Summary
Bu yazıda, yetişkin farelerde ve diseksiyon olarak kasların sonraki manipülasyonlar, dondurma, kesme, rutin boyama ve myofiber kesit alanı analizi akut iskelet kas yenilenmesini meydana ayrıntılı bir protokol açıklamaktadır.
Abstract
İskelet kası yenilenmesi yaralanma ya da hastalık yanıt olarak, yetişkin iskelet kaslarının oluşan bir fizyolojik bir süreçtir. Akut yaralanma kaynaklı iskelet kası rejenerasyon kas rejenerasyonu yanı sıra mekanizmaları ve farklı oyuncular yer alan olayları incelemek için yaygın olarak kullanılan bir, güçlü modeli sistemidir. Gerçekten de, bu sürecin ayrıntılı bilgi, iskelet kas dejenerasyonu neden patolojik durumların daha iyi anlaşılması için gerekli olan ve yeni hedef tedavi stratejileri belirleme yardımcı olur. Bu çalışma cardiotoxin tek bir intramüsküler enjeksiyon (CTX) aracılığıyla farelerde akut iskelet kas rejenerasyonu ikna etmek için ayrıntılı ve tekrarlanabilir bir protokol açıklar. CTX yılan zehiri toksinler ailesine aittir ve sonunda rejenerasyon olaylarını tetikleyen myofibers bir myolysis neden olur. iskelet kası rejenerasyon dinamikleri, kas bölümleri histolojik analizi ile değerlendirilir. ayrıca protokol, Diseksiyon donma ve tibialis anterior kas yanı sıra yaygın sonraki morfolojik ve morfometrik analizi için kullanılan rutin Hematoksilen & Eosin boyama kesmek için deneysel prosedürler göstermektedir.
Introduction
Memeli yetişkin iskelet kas kasılması için özel olan çok çekirdekli kas hücreleri (myofibers) arasında fasiküller grupları ile oluşturulmaktadır. Her myofiber düzenli ve sürekli olarak düzenlenen kontraktil proteinlerin (aktin ve myosin filamanların) oluşur sarcolemma (plazma membran) içeren ve myofibrils çevrili bir ince uzun sinsityum vardır. Erişkin yaşamda ve dinlenme koşullarında, iskelet kasları kendi myonuclei 1 çok düşük bir ciro var; Gerçekten, sarcolemma altında, myofiber çevresinde yer almaktadır myonuclei, hücre döngüsünün G0 fazında tutuklandı ve 1,2 çoğalırlar edemiyoruz vardır.
İskelet kasları, zarar aşağıdaki sıkıca birbirleriyle ilişkili olan doku yeniden birkaç olaylardan sonra homeostazisini ulaşan yeniden özgü yeteneği var. akut yaralanma veya travma sonrasında dejenerasyon, indüklenir yenilenmesi işlemleri ve ardındankas hücrelerinin bir yerleşik nüfusun dahil olmak üzere farklı hücre popülasyonu, içerdiğini, uydu hücreleri (SC'ler). Gerçekten de, bir çevresel uyarıcılar olmadan uydu hücreleri, hareketsiz bir durumda olan sarkolemma ve bazal lamina 3,4 arasında bir niş yer almaktadır. Bir yaralanma ya da hastalık, aktif, yeni şekillendirme myofibers 5 sebebiyet veren, hasar görmüş alanlara göç ve sonunda ayırt çoğaltacak haline AVM ardından. Aktif SC'ler travma 6-8 sitesinde işe farklı hücre popülasyonlarının, temel olarak iltihap hücreleri ile çapraz-kurulması. Bu cross-talk hücreleri sonunda 9 homeostazı lider, moleküler sinyaller yapısal değişiklikler hangi sürücü tarafından düzenlenmiş bir paradigma izlemenizi sağlar. AVM, inflamatuar ve interstisyel hücreler, anjiyojenik süreçler ve yeniden innervasyon etkinliklerin yanı sıra, aynı zamanda bu son derece organize ve s onarmak için koordineli bir şekilde hareket ederek, söz konusupecialized yapısı.
