Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Edu धुंधला द्वारा ड्रोसोफिला एडल्ट अंडाशय में mitochondrial डीएनए प्रतिकृति के सीटू लेबलिंग में

Published: October 15, 2016 doi: 10.3791/54516
Automatic Translation
1, 1
1Lab of Molecular Genetics, National Heart, Lung and Blood Institute, National Institutes of Health

Introduction

परमाणु जीनोम इसके अलावा, प्रत्येक यूकेरियोटिक सेल भी mitochondrial मैट्रिक्स में छोटे परिपत्र डीएनए की प्रतियां के हजारों शामिल हैं। जबकि mitochondrial डीएनए (mtDNA) इलेक्ट्रॉन परिवहन श्रृंखला के लिए आवश्यक सब यूनिटों को कूटबद्ध, mitochondrial proteome का बहुमत है, प्रतिकृति और mtDNA के प्रतिलेखन के लिए सभी कारकों सहित परमाणु जीनोम से इनकोड किया गया है। परमाणु जीनोम कि विरासत का मेंडेलियाई कानून इस प्रकार के विपरीत, पशु mitochondrial जीनोम मातृ वंश के माध्यम से विशेष रूप से विरासत में मिली है। इसलिए, समझ कैसे mtDNA प्रचूर मात्रा में और एक पीढ़ी से महिला oocyte के माध्यम से अगले करने के लिए प्रसारित किया जाता है मूल रूप से महत्वपूर्ण है। हालांकि, वहाँ कैसे mtDNA प्रतिकृति महिला germline में विनियमित है पर जारी बहस चल रही है। इसके अतिरिक्त, mtDNA संचरण के लिए व्यापक रूप से स्वीकार mtDNA टोंटी सिद्धांत चलता है कि मौलिक जर्म कोशिकाओं में mtDNA की आबादी ड्यूरिन एक अपेक्षाकृत छोटी संख्या को subsampled हैजी विकास 1 2। यह भी संकेत मिलता है कि mtDNA प्रतिकृति अस्थायी और oogenesis दौरान स्थानिक विनियमित है। इसलिए, बगल में germline विकास के दौरान mtDNA प्रतिकृति का पता लगाने के mtDNA विरासत के तंत्र की समझ की सुविधा होगी।

ड्रोसोफिला oogenesis mtDNA प्रतिकृति और ट्रांसमिशन अध्ययन करने के लिए एक आनुवंशिक रूप से विनयशील प्रणाली प्रदान करता है। दो ड्रोसोफिला अंडाशय से प्रत्येक में, वहाँ ovarioles 3 बुलाया अंडा कक्षों में से 16-20 स्वतंत्र तार, जो अंडा उत्पादन के कार्यात्मक इकाइयां हैं (चित्रा 1 ए देखें) कर रहे हैं। प्रत्येक ovariole oogenesis, जहां पूर्वकाल टिप एक संरचना germarium कहा जाता है से बना है की एक प्रगतिशील रेखीय संगठन शामिल हैं। germarium आगे चार क्षेत्रों है कि अलग-अलग विकास के चरणों में रोगाणु कोशिकाओं होते हैं में विभाजित है। क्षेत्र में 1, germline स्टेम कोशिकाओं विषम प्रभाग के माध्यम से जाना बेटी ग के रूप में जाना जाता कोशिकाओं का उत्पादन करने के लिएystoblasts। क्षेत्र 2A cystoblasts कि उनके अंतिम विभाजन पूरा कर लिया है शामिल हैं। Cystoblasts विभाजन का उत्पादन 16 सेल समूहों के चार दौर से गुजरना। 16 कोशिकाओं cytoplasmic पुलों अंगूठी नहरों बुलाया द्वारा एक दूसरे से जुड़े रहते हैं। केवल कोशिकाओं में से एक, oocyte के रूप में भेदभाव के लिए करता है, जबकि अन्य 15 polyploid नर्स कोशिकाओं के रूप में विकसित करना। एक आवश्यक cytoplasmic संरचना, fusome के रूप में जाना जाता है, अंगूठी नहरों के गठन के साथ की सुविधा पुटी polarity और नर्स सेल oocyte बातचीत 4,5 निर्धारित करने का प्रस्ताव है। अल्सर क्षेत्र 2 बी की ओर बढ़ने, पुटी संरचनाओं germarium की पूरी चौड़ाई अवधि, और अधिक कूप कोशिकाओं के साथ जुड़ा हो। germarium संरचनाओं क्षेत्र 3 पहले नवोदित अंडा चैम्बर युक्त के साथ खत्म होता है। बाद में, अंडा कक्षों germarium, जो 14 आकृति विज्ञान के अलग चरणों में ovariole के माध्यम से प्रगति के पीछे अंत में इकट्ठा कर रहे हैं। oocyte के विकास, नर्स कोशिकाओं पर निर्भर करता है कआईसीएच परिवहन प्रोटीन, mRNA और endomembrane संरचनाओं (जैसे, Golgi) oocyte में अंगूठी नहरों के माध्यम से। ड्रोसोफिला oogenesis के दौरान यह पाया गया है कि प्रत्येक 16 सेल पुटी के भीतर माइटोकॉन्ड्रिया का एक अंश fusome के साथ जुड़े थे, अंगूठी नहरों के माध्यम से ले जाया गया और एक बड़ी Balbiani शरीर 6 बुलाया मास में एकल oocyte में कर दिया गया था। यह घटना महिला के अंडाशय के माध्यम से mitochondrial विरासत की गुणवत्ता नियंत्रण के लिए योगदान करने के लिए प्रस्तावित किया गया था।

