig temperatur, og for å hindre at prøvestykkene fra tiner (for eksempel i løpet av overføringen til -80 ° C fryser.). De stigende temperatur resulterer i ukontrollert tining og gjenfrysing av vann-mikrokrystallene som er tilstede i vevet og til slutt fører til dannelse av gjenstander eller nedbrytning av muskelfibre (visualisert på vevssnittene som store, hvite hull i sentrum av fiberen).

4. Kryostat Seksjonering av frosne muskler

1. Sett kryostaten kammertemperaturen to -20 til -22 ° C.
2. Sette prøven stussen, bladet, og prøven i kryostaten kammeret, slik at de kan stabilisere seg i minst 30 min.
3. Plasser en liten mengde frysing forbindelse (f.eks oktober compound) på prøve spire og fordype korken med prøven før frysing sammensatte stivner. I mellomtiden plassere bladet i bladholderen.
4. Rett prøven og bladet ved hjelp av de medfølgende skruene til å orientere prøveholder med bladholderen (figur 2B).
5. Sett snittykkelse til 10 mikrometer. Fortsett å kutte vev. For hver omdreining av drivhjulet, går prøveholder en kontrollert avstand mot bladet.
6. Plasser delene på en polarisert lysbilde (8-10 pkt per lysbilde) (figur 2C).
7. Etter seksjonering, lagre lysbilder ved -80 ° C.
   Merk: Prøven kan oppbevares i en -80 ° C fryser og gjenbrukes for further seksjonering, hvis riktig håndtert og lagret.

5. Rutine Histologisk Farging (Hematoxylin og eosin Flekker)

Merk: Flere histologiske flekker kan utføres på muskel seksjoner ifølge analysen. En rutinemessig histologisk flekken for morfologisk og morfometrisk analyse er Hematoxylin og eosin (H & E) bichromic flekken. Den hematoxylin flekker kjerner en dyp lilla. Nukleær farging er motfarget med eosin (rosa / rød), som flekker eosinofile strukturer, slik som de myofibers i cytoplasma.

1. Fullstendig lufttørke frosne lysbilder med seksjoner for 10 - 15 minutter ved romtemperatur, lodge lysbildene i en farging brett, og sett brettet i en farging trau.
2. Flekk i 1 min med hematoksylin.
3. Lå farging trau under en ganske svak vann fra springen jet i 10 min for å vaske ut hematoxylin.
4. Fordype lysbildene i 5 min i 95% etanol, hvis vil bli brukt en alkoholisert løsning av eosin (hopp thans trinn i tilfelle av en vandig oppløsning eosin).
5. Counterstain i 1 min med eosin-løsning.
6. Skyll med vann for å eliminere overdreven eosin løsning.
   Merk: Optimal timing av farging med enten hematoxylin eller eosin bør defineres for hver ny batch.
7. Dehydrere prøvene i en gradert etanolserie: 50% og 70% (noen få sekunder hver). Hurtig dyppes i 95% etanol, etterfulgt av 2 forandringer i 100% etanol, 5 min hver.
8. Klar i 2 endringer xylen, hver 5 min eller lengre. Dette trinn må utføres under en kjemisk hette.
9. Monter skinnene med en xylen-baserte montering medium, bruke noen dråper montering medium på lysbildet og dekker med et dekkglass. Monterings mediet kan også bli brukt til dekkglass og dekkglass satt på lysbildet.
   1. Unngå dannelse av luftbobler mellom lysbildet og dekkglass. For å eliminere luftbobler, holde lysbilde vertikal (etter montering) og klem ut overflødig mobokføring medium og luftbobler ved å trykke forsiktig på dekkglass med butt pinsett (eller en lignende butt verktøy).
10. Hold lysbildene under panseret i noen timer eller over natten for å la xylen fordampe helt før du går videre til analyse.
11. Utføre den morfologiske og morfometrisk analyse av H & E-fargede regenererende muskel seksjoner ved hjelp av ikke-overlappende serielle bilder av minst en hel muskel seksjon per mus. Ta bilder med en lys-feltet mikroskop, med 20X forstørrelse.
    Merk: Det anbefales et minimum antall av fem mus for å oppnå statistisk signifikans av målingene.
    Merk: Bildeanalyse programvare er tilgjengelig for dette formålet, slik som gratis nedlasting programvare ImageJ (http://imagej.nih.gov/ij/).