kas fizyolojisini anlamak için değil, aynı zamanda tüm sürecin derin bilgi gerektiren tedavi stratejileri geliştirmek için değil sadece, iskelet kası yenilenme farklı yönlerini inceleyerek büyük ilgi var. Çeşitli deneysel yaklaşımlar günümüzde farklı hücre popülasyonlarının, sinyal yolları ve ilgili moleküler mekanizmaların kimliğini ve işlevini incelemek için kullanılabilir. Akut yaralanma Fare modelleri bu sürecin pek çok yönünü araştırmak için güçlü bir araç temsil etmektedir. Farklı yaygın akut kas hasarı araştırmacılar sürecinin sonuna kadar çok erken aşamalarında, in vivo rejenerasyon sürecini takip etmesine izin ikna etmek için teknikler kullanılır. Bu protokol myolysis uyarır ve doku örneklerinin analizine kadar yenilenme sürecini tetikleyen yılan zehiri türevi cardiotoxin intramüsküler enjeksiyon (CTX), gelen adımları açıklar. CTX enjeksiyonundan sonra, mice deney koşullarına bağlı olarak, farklı zaman noktalarında feda edilebilir ve iskelet kasları parçalara ayrıldı ve daha fazla analiz için işlenebilir. Son olarak, biz morfolojik gözlemler ve temel kantitatif analizleri yapmak için doku bölümleri boyama protokol açıklar. Bu protokol, yüksek ölçüde tekrarlanabilir biçimde 10 in vivo akut iskelet kas rejenerasyon çalışma sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bütün deneyler, hayvan araştırmaları için kurumsal talimatlarına göre yapılan ve Deney Hayvanları yasalara uygun Halk Sağlığı, Hayvan Sağlığı, Beslenme ve İtalyan Sağlık Bakanlığı Gıda Güvenliği Dairesi tarafından onaylanmıştır. Servikal dislokasyon prosedürleri IACUC veya eşdeğer gereksinimlerine göre kurumdan kuruma değişebilir.
Tibialis anterior kas 1. Cardiotoxin Enjeksiyon
- işleme başlamadan önce, steril fosfat tamponlu tuz (PBS) içinde ya da su içinde cardiotoxin stok çözelti seyreltilerek cardiotoxin (CTX) çalışma çözeltisinin 10 uM hazırlayın.
Not: CTX 1 mg / ml su içinde çözünür. 70 mcM stok solüsyonu hazırlayın. -20 ° C'de kısım ve mağaza. Bu protokol için kullanılan CTX yaklaşık 7000 Da'lık bir moleküler ağırlığa sahip cardiotoxins bir karışımıdır.
Giymek tavsiye edilir: DİKKATçift eldiven, bir hijyen maskesi ve koruyucu gözlük seyreltilmiş bile, ve çözümü ile herhangi bir teması önlemek için çok dikkatli olmak (alternatif olarak güvenlik gözlükleri için, bir başlık altında çalışmak için tavsiye edilir). - Ketamin ve ksilazin (80 mg / kg ve / kg vücut kütlesinin 10 mg) ya da diğer kabul uygun anestezik intraperitoneal enjeksiyonu ile farelere anestezi.
- Fare yüzü yukarı gelecek şekilde,% 70 etanol ile arka bacaklarda sprey. Bir neşter yardımıyla Tibialis Anterior (TA) kas tam yerini, görselleştirmek için, diz altında, alt bacağın ön kısmında uzakta saçlarını kesti.
Not: TA kas kemik yanal aşağı gidiş ve ayak bileğinde biten, tibianın proksimal gövde doğar. Onun uzun tendon (Şekil 1A bakınız) bileği boyunca ayak içine uzanır. - geri pistonu yavaşça çekerek enjektöre çözümün ~ 100 uL çizin.
- (Hava kabarcıklarını çıkarmak dik şırınga tutaniğne ile yukarı doğru). Yavaşça aşağı pistonu çekerek tüpün iç kısmına bağlı herhangi bir hava kabarcıkları yukarı doğru gelip yardımcı olmak için şırınga tarafını hafifçe vurun. Yavaş yavaş büyük hava kabarcıkları serbest bırakmak için pistonu basın. sıvı birkaç damla iğne çıkacaktır. Bu noktada, cardiotoxin toksisitesi göz önüne alındığında, onu dağıtmak tüp içine tekrar sıvıyı almak ve emin olun.
- Arzu edilen doz, ulaşılana kadar şırıngaya solüsyonu çekin. Her TA kas için CTX solüsyonu 20 mcL enjekte edilir.
- diz doğru tendonu, rehberlik gibi Tibia kemiğinin pozisyonu takip ederek ta merkezinde iğne takın. TA ince doku olduğundan, (2/3 mm derinliğinde iğne, yaklaşık 10 ° ila 20 ° açı ekleyin) çok derin gitmeden enjeksiyon gerçekleştirmek ve kas kendisi (Şekil 1A) ötesine geçerek kaçının.