mtDNA संश्लेषण की जांच सेलुलर डीएनए में लेबल डीएनए व्यापारियों के समावेश पर निर्भर करता है। परंपरागत रूप से, thymidine 5-ब्रोमो-2'- deoxyuridine की एक nucleoside अनुरूप (BrdU) टिशू कल्चर कोशिकाओं 7,8 में mtDNA प्रतिकृति लेबल करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। हालांकि, एंटीबॉडी आधारित BrdU लेबलिंग विशेष रूप से पूरे माउंट ऊतक धुंधला के लिए कई सीमाओं को दर्शाती है। BrdU लेबलिंग का एक बड़ा नुकसान यह है कि यह डीएनए विकृतीकरण की आवश्यकता को बेनकाब करने के लिए हैBrdU मिलान, इतना है कि यह विरोधी BrdU एंटीबॉडी से पता लगाया जा सकता है। नमूना इस तरह के रसायनों (जैसे, हाइड्रोक्लोरिक एसिड या मेथनॉल और एसिटिक एसिड के मिश्रण), गर्मी, या DNase साथ पाचन के रूप में कठोर अप्राकृतिकरण की स्थिति है, जो नमूना की संरचना को बाधित और निम्न धुंधला प्रक्रिया 9 उलझा सकता है के तहत इलाज किया जाना है, 10।

इधर, एक वैकल्पिक thymidine अनुरूप 5-ethynyl 2'- deoxyuridine (edu) ड्रोसोफिला वयस्क अंडाशय में नकल mitochondrial डीएनए लेबल करने के लिए प्रयोग किया जाता है। इस विधि को तेजी से और अत्यधिक संवेदनशील है। Edu आसानी से डीएनए प्रतिकृति के दौरान सेलुलर डीएनए में शामिल किया है। निम्नलिखित का पता लगाने के एक "क्लिक" प्रतिक्रिया पर आधारित है, एक घन (मैं) टर्मिनल alkyne समूह और एक फ्लोरोसेंट azide 10 के बीच सहसंयोजक प्रतिक्रिया -catalyzed। क्योंकि प्रतिक्रिया नमूना के विकृतीकरण की आवश्यकता नहीं है, यह अच्छा संरचनात्मक संरक्षण के लिए अनुमति देता है। इसके अलावा, डाई एक का आकारZide एक एंटीबॉडी अणु 10 है, जो पूरे माउंट ऊतकों की तेज और कुशल प्रवेश सक्षम बनाता है की है कि केवल 1/500 है। हम ड्रोसोफिला oogenesis दौरान mtDNA प्रतिकृति पता लगाने के लिए इस विधि का इस्तेमाल किया और ड्रोसोफिला अंडाशय 11 की germarium क्षेत्र में एक हड़ताली स्थानिक पैटर्न है, जो हमें आगे के लिए एक प्रतिकृति पर निर्भर mtDNA चयनात्मक विरासत तंत्र का प्रस्ताव करने के लिए मिल गया है। हम यहाँ ड्रोसोफिला अंडाशय में mtDNA प्रतिकृति के edu लेबलिंग पर एक विस्तृत प्रोटोकॉल उपस्थित थे। (: Coi T300I मीट्रिक टन) 11, साथ ही साथ mitochondrial uncouplers, जो mitochondrial झिल्ली क्षमता नष्ट करना और संभावित mtDNA प्रतिकृति को बाधित करने के लिए विभिन्न उपचार प्रोटोकॉल के आवेदन प्रदर्शित करने के लिए, हम भी एक mtDNA उत्परिवर्ती ड्रोसोफिला में mtDNA प्रतिकृति का परीक्षण किया।

Protocol

1. ऊतक संग्रह और विच्छेदन

  1. सूखी खमीर युक्त प्रत्येक शीशी में, संस्कृति में 10 वयस्क मादा 2-3 दिनों के लिए 10 पुरुषों के साथ मक्खियों।
    नोट: बनाए रखने अच्छी तरह से खिलाया मादा मक्खियों समग्र गुणवत्ता और अंडाशय उत्पादन की उपज में सुधार और विच्छेदन की सुविधा होगी।
  2. असंवेदनता महिला एक कार्बन डाइऑक्साइड (सीओ 2) के लिए उड़ान भरने के पैड पर मक्खियों।
  3. स्टिरियोस्कोप के तहत, आरटी मध्यम (श्नाइडर के ड्रोसोफिला मध्यम 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) के साथ पूरक) एक विदारक पैड पर की कई बूँदें जगह है। मध्यम में सभी विच्छेदन प्रक्रियाओं का संचालन ऊतकों जीवित और स्वस्थ रखने के लिए।
  4. एक पला महिला अपने निचले छाती में तेज ठीक नाक संदंश के साथ उड़ान भरने के लिए ले लो। मक्खी के चरम पर पीछे धीरे tug के लिए जब तक पेट में ऊतकों उजागर कर रहे हैं संदंश की एक और सेट का प्रयोग करें। अन्य ऊतकों (जैसे हिम्मत) से दो अंडाशय को अलग करें।
    नोट: प्रत्येक अंडाशय को प्रदर्शित करता है एक अपारदर्शी संरचना है कि रचना है16-20 जुड़ी ovarioles की घ।
  5. अभिकर्मकों की पैठ बढ़ाने के लिए, उन्हें अलग खींच रहा है और समय की एक जोड़ी ovariole प्रत्येक के बीच में संदंश के सुझावों से गुजर रहा अंडाशय खुला। निम्नलिखित प्रक्रिया के दौरान ऊतकों के नुकसान को कम करने के लिए एक अंडाशय के भीतर जुड़े ovarioles रखें।
  6. अंडाशय 10% FBS के साथ श्नाइडर के ड्रोसोफिला माध्यम के 500 μl युक्त एक 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब करने के लिए तुरंत स्थानांतरण।
  7. विच्छेदन दोहराएँ और प्रत्येक microcentrifuge ट्यूब में 10-15 अंडाशय इकट्ठा।

