Introduction
Concussão, também chamado de leve lesão cerebral traumática (mTBI), é a ocorrência mais frequente de lesão cerebral traumática (TBI) e afeta milhões de pessoas em Estados Unidos. Concussões podem ser difíceis de diagnosticar e não há nenhuma cura específica para concussão. Há um crescente reconhecimento e alguma evidência de que trauma mecânico leve resultante de lesões desportivas, combate militar, e outras atividades fisicamente atraentes podem ter consequências neurológicas cumulativos e crônicos 1,2. No entanto, ainda há uma falta de conhecimento sobre concussões e seus efeitos. metodologia atual restringe os estudos de patologia e tratamento em seres humanos uma vez que apenas a avaliação neurológica e avaliação por imagem estão disponíveis para o diagnóstico clínico. Os modelos animais proporcionam um meio para estudar abalos de uma maneira eficiente e rigoroso, controlado e com a esperança de ainda mais o diagnóstico e tratamento de mTBI.
Estudos têm adaptado TCE tradicionalmodelos como o impacto cortical controlado (CCI), o impacto por percussão fluida (FPI), lesão queda de peso e lesão física por explosão de realizar mTBI e estimular gravidades baixos de ferimento, alterando os parâmetros de lesão. Estes modelos são benéfico de usar devido à sua capacidade de se replicar trauma cerebral morfologicamente semelhante à condição clínica; no entanto, eles também têm as suas próprias limitações. A gravidade da lesão induzida por uma lesão aceleração (queda de peso) é muitas vezes altamente variável. Os dois resultados do CCI leve - hemorragia subaracnóide e contusão focal - não são comparáveis com os abalos humanas típicas. CCI e FPI exigem uma craniotomia, que não é clinicamente relevante, enquanto a lesão física por explosão é um modelo mais controversa no que diz respeito à posição da exposição e da pressão de pico diferentes medidas, bem como a lesão secundária variável durante a exposição 3-6. Um modelo animal de concussão atualizada que podem traduzir a investigação pré-clínica no setti clínicang é necessário em investigação.
A questão-chave na modelagem de TCE leve é definir a gravidade da lesão experimental, que replica mais se aproxima da lesão em um ambiente clínico. Recentemente, diferentes grupos de pesquisa desenvolveu o traumatismo craniano fechado ou ferimento na cabeça de concussão (CHI) modelo 7-10. CHI é uma modificação de ICC sem uma craniotomia, mas ainda utiliza um sistema electrónico de impacto magnética tradicional para gerar um impacto da cabeça. A CHI pode induzir uma concussão variando de leve a moderada, ajustando os parâmetros de impacto. A perda de consciência (LOC) pode ser observado imediatamente após o impacto através da detecção de uma diminuição na taxa de respiração ou a cessação temporária da respiração. O período de LOC é utilizada para determinar a gravidade da lesão. Este trabalho inclui uma versão ligeiramente melhorada e actualizada de um modelo repetitivo CHI (rCHI) em ratos, juntamente com um protocolo detalhado passo-a-passo e resultados representativos. O rCHI estratégias modelo de investigação are benéfica para determinar efeitos mTBI e tratamentos potenciais, especialmente porque não existe um modelo animal individual capaz de imitar todas as alterações patológicas induzidas por concussão.
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Protocol
Todos os procedimentos foram realizados sob protocolos # 201207692 aprovado pelo Comitê de Cuidado e Uso Institucional animal da Universidade da Flórida e de acordo com o National Institutes of Health Guide para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório.
1. Animal Care
- Use 3-4 meses de idade, machos C57BL / 6J. Fornecer roupa de cama, material de nidificação, alimentação e água ad libitum. Mantenha os ratos em ambientes com temperaturas controladas a 20 - 22 ° C com 12 horas de luz / 12 horas ciclos escuros constantes.
2. Pré-impacção Preparação
- Anexar uma ponta de metal de silicone revestido de borracha feitos sob medida para um dispositivo de impacto estereotáxica eletromagnética. Certifique-se a parte inferior plana da ponta é paralela à superfície da ponta da sonda (Figura 1A).
- Anestesiar o mouse com 4% de isoflurano seguido de anestesia de manutenção de 2,5% de isoflurano. Verifique a anestesia através do medidor de vazão. monitor o nível de anestesia até que o animal atinge um nível cirúrgico de anestesia, mostrando a perda do reflexo interdigital.
- Coloque o mouse em uma posição de bruços em uma almofada de aquecimento. Use um cone de nariz em forma de funil para manter o rato sob anestesia. Completamente raspar a cabeça, usando um aparador. Use vaselina pomada oftálmica nos olhos do rato para evitar a secura e sob anestesia.
3. Parâmetros de Impacto Ambiente
NOTA: O sistema de impacto inclui uma caixa de controle para definir os parâmetros de impacto, um actuador para realizar a impactação, e um quadro estereotáxico digital com 3 eixos de movimento.
- Pré-definir a velocidade do dispositivo de impacto a 4 m / s e o tempo de paragem de 240 ms sobre a caixa de controlo.
4. Posicionamento do Centro de Impacto
- Coloque uma almofada de aquecimento suave sob o corpo do animal para manter a temperatura corporal próximo de 39 ° C. Montar o mouse em um quadro estereotáxico em um prone posição com as barras de ouvido blunt-end.
- Abaixe a ponta impacto perto da cabeça do rato movendo o Z-motorista. Ajuste a ponta impacto plana (9 mm de diâmetro), movendo o X e Y motoristas meio caminho para as coordenadas do alvo acima da sutura sagital.
- Certifique-se de uma extremidade da ponta de impacto é verticalmente paralelo a uma linha horizontal imaginária desenhada entre as duas orelhas (Figura 1C). O centro de impacto corresponde ao meio do caminho sutura sagital central, entre suturas interfrontal e lambdóide (interaurais 9 mm para interaurais 0 mm, lateral 4,5 mm).
5. Impacto ajuste de profundidade
- Para configurar correctamente a profundidade do impacto, use ponta da sonda adicional para substituir a ponta impacto revestido de borracha de silicone isolados.
- Para se certificar de que não há deslocamento do centro de impacto após dicas de comutação, definir o X e Y canal no painel de controle estereotáxico digitais para zero antes de mudar as pontas.
- Mova o prove ponta para o centro da área de impacto movendo manualmente os X e Y.-drives.
- sensor de contato clipe para a cauda do rato.
- Mova o pêndulo (unidade Z) para baixo até a ponta da sonda toca a superfície do local do impacto.
- Defina o canal Z no painel de controle estereotáxico para zero.
- Mova a ponta impacto de volta para a área de impacto ajustando manualmente X e Y drivers (não os botões de zero no painel de controle estereotáxico digital) até que X e Y motoristas são zero (onde a ponta impacto foi posicionado anteriormente).
- Retrair o atuador movendo a chave de retração na caixa de controle. mover manualmente o pêndulo para baixo (driver Z) por 4 mm.
6. Impacto
- Desencadear o impacto clicando no botão impacto sobre a caixa de controle e atingir uma profundidade de deformação de 4 mm.
7. Pós-impactação
- Medir o tempo do impacto, até a primeira respiração do mouse usando um temporizador.
- Permitir a recuperação antes de retornar o animal de volta em uma gaiola limpa. Não devolva um animal para a companhia de outros animais até que esteja totalmente recuperado.
- Observe e pesar os ratos diariamente. Se os ratos mostram sinais de dor, por via intraperitoneal com meloxicam injecta-a 1 - 2 mg / kg a cada 12-24 horas.
8. Impactação repetitivo
- Dê os ratos lesões adicionais nos dias 4, 7 e 10 após a lesão inicial (intervalo de 72 horas entre os impactos).
9. Imuno-histoquímica (IHC)
- perfusão transcardial
- Anestesiar os ratos por meio de injecção intraperitoneal com 200 m / kg de pentobarbital.
- Avaliar e assegurar a anestesia cirúrgica plano por uma pitada dedo do pé. Secure o mouse na posição supina gravando suavemente as patas dianteiras e as patas traseiras para uma superfície de trabalho de isopor dentro de uma Cobertura de vapores químicos.