- enjeksiyondan hemen sonra iğneyi çekin ama 2 beklemeyin - sızıntısı önlemek için 3 snCTX yaş kas düşer.
- Fareler anestezi beri, uyanık ve kullanılan etanol vücut ısısını düşürmek kadar işlem sonrası, (37 ° C'de) ısıtılmış bir plaka üzerinde kafes yerleştirin.
2. Tibialis Anterior İzolasyon
Not: Kas deney ihtiyaçlarına göre cardiotoxin enjeksiyondan sonra farklı zaman noktalarında izole edilebilir.
- servikal dislokasyon ile fare Kurban.
- % 70 etanol ile arka ayaklarının püskürtün. İşlem sırasında, hayvan aşağı tutmak için bir desteğe sabitlenebilir.
- (Ayak üstü) proksimal tendon düzeyinde cilt kesmek, deri altında makas bıçaklarının birini takın ve diz yönünde yukarı doğru deriyi kesti. forseps yardımıyla, cilt yukarı çekin ve tamamen kas maruz kalmaktadır. Dikkatle deri ve ilgi alanından tüm saç kaldırın.
- Th yavaş kısma veya keserek fasya (eleyincımbız ucu-veya tibia (Şekil 1B) ters tarafında) kasının aşırı çevresini makas diseksiyon ince mikro. Bir kez kırık, yavaşça ince uçlu cımbız yardımı ile fasya kaldırmak; Altta yatan kas zarar vermemek.
Not: diğer kasların ve organların olduğu gibi, TA fasya (bacağın derin fasya), derin cilt altına yatıyor ve kolayca altta yatan kas izole etmek kaldırılması gerekiyor bağ dokusu ince bir tabaka ile kaplıdır. - Distal TA tendonu ve yan yana olan ayak yukarıda Ekstansör Digitorum tendonu, gözünüzde canlandırın. Extensor digitorum longus (EDL) kas tendonu biraz TA tendonun altında yer almaktadır. Yetişkin farelerin Tendonlar çıplak gözle görebilir.
- İki aşağıdaki tekniklerden biri aşağıdaki TA kas kaldırın:
- holdin, ince mikro makas diseksiyon hem tendonları kesin ve yakın tarafına doğru çeking forseps ile tendonların. İki tendonları ayrı kasları ayırmak için farklı yönlerde nazikçe çekerek.
- Ince uçlu cımbız yardımıyla, tendon kendisi (Şekil 1C, üst resim) altında ucu geçerek Ekstansör Digitorum tendonunun distal TA tendon ayırın. Yavaşça altta yatan kasları (Şekil 1C, alt resim) ayırmak için ta aşağıda cımbız kaydırın.
- , Hafifçe yükseltilmiş tutmak ta tendonuna kesmek için kas altında cımbız tutun ve yavaşça diz (Şekil 1D, sol resim) bağlı altında sadece bölgede kadar yukarı doğru çekin. Makas (Şekil 1D, sağ resim) ile kas kenarında izleyen, diz altında TA kesti.
Not: kas hafifçe yanlara bağlı kalırsa, bunu ayırmak yardımcı olmak için diseksiyon makas ince mikro kullanın.
Not: forseps kolayca ta aşağıda sığmayan,fasya tamamen kaldırıldı edilmediğini mümkündür, ve hala kas üstünde görünür olabilir. Bu durumda, devam etmeden önce iyice kaplamasını çıkarın.
3. Taze Donmuş kas Tekniği
- Tragasant zamkı ya da mantar, bir dilim benzer bir yapışkan dondurma bileşik (örneğin, optimal kesme ısısı (OCT) bileşiği) küçük bir miktar. Dondurmadan önce arka tarafındaki Cork'ın dilim etiket, gerekli (Şekil 2A) eğer.
- Kas enine bölümleri elde etmek için, mantar göre bir dik bir pozisyonda kas var emin distal tendon ekleme ve dışında yaklaşık 3/4 kas bırakarak kitre zamkı içine TA lavabo (Şekil Şekil 2A).
- bir alüminyum kutu doldurun (alternatif bir metal bardak veya bir cam kap) izopentan ile. Bir Dewar içeren Liqui izopentanın can Askıyad azot, sıvı azot teneke kutu içine girmek için izin vermiyor.
Not: İzopentan doku uygun dondurma (-150 arasında -160 ° C) uygun bir sıcaklığa ulaşması gerekir. bazı beyaz bir katı parçacıklar kutunun altındaki oluşturmaktadır ve izopentan hafif viskoz olduğunda doğru sıcaklığa ulaşılır.
Not: dondurma eserler yol açabilir olarak, katı parçacıkların oluşturulmasından önce örneği donma etmeyin. izopentan tamamen katı hale gelirse o çözülene kadar Öte yandan, bazı beyaz parçacıklar hala mevcut emin, oda sıcaklığında bekletin. - Mixter forseps kullanarak hızla kas yerleştirilmiş aşağı doğru tutarak, izopentan içine kas ile mantar daldırın ve tamamen sıvıya batırılmış zaman mantar serbest bırakmak için emin olun. örnek yüzen ise bu şekilde, mantar sadece ters tarafı sıvı içinde görünür olmalıdır.
- sa bırakın1 dakika için izopentan içinde yapıldığı Örnek.
- Mixter forseps (ya da benzer bir forseps) kullanılarak, kas almak ve en az 2 dakika süreyle sıvı nitrojen içine daldırın.
- Bir saklayabilirsiniz -80 ° C derin dondurucuda doğrudan etiketli alüminyum folyo ile ayrı ayrı numuneler sarın ve hemen kuru buz (-70 ° C) koyun, ya da.
Not: süreci boyunca, adım 3.4 3.7, doğru sıcaklık korumak için ve (. ° C derin dondurucuda -80 transferi sırasında, örneğin) çözülme gelen örnekleri önlemek için son derece önemlidir. kontrolsüz çözülme ve doku içinde mevcut olan ve sonunda eşya oluşumunu veya kas liflerinin bozulmasına sebep olur, su mikrokristallerinin soğutulmasından yükselen sıcaklığı sonuçları (lifin merkezinde büyük beyaz delikler doku bölümleri üzerinde görülebilmektedir).
Dondurulmuş Kaslar 4. Kriyostat Kesit
- Kriyostat odası sıcaklığı t SetO -20 -22 ° C arasındadır.
- en az 30 dakika boyunca dengeye kavuşmaları için izin numune saplama, bıçak ve kriyostat bölmesinde örnek koyun.
- Örnek saplama donma bileşik (örn Ekim bileşik) küçük bir miktar koyun ve dondurma bileşik katılaşır önce numune ile mantar batırmayın. Bu arada, bıçak tutucu bıçağı yerleştirin.
- Bıçak tutucu (Şekil 2B) ile numune tutucu yönlendirmek için verilen vidaları kullanarak numune ve bıçak hizalayın.
- 10 um bölüm kalınlığı ayarlayın. doku kesmek için devam edin. Tahrik tekerleğinin her fırsatta için, numune tutucu bıçak doğru kontrollü bir mesafe ilerler.
- Kutuplaşmış slayt (slayt başına 8 ila 10 bölüm) (Şekil 2C) ile ilgili bölümleri yerleştirin.
- Kesit sonra, -80 ° C slaytlar saklayın.
Not: Örnek -80 ° C dondurucu içinde depolanır ve ilave edilen yeniden kullanılabilirgerei ve depolandığı takdirde r, kesit.
5. Rutin histolojik Boyama (Hematoksilen & Eosin Lekeleri)
Not: Çeşitli histolojik lekeleri analizine uygun olarak kas kesitleri üzerinde gerçekleştirilebilir. morfolojik ve morfometrik analizi için bir rutin histolojik leke Hematoksilen & Eosin (H & E) bichromic leke. Hematoksilen çekirdekler derin mor lekeler. Nükleer boyanma eozin ile zıt böyle sitoplazmada myofibers olarak eozinofilik yapıları, lekeleri (pembe / kırmızı).
- Tamamen hava-kuru 10 bölümleri ile dondurulmuş slaytlar - oda sıcaklığında 15 dakika, bir boyama tepsi slaytlar Köşkü ve boyama teknesine tepsiyi koydu.
- hematoksilen ile 1 dakika boyunca Leke.
- 10 dk hematoksilin yıkamak için oldukça zayıf bir musluk su jeti altında boyama çukur yatıyordu.
- eozin bir alkolik bir çözüm kullanılacaksa t atlayın (5 dk 95% etanol için slaytlar daldırınsulu eosin solüsyonu halinde onun aşaması).
- eozin çözeltisi ile 1 dakika boyunca karşıt.
- Aşırı eozin çözümü ortadan kaldırmak için su ile durulayın.
Not: hematoksilin ve eosin ile ya boyama optimal süresi, her yeni bir partisi için tanımlanmalıdır. - sınıflandırılmış etanol serileri örnekleri kurutmak:% 50 ve% 70 (bir kaç saniye) ekstrakte edildi. Hızla% 100 etanol içinde 2 değişiklik, her biri 5 dakika, ardından% 95 etanol içinde bırakın.
- ksilen 2 değişiklikler, her 5 dakika veya daha uzun temizleyin. Bu adım, bir kimyasal başlık altında gerçekleştirilmelidir.
- slayt montaj orta ve bir lamel ile kaplama birkaç damla uygulayarak, bir ksilen bazlı montaj orta slaytlar monte edin. montaj orta da lamel ve slayt koymak lamel uygulanabilir.
- slayt ve lamel arasındaki hava kabarcıkları oluşturarak kaçının. , Hava kabarcıklarını ortadan kaldırmak (montaj sonra) dikey slayt tutmak ve fazla mo dışarı sıkmakyavaşça künt forseps (ya da benzer bir künt bir araç) ile lamel basarak unting orta ve hava kabarcıkları.
- ksilen analizine geçmeden önce tamamen buharlaşması izin gecede birkaç saat için kaputun altında slaytlar tutun ya da.
- fare başına en az bir tam kas bölümünün örtüşmeyen seri görüntüleri kullanarak H & E boyalı yenileyici kas bölümlerinin morfolojik ve morfometrik analizi yapın. 20X büyütme ile, parlak alan mikroskobu ile görüntü yakalama.
Not: 5 fareler en az sayıda ölçümleri istatistiksel önemi alınması tavsiye edilir.
Not: Görüntü analiz yazılımı gibi (http://imagej.nih.gov/ij/) ücretsiz indir yazılım ImageJ olarak, bu amaç için kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
H & E boyama iskelet kası rejenerasyon sırasında belirli zaman noktalarında yenileme işleminin morfolojisinin değerlendirilmesi yapılır. Şekil 3, yabani tip farelerin yaralı ta kasları üzerinde gerçekleştirilen zaman süreci analizi gösterir. Şekil 3A'da şematik olarak kaslar, CTX enjeksiyonundan sonra 3, 7, 15, ve 30 gün sonra izole edilmiştir. H & E boyalı enine kesitler temsili görüntü (Şekil 3B-D), zaman içinde, iskelet kası tamir dinamiklerini göstermektedir. Yaralanmadan sonra 3. günde, kas yapısal mimarisi tamamen yıkılmış olup, her iki myofibers dejenere (nekrotik alan) ve hücreler açıkça (Şekil 3B) görünür tek çekirdekli. Hücrelerin bu heterojen bir grup ağırlıklı olarak geçici yükseltme uydu kan 11 işe hücreler (miyoblastlar), inflamatuar hücreler ve dokular arası ve parti endotel hücreleri oluşuryaralanma yerinde tetiklenir yenilenmesi işlemi, cipate. Bu bağlamda, yeni yenileyici myofibers füzyon ve miyoblastların farklılaşması ile oluşturulur. Rejenere alanının ana özelliği, merkezi bir konumda bulunan çekirdek ve koyu lekeli sitoplazma (Şekil 3C), küçük bazofilik myofibers varlığıdır. Bu giderek azalır, ancak bu aşamada, enflamasyon, hala görünür. Rejenere myofibers büyüklüğü merkezi bir konuma çekirdekleri (Şekil 3D, E) ile karakterize edilen eozinofilik yeniden myofibers sebebiyet veren, zamanla artar. rejenere myofibers rejenerasyon ileriki aşamalarında ve sürecin sonuna kadar görebilir. Sağlıklı myofibers pembe sitoplazma ile sarkolemma altında liflerin çevresine yerleştirilen çekirdeklerle yüksek organize ve birbirine yakın görünür. Bu myofibers genellikle CTX enjeksiyonu ve yaralanma yerinde uzak mevcut olduğu ve daha azrejenerasyon kesinlikle tam olduğu ly bölgeleri temsil ediyor. Gerçekten de, yeniden, elyaflar, birkaç ay yaralanma sonrası çevresine hareket merkezi bir konumda bulunan çekirdeklerin varlığı ile karakterize edilir.
lekeli kas bölümlerin Dijital görüntüler doğru ilgilenen alanların hatlarını özetleyerek ilgi alanları ölçmek için gerekli mekansal kalibrasyon, ölçek çubukları ekleyerek yakalanır. myofiber kesit alanı (CSA) ölçülmesi çok farklı fare grupları arasında yenilenmesi eğilimi farklılıkları ölçmek için kullanılan bir güvenilir bir morfometrik analizdir. Bu analiz en az 500 ve yukarı Bölüm başına 1000 liflere de dahil olmak üzere, merkezi çekirdekli myofibers alanlarının ölçümünü gerektirir. Hem rejenere ortalama ve rejenere myofiber alanları ve bu alanların Gauss dağılımı rejenerasyon proc göstergeleridiress. Artan myofiber CSA genellikle gelişmiş bir ve / veya hızlandırılmış rejeneratif tepki ile ilişkilidir. Ayrıca, uygun rejenerasyon yetmezliği CSA bir azalma ile ilişkilidir. Burada, myofiber CSA analiz rapor farklı zaman noktalarında ortalama (Şekil 3F) ve myofiber CSA dağılımı (Şekil 3G) hem de göstermiştir. myofiber alanlarının dağılımı rejenerasyon ilerledikçe süreci olarak büyük boyutlu lifleri doğru CSA vardiya zamanla ve nasıl değiştirir nasıl analiz vurgulamaktadır.
Şekil 1. İntramuskuler ve tibialis kas izolasyonu. Tibialis anterior kas içinde cardiotoxin A. intramusküler enjeksiyon. B. Kas fasya çıkarılması. beyaz ok inci çıkarmak için kas tutam ince uçlu cımbız gösterire fasya. Cı. Üst resim Distal TA tendonun anatomik pozisyonunu gösterir. Alt resim TA kaldırın ve kas hasarı kaçınarak kaldırmak için nasıl gösterir. D. Sol resim: TA yukarı uzak tendonun çekerek kaldırdı. beyaz ok uzak EDL tendonuna gösterir. Sağ resim: forseps ile tendon tutarak, TA üst kenarı diz altında kesilir. beyaz ok kesme sitesini gösterir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2. Taze Donma Kas ve Dondurulmuş Kasların Kriyostat Kesit. Kitre zamkı taze kas dahil A. Tekniği. TA kas yaklaşık 3/4 dışarıyla, tendon gelen sakız batırılır vemantar ile ilgili olarak dikey konumda muhafaza. Kriyostat kesit için prosedürün B. Temsilcisi görüntüler. Mantar örnek saplama bileşiği dondurma küçük bir miktar yerleştirilir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
İskelet Kası Rejenerasyon Şekil 3. gün Dersin Analizi. Akut iskelet kası hasarı A. Deneysel düzeni. BE. cardiotoxin hematoksilen & Eosin boyanan kesitler (CTX) Temsilcisi resimler yaralanma sonrası belirtilen günlerde kasları ile tedavi edilen. B. (Resmin sol tarafında) siyah sürekli çizgi, muhtemelen iltihap hücreleri tarafından işgal nekrotik liflerin bir çift, içine alır. kesikli çizgi (sağ tarafResmin) tek çekirdekli hücrelerin infiltre bir alanı işaretler. Merkezi bir konumda bulunan çekirdeğin C. tek olgunlaşmamış myofiber siyah bir daire ile gösterilir. DE. merkezi bir konumda bulunan çekirdeklerle Büyük rejenere eozinofilik myofibers, siyah çevreler tarafından işaretlenir. Ölçek çubukları 100 mm temsil etmektedir. TA kas bölümlerde merkezi çekirdekli myofiber boyutu değerleri F. ortalama. Değerler ortalama ± SEM, 5 fare / grup ortalamasıdır. G. Myofiber 6, 15 alan (CSA) dağılımı kesit çapraz ve 30 gün CTX enjeksiyonundan sonra. Değerler ortalama ± SEM, 5 fare / grup ortalamasıdır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada, iskelet kasında (yani, CTX kas içi enjeksiyon) akut hasara yol için bir protokol açıklar. Bu yaygın in vivo iskelet kası yenilenme dinamiklerini incelemek için güçlü bir araç olarak kullanılmaktadır. CTX enjeksiyon sarcolemma bir depolarizasyon ve elyaf 12 kasılması neden olur kas lifleri, yozlaşmasına neden olur ve kas yenilenme yol açan olaylar zincirini tetikler. İskelet kas deney ihtiyaçlarına göre, enjeksiyon ve yaralanma sonrası istenen zaman noktalarında kesilir, ve daha sonra, histolojik analizler için kullanılır. parçalara kaslar ya kriyo-koruyucu ortam dahil sonra, dondurulmuş ya da parafın içine dahil edilebilir. Bununla birlikte, bu işlemler eserler üretmek ve, daha sonraki analizler etkileyebilir paraformaldehid ile önceden tespit, bir adım gerektirir. doğrudan doku Donma bu sorunu önleyebilirsiniz. Notun, birçokprimer antikorlar bu prosedür daha güvenilir kılar taze donmuş kas bölümlerinde 13, münhasıran veya daha etkili çalışır. Morfometrik analiz genellikle aynı yaş farelerin gruplar arasında yenilenmesi işlemlerinde farkların değerlendirilmesi ve spesifik genetik mutasyonlar ve / veya farmakolojik tedaviler ile sağlayan zaman akışı deneylerinde, gerçekleştirilir. CTX-kaynaklı hasar protokol başına yüksek tekrarlanabilir olmasına rağmen, olası bir sınırlama CTX enjeksiyon operatöre bağımlı değişkenlik nedeniyle. Bu sınırlamayı aşmak için, süre boyunca deneyi aynı operatör tarafından gerçekleştirilir tercih edilir.
kas yenilenmesi oranı, toplam alanı üzerinde sağlıklı elyafları nekrotik alanlara ve inflamasyon, ve rejenere ve rejenere alanların yüzdesi olarak belirlenebilir. , distrofık MDX mi olduğu gibi kronik hasarın olayları incelemek Ancak, bu yaklaşım daha çok kullanılandaha çok, akut yaralanma modellerinde daha CE. distrofik kas dejenerasyon ve rejenerasyon uyumsuz olaylar ile karakterizedir Nitekim, akut yaralanma iyi tanımlanmış ve sonuç olarak ortaya çıkan olaylar tarafından takip edilmektedir. Yukarıda açıklanan morfolojik özelliklerin ampirik belirlenmesini gerektirir Bu analizlerin, bir kısıtlaması, tamamen tarafsız olmamasıdır. Deneysel sonuçları desteklemek için, morfolojik analiz her zaman deneysel sonuçları desteklemek için, bu tür spesifik moleküler belirteçlerin immünofloresan analizi gibi, daha fazla analiz ile tamamlanmalıdır. Bu nedenle, su götürmez sonuçları yorumlamak paralel analiz kullanılması tercih edilir. Örneğin, yenileyici myofibers olumlu yeni kurulan myofibers spesifik ifade edilir embriyonik miyozin ağır zincir (eMyHC) için boyandı. Bu nedenle, eMyHC lekeli myofibers ölçümü morfolojik analiz ile yan yana gerçekleştirilebilir.
CSA analizi daha güvenilir bir miktar ve H & E boyalı bölümler ya da kas liflerinin kenar işaretleri laminin ile lekelenmiş kas kesitleri üzerinde ya da gerçekleştirilebilir; yukarıda tarif edildiği gibi kantitatif, ImageJ uygun makroları kullanılarak gerçekleştirilir. Her iki durumda da, ilk bölümlerde kalitesini değerlendirmek için ve deforme veya kıvrılmış görünen doku alanları dışlamak için gerekli her zaman.
dokuların Şekil incelemesi yanında, H & E ile boyanmış kesitler gibi fibroz ve / veya yağlı doku varlığı gibi diğer özel özellikler, tanımlanması için izin verir. Gerçekten de, fibroz, ya yenilenmesi bozulur veya kronik hastalıkların 14 oluşur hücre dışı matrisin aşırı birikimi türemiştir. soluk malzeme H & E-histolojik boyama rejenere myofibers arasında yatırılan Nitekim, hücre dışı matriks birikimi görülebilir. CTX enjeksiyon sanmı t kullanılabilirmyofibers dejenerasyon ve rejenerasyon ve yara dokusunun dalgaları tabi ki o taklit kronik bir hastalıktır anormal birikir. Ancak, daha güvenilir protokoller kas fibrozis 15 ikna etmek için kullanılabilir ve özel histolojik boyama gibi Masson trikrom veya Sirius Kırmızı boyaması olarak bu yapıları tespit ve ölçmek için yapılabilir. yağ dokusu oluşumu, Yağ Kırmızı boyama ile ölçülür yağ dokusu mevcudiyetinde önemli bir gösterge veren myofibers arasındaki yuvarlak beyaz yapılar olarak H & E ile boyanmış bölümlerinde de açıkça görülebilir. Son olarak, iskelet kası bölümlerde özel antikorlar ve protokoller kullanılarak immünoflüoresans analizi gerçekleştirmek için kullanılabilir tarif edilen protokol izlenerek elde edilmiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cardiotoxin from Naja mossambica mossambica | SIGMA ALDRICH | C9759 | |
| Syringe For Insulin BD Micro-Fine+ Needle 30 G x 8 mm - Da 0.3 mL | BD | 324826 | |
| Tragacanth Gum | MP BIOMEDICALS,LLC | 104792 | |
| 2-Methylbutane (Isopentane) | SIGMA ALDRICH | 78-78-4. | |