2. edu लेबलिंग

  1. प्रत्येक ट्यूब में मध्यम Aspirate, और 10% 7 सुक्ष्ममापी aphidicolin युक्त FBS के साथ श्नाइडर के ड्रोसोफिला माध्यम के 500 μl के साथ बदलें।
    नोट: Aphidicolin mtDNA प्रतिकृति 7, 12 को प्रभावित किए बिना डीएनए पोलीमरेज़ α बाधा परमाणु डीएनए संश्लेषण ब्लॉक करने के लिए प्रयोग किया जाता है। यह aphidicolin एकाग्रता अप करने के लिए बढ़ाने के लिए संभव है70 माइक्रोन के लिए बेहतर निषेध प्राप्त करने के लिए। DMSO में 3-30 मिमी aphidicolin के शेयर समाधान के लिए 6 सप्ताह के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में संग्रहित किया जा सकता है।
  2. अंडाशय स्वस्थ रखने के लिए, यह सुनिश्चित करें कि वे समाधान के तहत डूब रहे मध्यम बदलते समय। 2.6 कदम के माध्यम से 10% FBS के साथ श्नाइडर के ड्रोसोफिला मध्यम का प्रयोग करें।
  3. कोमल रोटेशन के साथ एक बेंच शीर्ष घुमाव पर आरटी पर 3 घंटे के लिए अंडाशय सेते हैं।
    1. नशीली दवाओं के उपचार, जैसे, mitochondrial uncoupler कार्बोनिल साइनाइड 4-trifluoromethoxy phenylhydrazone (FCCP) के लिए, aphidicolin उपचार के 2 घंटे के बाद मध्यम में दवा की उचित एकाग्रता (जैसे, 10 माइक्रोन FCCP) जोड़ें। एक और 1 घंटे के लिए incubating जारी रखें।
  4. के साथ या बिना दवा युक्त मध्यम aphidicolin निकालें। संक्षेप में मध्यम के साथ अंडाशय (aphidicolin आवश्यक नहीं है) में दो बार कुल्ला।
  5. 1 मिलीलीटर मध्यम युक्त 10 माइक्रोन edu और 7 सुक्ष्ममापी aphidicolin जोड़ें और incubatin जारी रखने के लिए2 घंटे के लिए आरटी पर जी। -20 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिमी edu शेयर समाधान (DMSO में) की दुकान।
  6. Edu और aphidicolin युक्त मध्यम निकालें। 3 मिनट प्रत्येक के लिए मध्यम (aphidicolin के बिना) के साथ धो दो बार।

3. ऊतक निर्धारण और Permeabilization

  1. फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस, 7.4 पीएच) में एक 4% paraformaldehyde समाधान तैयार है।
    नोट: हम पूर्व रन बनाए ampoules में संग्रहीत वाणिज्यिक उपलब्ध paraformaldehyde इस्तेमाल किया। एक नया इंजेक्शन की शीशी खोलें और उपयोग करने से पहले 4% पतला।
    चेतावनी: संक्रामक विषैला होता है; यह त्वचा और आंखों की सुरक्षा के साथ एक धूआं हुड में नियंत्रित किया जाना चाहिए।
  2. कोमल रोटेशन के साथ आरटी पर 20 मिनट के लिए 4% paraformaldehyde के साथ अंडाशय को ठीक करें।
  3. लगानेवाला निकालें और 5 मिनट प्रत्येक समय के लिए पीबीएस में 3% बीएसए के 1 मिलीलीटर में दो बार अंडाशय धो लें।
  4. ऊतकों permeabilize करने के लिए, धोने समाधान निकालने और पीबीएस में 0.5% ट्राइटन X-100 के 1 मिलीलीटर जोड़ें। 20 मिनट के लिए आरटी पर सेते हैं।
  5. permeabilization समाधान निकालें और 1 मिलीलीटर में दो बार धोनेपीबीएस में 3% बीएसए की।

4. edu जांच

नोट: edu पता लगाने पर "क्लिक" रसायन शास्त्र आधारित है, एक घन (आई) -catalyzed [3 + 2] cycloaddition 13 है, जो edu के टर्मिनल alkyne समूह के लिए फ्लोरोसेंट azides कहते हैं, और फ्लोरोसेंट अणु बाद में पता लगाने के अधीन है। घन (आई), जो आसानी से गैर उत्प्रेरक घन (द्वितीय) प्रजातियों के लिए ऑक्सीकरण हो जाता है के बाद से, प्रतिक्रिया को उत्प्रेरित करने की आवश्यकता है, यह बगल में घन (द्वितीय) सल्फेट को कम करने के लिए घन (आई) प्राप्त करने के लिए सिफारिश की है। यही कारण है कि घन (द्वितीय) सल्फेट ऐसे एस्कॉर्बिक एसिड (यहाँ 'बफर एडिटिव ") तांबा उत्पन्न करने के लिए (मैं) के रूप में एक कम करने की मौजूदगी में प्रयोग किया जाता है, है।