Representative Results

H & E farging muliggjør evaluering av morfologien til regenereringsprosessen ved bestemte tidspunkter i løpet av skjelettmuskel regenerering. Figur 3 viser tidsforløpet analyse utført på skadde TA musklene i villtype-mus. Musklene har blitt isolert ved 3, 7, 15 og 30 dager etter injeksjonen CTX, som skjematisk vist i figur 3A. Representative bilder av H & E-fargede tverrgående avsnittene viser dynamikken i skjelettmuskulatur reparasjon over tid (figur 3B-E). På dag 3 etter skade, er den strukturelle arkitektur av muskelen helt ødelagt, og begge utartet myofibers (nekrotisk område) og mononukleærerte cellene er godt synlig (figur 3B). Denne heterogen gruppe av celler består hovedsakelig av forbigående forsterkende satellittceller (myoblasts), inflammatoriske celler rekruttert fra blod ^11, og interstitiell og endotelceller som participate i regenereringen som utløses på stedet av skader. I denne sammenheng blir nye Regenererende myofibers generert ved fusjon og differensiering av myoblasts. Den viktigste funksjonen til regenererende området er tilstedeværelsen av små basofile myofibers med sentral beliggenhet kjerner og en mørk-farget cytoplasma (Figur 3C). På dette stadiet er betennelse fremdeles synlig, selv om den gradvis avtar. Størrelsen av regenererende myofibers øker over tid, noe som gir opphav til eosinofile regenerert myofibers karakterisert ved sentralt plasserte kjerner (figur 3D, E). Den regenererte myofibers er synlige på senere stadier av regenerering og til slutten av prosessen. De friske myofibers vises høyt organisert og nær hverandre, med et rosa cytoplasma og med kjernene plassert ved periferien av fibrene, under sarcolemma. Disse myofibers er vanligvis til stede langt fra stedet til CTX injeksjon og skader, og de mer sjeldnely representerer områder hvor regenereringen er definitivt avsluttet. Faktisk er regenererte fibre karakteriseres ved nærværet av sentralt plasserte kjerner som beveger seg til periferien bare noen måneder etter skade.

Digitale bilder av de fargede muskel seksjonene er fanget ved å legge til skala barer for romlig kalibrering, noe som er nødvendig for å måle de områder av interesse ved å skissere konturene av de interesserte områder. Målingen av myofiber tverrsnittsareal (CSA) er en pålitelig morfometrisk analyse, som er mye brukt for å kvantifisere de forskjeller i regenereringen trend mellom ulike grupper av mus. Denne analysen krever måling av områder med en sentral kjerneholdige myofibers, inkludert minst 500 og opp til 1000 fibre pr seksjon. Både gjennomsnittet av regenererende og regenererte myofiber områdene, og Gaussian distribusjon av disse områdene er indikatorer for regenerering process. Økt myofiber CSA er vanligvis forbundet med en forbedret og / eller akselerert regenerativ respons. Tvert imot, er svikt i riktig regenerering assosiert med en reduksjon i CSA. Her rapporterte vi at myofiber CSA analyse, angitt som både gjennomsnittet (figur 3F) og distribusjon (figur 3G) av myofiber CSA ved ulike tidspunkt. Analysen viser hvordan fordelingen av myofiber områder endringer over tid og hvordan CSA skift mot større størrelse fibre som prosessen med regenerering inntektene.