| OCT Killik Solution For Inclusion Cryostat | Bio-optica | 05-9801 | |
| Feather Microtome Blade S35 | Bio-optica | 01-S35 | |
| Glass Slide Superfrost Plus | Menzel-Gläser | 09-OPLUS | |
| Dumon #5 Mirror Finish Forceps | 2BIOLOGICAL INSTRUMENTS | 11251-23 | |
| Scissors Straight Sharp/Sharp | 2BIOLOGICAL INSTRUMENTS | 15024-10 | |
| Scissors Noyes Straight | 2BIOLOGICAL INSTRUMENTS | 15012-12 | |
| Fine Iris Scissors Straight Sharp/Sharp 10.5 cm | 2BIOLOGICAL INSTRUMENTS | 14094-11 | |
| Eukitt | Bio-optica | 09-00100 | |
| Slide Coverslip | BIOSIGMA | VBS651 | |
| Xylene | SIGMA ALDRICH | 214736 | |
| Ethanol 100% | sigma-Aldrich | 02860-2.5L | |
| Hematoxyline | J.T. BAKER | 3873 | |
| Eosin | SIGMA ALDRICH | HT110116 | |
| Cryostat | LEICA | CM3050 S |
References
- Morgan, J. E., Partridge, T. A. Muscle satellite cells. Int J Biochem Cell Biol. 35 (8), 1151-1156 (2003).
- Roca, I., Requena, J., Edel, M. J., Alvarez-Palomo, A. B. Myogenic Precursors from iPS Cells for Skeletal Muscle Cell Replacement Therapy. J Clin Med. 4 (2), 243-259 (2015).
- Cheung, T. H., Rando, T. A. Molecular regulation of stem cell quiescence. Nat Rev Mol Cell Biol. 14 (6), 329-340 (2013).
- Dumont, N. A., Wang, Y. X., Rudnicki, M. A. Intrinsic and extrinsic mechanisms regulating satellite cell function. Development. 142 (9), 1572-1581 (2015).
- Hawke, T. J., Garry, D. J. Myogenic satellite cells: physiology to molecular biology. J Appl Physiol. 91 (1985), 534-551 (1985).
- Saclier, M., et al. Differentially activated macrophages orchestrate myogenic precursor cell fate during human skeletal muscle regeneration. Stem Cells. 31 (2), 384-396 (2013).
- Pillon, N. J., Bilan, P. J., Fink, L. N., Klip, A. Cross-talk between skeletal muscle and immune cells: muscle-derived mediators and metabolic implications. Am J Physiol Endocrinol Metab. 304 (5), E453-E465 (2013).
- Bentzinger, C. F., Wang, Y. X., Dumont, N. A., Rudnicki, M. A. Cellular dynamics in the muscle satellite cell niche. EMBO Rep. 14 (12), 1062-1072 (2013).
- Costamagna, D., Costelli, P., Sampaolesi, M., Penna, F. Role of Inflammation in Muscle Homeostasis and Myogenesis. Mediators Inflamm. 2015, (2015).
- Charge, S. B., Rudnicki, M. A. Cellular and molecular regulation of muscle regeneration. Physiol Rev. 84 (1), 209-238 (2004).
- Arnold, L., et al. Inflammatory monocytes recruited after skeletal muscle injury switch into antiinflammatory macrophages to support myogenesis. J Exp Med. 204 (5), 1057-1069 (2007).
- Chang, C. C., Chuang, S. T., Lee, C. Y., Wei, J. W. Role of cardiotoxin and phospholipase A in the blockade of nerve conduction and depolarization of skeletal muscle induced by cobra venom. Br J Pharmacol. 44 (4), 752-764 (1972).
- Meng, H., et al. Tissue triage and freezing for models of skeletal muscle disease. J Vis Exp. (89), (2014).
- Mann, C. J., et al. Aberrant repair and fibrosis development in skeletal muscle. Skelet Muscle. 1 (1), (2011).
- Pessina, P., et al. Novel and optimized strategies for inducing fibrosis in vivo: focus on Duchenne Muscular Dystrophy. Skelet Muscle. 4 (1), 7 (2014).