  1. प्रयोग से पहले, (एलेक्सा स्त्राव 488 azide, एलेक्सा स्त्राव 555 azide या दूसरों को, वरीय fluorophore, जो "डाई azide" इसके बाद नामित कर रहे हैं पर निर्भर करता है), edu प्रतिक्रिया बफर और edu बफर एडिटिव एलेक्सा स्त्राव azide के काम कर समाधान तैयार निर्माता के अनुसारनिर्देश।
    1. 70 μl DMSO में डाई azide Reconstitute। अप करने के लिए 1 वर्ष के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर काम कर समाधान स्टोर।
    2. विआयनीकृत पानी के साथ 10x edu प्रतिक्रिया बफर गिराए द्वारा ताजा edu प्रतिक्रिया बफर तैयार करें।
      नोट: प्रयोग करने के बाद, 4 डिग्री सेल्सियस पर किसी भी शेष 1x समाधान की दुकान। 1x समाधान अप करने के लिए 6 महीने के लिए स्थिर है।
    3. पूरी तरह से विआयनीकृत पानी 2 मिलीलीटर में पाउडर भंग द्वारा edu बफर एडिटिव के एक 10x शेयर समाधान करें।
      नोट: यह शेयर समाधान 1 साल के लिए कम से -20 डिग्री सेल्सियस के लिए स्थिर है। समाधान के लिए एक भूरे रंग विकसित करता है, तो उसे अपमानित किया है और खारिज किया जाना चाहिए।
  2. Edu प्रतिक्रिया कॉकटेल ताजा हर बार तैयार है, और तैयारी के 15 मिनट के भीतर का उपयोग करें। प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणाम प्राप्त करने के लिए, यकीन है कि प्रतिक्रिया घटकों उसी अनुपात में रखा जाता हैं।
    1. ताजा 1x edu विआयनीकृत पानी में 10x शेयर समाधान (कदम 4.1.3 में तैयार) 01:10 गिराए द्वारा एडिटिव समाधान बफर बनाओ। का प्रयोग करें sएक ही दिन में olution।
    2. क्रम में निम्न सामग्री के संयोजन द्वारा edu प्रतिक्रिया कॉकटेल के 1 मिलीलीटर तैयार: 860 μl 1x edu प्रतिक्रिया बफर, 40 μl CuSO 4, 2.5 μl डाई azide, 100 μl 1x edu बफर एडिटिव।
      नोट: यह महत्वपूर्ण है कि सामग्री के क्रम में इष्टतम प्रदर्शन को सुनिश्चित करने के लिए जोड़ रहे हैं।
  3. 3% बीएसए के साथ पीबीएस निकालें और प्रत्येक ट्यूब edu प्रतिक्रिया कॉकटेल के 0.5 मिलीलीटर जोड़ें। कोमल रोटेशन के साथ 30 मिनट के लिए आरटी पर सेते हैं। नमूने प्रकाश से सुरक्षित रखें।
  4. Edu प्रतिक्रिया कॉकटेल निकालें और पीबीएस में 3% बीएसए के 1 मिलीलीटर के साथ एक बार धो लें।
  5. पीबीएस के 1 मिलीलीटर के साथ एक बार नमूने धो लें।

5. एंटीबॉडी लेबलिंग

नोट: edu धुंधला के बाद एंटीबॉडी लेबलिंग प्रदर्शन करना। कोई अतिरिक्त धुंधला वांछित है, एक बढ़ते और इमेजिंग सीधे करने के लिए आगे बढ़ सकते हैं। यह महत्वपूर्ण है कि नमूने सभी निम्न कार्यविधियों में प्रकाश से संरक्षित किया।

  1. धोने के समाधान निकालें। अवरुद्ध समाधान 30 मिनट के लिए पीबीएस में 0.2% और 0.1% बीएसए ट्राइटन X-100 युक्त के 1 मिलीलीटर में अंडाशय ब्लॉक।
  2. अवरुद्ध समाधान निकालें और प्राथमिक एंटीबॉडी अवरुद्ध समाधान में पतला है (उदाहरण के लिए, माउस एटीपी synthase एंटीबॉडी α सबयूनिट, 1: 1,000 कमजोर पड़ने) के साथ बदलें। 4 डिग्री सीओ / एन पर अंधेरे में सेते हैं।
  3. अवरुद्ध समाधान 3 बार, 10 मिनट प्रत्येक समय के 1 मिलीलीटर के साथ नमूने धो लें। पृष्ठभूमि को कम करने के लिए, 30 मिनट प्रत्येक के लिए दो बार धो लें। अवरुद्ध समाधान निकालें।
  4. आरटी पर 2 घंटे के लिए: (200 कमजोर पड़ने जैसे, बकरी विरोधी माउस एलेक्सा स्त्राव 568 माध्यमिक एंटीबॉडी, 1) अवरुद्ध समाधान में पतला एंटीबॉडी के साथ सेते हैं।
    नोट: edu के लिए मिलकर एक से एक अलग रंग का प्रयोग करें।
  5. 5.3 चरण में प्रदर्शन धोने के चरणों को दोहराएँ।
  6. पीबीएस के 1 मिलीलीटर के साथ कुल्ला एक बार डिटर्जेंट हटा दें।

6. बढ़ते और इमेजिंग

  1. ध्यान से सभी पीबीएस और आई एम एम को दूरediately 50 μl बढ़ते मध्यम (के साथ या बिना DAPI) के साथ अंडाशय को कवर किया।
    ध्यान दें: एक बढ़ते मध्यम कि जब ovarioles एक दूसरे से अलग किया जा रहा है कठोर नहीं है का प्रयोग करें। अंडाशय एक सप्ताह तक के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर बढ़ते मध्यम में संग्रहित किया जा सकता है।
  2. एक विंदुक टिप के अंत कट और एक खुर्दबीन स्लाइड पर ध्यान अंडाशय हस्तांतरण करने के लिए इस्तेमाल करते हैं।
  3. stereomicroscope के तहत तेज ठीक नाक संदंश के साथ पूरी तरह से अलग प्रत्येक ovariole। पीछे के अंत और चरण 14 या परिपक्व अंडे कक्षों में जोड़ने के ऊतकों को हटाने। युवा अंडा कक्षों पूर्वकाल अंत और पारदर्शी पर हैं।
  4. संदंश के साथ अंडा कक्षों संरेखित इतना है कि वे एक दूसरे के साथ ओवरलैप नहीं है।
  5. धीरे-धीरे नमूने के शीर्ष पर एक # 1.5 गिलास coverslip कम है। बढ़ते मध्यम आरटी पर कई घंटे के लिए भाजन करने की अनुमति दें। पारदर्शी नेल पॉलिश के साथ सील।
  6. छवि 4 डिग्री सेल्सियस पर अगले दिन, या दुकान इमेजिंग के लिए पहले स्लाइड।
  7. एक confocal मील के तहत कल्पनाएक 63X उद्देश्य तेल विसर्जन के साथ croscope। तीन आयामी Z ढेर छवियों पर कब्जा।
    नोट: वहाँ मजबूत edu उपकला म्यान में बाद में चरण अंडा कक्षों और पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति में संकेत है। जब एक विशेष germarium में edu लेबलिंग की जांच, एक germariums कि द्वारा छा या अन्य ऊतकों या बाद में चरण अंडा कक्षों के करीब रहे हैं बचना चाहिए।