- Faça uma incisão através da pele ao longo da linha média torácica a partir de apenas abaixo do apêndice xifóide até a clavícula. Faça duas incisões na pele adicionais no processo xifóide e prossiga ao longo da base da caixa torácica ventral lateralmente.
- Abrir a cavidade torácica e expor o coração, cortando através da musculatura torácica e caixa torácica.
- Fixe o coração batendo com uma pinça sem corte e fazer uma 1 - incisão de 2 mm de ventrículo esquerdo.
- Imediatamente insira uma agulha de borboleta para o átrio direito. Comece a infusão de solução salina 20 ml, empurrando a seringa lentamente.
- Mudar de solução salina a 4% paraformaldeído. Continue a perfusão com 20 ml de paraformaldeído.
- Decapitar o mouse e remover a pele com uma tesoura. Isolar o cérebro do crânio utilizando um cortador de osso.
- Cryostat seccionamento
- tecidos cerebrais incorporar em temperatura de corte (OCT) formulação e congelamento ideal a -80 ° C. Colocar o cérebro no criostato com uma orientação sagital. seções do cérebro corte de 5 mm de espessura.
- coloração
- Secam-se as secções congeladas à temperatura ambiente durante 1 h.
- Incubar as lâminas com 100 ul de soro de cabra 2% e 0,1% de Triton X-100 em fosfato salino tamponado (PBS) durante 1 h à TA.
- Lavar as lâminas 3 vezes com 300 ul de PBS. Em seguida, as lâminas incubar com anti-GFAP (1: 200) ou anticorpo anti-ferritina (1: 200) em separado durante a noite a 4 ° C.
- Lavar as lâminas 3 vezes com 300 ul de PBS. Em seguida, as lâminas incubar durante 2 horas à temperatura ambiente com anticorpo secundário conjugado com biotina.
- Lavar as lâminas 3 vezes com 300 ul de PBS. Em seguida, incubar as lâminas com solução de complexo avidina-biotina (ABC) (01:50) à temperatura ambiente durante 30 min.
- Lavar as lâminas 3 vezes com 300 ul de PBS. Em seguida, incuba-se 3,3'-diaminobenzidina solução (DAB) de substrato (50 ml de PBS, 10 ul de H 2 O 2, 10 mg de DAB pílula, filtro antes de usar) para 5-8 min. Observe as lâminas sob o microscópio até as células positivas aparecem.
- Lavar as lâminas em lenta água corrente da torneira durante 5 min. lâminas limpas com um laboratório-wipe. Em seguida, montar as seções com meio de montagem e lamela.
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Representative Results
Neste modelo (Figura 1 AC), houve breves períodos de respiração ofegante e rasas. A perda de consciência (inconsciente) é definida como uma diminuição na taxa de respiração ou cessação temporária da respiração antes de retomar a respiração normal. Um impacto no centro da cabeça provocada inconsciência de curto prazo (7,5 ± 4,7, 7,8 ± 5,5, 10,2 ± 8,8, 9,5 ± 8,0 seg a cada impacto separadamente, Figura 1D). Cérebro do rato apresentaram morfologia normal, H & E coloração histológica, que não indicou óbvio lesões ou tecidos estruturais danos resultantes do impacto (Figura 2A). Em resposta a TBI, os astrócitos são conhecidas por sofrerem alterações certas incluindo a activação, proliferação, ou gliose reactiva 11,12. Aumento de proteína glial fibrilar (GFAP) células positivas ácidas com corpos de grandes células e sinapses grossos são os astrócitos activados. o corpus caloso a partir de cérebros de rato rCHI mostraram sinais evidentes de activação de astrócitos em 7 dias após o último impacto (Figura 2B).
Microbleeds no tecido são comuns em mTBI e podem conduzir à libertação de ferro da hemoglobina 13. A sobrecarga de ferro no soro podem ser detectados por testes de ferritina em contextos clínicos 13. As células imunopositivas ferritina no córtex do rato foram encontrados um dia após o último impacto e durou, pelo menos, sete dias, sugerindo que múltiplos impactações pode resultar em micro-hemorragias cortical (Figura 2C).
Figura 1. A Mouse Model of repetitivo Concussive Head Injury. (A) 1 mm de espessura de silicone ponta revestida de borracha feito sob medindo 9 mm de diâmetro com uma ponta de prova. (B) Um rato é mounted em um quadro estereotáxico em uma posição propensa com uma almofada de aquecimento suave sob o corpo. (C) O posicionamento do centro impacto. A extremidade da ponta de impacto é verticalmente paralelo a uma linha horizontal imaginária desenhada entre os dois ouvidos. O centro de impacto corresponde a meio caminho entre suturas interfrontal e lambdóide (interaurais 9 mm para interaurais 0 mm, lateral 4,5 mm). (D) A apnéia é definida como breves períodos de cessação temporária da respiração. Média e desvio padrão são mostrados no painel inferior. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Histologia para repetitivo Concussive Head Injury. (A, esquerda) Um cérebro de ratinho foi removido, após a perfusão com paraformaldeído a 4%. Nenhum dano tecidual foi encontrado.
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Discussion
Para imitar lesões cerebrais morfologicamente semelhantes ao quadro clínico, os sintomas pós-concussão são esperadas. sintomas pós-concussão geralmente incluem dores de cabeça, tonturas, vertigens, fadiga, problemas de memória e de sono, dificuldade de concentração, bem como a ansiedade e humor deprimido. Como os sintomas somáticos pode ainda não ser mensurável em modelos animais, as mudanças da função motora e cognitiva e comportamento emocional são usados como critérios para avaliar racionalmente concussão em modelos animais. Em um estudo publicado anterior, foi mostrado que o modelo do rato rCHI induz défices na aprendizagem espacial, memória e ansiedade 8. Mais importante, o modelo rCHI utilizados no presente protocolo representa clínica sem lesão cerebral invasiva ou estrutura do cérebro fractura, ambas as quais podem resultar em sangramento, hemorragia, edema, ou perda da morte de células / tecido aguda.
A seguir, são dicas importantes para modelar com sucesso concussio consistenten / mTBI utilizando um sistema de impacto ímã eletrônico:
Evitar uma segunda lesão cerebral directamente a seguir à primeira lesão cerebral que pode ser causado pelo movimento durante o impacto. A cabeça de rato pode mover-se ligeiramente para baixo durante o impacto. Para evitar uma contusão cerebral causada por um movimento rápido contra chão ou na cabeça alongamento, uma almofada de aquecimento suave deve ser colocado por baixo do corpo do rato. A cabeça eo corpo também deve ser mantido horizontal. Além disso, usar barras de ouvido blunt-end para corrigir o cabeça de rato na moldura estereotáxica, e não inseri-los dentro do canal auditivo. Isso protege o mouse do prejuízo causado pelas pontas afiadas durante o movimento.
Corretamente posicionar o centro de impacto e estabelecer a zero. Ao contrário de ferimento na cabeça aberta, o posicionamento da ponta impacto é relativamente difícil. O tamanho da ponta do impacto e do centro de impacto afetar a gravidade da lesão e lesões. Com base na anatomia do cérebro do rato, o centro de impacto é projetado para corresponder a meio caminhoentre suturas interfrontal e lambdóide (interaurais 9 mm para interaurais 0 mm, lateral 4,5 mm). Assim, uma ponta optimizado 9 milímetros é necessária. A ponta de impacto deve ser ajustado para o alvo coordena a meio caminho acima da sutura sagital, e uma extremidade da ponta de impacto deve ser verticalmente paralelo a uma linha horizontal imaginária desenhada entre as duas orelhas (Figura 1C). A ponta impacto isolado com uma borracha de silicone blocos de revestimento do sensor de contato e impede a configuração de profundidade impacto. A ponta da sonda é necessária e deve ser paralela à superfície do botão na ponta de impacto. O centro do impacto é ajustada para o local de tocar ponta da sonda através do funcionamento do instrumento estereotáxico. Esfregando a cabeça com solução salina aumenta a electro-sensibilidade. Além disso, a sonda é removível ou concebidos para não ferir o cérebro durante o impacto. Uma forma alternativa é a construção de duas pontas com o mesmo comprimento; uma ponta revestida com borracha de silicone e a outra ponta seria de metal, que seráusado como uma ponta da sonda. As duas pontas devem ser alternado entre posicionamento e impactante.
