Introduction
Naast het nucleaire genoom, elke eukaryote cel bevat ook duizenden exemplaren van kleine cirkelvormige DNA in de mitochondriale matrix. Terwijl mitochondriaal DNA (mtDNA) codeert essentiële subeenheden van electronentransportketting de meerderheid van de mitochondriale proteoom, waaronder alle elementen voor replicatie en transcriptie van mtDNA gecodeerd door het nucleaire genoom. In tegenstelling tot het nucleaire genoom die Mendeliaanse erfrechterlijk volgt, wordt het dier mitochondriaal genoom exclusief geërfd via de moederlijn. Daarom begrijpen hoe mtDNA wordt verspreid en overgedragen van de ene generatie naar de volgende door middel van de vrouwelijke eicel is van fundamenteel belang. Echter, er is voortdurende discussie over de vraag hoe mtDNA replicatie is geregeld in de vrouwelijke kiemlijn. Daarnaast is de algemeen aanvaarde mtDNA knelpuntentheorie voor mtDNA transmissie suggereert dat de populatie van mtDNA in primordiale kiemcellen is subsampled een relatief klein aantal during ontwikkeling 1 2. Het houdt ook in dat mtDNA replicatie is tijd en ruimte gereguleerd tijdens oögenese. Daarom zal de in situ detectie van mtDNA replicatie tijdens kiemlijn ontwikkeling van het inzicht in het mechanisme van mtDNA overerving vergemakkelijken.
Drosophila oögenese biedt een genetisch handelbaar systeem om mtDNA replicatie en transmissie te bestuderen. In elk van de twee Drosophila eierstokken, er 16-20 onafhankelijke strengen ei kamers genoemd ovarioles 3, waarbij de functionele eenheden van eierproductie zijn (zie figuur 1A). Elke ovariole bevat een geleidelijke lineaire ordening oögenese, waarbij het voorste uiteinde bestaat uit een structuur genaamd germarium. De germarium is verder onderverdeeld in vier regio's die kiemcellen in verschillende ontwikkelingsstadia bevatten. In regio 1, kiembaan stamcellen gaan door asymmetrische divisie dochtercellen bekend als c producerenystoblasts. Regio 2a bevat de cystoblasts dat hun laatste divisie hebben afgerond. Cystoblasts ondergaan vier rondes van verdeeldheid produceren 16-celgroepen. De 16 cellen blijven met elkaar verbonden door cytoplasmatische bruggetjes grachten. Slechts één van de cellen verbindt differentiatie als de eicel, terwijl de andere 15 ontwikkelen polyploïde cellen verpleegster. Essentieel cytoplasmatische structuur, bekend als fusome wordt voorgesteld vergemakkelijken de vorming van grachten, bepalen de cyste polariteit en de verpleegkundige cel-interacties eicel 4,5. Aangezien de cysten komen tot gebied 2b, de cyste structuren overspannen de gehele breedte van de germarium, en meer geassocieerd met follikelcellen. De germarium structuren eindigen met regio 3 met daarin de eerste ontluikende ei kamer. Vervolgens worden de ei kamers gemonteerd aan het achterste uiteinde van de germarium, die verder door de ovariole in 14 morfologisch verschillende fasen. De groei van de eicel is afhankelijk van de verpleegster cellen, which transporteiwitten, mRNA en endomembrane structuren (bijv Golgi) via de grachten in de eicel. Tijdens Drosophila oogenesis, werd gevonden dat een fractie van de mitochondriën in elke cel 16 cysten werden bij dit fusome, bewogen door de grachten en afgeleverd in de interne eicel in een grote massa genaamd Balbiani lichaam 6. Dit fenomeen werd voorgesteld bij te dragen tot de kwaliteitscontrole van mitochondriale erfelijkheid vrouwelijke eierstokken.
Detectie van mtDNA synthese is gebaseerd op de opname van gelabelde DNA precursors in cellulair DNA. Traditioneel, een nucleoside-analoog van thymidine 5-broom-2'-deoxyuridine (BrdU) werd gebruikt om het mtDNA replicatie in weefselcultuur cellen 7,8 labelen. Echter, de antilichaam-gebaseerde BrdU labeling vertoont een aantal beperkingen, in het bijzonder voor de hele-mount weefsel kleuring. Een groot nadeel van BrdU labeling is dat het DNA denaturatie blootde BrdU epitoop, zodat het kan worden gedetecteerd door het anti-BrdU-antilichaam. Het monster moet worden behandeld onder zware denaturerende omstandigheden zoals chemicaliën (bijvoorbeeld, zoutzuur of mengsels van methanol en azijnzuur), warmte of digestie met DNase, die de structuur van het monster kunnen verstoren en bemoeilijken de volgende kleuringsprocedure 9, 10.