Representative Results

ऊपर प्रोटोकॉल जो ड्रोसोफिला oogenesis दौरान mitochondrial डीएनए प्रतिकृति से संकेत मिलता है माइटोकांड्रिया (चित्रा 1 बी-सी) के साथ जुड़े कबरा संरचनाओं, के दृश्य के लिए अनुमति देता है। Edu puncta एटीपी synthase अल्फा सबयूनिट (चित्रा 2) के लिए धुंधला द्वारा चिह्नित माइटोकॉन्ड्रिया के साथ स्थानीय। मनाया संकेतों ethidium ब्रोमाइड 11, mtDNA प्रतिकृति 14 के लिए एक अवरोध करनेवाला के साथ इलाज किया अंडाशय में अनुपस्थित थे, मान्य है कि इन puncta वास्तव में लेबल नकल mtDNA.Aphidicolin mtDNA प्रतिकृति (चित्रा 2) को प्रभावित किए बिना परमाणु डीएनए धुंधला को बाधित करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। Aphidicolin उपचार के बिना, तीव्र edu संकेतों नाभिक लेबल, और mtDNA puncta मुश्किल से पता चला रहे थे (चित्रा 3)। हालांकि, aphidicolin की उपस्थिति में, परमाणु समावेश नाटकीय रूप से कम हो गया था और कई माइटोकॉन्ड्रिया के साथ जुड़े puncta मनाया गया।

(चित्रा 1 बी) में mtDNA प्रतिकृति के एक उच्च स्तर पर है। हालांकि, विशेष रूप से, mtDNA प्रतिकृति germarium में एक स्थानिक पैटर्न का प्रदर्शन किया। Edu puncta की संख्या से संकेत दिया है, वहाँ germarium के क्षेत्र में 1 mtDNA प्रतिकृति के एक मध्यम स्तर है, लेकिन लगभग क्षेत्र 2A में कोई edu समावेश (चित्रा 1 सी)। पुटी germarium में इस क्षेत्र 2 बी को नीचे ले जाता है के रूप में, mtDNA प्रतिकृति फिर से शुरू करने और इस क्षेत्र 2 बी के पीछे पुटी में edu puncta की संख्या उस क्षेत्र 2A चित्रा (1 सी) की तुलना में बहुत अधिक था। विशेष रूप से, गहन edu समावेश, अंगूठी नहरों और fusome संरचनाओं के आसपास केंद्रित था के रूप में हू ली ताई शाओ (एचटीएस) प्रोटीन से सना हुआ। mtDNA germarium के क्षेत्र 3 में एक उच्च स्तर पर नकल रखा (चित्रा 1 सी)

विशिष्ट के सहयोग से प्रदर्शित करने के लिएआईसी जीन या mtDNA प्रसार के साथ उपचार, ड्रोसोफिला अंडाशय जीन में गड़बड़ी या नशीली दवाओं के उपचार के अधीन किया जा सकता है। हम FCCP, एक क्लासिक mitochondrial protonophore, जो mitochondrial झिल्ली क्षमता dissipates के विभिन्न सांद्रता के साथ अंडाशय का इलाज किया। एक नियंत्रण के रूप में, DMSO mtDNA प्रतिकृति (चित्रा -4 ए) पर कोई प्रभाव नहीं पड़ा। FCCP की उच्च खुराक (10 माइक्रोन) के लगभग mtDNA प्रतिकृति समाप्त पूरी तरह germarium (चित्रा 4D) के दौरान। बहरहाल, FCCP (2 या 5 माइक्रोन) के के निचले एकाग्रता एक नाबालिग क्षेत्रों 2 बी और 3 (चित्रा 4 बी-सी) में 1 क्षेत्र में mtDNA प्रतिकृति पर प्रभाव लेकिन हिचकते प्रतिकृति थी, सुझाव क्षेत्रों 2 बी और 3 mitochondrial व्यवधान के प्रति संवेदनशील हैं, या वे रिश्तेदार धीमी प्रतिकृति कैनेटीक्स बनाए रखें। ऊपर दिए गए परिणामों से संकेत दिया कि mtDNA प्रतिकृति mitochondrial गतिविधि के साथ जुड़ा हुआ है। विशेष रूप से, germarium के विभिन्न क्षेत्रों mitochondrial छोटा सा भूत के लिए अलग तरह से प्रतिक्रिया व्यक्तairment।

