Un modelo de lesión en la cabeza repetidos de conmoción en ratones

Introduction

Conmoción cerebral, también llamada lesión cerebral traumática leve (LCTL), es la ocurrencia más frecuente de lesión cerebral traumática (TBI) y afecta a millones de personas en los Estados Unidos. Las conmociones cerebrales pueden ser difíciles de diagnosticar y no existe una cura específica para la conmoción cerebral. Hay un creciente reconocimiento y alguna evidencia de que los traumatismos mecánicos leves como consecuencia de lesiones deportivas, combate militar, y otras actividades atractivas físicamente puede tener consecuencias neurológicas crónicas y acumulativas ^1,2. Sin embargo, todavía hay una falta de conocimiento sobre las conmociones cerebrales y sus efectos. metodología actual restringe los estudios de patología y el tratamiento en humanos, ya que sólo la valoración neurológica y evaluación de imágenes están disponibles para el diagnóstico clínico. Los modelos animales proporcionan un medio para estudiar conmociones cerebrales de una manera eficiente, riguroso y controlado con la esperanza de diagnóstico y tratamiento de LCTL.

Los estudios han adaptado tradicional TBImodelos como el impacto cortical controlado (CCI), el impacto de percusión de fluido (FPI), lesión de caída de peso, y la lesión por estallido para realizar LCTL y estimulan la gravedad de lesiones bajas cambiando los parámetros de lesiones. Estos modelos son beneficiosos de usar debido a su capacidad para replicarse trauma cerebral morfológicamente similar a la situación clínica; sin embargo, también tienen sus propias limitaciones. La gravedad de la lesión inducida por una lesión de aceleración (caída de peso) es a menudo muy variable. Los dos resultados de la ICC leve - hemorragia subaracnoidea y contusión focal - no son comparables con las conmociones cerebrales humanas típicas. CCI y FPI requieren una craneotomía, que no es clínicamente relevante, mientras que la lesión por estallido es un modelo más controvertida en lo que respecta a las diferentes medidas de posición de la exposición y el pico de presión, así como lesión secundaria variable durante la exposición ^_3-6. Un modelo animal de conmoción actualizado que se puede traducir la investigación preclínica a la clínica setting es necesaria en la investigación.

La cuestión clave en el modelado de una LCT leve es definir la gravedad de la lesión experimental, que se replica más de cerca posible de la lesión en un entorno clínico. Recientemente, diferentes grupos de investigación desarrollaron la lesión en la cabeza cerrada o lesión en la cabeza de conmoción (CHI) modelo ^7-10. CHI es una modificación del CCI sin una craneotomía, pero todavía utiliza un sistema electrónico de impacto magnética tradicional para generar un impacto de la cabeza. Un CHI puede inducir una conmoción cerebral que van de leves a moderados mediante el ajuste de los parámetros de impacto. La pérdida de conciencia (LOC) se puede observar inmediatamente después de un impacto por la detección de una disminución en la tasa de respiración o la terminación transitoria de la respiración. El período de LOC se usa para determinar la gravedad de la lesión. Este documento incluye una versión ligeramente mejorada y actualizada de un modelo repetitivo CHI (rCHI) en ratones, junto con un protocolo detallado paso a paso y los resultados representativos. El rCHI estrategias de investigación modelo de unare beneficiosa en la determinación de los efectos LCTL y posibles tratamientos, sobre todo porque no existe un modelo animal individual capaz de imitar todos los cambios patológicos de conmoción cerebral inducida.

Protocol

Todos los procedimientos se realizaron bajo protocolos # 201207692 aprobado por el Comité de Cuidado y Uso de Animales institucional de la Universidad de Florida y de acuerdo con los Institutos Nacionales de Salud de Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio.

1. Cuidado de Animales

1. Utilice 3-4 meses de edad de sexo masculino C57BL / 6J. Proporcionar ropa de cama, material de nidificación, alimentación y agua ad libitum. Mantener los ratones en una temperatura ambiente controlada a 20 - 22 ° C, con constantes de 12 horas de luz / 12-hr ciclos de oscuridad.

2. Pre-impactación Preparación

1. Coloque una punta de metal revestida de silicona a medida para un dispositivo de impacto estereotáxica electromagnética. Asegúrese de que la parte inferior plana de la punta es paralela a la superficie de la punta de la sonda (Figura 1A).
2. Anestesiar al ratón con 4% de isoflurano seguido de anestesia de mantenimiento de 2,5% de isoflurano. Compruebe la anestesia a través del medidor de flujo. monitor el nivel de la anestesia hasta que el animal alcanza un nivel quirúrgico de anestesia, mostrando la pérdida del reflejo de retirada pedal.
3. Ponga el ratón en una posición de decúbito prono sobre una almohadilla térmica. Use un cono de la nariz en forma de embudo para mantener el ratón bajo anestesia. Afeitarse completamente la cabeza utilizando un condensador de ajuste. Utilizar vaselina ungüento oftálmico en los ojos del ratón para evitar la sequedad, mientras que bajo anestesia.

