Introduction
Förutom det nukleära genomet, varje eukaryotisk cell innehåller också tusentals kopior av små cirkulärt DNA i den mitokondriella matrisen. Medan mitokondrie-DNA (mtDNA) kodar väsentliga underenheter av elektrontransportkedjan, är majoriteten av den mitokondriella proteomet, inklusive alla faktorer för replikation och transkription av mtDNA som kodas av det nukleära genomet. I motsats till det nukleära genomet som följer Mendels lagar om arv, djuret mitokondriella genomet ärvs enbart genom moderns härstamning. Därför är fundamentalt viktigt att förstå hur mtDNA är frodats och överförs från en generation till nästa genom den kvinnliga äggcellen. Det finns dock fortsatt debatt om hur mtDNA replikation regleras i den kvinnliga könsceller. Dessutom föreslår den allmänt accepterade mtDNA flaskhals teori för mtDNA växellåda som befolkningen i mtDNA i primordiala könsceller subsamplas till ett relativt litet antal During utveckling 1 2. Det innebär också att mtDNA replikation är tidsmässigt och rumsligt reglerad under oogenes. Följaktligen kommer in situ-detektion av mtDNA replikation under arvslinjeutveckling underlätta förståelsen av mekanismen för mtDNA arv.
Drosophila oogenes ger en genetiskt lätthanterlig system för att studera mtDNA replikation och transmission. I vart och ett av de två Drosophila äggstockarna, det finns 16-20 oberoende strängar av ägg kammare kallas ovarioles 3, som är funktionella enheter av äggproduktionen (se figur 1A). Varje ovariole innehåller en progressiv linjär organisationen av oogenes, där den främre spetsen består av en struktur som kallas germarium. Den germarium är indelad i fyra regioner som innehåller könsceller vid olika utvecklingsstadier. I region 1, nedärvda stamceller gå igenom asymmetrisk division för att producera dotterceller som kallas Cystoblasts. Region 2a innehåller cystoblasts som har avslutat sin slutliga division. Cystoblasts genomgå fyra omgångar av division producerar 16-cellgrupper. De 16 cellerna förblir förbundna med varandra genom cytoplasmatiska bryggor kallade ring kanaler. Endast en av cellerna förbinder sig att differentiering som oocyten, medan den andra 15 utvecklas som polyploida sjuksköterska celler. En väsentlig cytoplasmisk struktur, känd som fusome, föreslås för att underlätta med bildandet av ring kanaler, fastställa vilken cysta polaritet och sjuksköterskan cell äggcell interaktioner 4,5. Såsom cystor gå mot område 2b, cysta strukturer spänner över hela bredden av germarium, och bli mer associerad med follikelceller. De germarium strukturer avslutas med region 3 som innehåller det första spirande ägget kammare. Därefter ägget kamrarna monteras vid den bakre änden av germarium, som utvecklas genom ovariole i 14 morfologiskt distinkta steg. Tillväxten av äggcellen beror på sjuksköterskan cellerna, WHich transportproteiner, mRNA och endomembrane strukturer (t.ex. Golgi) via ring kanalerna in i äggcellen. Under Drosophila oogenes, visade det sig att en fraktion av mitokondrierna inom varje 16-cell-cysta var förknippade med det fusome, förflyttas genom ring kanalerna och levererades i den inre oocyt i en stor massa som kallas Balbiani kroppen 6. Detta fenomen föreslogs att bidra till kvalitetskontroll av mitokondrie arv genom kvinnliga äggstockar.
Detektion av mtDNA syntes bygger på inkorporeringen av märkta DNA-prekursorer i cellulärt DNA. Traditionellt har en nukleosid analog av tymidin 5-brom-2'-deoxiuridin (BrdU) användes för att märka mtDNA replikation i vävnadsodlingsceller 7,8. Emellertid uppvisar antikroppsbaserad BrdU-märkning flera begränsningar, särskilt för hel-mount vävnadsfärgning. En stor nackdel med BrdU-märkning är att det kräver DNA denaturering för att exponeraBrdU-epitop, så att den kan detekteras av anti-BrdU-antikropp. Provet måste behandlas under svåra denatureringsförhållanden såsom kemikalier (t ex saltsyra eller blandningar av metanol och ättiksyra), värme, eller digestion med DNas, som skulle kunna störa strukturen av provet och komplicera följande färgningsproceduren 9, 10.