आकृति 1
चित्रा ड्रोसोफिला oogenesis दौरान 1. mtDNA प्रतिकृति। (ए) एक ड्रोसोफिला ovariole का आरेख और germarium के एक बढ़ाया दृश्य। ovariole दिखाता है सही, पूर्वकाल बाएं से पीछे अंडा कक्षों के लगातार विकास के चरणों। germarium में, fusome (लाल), germline स्टेम कोशिकाओं (नीला), माइटोकांड्रिया (हरा), भविष्य oocyte (टूटी हुई लाइन, स्थिति, fusome संरचना और mitochondrial समूहों द्वारा मान्यता प्राप्त), अल्सर (आड़ू) और चार विकास क्षेत्रों के विकास को दिखाया जाता है । (बी) के एक जंगली प्रकार ovariole edu द्वारा लेबल और HTS-आर सी, अंगूठी नहरों और fusome के लिए एक मार्कर के खिलाफ एंटीबॉडी के प्रतिनिधि Z ढेर प्रक्षेपण। aphidicolin की उपस्थिति में, edu mtDNA (तीर) और नाभिक (तीर) में शामिल किया गया था। स्केल बार, 10 माइक्रोन।(सी) बी में बॉक्सिंग क्षेत्र में उल्लिखित germaria का बढ़ाया देखें। चार विकासात्मक क्षेत्रों संकेत कर रहे हैं। स्केल पट्टी, 5 माइक्रोन 11। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2 ड्रोसोफिला germarium aphidicolin उपचार के साथ edu समावेश द्वारा कल्पना में mtDNA प्रतिकृति (ए।) - (डी) edu समावेश दिखा एक जंगली प्रकार germarium के प्रतिनिधि confocal खंड (हरे, ख), माइटोकॉन्ड्रिया, एटीपी Synthase अल्फा सबयूनिट धुंधला द्वारा चिह्नित (लाल, सी), और नाभिक, DAPI धुंधला (नीला, डी) डीएनए पोलीमरेज़-α अवरोध aphidicolin के साथ पूर्व ऊष्मायन के साथ साथ लेबल। (ए एंड# 39 ;-D ') एक बढ़ाया में) बॉक्सिंग क्षेत्र की छवि (एक edu समावेश (बी दिखा'), माइटोकांड्रिया (सी ') और नाभिक (डी')। aphidicolin की उपस्थिति में, परमाणु समावेश (तीर) कम हो जाता है और कई puncta माइटोकांड्रिया (तीर) के भीतर स्थानीय थे। स्केल सलाखों, 10 माइक्रोन। यह आंकड़ा 11 से संशोधित किया गया है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3. mtDNA प्रतिकृति मात्र aphidicolin इलाज के बिना ड्रोसोफिला germarium में पता चला है (ए।) - (डी) edu समावेश (हरा) दिखा एक जंगली प्रकार germarium के प्रतिनिधि confocal अनुभाग, माइटोकॉन्ड्रिया, द्वारा चिह्नितएटीपी Synthase अल्फा सबयूनिट धुंधला (लाल), और नाभिक, डीएनए पोलीमरेज़-α अवरोध aphidicolin के अभाव में DAPI धुंधला (नीला) के साथ लेबल। (A'- डी ') एक बढ़ाया (ए) में बॉक्सिंग क्षेत्र की छवि edu समावेश (बी दिखा'), माइटोकांड्रिया (सी ') और नाभिक (डी')। aphidicolin बिना, तीव्र edu संकेतों लेबल नाभिक (तीर), और mtDNA puncta मुश्किल से पता चला रहे थे। स्केल सलाखों, 10 माइक्रोन। यह आंकड़ा 11 से संशोधित किया गया है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4. Mitochondrial uncoupler mtDNA प्रतिकृति impairs। प्रतिनिधि Z ढेर जंगली प्रकार germarium दिखा परियोजनाओं DMSO के साथ इलाज(ए) या 2 माइक्रोन (बी), 5 सुक्ष्ममापी (सी), 10 माइक्रोन (डी) edu समावेश के दौरान की सांद्रता में mitochondrial uncoupler FCCP। नोट क्षेत्र 2 बी 2 माइक्रोन FCCP (बी) के साथ इलाज में बिगड़ा edu लेबलिंग, और दोनों क्षेत्र 2 बी और 3 से 5 माइक्रोन के FCCP के साथ इलाज में (बक्से में उल्लिखित)। चार विकासात्मक क्षेत्रों दिखाए जाते हैं। तीर, परमाणु डीएनए; तीर, mtDNA। स्केल बार, 10 माइक्रोन। यह आंकड़ा 11 से संशोधित किया गया है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

Edu लेबलिंग proliferating कोशिकाओं है, जो समावेश और नए संश्लेषित डीएनए में nucleoside analogues के धुंधला पर आधारित है में डीएनए संश्लेषण पता लगाने के लिए एक उपन्यास और कारगर तरीका है। इस विधि से यह तेजी से और बेहद संवेदनशील है कि में BrdU लेबलिंग विधि से बेहतर है। इससे भी महत्वपूर्ण बात, यह 9 माउंट पूरे ऊतकों, 10। ऐतिहासिक, BrdU लेबलिंग करने के लिए एक बेहतर विकल्प के रूप में, edu लेबलिंग के एस चरण के दौरान परमाणु डीएनए प्रतिकृति के अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया गया था अच्छा संरचनात्मक संरक्षण और कुशल की एडू-डाई प्रवेश के लिए अनुमति देता है कोशिका चक्र। Aphidicolin डीएनए पोलीमरेज़ α के एक अवरोध है, जो एस चरण 12 से 15 परमाणु डीएनए प्रतिकृति के लिए मुख्य पोलीमर्स है। mtDNA प्रतिकृति डीएनए पोलीमरेज़ γ, जो इलाज के aphidicolin के प्रति असंवेदनशील है द्वारा किया जाता है। इसलिए, पहले और edu ऊष्मायन के दौरान aphidicolin के साथ इलाज के लिए काफी परमाणु डीएनए में edu समावेश हिचकते हैं। यह होना चाहिएध्यान दिया जाना aphidicolin कई हफ्तों के लिए स्थिर हो सकता है कि यदि उचित रूप से संग्रहीत है, और परमाणु डीएनए प्रतिकृति में बाधा aphidicolin की प्रभावकारिता हमारे हाथ में चर रहा था। आगे डेटा से विश्लेषण करती है ovarioles या मजबूत परमाणु डीएनए लेबलिंग के साथ अंडा कक्षों बाहर रखा जाना चाहिए।