Figur 1. Intramuskulær Injeksjon og Isolering av tibialis muskel. A. intramuskulær injeksjon av Cardiotoxin i tibialis anterior muskelen. B. Fjerning av muskel fascia. Den hvite pilen indikerer de tynne-tipped pinsett som klemme muskler til å fjerne the fascia. C. Det øverste bildet viser anatomiske plasseringen av distal TA sene. Det nederste bildet viser hvordan å løfte TA og fjerne det samtidig unngå muskelskader. D. Venstre bilde: TA løftes ved å trekke den distale sene oppover. Den hvite pilen viser distal EDL sene. Høyre bilde: ved å holde den sene med tang, er den øverste kanten av TA avskåret under kneet. Den hvite pilen indikerer klippe nettstedet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2. Frisk Frysing Muskel og Cryostat Seksjonering av frosne muskler. A. Technique av frisk muskel inkludering i tragantgummi. TA muskelen er nedsenket i tannkjøttet fra senen, med ca 3/4 utenfor ogopprettholdt i en vinkelrett stilling i forhold til korken. B. Representative bilder av prosedyren for cryostat seksjonering. Korken er plassert i en liten mengde iskaldt forbindelsen på prøven stump. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3. Tid Course Analyse av Skeletal Muscle Regeneration. A. Eksperimentell ordningen med akutt skjelettmuskelskader. BE. Representative bilder av Hematoxylin & eosin farget deler av Cardiotoxin (CTX) -behandlet muskler på angitte dagene etter skade. B. Den svarte sammenhengende linje (på venstre side av bildet), omslutter et par av nekrotiske fibre, sannsynligvis invadert av inflammatoriske celler. Den stiplede linjen (høyre sideav bildet) markerer et område av infiltrerende mononukleærerte celler. C. En enkelt umoden myofiber med sentralt plassert kjerne er indikert ved den svarte sirkelen. DE. Store regenererte eosinofile myofibers, med sentral beliggenhet atomkjerner er merket med svarte sirkler. Skala barer representerer 100 mm. F. Gjennomsnitt av sentralt kjerneholdige myofiber størrelsesverdier i TA muskel seksjoner. Verdier er gjennomsnitt ± SEM, 5 mus / gruppe. G. Myofiber tverrsnittsareal (CSA) fordeling på 6, 15, og 30 dager etter CTX injeksjon. Verdier er gjennomsnitt ± SEM, 5 mus / gruppe. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

Her beskriver vi en protokoll for å indusere akutt skade i muskulaturen (dvs. intramuskulær injeksjon av CTX). Den er mye brukt som et kraftig verktøy for å studere dynamikken i skjelettmuskulatur regenerering in vivo. CTX injeksjon induserer degenerering av muskelfibre, som er forårsaket av depolarisering av sarcolemma og sammentrekning av fibrene ^12, og utløser den kaskade av hendelser som fører til muskel regenerering. Skjelettmuskulatur dissekeres på ønskede tidspunkter etter injeksjonen, og skade, i henhold til eksperimentelle krav, og anvendt for påfølgende histologisk analyse. De dissekert musklene kan enten frosset, etter inkludering i kryo-beskyttelses media, eller inkludert i parafin. Men disse fremgangsmåtene krever et trinn med forhåndsfiksering med paraformaldehyd, som kan generere gjenstander og kan til slutt påvirke de etterfølgende analyser. Frysing vevet direkte kan unngå dette problemet. Av notatet, mangeprimære antistoffer jobber utelukkende eller mer effektivt på Dypfryst muskel §§ ^13, noe som gjør denne prosedyren mer pålitelig. Den morfometrisk analyse blir vanligvis utført på tid kurs eksperimenter, som gir mulighet for evaluering av forskjeller i fornyelsesprosesser mellom grupper av mus med samme alder og med spesifikke genetiske mutasjoner og / eller farmakologisk behandling. Selv om protokollen for CTX-indusert skade er meget reproduserbar per se, er en mulig begrensning på grunn av operatøravhengig variasjon av CTX injeksjon. For å overvinne denne begrensningen, er det å foretrekke at hele tidsforløpet forsøket utføres ved den samme operatør.

Omfanget av muskel regenerering kan bli kvantifisert som prosent friske fibre, nekrotiske områder og betennelse, og regenerering og regenererte områder over det totale areal. Imidlertid er denne tilnærmingen mest brukt når man studerer hendelser på kronisk skade, for eksempel i dystrofe MDX mice, snarere enn i modeller av akutt skade. Faktisk, mens dystrofe muskler er preget av asynkrone hendelser på degenerasjon og regenerasjon, er akutt skade fulgt av veldefinerte og følgehendelser. En begrensning av disse analysene, som krever en empirisk identifikasjon av de morfologiske trekk som er beskrevet ovenfor, er at de ikke er helt objektivt. For å støtte eksperimentelle konklusjoner, bør den morfologiske analysen alltid skal suppleres med ytterligere analyse, slik som immunofluorescens-analyse av spesifikke molekylære markører, for å understøtte eksperimentelle konklusjoner. Av denne grunn er det foretrukket å benytte parallell analyse til utvetydig å tolke resultatene. For eksempel er regenererende myofibers positivt farget for embryonal Myosin Heavy Chain (eMyHC) som uttrykkes spesifikt i nydannede myofibers. Således kan kvantifisering av eMyHC-fargede myofibers utføres side-ved-side med morfologisk analyse.

CSA-analyse er en mer pålitelig og kvantifisering kan utføres enten med H & E-fargede seksjoner eller på muskel seksjonene farget med laminin, som markerer kanten av muskelfibrene; Kvantifisering blir utført ved hjelp av egnede makroer av ImageJ, som beskrevet ovenfor. I begge tilfeller er det alltid nødvendig å først vurdere kvaliteten på delene og å ekskludere områder av vev som vises deformert eller krøllete.

Foruten de morfologiske analyser av vev, H & E-fargede seksjoner gir mulighet for identifisering av andre spesifikke egenskaper, som for eksempel nærvær av fibrose og / eller fettvev. Faktisk stammer fibrose fra overdreven akkumulering av ekstracellulære matrise som skjer enten hvis regenerering er svekket eller i kroniske sykdommer ^14. Faktisk er ekstracellulære matrise opphopning synlig som blek materiale avsatt mellom regenererte myofibers i H & E-histologisk farging. Flere runder med CTX injeksjon kan brukes to ligne kronisk sykdom der myofibers gjennomgå bølger av degenerasjon og regenerasjon og arrvev akkumulerer abnormt. Men mer pålitelige protokoller er tilgjengelige for å indusere muskelfibrose ^15, og bestemt histologisk farging kan utføres for å identifisere og kvantifisere disse strukturer, slik som Masson største Trichrome eller Sirius rød farging. Dannelse av fettvevet er klart synlig i H & E-fargede seksjoner som avrundede hvite strukturer mellom de myofibers, noe som gir en viktig indikasjon på tilstedeværelse av fettvev, som er kvantifisert ved Oil rød farging. Til slutt, muskelavslappende seksjoner oppnådd ved å følge den protokoll som er beskrevet kan brukes til å utføre immunofluorescensanalyse ved hjelp av spesifikke antistoffer og protokoller.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cardiotoxin from Naja mossambica mossambica	SIGMA ALDRICH	C9759
Syringe For Insulin BD Micro-Fine+ Needle 30 G x 8 mm - Da 0.3 mL	BD	324826
Tragacanth Gum	MP BIOMEDICALS,LLC	104792
2-Methylbutane (Isopentane)	SIGMA ALDRICH	78-78-4.
OCT Killik Solution For Inclusion Cryostat	Bio-optica	05-9801
Feather Microtome Blade S35	Bio-optica	01-S35
Glass Slide Superfrost Plus	Menzel-Gläser	09-OPLUS
Dumon #5 Mirror Finish Forceps	2BIOLOGICAL INSTRUMENTS	11251-23
Scissors Straight Sharp/Sharp	2BIOLOGICAL INSTRUMENTS	15024-10
Scissors Noyes Straight	2BIOLOGICAL INSTRUMENTS	15012-12
Fine Iris Scissors Straight Sharp/Sharp 10.5 cm	2BIOLOGICAL INSTRUMENTS	14094-11
Eukitt	Bio-optica	09-00100
Slide Coverslip	BIOSIGMA	VBS651
Xylene	SIGMA ALDRICH	214736
Ethanol 100%	sigma-Aldrich	02860-2.5L
Hematoxyline	J.T. BAKER	3873
Eosin	SIGMA ALDRICH	HT110116
Cryostat	LEICA	CM3050 S