Här, är en alternativ tymidinanalogen 5-etynyl-2'-deoxiuridin (EDU) användes för att märka den replikerande mitokondrie-DNA i Drosophila vuxna äggstockar. Denna metod är snabbare och mycket känslig. Edu är lätt införlivas i cellulär DNA under DNA-replikation. Följande detekteringen är baserad på en "klick" reaktion, en Cu (I) -catalyzed kovalent reaktion mellan den terminala alkynen grupp och en fluorescerande azid 10. Eftersom reaktionen inte kräver denaturering av provet, gör det god strukturell konservering. Vidare, storleken på färgämnet enzide är endast 1/500 av den hos en antikroppsmolekyl 10, vilket möjliggör snabb och effektiv penetrering av hel-mount vävnader. Vi har använt denna metod för att detektera mtDNA replikation under Drosophila oogenes och hittade en slående rumslig mönster i germarium regionen Drosophila äggstock 11, som leder oss att föreslå en replikationsberoende mtDNA selektiv arvsmekanismen. Vi presenterar här ett detaljerat protokoll på EDU märkning av mtDNA replikation i Drosophila äggstockar. För att visa tillämpningen av protokollet, testade vi också mtDNA replikation i en mtDNA mutant Drosophila (mt: COI T300I) 11, samt med olika behandling av mitokondriella uncouplers, som avleder den mitokondriella membranpotentialen och potentiellt störa mtDNA replikation.
Protocol
1. Tissue Insamling och Dissection
- I varje flaska innehåller torrjäst, flugor kultur 10 vuxen hona med 10 hanar för 2-3 dagar.
Notera: Att upprätthålla välnärda kvinnliga flugor kommer att förbättra den övergripande kvaliteten och utbytet av äggstocken produktion och underlätta dissektion. - Söva kvinnliga flugor på en koldioxid (CO 2) flyga pad.
- Under stereoskop, placera flera droppar RT-medium (Schneiders Drosophila-medium kompletterat med 10% fetalt bovint serum (FBS)) på en dissekera pad. Genomföra alla dissektion förfaranden i mediet för att hålla vävnaderna levande och friska.
- Ta en göds kvinnlig flyga med skarpa fin-nosed pincett vid sin nedre bröstkorgen. Använd en annan uppsättning av pincett för att rycka försiktigt längst bakre delen av farten tills vävnaderna i buken utsätts. Lossa de båda äggstockarna från andra vävnader (t.ex. tarmar).
Obs: Varje äggstocks visar en ogenomskinlig struktur som är komponerad av 16-20 bifogade ovarioles. - Att förhöja penetrationen av reagens öppnar äggstockarna genom att dra isär dem och passerar spetsarna på pincetten mellan varje ovariole ett par gånger. Håll ovarioles anslutna inom en äggstock att minimera förlust av vävnad under följande procedurer.
- Överför äggstockarna omedelbart en 1,5 ml mikrocentrifugrör innehållande 500 pl Schneiders Drosophila-medium med 10% FBS.
- Upprepa dissekering och samla 10-15 äggstockar i varje mikrocentrifugrör.
2. edu Labeling
- Aspirera mediet i varje rör, och ersätt med 500 pl Schneiders Drosophila-medium med 10% FBS innehållande 7 iM afidikolin.
Notera: afidikolin används för att blockera nukleär DNA-syntes genom att hämma DNA-polymeras α utan att påverka mtDNA replikering 7, 12. Det är möjligt att öka afidikolin koncentration upptill 70 ^ M för att uppnå bättre hämning. Stamlösningen av 3-30 mM afidikolin i DMSO kan lagras i mörker vid -20 ° C i upp till sex veckor. - För att hålla äggstockarna frisk, se till att de är nedsänkta i lösningar när du byter mediet. Använd Schneiders Drosophila-medium med 10% FBS genom steg 2,6.
- Inkubera äggstockar under 3 h vid RT på en bänk-top rocker med försiktig rotation.
- För läkemedelsbehandling, t.ex. mitokondriell frikopplare karbonyl cyanid 4-trifluorometoxi fenylhydrazon (FCCP), tillsätt lämplig koncentration av läkemedel (t.ex. 10 iM FCCP) i mediet efter två timmar av afidikolin behandling. Fortsätta att inkubera under ytterligare 1 timme.
- Ta bort mediet innehållande afidikolin med eller utan läkemedel. skölj hastigt äggstockarna med medelhög (afidikolin är inte nödvändigt) två gånger.
- Tillsätt 1 ml medium innehållande 10 | iM edu och 7 iM afidikolin och fortsätta incubating vid RT under 2 h. Lagra 10 mM edu stamlösning (i DMSO) vid -20 ° C.
- Ta bort mediet innehållande edu och afidikolin. Tvätta med medium (utan afidikolin) två gånger under 3 minuter vardera.
3. vävnadsfixering och Permeabilization
- Bered en 4% paraformaldehydlösning i fosfatbuffrad saltlösning (PBS, pH 7,4).
Obs: Vi använde kommersiellt tillgängliga paraformaldehyd lagras i förväg gjorde ampuller. Öppna en ny ampull och späd till 4% före användning.
VARNING: Formaldehyd är giftigt, det bör hanteras i ett dragskåp med huden och ögonskydd. - Fix äggstockar med 4% paraformaldehyd under 20 min vid RT under försiktig rotation.
- Avlägsna fixativet och tvätta äggstockar två gånger i 1 ml av 3% BSA i PBS under 5 minuter varje gång.
- Att permeabilisera vävnader, ta bort tvättlösningen och tillsätt 1 ml av 0,5% Triton X-100 i PBS. Inkubera vid RT i 20 min.
- Avlägsna permeabilization lösning och tvätta två gånger i 1 mlav 3% BSA i PBS.
4. edu Detection
Anmärkning: edu detektering är baserad på "klick" kemi, en Cu (I) -catalyzed [3 + 2] cykloaddition 13, som lägger till fluorescerande azider till terminalen alkynen grupp av ENE och den fluorescerande molekylen utsätts för efterföljande detektering. Eftersom Cu (I), som lätt oxideras till de icke-katalytiska Cu (II) arter, krävs för att katalysera reaktionen, är det rekommenderat att minska Cu (II) sulfat in situ för erhållande av Cu (I). Det vill säga, Cu (II) sulfat används i närvaro av ett reduktionsmedel, såsom askorbinsyra (häri "bufferttillsatsen") för att generera koppar (I).
- Innan experimentet förbereda verksamma lösningen enligt Alexa Fluor azid (Alexa Fluor 488 azid, Alexa Fluor 555 azid eller andra, beroende på den föredragna fluoroforen, som namnges som "färgämne azid" nedan), EDU reaktionsbuffert och EDU buffert tillsats enligt tillverkarensinstruktioner.
- Bered färgen azid i 70 pl DMSO. Förvara arbetslösning vid -20 ° C i upp till 1 år.
- Framställ färsk edu reaktionsbuffert genom att späda 10x EDU reaktionsbuffert med avjoniserat vatten.
Obs: Efter användning, förvara eventuellt kvarvarande 1x lösning vid 4 ° C. 1x Lösningen är stabil i upp till 6 månader. - Gör en 10x stamlösning av edu bufferttillsatsen genom att fullständigt lösa upp pulvret i 2 ml avjoniserat vatten.
Obs! Denna stamlösning är stabil i upp till ett år vid -20 ° C. Om lösningen utvecklar en brun färg, har det försämrats och måste kasseras.
- Förbered edu reaktions cocktail färska varje gång, och använd inom 15 minuter efter beredning. För att uppnå reproducerbara resultat, se till att reaktionskomponenterna hålls vid samma förhållanden.
- Göra färsk 1x edu buffra tillsatslösning genom att späda 10x stamlösning (framställd i steg 4.1.3) 1:10 i avjoniserat vatten. Använd denna ärolution på samma dag.
- Förbereda en ml edu reaktionscocktailen genom att kombinera följande ingredienser i nämnd ordning: 860 ^ il 1 x edu reaktionsbuffert, 40 | il CUSO4, 2,5 | il färgämne azid, 100 ^ il 1 x edu bufferttillsats.
Obs: Det är viktigt att ingredienserna tillsätts i syfte att säkerställa optimal prestanda.
- Ta bort PBS med 3% BSA och tillsätt 0,5 ml av edu reaktions cocktail till varje rör. Inkubera vid RT i 30 min med försiktig rotation. Håll proverna skyddas från ljus.
- Avlägsna edu reaktions cocktail och tvätta en gång med 1 ml av 3% BSA i PBS.
- Tvätta proverna en gång med 1 ml PBS.
5. Antikropp Labeling
Obs: Utför antikroppsmärkning efter edu färgning. Om inga ytterligare färgning önskas, kan en vidare till montering och avbildning direkt. Det är viktigt att proven skall skyddas från ljus i alla följande procedurer.
- Ta bort tvättlösningen. Blockera äggstockarna i 1 ml blockeringslösning innehållande 0,2% BSA och 0,1% Triton X-100 i PBS under 30 min.
- Avlägsna den blockerande lösningen och ersätta med primär antikropp utspädd i blockeringslösning (t.ex. mus ATP-syntas subenhet α antikropp, 1: 1000 utspädning). Inkubera i mörker vid 4 ° CO / N.
- Tvätta proverna med 1 ml av blockeringslösning 3 gånger, 10 min varje gång. För att minimera bakgrunden, tvätta två gånger under 30 min vardera. Avlägsna den blockerande lösningen.
- Inkubera med sekundär antikropp utspädd i blockeringslösning (t.ex. get-anti-mus-Alexa Fluor 568 sekundär antikropp, en: 200 spädning) under 2 h vid RT.
Obs: Använd en annan färg än den som är kopplad till edu. - Upprepa tvättstegen som utförs i steg 5,3.
- Skölj med 1 ml PBS en gång för att avlägsna detergenten.
6. Montering och Imaging
- Försiktigt bort all PBS och immediately täcker äggstockar med 50 pl monteringsmedium (med eller utan DAPI).
Notera: Använd ett monteringsmedel som inte härdar medan ovarioles håller på att separeras från varandra. Äggstockar kan lagras i monteringsmedium vid 4 ° C i upp till en vecka. - Skära av änden av en pipettspets och använda den för att överföra äggstockar försiktigt på ett objektglas.
- Helt separat varje ovariole med skarpa fin-nosed pincett under stereomikroskop. Ta bort anslutnings vävnader vid den bakre änden och etapp 14 eller mogna ägg kammare. De unga ägg kamrarna är vid den främre änden och öppet.
- Rikta in ägg kammare med pincett så att de inte överlappar varandra.
- Långsamt sänka en # 1,5 täckglas ovanpå proverna. Göra det möjligt för monteringsmedel för att polymerisera under flera timmar vid rumstemperatur. Täta med transparent nagellack.
- Bild glider nästa dag, eller förvara vid 4 ° C före avbildning.
- Visualisera i ett konfokalt mimikroskop med en 63X oljeimmersionsobjektiv. Fånga tredimensionella z-stackar bilder.
Obs: Det finns starka edu signal i senare skede ägg kammare och bakgrundsfluorescens i epitel manteln. När man granskar EDU märkning inom ett visst germarium bör man undvika germariums som överlappas av eller nära andra vävnader eller senare skede ägg kammare.
Representative Results
Det ovanstående protokollet möjliggör visualisering av punktat strukturer i samband med mitokondrier (Figur 1B-C), som tyder på mitokondrie-DNA-replikation under Drosophila oogenes. ENE puncta lokaliserade med mitokondrier markerade genom färgning för ATP-syntas alfa-subenheten (Figur 2). De observerade signalerna var frånvarande i äggstockar behandlade med etidiumbromid 11, en inhibitor för mtDNA replikation 14, validerar att dessa puncta faktiskt etikett repliker mtDNA.Aphidicolin användes för att inhibera nukleär DNA-färgning utan att påverka mtDNA replikation (figur 2). Utan afidikolin behandling intensiva EDU signaler märka kärnorna, och mtDNA puncta var knappt detekteras (Figur 3). Men i närvaro av afidikolin, kärnkraft inkorporering minskade dramatiskt och många puncta samband med mitokondrier observerades.
(Figur 1B). Men framför allt, visade mtDNA replikering en rumslig mönster i germarium. Såsom indikeras med antalet edu puncta, det finns en måttlig nivå av mtDNA replikation i region 1 i germarium, men nästan ingen edu inkorporering i region 2A (Figur 1C). Som cysta rör sig nedåt till region 2B i germarium, återupptogs mtDNA replikation och antalet edu puncta i den bakre cysta av region 2B var mycket högre än den i region 2A (Figur 1C). Specifikt intensiv EDU inkorporering koncentrerade runt ringen kanaler och fusome strukturer, som färgas av hu li tai shao (HTS) protein. mtDNA hålls replikera på en hög nivå i region 3 av germarium (Figur 1C)
För att demonstrera associationen av specific gener eller behandling med mtDNA spridning kan Drosophila äggstockar utsättas för genmanipulation eller läkemedelsbehandling. Vi behandlade äggstockar med olika koncentrationer av FCCP, en klassisk mitokondriell protonophore, som avleder mitokondriell membranpotential. Som en kontroll, DMSO hade ingen effekt på mtDNA replikation (figur 4A). Höga doser av FCCP (10 iM) nästan uttömda mtDNA replikation helt under germarium (Figur 4D). Trots lägre koncentration av FCCP (2 eller 5 M) hade en mindre inverkan på mtDNA replikation i region 1 men hämmade replikering i regioner 2B och 3 (Figur 4B-C), vilket tyder på områdena 2B och 3 är mer känsliga för mitokondriell störning, eller de upprätthåller relativt långsammare replikering kinetik. Ovanstående resultat indikerade att mtDNA replikation är associerad med mitokondriell aktivitet. Särskilt olika regioner i germarium reagerade olika på mitokondriell impairment.
Figur 1. mtDNA replikation under Drosophila oogenes. (A) Diagram av en Drosophila ovariole och en förstorad vy av den germarium. Den ovariole visar från vänster till höger, främre till bakre, successiva utvecklingsstadier av ägg kammare. I germarium, är fusome (röd), nedärvda stamceller (blå), mitokondrier (grön), framtida äggcell (streckad linje, som erkänns av positionering, fusome struktur och mitokondriella kluster), utveckling av cystor (persika) och fyra utvecklingsområden visas . (B) Representativa z-stack projektion av en vildtyp ovariole märkt genom edu och antikropp mot Hts-RC, en markör för ring kanaler och fusome. I närvaro av afidikolin var edu införlivas mtDNA (pilhuvuden) och kärnor (pilar). Skalstock, 10 | j, m.(C) Förstorad bild av germaria som beskrivs i den inramade regionen i B. De fyra utvecklingsområden anges. Skala bar, 5 pm 11. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. mtDNA replikation i Drosophila germarium visualiseras genom EDU inkorporering med afidikolin-behandling (A) -. (D) Representant konfokala avsnitt av en vildtyp germarium visar edu inkorporering (grön, b), mitokondrier, präglad av ATP-syntas alfasubenhet färgning (röd, C) och kärnor, märkt med DAPI-färgning (blå, D) med pre-inkubering med DNA-polymeras-α-inhibitor afidikolin. (A &# 39 ;-D ') En förstorad bild av den inramade området i (A), som visar EDU inkorporering (B'), mitokondrier (C ') och kärnor (D'). I närvaro av afidikolin, är kärn inkorporering (pilar) minskas och många puncta var lokaliserade inom mitokondrier (pilhuvuden). Skalstrecken, 10 ^ M. Siffran har ändrats från 11. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. mtDNA replikation knappt detekteras i Drosophila germarium utan afidikolin-behandling (A) -. (D) Representant konfokala avsnitt av en vildtyp germarium visar edu inkorporering (grön), mitokondrier, präglad avATP-syntas alfa-subenhet färgning (röd) och kärnor, märkt med DAPI färgning (blå) i frånvaro av DNA-polymeras-α-hämmare afidikolin den. (A'-D ') En förstorad bild av den inramade området i (A), som visar EDU inkorporering (B'), mitokondrier (C ') och kärnor (D'). Utan afidikolin var intensiva edu signaler etikett kärnor (pilar), och mtDNA puncta knappt detekteras. Skalstrecken, 10 ^ M. Siffran har ändrats från 11. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Mitochondrial frikopplare försämrar mtDNA replikation. Representativa z-stack projekt med vildtyp germarium behandlades med DMSO(A) eller det mitokondriella frikopplare FCCP vid koncentrationer av 2 ^ M (B), 5 ^ M (C), 10 ^ M (D) under edu inkorporering. Notera nedsatt EDU märkning region 2B behandlades med 2 iM FCCP (B), och i både regionen 2B och 3 behandlades med 5 iM FCCP (beskrivs i rutorna). Fyra utvecklingsområden visas. Pilar, kärn-DNA; pilspetsar, mtDNA. Skalstock, 10 | j, m. Siffran har ändrats från 11. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
Edu märkningen är en ny och effektiv metod för att detektera DNA-syntes i celler som förökar, som grundar sig på införlivandet och färgning av nukleosidanaloger i nyligen syntetiserat DNA. Denna metod är överlägsen metoden BrdU-märkning i det att den är snabbare och mycket känslig. Ännu viktigare, gör det möjligt för god strukturell konservering och effektiv edu-dye penetration av hela montering vävnader 9, 10. Historiskt sett som ett överlägset alternativ till BrdU märkning EDU märkning användes för att studera kärn DNA-replikation under S-fasen av cellcykeln. Afidikolin är en hämmare av DNA-polymeras α, som är den viktigaste polymeras för nukleär DNA-replikation på S-fas 12 15. mtDNA replikation utförs genom DNA-polymeras γ, som är okänslig för afidikolin-behandling. Därför behandling med afidikolin före och under edu inkubation signifikant mindre edu inkorporering i kärn-DNA. Det bordenoteras att afidikolin kan vara stabil under flera veckor om lämpligt lagras och effekten av afidikolin i hämma nukleärt DNA-replikation var variabel i våra händer. De ovarioles eller ägg kammare med stark nukleärt DNA märkning bör undantas från ytterligare dataanalyser.
mtDNA replikation kan lätt visualiseras som puncta i cytoplasman, vilket också ger ett enkelt sätt för att kvantifiera nivån av mtDNA replikation genom att räkna antalet edu puncta, normaliserad till den totala volymen av cytoplasman. Bildprogram kan tillämpas för att automatiskt identifiera edu puncta i mikroskopiska bilder, vilket är särskilt användbart för beräknings analyser av stora datamängder. Dock bör försiktighetsåtgärder vidtas, eftersom ofullständig hämning av nukleär DNA-replikation kan leda till ENE ingå i distinkta loci på kromosom och visas som puncta inuti kärnan. Även i andra fall, intensiteten i edu inkorporering i replicating mtDNA kan vara svag, medan bakgrunden och buller kan vara hög. Därför bör de enskilda parametrarna för automatiska bildanalyser noggrant definierade. Det rekommenderas också att bilderna ska undersökas med utbildade ögon för att se till att korrekt edu puncta identifieras.
Visualisering av nysyntetiserade mtDNA under Drosophila oogenes ger en möjlighet att undersöka hur mtDNA replikation regleras under fysiologiska eller patologiska tillstånd, genom att utföra experiment i flugor utsätts för en mängd olika farmakologiska eller genetiska störningar. I en tidigare studie visades EDU inkorporeringsanalys utförs i en mtDNA mutant Drosophila mt: COI T300I 11. Vidare att störa mitokondriell membranpotential, var äggstockar behandlade med olika koncentrationer av mitokondriell frikopplare FCCP eller 2,4-dinitrofenol (DNP) före edu inkorporering. Beroende på experimentsyfteoch läkemedelsegenskaper kan olika metoder användas för effektiv leverans. För vuxna flugor, kan läkemedel presenteras som en ånga (t.ex. etanol och kokain) 16,17 eller droger kan injiceras i buken, där det diffunderar snabbt genom hela kroppen 18. Den vanligaste praxis är att läkemedel tillsätts till flyga livsmedel eller en sackaros / läkemedels-mättade filterpapper. Till exempel, den inhibitor av mikrotubuli montering, kolchicin, matades till flugor för 2-3 dagar innan äggstock dissekering 19. Därför är det viktigt att utvärdera läkemedelstillförselmetod och välja lämpliga koncentrationer.
Att säkerställa en framgångsrik avbildning av mtDNA replikation i Drosophila äggstockar, måste flera viktiga steg noggrant utföras. Främst bevara livskraften och hälsa av äggstockarna under dissekering och EDU inkorporering är väsentliga (steg 1 och 2). Den Schneiders Drosophila-medium med FBS behöver värmas till RTföre användning. Man bör minimera direktkontakt mellan ägg kamrarna och dissekera verktyg eller pipettspetsar. Äggstockarna bör nedsänkas under lösningar hela tiden för att undvika uttorkning. Felhantering vävnaderna kan lätt leda till svag eller ingen fluorescenssignaler. Under vävnaden monteringssteg, bör ovarioles separeras från varandra och sprids ut på objektglas. Se till att ägg kamrarna inte staplas ovanpå varandra. Vi märkte att de ägg kamrarna bortom steget 14 visade lite edu inkorporering. Dessutom, på grund av den stora storleken, den sena skede ägg kammare ofta orsakar grann yngre ägg kammare att vara ur fokus. Det rekommenderas att det sena stadiet ägg kammare kasseras.
Här ger vi ett detaljerat protokoll för märkning replikera mtDNA i Drosophila vuxna äggstockar. Denna metod möjliggör enkel kvantifiering av mtDNA replikation under olika genetiska och farmakologiska störningar,och kommer att vara användbart för att dissekera mekanismerna bakom utvecklings mitokondriell biogenes och mtDNA arv.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Schneider’s Drosophila medium | Invitrogen | 21720-024 | |
| FBS | Invitrogen | 10100-147 | |
| Pair of Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Aphidicolin | Sigma | A0781 | Aliquot after dissolving in DMSO. Avoid repetitive thawing and freezing. Protect from light. May be used within 6 weeks after dissolving. |
| FCCP | Sigma | C2920 | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| Paraformaldehyde, 16% EM grade | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Formaldehyde is toxic; it should be handled in a fume hood with skin and eye protection. |
| PBS | KD Medical | RGF-3190 | |
| BSA | Sigma | A7030 | |
| Triton X-100 | Sigma | T9284 | |
| Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Imaging Kit | Invitrogen | C10337 | EdU, CuSO4, Alexa Fluor 488 azide, EdU reaction buffer and Edu buffer additive are included |
| Mouse ATP synthase subunit α antibody, (15H4C4) | MitoSciences | Ab14748 | 1:1,000 dilution |
| Mouse Hts antibody (clone RC) | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) | hts RC | 1:1,000 dilution |
| Goat anti-mouse Alexa Fluor 568 secondary antibody | Invitrogen | A-11004 | 1:200 dilution |
| Vectashield mounting medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1500 | |
| Glass coverslips, #1.5 22 mm x 22 mm | Fisher Scientific | 12-541-B | |
| Microscope slide | Fisher Scientific | 22-038-103 | |
| Nail polish | Elf | Many of the pigments used in nail polishes are fluorescent and leach into specimens. Only clear nail polish should be used. |
References
- Taylor, R. W., Turnbull, D. M. Mitochondrial DNA mutations in human disease. Nat Rev Genet. 6 (5), 389-402 (2005).
- Wallace, D. C., Chalkia, D. Mitochondrial DNA genetics and the heteroplasmy conundrum in evolution and disease. Cold Spring Harb Perspect Biol. 5 (11), a021220 (2013).
- Spradling, A. C. The development of Drosophila melanogaster. , Cold Spring Harbor Lab. Press. (1993).
- Riechmann, V., Ephrussi, A. Axis formation during Drosophila oogenesis. Curr Opin Genet Dev. 11 (4), 374-383 (2001).
- Lin, H., Yue, L., Spradling, A. C. The Drosophila fusome, a germline-specific organelle, contains membrane skeletal proteins and functions in cyst formation. Development. 120 (4), 947-956 (1994).
- Cox, R. T., Spradling, A. C. A Balbiani body and the fusome mediate mitochondrial inheritance during Drosophila oogenesis. Development. 130 (8), 1579-1590 (2003).
- Davis, A. F., Clayton, D. A. In situ localization of mitochondrial DNA replication in intact mammalian cells. J Cell Biol. 135 (4), 883-893 (1996).
- Iborra, F. J., Kimura, H., Cook, P. R. The functional organization of mitochondrial genomes in human cells. BMC Biol. 2, (2004).
- Rakic, P. Neurogenesis in adult primate neocortex: an evaluation of the evidence. Nat Rev Neurosci. 3 (1), 65-71 (2002).
- Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (7), 2415-2420 (2008).
- Hill, J. H., Chen, Z., Xu, H. Selective propagation of functional mitochondrial DNA during oogenesis restricts the transmission of a deleterious mitochondrial variant. Nat Genet. 46 (4), 389-392 (2014).
- Lentz, S. I., et al. Mitochondrial DNA (mtDNA) Biogenesis: Visualization and Duel Incorporation of BrdU and EdU Into Newly Synthesized mtDNA In Vitro. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 58 (2), 207-218 (2010).
- Tornoe, C. W., Christensen, C., Meldal, M. Peptidotriazoles on solid phase: [1,2,3]-triazoles by regiospecific copper(i)-catalyzed 1,3-dipolar cycloadditions of terminal alkynes to azides. J Org Chem. 67 (9), 3057-3064 (2002).
- Horwitz, H. B., Holt, C. E. Specific inhibition by ethidium bromide of mitochondrial DNA synthesis in physarum polycephalum. J. Cell Biol. 49, 546-553 (1971).
- Huberman, J. A. New views of the biochemistry of eucaryotic DNA replication revealed by aphidicolin, an unusual inhibitor of DNA polymerase alpha. Cell. 23 (3), 647-648 (1981).
- McClung, C., Hirsh, J. Stereotypic behavioral responses to free-base cocaine and the development of behavioral sensitization in Drosophila. Curr Biol. 8 (2), 109-112 (1998).
- Moore, M. S., et al. Ethanol intoxication in Drosophila: Genetic and pharmacological evidence for regulation by the cAMP signaling pathway. Cell. 93 (6), 997-1007 (1998).
- Dzitoyeva, S., Dimitrijevic, N., Manev, H. Gamma-aminobutyric acid B receptor 1 mediates behavior-impairing actions of alcohol in Drosophila: adult RNA interference and pharmacological evidence. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (9), 5485-5490 (2003).
- Koch, E. A., Spitzer, R. H. Multiple effects of colchicine on oogenesis in Drosophila: induced sterility and switch of potential oocyte to nurse-cell developmental pathway. Cell Tissue Res. 228 (1), 21-32 (1983).