mtDNA प्रतिकृति आसानी से कोशिका द्रव्य है, जो भी edu puncta की संख्या, कोशिका द्रव्य की कुल मात्रा के लिए सामान्यीकृत की गणना के द्वारा mtDNA प्रतिकृति के स्तर यों के लिए एक सीधा रास्ता देता में puncta के रूप में देखे जा सकते हैं। इमेजिंग सॉफ्टवेयर स्वचालित रूप से सूक्ष्म छवियों, जो बड़े डेटा सेट के कम्प्यूटेशनल विश्लेषण के लिए विशेष रूप से उपयोगी है में edu puncta की पहचान करने के लिए लागू किया जा सकता है। हालांकि, सावधानियों, लिया जाना चाहिए, क्योंकि परमाणु डीएनए प्रतिकृति की अधूरी निषेध गुणसूत्र पर अलग-अलग स्थलों में edu समावेश करने के लिए नेतृत्व और नाभिक के अंदर puncta के रूप में प्रदर्शित कर सकते हैं। इसके अलावा अन्य मामलों में, edu की तीव्रता Repli में शामिलcating mtDNA, कमजोर हो सकता है, जबकि पृष्ठभूमि और शोर उच्च किया जा सकता है। इसलिए, स्वत: छवि विश्लेषण के लिए अलग-अलग मानकों को ध्यान से परिभाषित किया जाना चाहिए। यह भी सिफारिश की है कि छवियों को प्रशिक्षित आँखों से जांच की जानी चाहिए सुनिश्चित करें कि उचित edu puncta पहचान कर रहे हैं बनाने के लिए।

ड्रोसोफिला oogenesis दौरान नए संश्लेषित mtDNA के दृश्य की जांच करने के लिए कैसे mtDNA प्रतिकृति शारीरिक या रोग की स्थिति के तहत विनियमित है औषधीय या आनुवंशिक perturbations की एक किस्म के अधीन मक्खियों में प्रयोग बाहर ले जाने से, एक अवसर प्रदान करता है। Coi T300I 11: पिछले एक अध्ययन में, edu समावेश परख एक mtDNA उत्परिवर्ती ड्रोसोफिला मीट्रिक टन में प्रदर्शन किया गया था। इसके अलावा, mitochondrial झिल्ली क्षमता को बाधित करने के लिए, अंडाशय mitochondrial uncoupler FCCP या 2,4-Dinitrophenol (DNP) से पहले edu के लिए समावेश के विभिन्न सांद्रता के साथ इलाज किया गया। प्रायोगिक उद्देश्यों पर निर्भर करता हैऔर नशीली दवाओं के लक्षण, अलग अलग तरीकों का प्रभावी वितरण के लिए अपनाया जा सकता है। वयस्क मक्खियों के लिए, दवाओं एक वाष्प (जैसे, इथेनॉल और कोकीन) के रूप में प्रस्तुत किया जा सकता 16,17 या ड्रग्स पेट, जहां इसे जल्दी से शरीर 18 भर diffuses में इंजेक्ट किया जा सकता है। सबसे आम बात है कि दवाओं मक्खी भोजन या एक सूक्रोज / दवा संतृप्त फिल्टर पेपर के लिए जोड़ रहे हैं। उदाहरण के लिए, microtubule विधानसभा, colchicine के अवरोध, अंडाशय विच्छेदन 19 से पहले 2-3 दिनों के लिए मक्खियों को खिलाया गया था। इसलिए, यह दवा वितरण पद्धति का मूल्यांकन करने और उचित सांद्रता का चयन करने के लिए महत्वपूर्ण है।

ड्रोसोफिला अंडाशय में mtDNA प्रतिकृति के सफल इमेजिंग सुनिश्चित करने के लिए कई महत्वपूर्ण कदम सावधानी से निष्पादित किया जाना चाहिए। सबसे पहले, विच्छेदन और edu समावेश दौरान व्यवहार्यता और अंडाशय के स्वास्थ्य संरक्षण आवश्यक है (चरण 1 और 2)। FBS के साथ श्नाइडर के ड्रोसोफिला मध्यम आरटी के लिए गरम करने की जरूरत हैइस्तेमाल से पहले। एक अंडा कक्षों और विदारक उपकरण या पिपेट सुझावों के बीच सीधे संपर्क को कम करना चाहिए। अंडाशय निर्जलीकरण से बचने के समाधान के तहत डूब जाना चाहिए हर समय। Mishandling ऊतकों आसानी से नेतृत्व कर सकते बेहोश या कोई फ्लोरोसेंट संकेतों के लिए। ऊतक बढ़ते कदम के दौरान, ovarioles एक दूसरे से अलग किया जाना चाहिए और खुर्दबीन स्लाइड पर फैल गए। सुनिश्चित करें कि अंडा कक्षों के लिए एक दूसरे के ऊपर खड़ी नहीं कर रहे हैं। हमने देखा है कि मंच 14 परे अंडा कक्षों थोड़ा edu समावेश का प्रदर्शन किया। इसके अतिरिक्त, बड़े आकार की वजह से, देर चरण अंडा कक्षों अक्सर पड़ोसी छोटे अंडे कक्षों ध्यान से बाहर होने का कारण। इस प्रकार यह सिफारिश की है कि देर से मंच अंडा कक्षों खारिज किया।