Monitorar breves sintomas inconscientes do rato imediatamente após um impacto. Como discutido acima, a maioria dos sintomas pós-concussão são difíceis de observar imediatamente num modelo animal do rato de laboratório. pacientes mTBI podem experimentar uma breve perda de consciência após a lesão. Para estabelecer os parâmetros de lesões visíveis, uma breve perda de consciência era um sintoma utilizado para avaliar a validade deste modelo TBI concussão. Perda de consciência (LOC) é normalmente utilizado como critério para classificar a gravidade da lesão em pacientes com TCE. Na maioria dos abalos relacionadas com o desporto, a duração do LOC é menos de um minuto 14. Ao otimizar as condições experimentais, tais como a velocidade de impacto e tempo de permanência, o LOC é inferior a 10 segundos após o impacto. A condição de ter um impacto ideal é uma profundidade de impacto 4 mm, 240 ms tempo de permanência, e 4 m / s velocidade de impacto. O aumento da velocidade de impacto e habitatempo pode causar um aumento da pressão intracraniana aguda ao longo de um grande período de tempo, o que pode resultar em lesão cerebral grave ou morte imediatamente de depressão respiratória. Ratos perderá peso corporal depois de cada impacto, mas vai recuperar o peso após 72 horas de recuperação. intervalos repetitivos 72 horas são escolhidos para imitar um período de recuperação para atletas lesionados antes de retornar ao seu esporte.
Ao lado de perda de questões de consciência e respiratórias, os sintomas clínicos de uma concussão podem incluir convulsões, dores de cabeça, tonturas, náuseas e vómitos. No modelo, a dor pode ser o cérebro maioria sintoma desconfortável para os animais. escore de condição corporal e dor descrição da categoria deve ser utilizada como endpoints humanas. Além disso, outros parâmetros neurológicos específicos, tais como apreensão descontrolada, o comportamento circulando espontânea, perda de equilíbrio e incapaz de andar ou ficar deve ser considerada como endpoints humanas rCHI específicas do. Como este é um modelo de lesão leve, normalmente, não signisinais rença de dor são observados pós cada impacto. Analgésicos são tipicamente desnecessário neste nível de lesão cerebral. Este protocolo fornece as etapas-chave detalhadas para a modelagem de uma TCE leve concussão repetitivo. A velocidade e a profundidade de cada impacto pode ser ajustado, dependendo da gravidade da lesão desejada. Este modelo usa um sistema de impacto ímã eletrônico para entregar impactos. É estável com uma velocidade controlada com precisão, tempo de permanência e profundidade deformação. No entanto, porque é um traumatismo craniano fechado sem uma craniotomia, é impossível para posicionar precisamente o impacto cérebro de camundongo usando coordenadas estereotáxica. Também comutação as pontas de impacto / sonda pode resultar num deslocamento local do impacto, que é a principal causa de lesões inconsistentes. Considerando a lesão difusa e concussão saído como esperado, este modelo continua a ser preciso e fácil de controlar.
Este modelo é benéfico para usar por sua precisão e simplicidade na determinação dos efeitos de impactolesão cerebral leve -relacionados, especialmente concussão esportes relacionados. Ele serve como uma plataforma para estudos pré-clínicos, tais como explorar biomarcadores de diagnóstico e prognóstico, bem como o ensaio de dispositivos médicos, medicamentos e solução de terapia genética. Este modelo também pode ser utilizado para os estudos de encefalopatia traumática crónica (CTE), que actualmente só é diagnosticada através do exame neuropatológico.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| anesthesia machine | Eagle Eye Anesthesia, Inc | Model 150 | anesthesia |
| Electromagnetic Impactor | LeicaBiosystems | Impact One Stereotaxic Impactor | perform impaction |
| Digital Stereotaxic instrument | LeicaBiosystems | 39462501 | mount mouse and positioning tips |
| Sicilone rubber-coated metal tip | Precision Tool & Engineering, Gainesvill FL | custom-made | impact tip |
| Lithium Ion All-in-One Trimmer | WAHL Home Products | 9854-600 | shave mouse hair |
| paper clips | custom-made | probe tip | |
| Cotton tipped applicators | MEDLINE | MDS202055 | scrub head with saline |
| Tissue Tek O.C.T. | ASKURA FINETEK USA INC | 4583 | tissue embedding |
| anti-GFAP | Dako | CA93013 | antibody for IHC |
| anti Ferritin | Sigma | F6136 | antibody for IHC |
| VECTASTAIN Elite ABC kit | Vector laboratories | PK-6100 | IHC detection system |
| Permount Mounting Medium | Fisher Scientific | SP15-100 | |
| Aperio XT ScanScope scanner | Leica Microsystems Inc, | slides scanning | |
| Leica AutoStainer XL | Leica the pathology Company | ST2010 | H&E staining |
| DAB | sigma | D3939 | IHC detection system |
References
- Baugh, C. M., et al. Chronic traumatic encephalopathy: neurodegeneration following repetitive concussive and subconcussive brain trauma. Brain Imaging Behav. 6 (2), 244-254 (2012).
- McKee, A. C., et al. Chronic traumatic encephalopathy in athletes: progressive tauopathy after repetitive head injury. J. Neuropathol Exp Neurol. 68 (7), 709-735 (2009).
- Petraglia, A. L., Dashnaw, M. L., Turner, R. C., Bailes, J. E. Models of mild traumatic brain injury: translation of physiological and anatomic injury. Neurosurgery. 75 Suppl (4), S34-S49 (2014).
- Goldstein, L. E., McKee, A. C., Stanton, P. K. Considerations for animal models of blast-related traumatic brain injury and chronic traumatic encephalopathy. Alzheimers Res Ther. 6 (5), 64 (2014).
- Gold, E. M., et al. Functional assessment of long-term deficits in rodent models of traumatic brain injury. RegenMed. 8 (4), 483-516 (2013).
- Xiong, Y., Mahmood, A., Chopp, M. Animal models of traumatic brain injury. Nat Rev Neurosci. 14 (2), 128-142 (2013).
- Luo, J., et al. Long-term cognitive impairments and pathological alterations in a mouse model of repetitive mild traumatic brain injury. Front Neurol. , 5-12 (2014).
- Yang, Z., et al. Temporal MRI characterization, neurobiochemical and neurobehavioral changes in a mouse repetitive concussive head injury model. Sci Rep. 10 (5), 11178 (2015).
- Zhang, J., et al. Inhibition of monoacylglycerol lipase prevents chronic traumatic encephalopathy-like neuropathology in a mouse model of repetitive mild closed head injury. J Cereb Blood Flow Metab. 35 (3), 443-453 (2015).
- Petraglia, A. L., et al. The spectrum of neurobehavioral sequelae after repetitive mild traumatic brain injury: a novel mouse model of chronic traumatic encephalopathy. J Neurotrauma. 31 (13), 1211-1224 (2014).
- Lumpkins, K. M., Bochicchio, G. V., Keledjian, K., Simard, J. M., McCunn, M., Scalea, T. Glial fibrillary acidic protein is highly correlated with brain injury. J Trauma. 65 (4), 778-782 (2008).
- Yang, Z., Wang, K. K. Glial fibrillary acidic protein: from intermediate filament assembly and gliosis to neurobiomarker. Trends Neurosci. 38 (6), 364-374 (2015).
- Liu, H., et al. Increased expression of ferritin in cerebral cortex after human traumatic brain injury. Neurol Sci. 34 (7), 1173-1180 (2013).
- Jordan, B. D., et al. The clinical spectrum of sport-related traumatic brain injury. Nat Rev Neurol. 9 (4), 222-230 (2013).