Hier wordt een alternatieve thymidine analoog 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EDU) gebruikt om het repliceren mitochondriaal DNA in Drosophila volwassen eierstokken labelen. Deze werkwijze is sneller en zeer gevoelig. Edu wordt gemakkelijk in cellulair DNA tijdens de replicatie van DNA opgenomen. De volgende detectie is gebaseerd op een "klik" reactie, een Cu (I) -gekatalyseerde covalente reactie tussen de eindstandige alkyngroep en een fluorescerende azide 10. Omdat de reactie van de denaturatie van het monster vereist, is het mogelijk goede structurele conservering. Bovendien is de grootte van een kleurstofzide is slechts 1/500 van die van een antilichaam-molecuul 10, die een snelle en efficiënte penetratie van whole-mount weefsels mogelijk maakt. We hebben deze methode om mtDNA replicatie detecteren tijdens Drosophila oögenese gebruikt en vond een opvallend ruimtelijk patroon in de germarium regio Drosophila eierstok 11, die ons leiden tot een replicatie-afhankelijke mtDNA selectieve overervingsmechanisme stellen. Wij presenteren hier een gedetailleerd protocol over Edu etikettering van mtDNA replicatie in Drosophila eierstokken. Om de toepassing van het protocol aan te tonen, hebben we ook getest het mtDNA replicatie in een mtDNA mutant Drosophila (mt: CoI T300I) 11, evenals met uiteenlopende behandeling van mitochondriale ontkoppelrails, die het mitochondriale membraanpotentiaal te verdrijven en mogelijk verstoren mtDNA replicatie.
Protocol
1. Tissue Collection en Dissection
- In elk flesje dat droge gist, cultuur 10 volwassen vrouwelijke vliegt met 10 mannen voor 2-3 dagen.
Opmerking: Het handhaven van goed gevoede vrouwelijke vliegen zal de algehele kwaliteit en de opbrengst van de eierstokken de productie te verbeteren en dissectie te vergemakkelijken. - Verdoven de vrouwelijke vliegt op een kooldioxide (CO 2) vliegen pad.
- Onder de stereoscoop door diverse druppels RT medium (Schneider's Drosophila medium aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS)) op een dissectie pad. Voeren alle dissectie procedures het in het medium naar de weefsels levend en gezond te houden.
- Pak een vetgemest vrouwelijke vliegen met scherpe fine-nosed tang op zijn lagere thorax. Gebruik een andere set van een tang om zachtjes trekken aan de uiterste achterste van de vlieg, totdat de weefsels in de buik worden blootgesteld. Maak de twee eierstokken van andere weefsels (bijv lef).
Opmerking: Elke eierstok displays een ondoorzichtige structuur die composed van 16-20 bevestigd ovarioles. - De penetratie van reagentia verbeteren, opent de eierstokken door ze uit elkaar te trekken en het passeren van de uiteinden van de tang tussen elke ovariole een paar keer. Houd de ovarioles verbonden binnen een eierstok verlies aan weefsel minimaliseren tijdens de volgende procedures.
- Breng de eierstokken onmiddellijk naar een 1,5 ml microcentrifugebuis met 500 pl Schneider's Drosophila medium met 10% FBS.
- Herhaal de dissectie en het verzamelen van 10-15 eierstokken bij elke microcentrifugebuis.
2. EDU Labeling
- Zuig het medium in elke buis, en te vervangen door 500 ul van Schneiders Drosophila medium met 10% FBS met 7 uM aphidicoline.
Opmerking: afidicoline wordt gebruikt nucleaire DNA-synthese te blokkeren door remming van DNA-polymerase α zonder dat mtDNA replicatie 7, 12. Het is mogelijk om de aphidicoline concentratie te verhogentot 70 uM tot betere inhibitie. De voorraadoplossing van 3-30 mM in DMSO afidicoline kan tot 6 weken worden bewaard in het donker bij -20 ° C. - Om de eierstokken gezond te houden, ervoor zorgen dat ze worden ondergedompeld onder oplossingen tijdens het verwisselen van het medium. Gebruik Schneiders Drosophila medium met 10% FBS tot en met stap 2.6.