यहाँ हम लेबलिंग ड्रोसोफिला वयस्क अंडाशय में mtDNA नकल के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं। इस विधि विभिन्न आनुवंशिक और औषधीय perturbations के तहत mtDNA प्रतिकृति की साधारण मात्रा का ठहराव के लिए अनुमति देता है,और विकासात्मक mitochondrial biogenesis और mtDNA विरासत अंतर्निहित तंत्र विदारक के लिए उपयोगी हो जाएगा।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Schneider’s Drosophila medium Invitrogen 21720-024
FBS Invitrogen 10100-147
Pair of Dumont #5 Forceps Fine Science Tools 11252-20
Aphidicolin Sigma A0781 Aliquot after dissolving in DMSO. Avoid repetitive thawing and freezing. Protect from light. May be used within 6 weeks after dissolving. 
FCCP Sigma C2920
DMSO Sigma D2650
Paraformaldehyde, 16% EM grade Electron Microscopy Sciences 15710 Formaldehyde is toxic; it should be handled in a fume hood with skin and eye protection.
PBS KD Medical RGF-3190
BSA Sigma A7030
Triton X-100 Sigma T9284
Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Imaging Kit Invitrogen C10337 EdU, CuSO4, Alexa Fluor 488 azide, EdU reaction buffer and Edu buffer additive are included
Mouse ATP synthase subunit α antibody, (15H4C4) MitoSciences Ab14748 1:1,000 dilution
Mouse Hts antibody (clone RC) Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) hts RC 1:1,000 dilution
Goat anti-mouse Alexa Fluor 568 secondary antibody Invitrogen A-11004 1:200 dilution
Vectashield mounting medium with DAPI Vector Laboratories H-1500
Glass coverslips, #1.5 22 mm x 22 mm Fisher Scientific 12-541-B
Microscope slide Fisher Scientific 22-038-103
Nail polish Elf Many of the pigments used in nail polishes are fluorescent and leach into specimens. Only clear nail polish should be used.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Taylor, R. W., Turnbull, D. M. Mitochondrial DNA mutations in human disease. Nat Rev Genet. 6 (5), 389-402 (2005).
  2. Wallace, D. C., Chalkia, D. Mitochondrial DNA genetics and the heteroplasmy conundrum in evolution and disease. Cold Spring Harb Perspect Biol. 5 (11), a021220 (2013).
  3. Spradling, A. C. The development of Drosophila melanogaster. , Cold Spring Harbor Lab. Press. (1993).
  4. Riechmann, V., Ephrussi, A. Axis formation during Drosophila oogenesis. Curr Opin Genet Dev. 11 (4), 374-383 (2001).
  5. Lin, H., Yue, L., Spradling, A. C. The Drosophila fusome, a germline-specific organelle, contains membrane skeletal proteins and functions in cyst formation. Development. 120 (4), 947-956 (1994).
  6. Cox, R. T., Spradling, A. C. A Balbiani body and the fusome mediate mitochondrial inheritance during Drosophila oogenesis. Development. 130 (8), 1579-1590 (2003).
  7. Davis, A. F., Clayton, D. A. In situ localization of mitochondrial DNA replication in intact mammalian cells. J Cell Biol. 135 (4), 883-893 (1996).
  8. Iborra, F. J., Kimura, H., Cook, P. R. The functional organization of mitochondrial genomes in human cells. BMC Biol. 2, (2004).
  9. Rakic, P. Neurogenesis in adult primate neocortex: an evaluation of the evidence. Nat Rev Neurosci. 3 (1), 65-71 (2002).
  10. Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (7), 2415-2420 (2008).
  11. Hill, J. H., Chen, Z., Xu, H. Selective propagation of functional mitochondrial DNA during oogenesis restricts the transmission of a deleterious mitochondrial variant. Nat Genet. 46 (4), 389-392 (2014).
  12. Lentz, S. I., et al. Mitochondrial DNA (mtDNA) Biogenesis: Visualization and Duel Incorporation of BrdU and EdU Into Newly Synthesized mtDNA In Vitro. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 58 (2), 207-218 (2010).
  13. Tornoe, C. W., Christensen, C., Meldal, M. Peptidotriazoles on solid phase: [1,2,3]-triazoles by regiospecific copper(i)-catalyzed 1,3-dipolar cycloadditions of terminal alkynes to azides. J Org Chem. 67 (9), 3057-3064 (2002).
  14. Horwitz, H. B., Holt, C. E. Specific inhibition by ethidium bromide of mitochondrial DNA synthesis in physarum polycephalum. J. Cell Biol. 49, 546-553 (1971).
  15. Huberman, J. A. New views of the biochemistry of eucaryotic DNA replication revealed by aphidicolin, an unusual inhibitor of DNA polymerase alpha. Cell. 23 (3), 647-648 (1981).
  16. McClung, C., Hirsh, J. Stereotypic behavioral responses to free-base cocaine and the development of behavioral sensitization in Drosophila. Curr Biol. 8 (2), 109-112 (1998).
  17. Moore, M. S., et al. Ethanol intoxication in Drosophila: Genetic and pharmacological evidence for regulation by the cAMP signaling pathway. Cell. 93 (6), 997-1007 (1998).
  18. Dzitoyeva, S., Dimitrijevic, N., Manev, H. Gamma-aminobutyric acid B receptor 1 mediates behavior-impairing actions of alcohol in Drosophila: adult RNA interference and pharmacological evidence. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (9), 5485-5490 (2003).
  19. Koch, E. A., Spitzer, R. H. Multiple effects of colchicine on oogenesis in Drosophila: induced sterility and switch of potential oocyte to nurse-cell developmental pathway. Cell Tissue Res. 228 (1), 21-32 (1983).

Tags

आनुवंशिकी अंक 116, mitochondrial डीएनए डीएनए प्रतिकृति edu धुंधला क्लिक करें रसायन विज्ञान माइक्रोस्कोपी
Edu धुंधला द्वारा <em>ड्रोसोफिला</em> एडल्ट अंडाशय में mitochondrial डीएनए प्रतिकृति के <em>सीटू</em> लेबलिंग <em>में</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chen, Z., Xu, H. In Situ… More

Chen, Z., Xu, H. In Situ Labeling of Mitochondrial DNA Replication in Drosophila Adult Ovaries by EdU Staining. J. Vis. Exp. (116), e54516, doi:10.3791/54516 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter