Een Repetitive Concussive Head Injury Model in Muizen

Introduction

Hersenschudding, ook wel mild traumatisch hersenletsel (mTBI), is de meest veelvuldig voorkomen van traumatisch hersenletsel (TBI) en treft miljoenen mensen in de Verenigde Staten. Hersenschudding kan lastig te diagnosticeren en er is geen specifieke behandeling voor hersenschudding. Er is een groeiende erkenning en enig bewijs dat milde mechanische trauma als gevolg van sportblessures, militaire bestrijding en andere fysiek boeiende bezigheden cumulatief en chronische neurologische gevolgen ^1,2 kan hebben. Echter, er is nog steeds een gebrek aan kennis over hersenschudding en hun effecten. De huidige methode beperkt de studies van de pathologie en de behandeling bij de mens omdat alleen neurologische evaluatie en beeldvorming zijn beschikbaar voor de klinische diagnose. Dierlijke modellen bieden een middel om hersenschudding te studeren op een efficiënte, rigoureus, en gecontroleerde wijze met de hoop op verdere diagnostiek en behandeling van mTBI.

Studies hebben aangepast traditionele TBImodellen zoals gecontroleerde corticale invloed (CCI), vloeistof-percussie effect (FPI), gewicht daling letsel en blast letsel aan mTBI te voeren en het stimuleren van lage letsel ernst door het veranderen van de parameters letsel. Deze modellen zijn gunstig te gebruiken vanwege hun vermogen om hersentrauma morfologisch vergelijkbaar met de klinische toestand repliceren; Maar ze hebben ook hun eigen beperkingen. De ernst van de schade veroorzaakt door een versnelling van de schade (gewicht drop) is vaak zeer variabel. De twee resultaten van het milde CCI - subarachnoïdale bloeding en focale contusie - zijn niet vergelijkbaar met de typische menselijke hersenschudding. CCI en FPI vereisen een craniotomie, die niet klinisch relevant, terwijl blast letsel is een meer omstreden model met betrekking tot de verschillende belichting positie en piek drukmetingen evenals variabele secundaire verwondingen tijdens de belichting ^_3-6. Een bijgewerkte concussive diermodel dat pre-klinisch onderzoek kan vertalen naar de klinische Setting is noodzakelijk onderzoek.

De kernvraag in het modelleren van licht traumatisch hersenletsel is om de experimentele letselernst, die het meest repliceert de schade in een klinische setting te definiëren. Onlangs, verschillende onderzoeksgroepen ontwikkelde de gesloten hoofdletsel of concussive hoofdletsel (CHI) model ^7-10. CHI is een modificatie van CCI zonder craniotomie, maar gebruikt toch een traditioneel elektronisch magnetisch effect systeem een ​​hoofd effect opleveren. Een CHI kan een hersenschudding, variërend van licht aanzetten tot matig door het aanpassen van de impact parameters. Verlies van bewustzijn (LOC) kan direct worden waargenomen na een botsing door het detecteren van een afname van de ademhalingsfrequentie of tijdelijke beëindiging van de ademhaling. De periode van LOC wordt gebruikt om de ernst van de schade te bepalen. Dit artikel is voorzien van een licht verbeterde en geactualiseerde versie van een repetitieve CHI (rCHI) model bij muizen, samen met een uitvoerige stap-voor-stap protocol en representatieve resultaten. De rCHI model onderzoekstrategieën eenopnieuw gunstig bepalen mTBI effecten en mogelijke behandelingen, vooral omdat er geen individueel diermodel kan imiteren alle hersenschudding-geïnduceerde pathologische veranderingen.

Protocol

Alle procedures werden uitgevoerd onder protocollen # 201207692 door de Institutional Animal Care en gebruik Comite van de Universiteit van Florida en in overeenstemming met de National Institutes of Health Guide voor de zorg en het gebruik van proefdieren goedgekeurd.

1. Animal Care

1. Gebruik de 3-4-maanden-oude mannelijke C57BL / 6J muizen. Zorg voor beddengoed, nestmateriaal, voedsel en water ad libitum. Houd de muizen in omgevingstemperaturen geregeld op 20-22 ° C met een constante 12-uur licht / 12 uur donker cycli.

2. Pre-impactie Voorbereiding

1. Bevestig een op maat gemaakte siliconen-rubber beklede metalen punt aan een elektromagnetisch stereotaxische effect apparaat. Controleer de vlakke bodem van de tip is evenwijdig aan het oppervlak van het probe uiteinde (Figuur 1A).
2. Verdoven de muis met 4% isofluraan anesthesie gevolgd door handhaving van 2,5% isofluraan. Controleer de verdoving via de stroommeter. Monitor de verdoving niveau totdat het dier bereikt een chirurgische niveau van anesthesie door het tonen van het verlies van pedaal terugtrekking reflex.
3. Zet de muis in een buikligging op een verwarmingselement. Gebruik een trechtervormige neuskegel de muis onder verdoving houden. Volledig scheren het hoofd met behulp van een trimmer. Gebruik petrolatum oogzalf op de ogen van de muis tot droog voorkomen terwijl onder verdoving.

3. Impact Parameters Instelling

NB: De impact systeem omvat een besturingskast om de impact parameters in te stellen, een actuator aan de impactie uit te voeren, en een digitale stereotactische frame met 3-beweging assen.

1. Pre-set de snelheid van het effect apparaat tot 4 m / sec en dwell time tot 240 msec op de bedieningskast.

4. Plaatsing van de Impact Center

1. Liep zachte verwarmingselement onder het lichaam van het dier om de lichaamstemperatuur nabij 39 ° C te houden. Monteer de muis in een stereotactische frame in een prone positie met de stompe uiteinden oor bars.
2. Verlaag de impact tip in de buurt van het hoofd van de muis door het bewegen van de Z-driver. Stel de vlakke effect uiteinde (9 mm diameter) door de X- en Y-drivers bewegen halverwege de doelcoördinaten boven de pijlnaad.
3. Controleer een rand van de impact tip verticaal evenwijdig aan een denkbeeldige horizontale lijn tussen de twee oren (figuur 1C). Het centrum effect komt overeen met de centrale pijlnaad halverwege interfrontal en lambdoid hechtingen (interaurale 9 mm voor interaurale 0 mm, lateraal 4,5 mm).

5. Impact Diepte instellen

1. Om correct in te stellen van de impact diepte, gebruik bijkomende sonde met de geïsoleerde siliconen-rubber beklede invloed tip vervangen.
2. Om ervoor te zorgen dat er geen verschuiving van de impact centrum na het inschakelen tips, stel de X- en Y-kanaal op het digitale stereotaxische bedieningspaneel op nul voordat u de tips.
3. Verplaats de probe tip naar het midden van de impact gebied door de X-en Y-drives met de hand te bewegen.
4. Clip contact sensor aan de staart van de muis.
5. Verplaats de impactor (Z rijden) naar beneden tot de punt van de sonde raakt het oppervlak van de impact website.
6. Stel de Z-kanaal op de stereotaxische bedieningspaneel op nul.
7. Verplaats de impact uiteinde naar het raakvlak van handmatig instellen X- en Y-drivers (niet nul knoppen op de digitale stereotaxische regelpaneel) tot X- en Y-drivers nul (indien het effect tip eerder geplaatst).
8. Trek de actuator door het bewegen van het uitschuiven van de schakelkast. Handmatig verplaatsen de impactor omlaag (Z bestuurder) van 4 mm.

6. Impact

1. Trigger het effect door te klikken op het effect schakelaar op de bedieningskast en het bereiken van een vervorming diepte van 4 mm.

7. Post-impactie

1. Meet de tijd van het effect tot de muis eerste ademhaling met een timer.
2. Zorg voor herstel alvorens terug te keren het dier terug in een schone kooi. Heeft een dier niet terug naar het gezelschap van andere dieren tot volledig hersteld.
3. Observeren en wegen van de muizen dagelijks. Wanneer de muizen tekenen van pijn, intraperitoneaal injecteren met Meloxicam 1 - 2 mg / kg om 12-24 uur.

8. Repetitive Impaction

1. Geef de muizen extra letsel op dagen 4, 7 en 10 na de aanvankelijke verwonding (72 uur interval tussen impacts).

9. Immunohistochemie (IHC)

1. transcardial perfusie
   1. Verdoven de muizen via intraperitoneale injectie met 200 m / kg pentobarbital.
   2. Evalueren en verzekeren chirurgische-plane anesthesie door een teen knijpen. secure de muis in rugligging door voorzichtig taping de voorpoten en achterpoten van een Styrofoam werkoppervlak in een zuurkast.
   3. Maak een incisie door de huid langs de thoracale middellijn van net onder de zwaardvormig proces om het sleutelbeen. Voeg twee extra incisies in de processus xiphoideus en verder langs de basis van de ventrale laterale ribbenkast.
   4. Open de borstholte en bloot het hart door te snijden door middel van de thoracale spieren en ribbenkast.
   5. Beveilig het kloppend hart met stompe pincet en een 1-2 mm incisie in de linker hartkamer.
   6. Steek een vlinder naald in de rechterboezem onmiddellijk. Begin de infusie van 20 ml zoutoplossing door het indrukken van de spuit langzaam.
   7. Overschakelen van zoutoplossing om 4% paraformaldehyde. Verder perfusie met 20 ml paraformaldehyde.
   8. Onthoofden de muis en verwijder de huid met een schaar. Isoleer de hersenen uit de schedel met een bot mes.
2. Cryostat snijden
   1. Insluiten hersenweefsel in optimale snij-temperatuur (LGO) formulering en bevriezen bij -80 ° C. Plaats de hersenen in de cryostaat in een sagittale richting. Snijd de hersenen secties 5 micrometer dik.
3. kleuring
   1. Droog de vriescoupes bij kamertemperatuur gedurende 1 uur.
   2. Incubeer de glaasjes met 100 gl 2% geitenserum en 0,1% Triton X-100 in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) gedurende 1 uur bij KT.
   3. Was de dia 3 maal met 300 pi PBS. incubeer dan de dia's met anti-GFAP (1: 200) of anti-ferritine-antilichaam (1: 200) afzonderlijk een nacht bij 4 ° C.
   4. Was de dia 3 maal met 300 pi PBS. incubeer vervolgens dia gedurende 2 uur bij kamertemperatuur met biotine-geconjugeerd secundair antilichaam.
   5. Was de dia 3 maal met 300 pi PBS. incubeer daarna de glaasjes met avidine-biotine complex (ABC) oplossing (1:50) bij kamertemperatuur gedurende 30 min.
   6. Was de dia 3 maal met 300 pi PBS. Incubeer daarna in 3,3'-diaminobenzidine (DAB) substraatoplossing (50 ml PBS, 10 gl H ₂ O _2, 10 mg DAB pil, filter alvorens) gedurende 5-8 min. Let op de dia's onder de microscoop tot de positieve cellen verschijnen.
   7. Spoel de dia's in langzaam stromend leidingwater gedurende 5 minuten. Clean dia's met een lab-wipe. Monteer vervolgens de secties met montage medium en dekglaasje.

Representative Results

In dit model (Figuur 1 AC), waren er korte periodes van hijgend en ondiepe ademhaling. Een verlies van bewustzijn (onbewuste) wordt gedefinieerd als een daling van de ademhaling of transiënte beëindiging van de ademhaling voor hervatting van de normale ademhaling. Invloed op het midden van het hoofd veroorzaakt kortdurende bewusteloosheid (7,5 ± 4,7, 7,8 ± 5,5, 10,2 ± 8,8, 9,5 ± 8,0 sec bij iedere stoot afzonderlijk, figuur 1D). Muizenhersenen toonde normale morfologie van H & E histologische kleuring, die geen duidelijke structurele laesies of weefselschade als gevolg van de impact (Figuur 2A) aangegeven. In reactie op TBI zijn astrocyten bekend dat bepaalde veranderingen waaronder activatie, proliferatie of reactieve gliosis ^11,12 ondergaan. Verhoogde gliale fibrillaire zuur eiwit (GFAP) positieve cellen met grote cellichamen en dikke synapsen zijn de geactiveerde astrocyten. de corpus callosum van rCHI muizenhersenen liet duidelijke tekenen van astrocyten activatie op 7 dagen na de laatste effect (Figuur 2B).

Microbleeds in het weefsel zijn gemeenschappelijk in mTBI en kunnen leiden tot het vrijkomen van ijzer uit hemoglobine ^13. Ijzerstapeling in het serum kan worden gedetecteerd door ferritine proeven in klinische settings ^13. Het ferritine immunopositieve cellen in de muis cortex bleken één dag na de laatste effect en duurde ten minste zeven dagen, wat suggereert dat meerdere verstoppingen kan leiden tot corticale microbleeds (figuur 2C).

Figuur 1. een muismodel van Repetitive Concussive Head Injury. (A) Naar maat gemaakte 1 mm dik silicone rubberen tip meten van 9 mm in diameter met een sonde. (B) Een muis is mounted in een stereotactische frame in een buikligging met een zachte verwarming pad onder het lichaam. (C) De impact centrum positionering. De rand van de impact tip is verticaal parallel aan een denkbeeldige horizontale lijn tussen de twee oren. De impact centrum komt overeen met halverwege tussen interfrontal en lambdoid hechtingen (interaurale 9 mm voor interaurale 0 mm, zijdelings 4,5 mm). (D) Apneu wordt gedefinieerd als korte periodes van voorbijgaande beëindiging van de ademhaling. De gemiddelde en SD worden getoond in het onderste paneel. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2. Histologie voor Repetitive Concussive Head Injury. (A, links) Een muis hersenen werd verwijderd na perfusie met 4% paraformaldehyde. Geen weefselschade werd gevonden. (B) Verhoging van de biochemische marker voor gliose (GFAP) in het corpus callosum 7 dagen na de laatste blessure. Schaal bar = 200 urn. (C) door immunohistochemie het ferritine-H-keten werd gevonden in de hersenen cortex tot expressie na beschadiging. Het insert foto vertegenwoordigen vergroot positieve cellen. Schaal bar = 200 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussion

Om hersenletsel morfologisch vergelijkbaar met de klinische toestand na te bootsen, zijn post-hersenschudding symptomen verwacht. Post-hersenschudding symptomen over het algemeen zijn hoofdpijn, duizeligheid, vermoeidheid, geheugen en slaapproblemen, moeite met concentreren evenals angst en depressieve stemming. Aangezien somatische symptomen nog niet meetbaar in diermodellen kunnen zijn, worden de wijzigingen van motorische en cognitieve functies en emotioneel gedrag als criteria voor rationeel hersenschudding evaluatie in diermodellen. In een eerder gerapporteerde studie werd aangetoond dat de rCHI muismodel veroorzaakt gebreken in ruimtelijk leren, geheugen, en angst ^8. Belangrijker is dat de rCHI model gebruikt in dit protocol is de klinische setting zonder invasieve hersenletsel of hersenbeschadiging structuur breuk, beide kunnen leiden tot bloeden, bloedingen, oedeem of acuut verlies celdood / weefsel.

De volgende zijn de belangrijkste tips voor het succesvol modelleren consistente concussion / mTBI met behulp van een elektronisch magneet invloed systeem:

Vermijd een tweede hersenletsel direct na de eerste hersenletsel dat door beweging kan worden veroorzaakt tijdens de botsing. De muis hoofd kan iets naar beneden tijdens de botsing te verplaatsen. Om een ​​hersenkneuzing veroorzaakt door een snelle beweging tegen de harde grond of het hoofd uitrekken te voorkomen, moet een zachte verwarming pad onder de muis lichaam worden gebracht. Het hoofd en het lichaam moet ook horizontaal worden gehouden. Daarnaast gebruiken stompe-end oor bars om de muis hoofd in de stereotactische kader vast te stellen, en ze niet voegen in de gehoorgang. Dit beschermt de muis van de schade veroorzaakt door de scherpe uiteinden tijdens de beweging.

De juiste positie van de impact centrum en vaststelling van de nul. In tegenstelling tot de open hoofd letsel, de impact tip positionering is relatief moeilijk. De omvang van de impact punt en de impact centrum van invloed op de ernst van het letsel en laesies. Op basis van de hersenen van muizen anatomie, is de impact centrum ontworpen om te voldoen aan halverwegetussen interfrontal en lambdoid hechtingen (interaurale 9 mm voor interaurale 0 mm, zijdelings 4,5 mm). Aldus wordt een geoptimaliseerde 9 mm tip vereist. De impact tip moet worden aangepast aan de doelcoördinaten boven de pijlnaad midden en een rand van de impact tip uitsluitend verticaal evenwijdig aan een denkbeeldige horizontale lijn tussen de twee oren (figuur 1C). De geïsoleerde effect tip met een siliconen rubber coating blokkeert de aanraaksensor en voorkomt dat de impact diepte-instelling. Een sonde nodig is en parallel met het oppervlak van de knop op de gevolgen tip. Het centrum van het effect wordt aangepast aan de sondepunt raken plaats door bediening van de stereotaxische instrument. Schrobben het hoofd met een zoutoplossing verhoogt de electro-gevoeligheid. Bovendien, de probe ontworpen verwijderbare of de hersenen niet beschadigen tijdens de botsing. Een alternatieve manier is om twee uiteinden van dezelfde lengte te bouwen; een tip gecoat met siliconen rubber en de andere tip zou metaal, die zal wordengebruikt als sonde. De twee uiteinden worden geschakeld tussen positionering en beïnvloedende.