- Incubeer eierstokken gedurende 3 uur bij kamertemperatuur op een bankje-top rocker met zachte rotatie.
- Voor de behandeling met geneesmiddelen, bijvoorbeeld, mitochondriale ontkoppelrail carbonyl cyanide 4-trifluormethoxy fenylhydrazon (FCCP), voeg de juiste concentratie van het geneesmiddel (bijvoorbeeld 10 uM FCCP) in het medium na 2 uur van aphidicoline behandeling. Verder incuberen gedurende nog 1 uur.
- Verwijder het medium dat afidicoline met of zonder geneesmiddel. In het kort spoel de eierstokken met medium (aphidicoline is niet nodig) tweemaal.
- Voeg 1 ml medium dat 10 uM Edu en 7 uM aphidicoline en doorgaan incubating bij kamertemperatuur gedurende 2 uur. Bewaar de EDU 10 mM voorraadoplossing (in DMSO) bij -20 ° C.
- Verwijder het medium dat Edu en aphidicoline. Wassen met medium (zonder aphidicoline) tweemaal gedurende 3 min elk.
3. Tissue Fixatie en Permeabilisatie
- Bereid een 4% paraformaldehyde oplossing in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS, pH 7,4).
Let op: We gebruikten de handel verkrijgbare paraformaldehyde opgeslagen in het pre-scoorde ampullen. Open een nieuwe ampul en verdunnen tot 4% voor gebruik.
LET OP: Formaldehyde is giftig; het moet in een zuurkast met de huid en oogbescherming worden behandeld. - Fix eierstokken met 4% paraformaldehyde gedurende 20 min bij kamertemperatuur onder zacht rotatie.
- Verwijder het fixeermiddel eierstokken en was tweemaal in 1 ml 3% BSA in PBS gedurende 5 min per keer.
- Naar de weefsels permeabilize, verwijder de wasoplossing en voeg 1 ml 0,5% Triton X-100 in PBS. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 20 min.
- Verwijder de permeabilisatie oplossing en tweemaal wassen in 1 mlvan 3% BSA in PBS.
4. EDU Detection
Noot: edu detectie is gebaseerd op "click" chemie, een Cu (I) -gekatalyseerde [3 + 2] cycloadditie 13, welke fluorescerende aziden bijdraagt aan de terminale alkyn groep EDU en het fluorescerende molecuul wordt onderworpen aan daaropvolgende detectie. Aangezien Cu (I) die gemakkelijk wordt geoxideerd tot de niet-katalytische Cu (II) species, nodig om de reactie te katalyseren, is het raadzaam om de Cu (II) sulfaat beperken in situ Cu (I) te verkrijgen. Dat wil zeggen Cu (II) sulfaat wordt toegepast in aanwezigheid van een reductiemiddel zoals ascorbinezuur (hierin de "buffer additief") koper genereren (I).
- Voor het experiment, de voorbereiding van de werkoplossing van de Alexa Fluor azide (Alexa Fluor 488 azide, Alexa Fluor 555 azide of anderen, afhankelijk van de gewenste fluorofoor, die worden genoemd als "kleurstof azide" genoemd), edu reactiebuffer en EDU buffer additief volgens de fabrikantinstructies.
- Reconstrueren de kleurstof azide in 70 pl DMSO. Bewaar de werkoplossing bij -20 ° C tot 1 jaar.
- Bereid verse Edu reactie buffer door verdunning van de 10x EDU reactie buffer met gedemineraliseerd water.
Opmerking: na gebruik bewaar 1x resterende oplossing bij 4 ° C. De 1x oplossing is maximaal 6 maanden. - Maak een 10x voorraad oplossing van het Edu buffer additief door het volledig oplossen van het poeder in 2 ml gedeïoniseerd water.
Opmerking: Deze voorraad oplossing is tot 1 jaar bij -20 ° C. Als de oplossing ontstaat een bruine kleur, maar het is afgebroken en moet worden weggegooid.
- Bereid de EDU reactie cocktail verse elke keer, en gebruiken binnen 15 minuten na de bereiding. Om reproduceerbare resultaten te bereiken, zorg ervoor dat de reactie componenten zijn op dezelfde verhoudingen gehandhaafd.
- Maak verse 1x Edu buffer bewaarvloeistof door verdunning van de 10x voorraad-oplossing (bereid in stap 4.1.3) 1:10 in gedemineraliseerd water. Gebruik deze sPLOSSING op dezelfde dag.
- Bereid 1 ml van Edu reactie cocktail door het combineren van de volgende ingrediënten in deze volgorde: 860 ul 1x edu reactiebuffer, 40 pi CuSO4, 2.5 pi kleurstof azide, 100 ul 1x Edu buffer additief.
Opmerking: Het is belangrijk dat de ingrediënten toegevoegd om optimale prestaties te garanderen.
- Verwijder de PBS met 3% BSA en voeg 0,5 ml van de EDE reactiecoctail aan elke buis. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten onder zacht rotatie. Houd het beschermd tegen licht monsters.
- Verwijder de EDU reactiecoctail en eenmaal wassen met 1 ml 3% BSA in PBS.
- Was de monsters eenmaal met 1 ml PBS.
5. Antibody Labeling
Opmerking: Voer etikettering antilichaam na EDU kleuring. Indien geen extra kleuring is gewenst, kan men overgaan tot montage en beeldvorming direct. Het is belangrijk dat de monsters worden beschermd tegen licht in de volgende procedures.
- Verwijder de wasoplossing. Blokkeer de eierstokken in 1 ml van het blokkeren met 0,2% BSA en 0,1% Triton X-100 in PBS gedurende 30 min.
- Verwijder de blokkering oplossing en te vervangen door primair antilichaam verdund in het blokkeren van oplossing (bv, muis ATP synthase subunit α antilichaam, 1: 1000 verdunning). Incubeer in het donker bij 4 ° CO / N.
- Was de monsters met 1 ml blokkeeroplossing 3 maal, 10 minuten per keer. Om de achtergrond te minimaliseren, twee keer wassen gedurende 30 minuten elk. Verwijder de blokkerende oplossing.
- Incubeer met tweede antilichaam verdund in blokkeeroplossing (bijvoorbeeld geit anti-muis Alexa Fluor 568 secundair antilichaam, 1: 200 verdunning) gedurende 2 uur bij KT.
Opmerking: Gebruik een andere kleur dan de ene gekoppeld aan Edu. - Herhaal het wassen stappen uitgevoerd in stap 5.3.
- Spoelen met 1 ml PBS eenmaal om het reinigingsmiddel te verwijderen.
6. Montage en Imaging
- Verwijder voorzichtig al de PBS en immediately bedekken eierstokken met 50 gl montage medium (met of zonder DAPI).
Opmerking: Gebruik een fixeermiddel dat niet verhardt terwijl de ovarioles worden van elkaar gescheiden. Eierstokken kunnen voor tot een week opgeslagen in fixeermiddel bij 4 ° C. - Snijd het uiteinde van een pipet en deze gebruiken om eierstokken voorzichtig brengen op een microscoopglaasje.
- Volledig gescheiden elk ovariole met scherpe fine-nosed tang onder de stereomicroscoop. Verwijder het aansluiten van weefsels aan het achterste einde en het stadium 14 of rijpe eicel kamers. De jonge ei kamers zijn aan het voorste uiteinde en transparant.
- Lijn de ei kamers met een tang, zodat ze niet met elkaar overlappen.
- Langzaam lager a # 1,5 glazen dekglaasje bovenop de monsters. Laat het fixeermiddel polymeriseren gedurende enkele uren bij kamertemperatuur. Seal met transparante nagellak.
- Beeld schuift de volgende dag, en bewaar bij 4 ° C voorafgaand aan de beeldvorming.
- Visualiseren onder een confocale microscope met een 63x olie-immersie objectief. Leg driedimensionale z-stacks beelden.
Opmerking: Er is een sterke Edu signaal in later stadium ei kamers en de achtergrond fluorescentie in de epitheliale schede. Bij het onderzoek van Edu labeling in een bepaalde germarium, moet men germariums die worden overlapt door of in de buurt van andere weefsels of later stadium ei kamers te vermijden.
Representative Results
De bovenstaande protocol maakt visualisatie van de puntvormige structuren geassocieerd met mitochondriën (Figuur 1B-C), die mitochondriale DNA-replicatie in Drosophila oögenese geven. De EDE puncta gelocaliseerd mitochondria gekenmerkt door kleuring voor ATP synthase alfa-subeenheid (Figuur 2). De waargenomen signalen afwezig zijn in eierstokken behandeld met ethidiumbromide 11, een remmer voor mtDNA replicatie 14, gecontroleerd of deze inderdaad puncta label replicerende mtDNA.Aphidicolin werd gebruikt om nucleair DNA kleuring te remmen zonder dat mtDNA replicatie (Figuur 2). Zonder aphidicoline behandeling, intense Edu signalen etiket van de kernen en mtDNA puncta waren nauwelijks gedetecteerd (figuur 3). In aanwezigheid van afidicoline, nucleaire opname werd drastisch verminderd en vele puncta verband met mitochondria waargenomen.
(Figuur 1B). Echter, met name mtDNA replicatie vertoonden een ruimtelijk patroon in de germarium. Zoals aangegeven door het aantal EDU puncta, is er een beperkte mate van mtDNA replicatie in regio 1 van de germarium, maar bijna geen EDU inbouw in regio 2A (figuur 1C). Als de cyste verplaatst naar regio 2B in de germarium, mtDNA replicatie hervat en het aantal EDU puncta in het achterste gebied 2B van cyste was veel hoger dan in gebied 2A (Figuur 1C). In het bijzonder, werd intensief Edu incorporatie geconcentreerd rond de grachten en de fusome structuren, zoals gekleurd door de hu li tai shao (HTS) eiwit. mtDNA gehouden repliceren op een hoog niveau in het gebied 3 van het germarium (figuur 1C)
Om de associatie van SPECIF tonenic genen of behandeling met mtDNA proliferatie, kon Drosophila eierstokken worden onderworpen aan genetische manipulatie of behandeling met geneesmiddelen. We behandelden eierstokken met verschillende concentraties FCCP, een klassiek mitochondriale protonophore die mitochondriale membraanpotentiaal verdwijnt. Als controle werd DMSO had geen effect op mtDNA replicatie (Figuur 4A). Hoge doses FCCP (10 M) bijna op mtDNA replicatie volledig in het hele germarium (figuur 4D). Niettemin lagere concentratie FCCP (2 of 5 uM) had een klein effect op mtDNA replicatie in regio 1 maar remde replicatie in gebieden 2B en 3 (figuur 4B-C), wat suggereert regio 2B en 3 zijn gevoeliger voor mitochondriale verstoring of ze houden ten opzichte van tragere replicatie kinetiek. De bovenstaande resultaten gaven aan dat mtDNA replicatie geassocieerd met mitochondriale activiteit. In het bijzonder, verschillende regio's van de germarium reageerden verschillend op mitochondriale impairment.
Figuur 1. mtDNA replicatie tijdens Drosophila oögenese. (A) Schematische weergave van een Drosophila ovariole en een vergrote weergave van de germarium. De ovariole illustreert van links naar rechts, anterior naar posterior, opeenvolgende ontwikkelingsstadia van ei kamers. In de germarium, de fusome (rood), kiemlijn stamcellen (blauw), mitochondria (groen), de toekomstige eicel (gebroken lijn, erkend door de positionering, fusome structuur en mitochondriale clusters), de ontwikkeling van cysten (perzik) en vier ontwikkelings gebieden worden getoond . (B) Representatieve z-stack projectie van een wild-type ovariole gelabeld door Edu en antilichaam tegen Hts-RC, een marker voor grachten en fusome. In aanwezigheid van afidicoline, werd de EDE opgenomen in mtDNA (pijlpunten) en kernen (pijlen). Schaal bar, 10 micrometer.(C) Vergrote weergave van germaria in de boxed regio geschetst in B. De vier ontwikkelings- gebieden zijn aangegeven. Schaal bar, 5 micrometer 11. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. mtDNA replicatie in de Drosophila germarium gevisualiseerd door EDE opname met afidicoline behandeling (A) -. (D) Vertegenwoordiger confocale gedeelte van een wildtype germarium geeft edu incorporatie (groen, b), mitochondria, gekenmerkt door ATP synthase alpha subunit kleuring (rood, C) en kernen, gelabeld met DAPI kleuring (blauw, D) met pre-incubatie met DNA-polymerase-α remmer afidicoline. (A &# 39 ;-D) Een vergroot beeld van de boxed gebied (A) toont EDU incorporatie (B '), mitochondria (C) en kernen (D'). In aanwezigheid van afidicoline, wordt nucleaire opname (pijlen) gereduceerd en veel puncta gelokaliseerd binnen mitochondria (pijlpunten). Schaalbalken, 10 urn. Het cijfer is aangepast van 11. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. mtDNA replicatie nauwelijks gedetecteerd in de Drosophila germarium afidicoline zonder behandeling (A) -. (D) Vertegenwoordiger confocale gedeelte van een wildtype germarium geeft edu incorporatie (groen), mitochondria, gekenmerkt doorATP synthase alpha subeenheid kleuring (rood) en kernen, gelabeld met DAPI kleuring (blauw) in de afwezigheid van de DNA-polymerase α remmer afidicoline. (A'-D) toont een vergroot beeld van de boxed gebied (A) toont EDU incorporatie (B '), mitochondria (C) en kernen (D'). Zonder aphidicoline, werden intense Edu signalen label kernen (pijlen), en mtDNA puncta nauwelijks ontdekt. Schaalbalken, 10 urn. Het cijfer is aangepast van 11. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4. mitochondriaal ontkoppelrail schaadt het mtDNA replicatie. Vertegenwoordiger z-stack projecten met wild-type germarium behandeld met DMSO(A) of mitochondriale ontkoppelaar FCCP bij concentraties van 2 uM (B), 5 uM (C), 10 uM (D) tijdens EDU incorporatie. Let op de verminderde EDU etikettering regio 2B behandeld met 2 uM FCCP (B), en in beide regio 2B en 3 behandeld met 5 uM FCCP (beschreven in kaders). Vier gebieden ontwikkeling getoond. Pijlen, nucleair DNA; pijlpunten, mtDNA. Schaal bar, 10 micrometer. Het cijfer is aangepast van 11. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Discussion
EDU etikettering een nieuwe en efficiënte methode om DNA-synthese te detecteren in prolifererende cellen, die gebaseerd is op de opname en kleuring van nucleoside analogen nieuw gesynthetiseerde DNA. Deze methode is superieur aan de werkwijze BrdU labeling, dat het sneller en zeer gevoelig. Nog belangrijker, het zorgt voor een goede structurele conservering en efficiënte EDU-kleurstofpenetratie volle-mount weefsels 9, 10. Historisch gezien als een superieur alternatief voor BrdU labeling, edu labeling werd gebruikt voor het bestuderen van nucleaire DNA replicatie gedurende de S-fase van de celcyclus. Afidicoline is een remmer van DNA- polymerase α, die de belangrijkste polymerase nucleaire DNA replicatie S-fase 12 15. mtDNA replicatie door DNA polymerase γ, dat ongevoelig voor behandeling afidicoline uitgevoerd. Derhalve behandeling met afidicoline vóór en tijdens de EDU incubatie remde edu opname in nucleair DNA. Het zou moetengewezen dat afidicoline stabiel gedurende enkele weken kan zijn als geschikte wijze opgeslagen, en de werkzaamheid van afidicoline bij het remmen van nucleair DNA-replicatie was variabel in onze handen. De ovarioles of ei kamers met sterke nucleair DNA-etikettering dienen te worden uitgesloten van verdere data-analyses.
mtDNA replicatie kan gemakkelijk worden gevisualiseerd als puncta in het cytoplasma, welke ook verschaft een eenvoudige manier om het niveau van mtDNA replicatie gekwantificeerd door het tellen van het aantal EDU puncta, genormaliseerd naar het totale volume van cytoplasma. Beeldverwerkingssoftware kunnen worden toegepast om de EDU puncta automatisch identificeren microscopische beelden, wat vooral nuttig is voor computationele analyse van grote datasets. Moet echter voorzorgsmaatregelen worden genomen, omdat de onvolledige inhibitie van nucleair DNA replicatie kan leiden tot de EDE opname in verschillende loci op het chromosoom en worden weergegeven als puncta in de kern. Ook in andere gevallen, de intensiteit van Edu opname in replicating mtDNA zwak is, terwijl de achtergrond en lawaai hoog zijn. Derhalve de afzonderlijke parameters voor automatische beeld analyse zorgvuldig worden gedefinieerd. Ook wordt aanbevolen dat de beelden moeten worden onderzocht met getrainde ogen om ervoor te zorgen dat de juiste edu puncta worden geïdentificeerd.
Visualisatie van nieuw gesynthetiseerde mtDNA in Drosophila oögenese biedt de mogelijkheid om te onderzoeken hoe mtDNA replicatie wordt gereguleerd onder fysiologische of pathologische omstandigheden door het uitvoeren van het experiment met vliegen onderworpen aan een verscheidenheid van farmacologische of genetische verstoringen. In een eerdere studie, werd Edu incorporatie test uitgevoerd in een mtDNA mutant Drosophila mt: CoI T300I 11. Teneinde voorts de mitochondriale membraanpotentiaal verstoren, eierstokken werden behandeld met verschillende concentraties van mitochondriale ontkoppelaar FCCP of 2,4-dinitrofenol (DNP) vóór EDU opname. Afhankelijk van de experimentele doeleindenen drugs kenmerken, verschillende methoden kunnen zijn voor effectieve levering aangenomen. Voor volwassen vliegen, kunnen geneesmiddelen worden gepresenteerd als een damp (bijvoorbeeld ethanol en cocaïne) 16,17 of drugs kan worden geïnjecteerd in de buik, waar het snel diffundeert door het lichaam 18. Het meest gebruikelijk is dat geneesmiddelen worden toegevoegd aan de vlieg voedsel of sucrose / geneesmiddel verzadigd filtreerpapier. Bijvoorbeeld, de remmer van microtubule assemblage, colchicine, werd toegevoerd aan vliegen 2-3 dagen vóór dissectie eierstok 19. Daarom is het belangrijk om de geneesmiddel afgifte-methode evalueren en kies geschikte concentraties.
Om de succesvolle beeldvorming van mtDNA replicatie in Drosophila eierstokken te garanderen, moet een aantal kritische stappen zorgvuldig worden uitgevoerd. Foremost, het behoud van de leefbaarheid en de gezondheid van de eierstokken tijdens de dissectie en Edu integratie van essentieel belang is (stap 1 en 2). Schneider's Drosophila medium met FBS moet worden opgewarmd tot kamertemperatuurvoor gebruik. Men moet direct contact tussen de ei kamers en dissectie gereedschap of pipetpunten te minimaliseren. De eierstokken mag onder oplossingen worden ondergedompeld te allen tijde om uitdroging te voorkomen. Verkeerd gebruik van de weefsels kan gemakkelijk leiden tot flauwvallen of geen tl-signalen. Tijdens het weefsel montagestap moet ovarioles gescheiden van elkaar en verspreid op het microscoopglaasje. Controleer het ei kamers niet gestapeld bovenop elkaar. We hebben gemerkt dat het ei kamers boven het podium 14 weergegeven weinig EDU oprichting. Bovendien, als gevolg van de grote omvang, de late fase ei kamers vaak de oorzaak van het naburige jongere ei kamers zijn onscherp. Zo wordt aanbevolen dat de late stadium ei kamers worden weggegooid.
Hier hebben we een gedetailleerd protocol voor de etikettering repliceren mtDNA in Drosophila volwassen eierstokken. Deze methode zorgt voor een eenvoudige kwantificering van mtDNA replicatie onder verschillende genetische en farmacologische verstoringen,en zal nuttig zijn voor het ontleden van mechanismen die ten grondslag liggen aan de ontwikkeling mitochondriale biogenese en mtDNA erfenis.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Schneider’s Drosophila medium | Invitrogen | 21720-024 | |
| FBS | Invitrogen | 10100-147 | |
| Pair of Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Aphidicolin | Sigma | A0781 | Aliquot after dissolving in DMSO. Avoid repetitive thawing and freezing. Protect from light. May be used within 6 weeks after dissolving. |
| FCCP | Sigma | C2920 | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| Paraformaldehyde, 16% EM grade | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Formaldehyde is toxic; it should be handled in a fume hood with skin and eye protection. |
| PBS | KD Medical | RGF-3190 | |
| BSA | Sigma | A7030 | |
| Triton X-100 | Sigma | T9284 | |
| Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Imaging Kit | Invitrogen | C10337 | EdU, CuSO4, Alexa Fluor 488 azide, EdU reaction buffer and Edu buffer additive are included |
| Mouse ATP synthase subunit α antibody, (15H4C4) | MitoSciences | Ab14748 | 1:1,000 dilution |
| Mouse Hts antibody (clone RC) | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) | hts RC | 1:1,000 dilution |
| Goat anti-mouse Alexa Fluor 568 secondary antibody | Invitrogen | A-11004 | 1:200 dilution |
| Vectashield mounting medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1500 | |
| Glass coverslips, #1.5 22 mm x 22 mm | Fisher Scientific | 12-541-B | |
| Microscope slide | Fisher Scientific | 22-038-103 | |
| Nail polish | Elf | Many of the pigments used in nail polishes are fluorescent and leach into specimens. Only clear nail polish should be used. |
References
- Taylor, R. W., Turnbull, D. M. Mitochondrial DNA mutations in human disease. Nat Rev Genet. 6 (5), 389-402 (2005).
- Wallace, D. C., Chalkia, D. Mitochondrial DNA genetics and the heteroplasmy conundrum in evolution and disease. Cold Spring Harb Perspect Biol. 5 (11), a021220 (2013).
- Spradling, A. C. The development of Drosophila melanogaster. , Cold Spring Harbor Lab. Press. (1993).
- Riechmann, V., Ephrussi, A. Axis formation during Drosophila oogenesis. Curr Opin Genet Dev. 11 (4), 374-383 (2001).
- Lin, H., Yue, L., Spradling, A. C. The Drosophila fusome, a germline-specific organelle, contains membrane skeletal proteins and functions in cyst formation. Development. 120 (4), 947-956 (1994).
- Cox, R. T., Spradling, A. C. A Balbiani body and the fusome mediate mitochondrial inheritance during Drosophila oogenesis. Development. 130 (8), 1579-1590 (2003).
- Davis, A. F., Clayton, D. A. In situ localization of mitochondrial DNA replication in intact mammalian cells. J Cell Biol. 135 (4), 883-893 (1996).
- Iborra, F. J., Kimura, H., Cook, P. R. The functional organization of mitochondrial genomes in human cells. BMC Biol. 2, (2004).
- Rakic, P. Neurogenesis in adult primate neocortex: an evaluation of the evidence. Nat Rev Neurosci. 3 (1), 65-71 (2002).
- Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (7), 2415-2420 (2008).
- Hill, J. H., Chen, Z., Xu, H. Selective propagation of functional mitochondrial DNA during oogenesis restricts the transmission of a deleterious mitochondrial variant. Nat Genet. 46 (4), 389-392 (2014).
- Lentz, S. I., et al. Mitochondrial DNA (mtDNA) Biogenesis: Visualization and Duel Incorporation of BrdU and EdU Into Newly Synthesized mtDNA In Vitro. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 58 (2), 207-218 (2010).
- Tornoe, C. W., Christensen, C., Meldal, M. Peptidotriazoles on solid phase: [1,2,3]-triazoles by regiospecific copper(i)-catalyzed 1,3-dipolar cycloadditions of terminal alkynes to azides. J Org Chem. 67 (9), 3057-3064 (2002).
- Horwitz, H. B., Holt, C. E. Specific inhibition by ethidium bromide of mitochondrial DNA synthesis in physarum polycephalum. J. Cell Biol. 49, 546-553 (1971).
- Huberman, J. A. New views of the biochemistry of eucaryotic DNA replication revealed by aphidicolin, an unusual inhibitor of DNA polymerase alpha. Cell. 23 (3), 647-648 (1981).
- McClung, C., Hirsh, J. Stereotypic behavioral responses to free-base cocaine and the development of behavioral sensitization in Drosophila. Curr Biol. 8 (2), 109-112 (1998).
- Moore, M. S., et al. Ethanol intoxication in Drosophila: Genetic and pharmacological evidence for regulation by the cAMP signaling pathway. Cell. 93 (6), 997-1007 (1998).
- Dzitoyeva, S., Dimitrijevic, N., Manev, H. Gamma-aminobutyric acid B receptor 1 mediates behavior-impairing actions of alcohol in Drosophila: adult RNA interference and pharmacological evidence. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (9), 5485-5490 (2003).
- Koch, E. A., Spitzer, R. H. Multiple effects of colchicine on oogenesis in Drosophila: induced sterility and switch of potential oocyte to nurse-cell developmental pathway. Cell Tissue Res. 228 (1), 21-32 (1983).