Monitor kort bewusteloos symptomen van de muis direct na een impact. Zoals hierboven besproken, de meeste post-hersenschudding symptomen zijn moeilijk direct te observeren in een laboratoriummuis diermodel. mTBI patiënten kunnen een kort verlies van bewustzijn ervaren na het letsel. Om de zichtbare verwondingen parameters vast te stellen, een kort verlies van bewustzijn was een symptoom gebruikt om de geldigheid van deze concussive TBI model te evalueren. Verlies van bewustzijn (LOC) wordt normaal gebruikt als criteria om de ernst van het letsel bij TBI patiënten te classificeren. In de meeste sport-gerelateerde hersenschudding, de duur van de LOC is minder dan één minuut ^14. Door het optimaliseren van de experimentele condities, zoals botssnelheid en tijd stilstaan, LOC minder dan 10 seconden na een botsing. De optimale effect voorwaarde is een 4 mm effect diepte, 240 msec tijd wonen, en 4 m / s botssnelheid. Verhoogde botssnelheid en wonentijd kan acute verhoogde intracraniële druk te veroorzaken over een grote hoeveelheid tijd, die onmiddellijk kan leiden tot ernstig hersenletsel of de dood van respiratoire depressie. Muizen zal lichaamsgewicht verliezen na elke botsing, maar zal gewichtstoename na 72 uur van herstel. 72 uur repeterende intervallen worden gekozen om een ​​herstelperiode voor geblesseerde sporters na te bootsen alvorens terug te keren naar hun sport.

Naast het verlies van bewustzijn en ademhalingsproblemen, kan de kliniek symptomen van een hersenschudding omvatten convulsies, hoofdpijn, duizeligheid, misselijkheid en braken. In model, kunnen de hersenen pijn in de meerderheid ongemakkelijke symptoom voor de dieren. Conditiescore en pijn categorie beschrijving moet worden gebruikt als humane eindpunten. Daarnaast moeten andere specifieke neurologische eindpunten zoals ongecontroleerde aanvallen, spontane cirkelen gedrag, verlies van evenwicht en niet in staat om te lopen of staan ​​worden beschouwd als rCHI-specifieke humane eindpunten. Aangezien dit is een milde blessure model, normaal geen significant tekenen van pijn worden waargenomen na elke impact. Pijnstillers zijn meestal niet nodig op dit niveau van hersenletsel. Dit protocol bevat gedetailleerde belangrijke stappen voor het modelleren van een zich herhalend concussive licht traumatisch hersenletsel. De snelheid en diepte van elk effect kan worden aangepast aan de gewenste ernst van de schade. Dit model maakt gebruik van een elektronisch magneet invloed systeem om effecten te leveren. Het is stabiel met een nauwkeurig gecontroleerde snelheid, verblijftijd, en vervorming diepte. Omdat het een gesloten hoofdletsel zonder craniotomie, is het onmogelijk om muizenhersenen effect middels stereotactische coördinaten exact positioneren. Tevens schakelen de impact / meetpunten kan leiden tot een crash de verschuiving, die de belangrijkste oorzaak van inconsistente verwondingen. Gezien de diffuse letsel en hersenschudding bleek zoals verwacht, nauwkeurig en gemakkelijk te bedienen dit model blijft.

Dit model is gunstig om voor de nauwkeurigheid en eenvoud bij het bepalen van de effecten van de botsing-gerelateerde mild hersenletsel, met name sport-gerelateerde hersenschudding. Het dient als een platform voor preklinische studies, zoals het verkennen van diagnostische en prognostische biomarkers, evenals het testen van medische hulpmiddelen, geneesmiddelen en gentherapie oplossing. Dit model kan ook worden gebruikt voor de studies van chronische traumatische encefalopathie (CTE), dat momenteel alleen diagnosticeren via de post-mortem neuropathologisch onderzoek.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
anesthesia machine	Eagle Eye Anesthesia, Inc	Model 150	anesthesia
Electromagnetic Impactor	LeicaBiosystems	Impact One Stereotaxic Impactor	perform impaction
Digital Stereotaxic instrument	LeicaBiosystems	39462501	mount mouse and positioning tips
Sicilone rubber-coated metal tip	Precision Tool & Engineering, Gainesvill FL	custom-made	impact tip
Lithium Ion All-in-One Trimmer	WAHL Home Products	9854-600	shave mouse hair
paper clips	custom-made		probe tip
Cotton tipped applicators	MEDLINE	MDS202055	scrub head with saline
Tissue Tek O.C.T.	ASKURA FINETEK USA INC	4583	tissue embedding
anti-GFAP	Dako	CA93013	antibody for IHC
anti Ferritin	Sigma	F6136	antibody for IHC
VECTASTAIN Elite ABC  kit	Vector laboratories	PK-6100	IHC detection system
Permount Mounting Medium	Fisher Scientific	SP15-100
Aperio XT ScanScope scanner	Leica Microsystems Inc,		slides scanning
Leica AutoStainer XL	Leica the pathology Company	ST2010	H&E staining
DAB	sigma	D3939	IHC detection system