3. Ajuste los parámetros de impacto

NOTA: El sistema de impacto incluye una caja de control para ajustar los parámetros de impacto, un actuador para realizar la impactación, y un marco de estereotaxia digital con los ejes 3-movimiento.

1. Pre-establecer la velocidad del dispositivo de impacto a 4 m / s, y el tiempo de permanencia de 240 ms en la caja de control.

4. Colocación del Centro de Impacto

1. Aplique una almohadilla eléctrica suave bajo el cuerpo del animal para mantener la temperatura corporal alrededor de 39 ° C. Montar el ratón en un marco estereotáxico en un pronposición e con las barras de oído sin filo.
2. Bajar la punta de impacto cerca de la cabeza del ratón moviendo el Z-conductor. Ajustar la punta de impacto plana (9 mm de diámetro) moviendo los ejes X e Y en los conductores a medio camino a la meta coordina por encima de la sutura sagital.
3. Asegúrese de que uno de los bordes de la punta de impacto sea vertical paralelo a una línea horizontal imaginaria trazada entre los dos oídos (Figura 1C). El centro de impacto corresponde a la mitad de camino entre el centro de sutura sagital suturas interfrontal y lamboidea (interaurales 9 mm a interauricular 0 mm, lateral 4,5 mm).

5. Profundidad de impacto Marco

1. Para configurar correctamente la profundidad del impacto, usar punta de la sonda adicional para reemplazar la punta de impacto revestida de silicona con aislamiento.
2. Para asegurarse de que no hay un desplazamiento del centro de conmutación de impacto después de consejos, establecer los ejes X e Y del canal en el panel de control estereotáxico digitales a cero antes de cambiar las puntas.
3. Mueva el probe punta hasta el centro de la zona de impacto moviendo manualmente los X-e Y unidades.
4. sensor de contacto del clip de la cola del ratón.
5. Mover el impactador (unidad Z) hacia abajo hasta que la punta de la sonda toca la superficie del lugar del impacto.
6. Ajuste el canal Z en el panel de control estereotáxico a cero.
7. Mueva la punta de impacto de nuevo a la zona de impacto ajustando manualmente X e Y en los conductores (no con los botones de cero en el panel de control estereotáxica digital) hasta que X e Y son los conductores de cero (donde la punta de impacto anteriormente se ha posicionado).
8. Retraer el accionador moviendo el interruptor de retracción en la caja de control. mover manualmente el impactador hacia abajo (controlador Z) a los 4 mm.

6. Impacto

1. Desencadenar el impacto pulsando el interruptor impacto en la caja de control y lograr una profundidad de deformación de 4 mm.

7. Post-impactación

1. Se mide el tiempo desde el impacto hasta primera respiración del ratón utilizando un temporizador.
2. Permitir la recuperación antes de volver al animal en una jaula limpia. No devuelva un animal a la compañía de otros animales hasta que esté completamente recuperado.
3. Observar y sopesar los ratones diariamente. Si los ratones muestran signos de dolor, por vía intraperitoneal a inyectar con Meloxicam en 1 - 2 mg / kg cada 12 a 24 hr.

8. La impactación repetitivo

1. Dar a los ratones lesiones adicionales en los días 4, 7 y 10 después de la lesión inicial (intervalo de 72 horas entre los impactos).

9. La inmunohistoquímica (IHC)

1. perfusión transcardial
   1. Anestesiar a los ratones mediante inyección intraperitoneal con 200 m / kg de pentobarbital.
   2. Evaluar y asegurar la anestesia quirúrgica placa de circuitos mediante una pizca dedo del pie. SegundoUre el ratón en la posición supina con cinta adhesiva suavemente las patas delanteras y las patas traseras a una superficie de trabajo de espuma de poliestireno dentro de una campana de humos química.
   3. Hacer una incisión a través de la piel a lo largo de la línea media dorsal desde justo debajo de la apófisis xifoides hasta la clavícula. Hacer dos incisiones adicionales de la piel en el proceso xifoides y proceder a lo largo de la base de la caja torácica ventral lateralmente.
   4. Abra la cavidad torácica y exponer el corazón cortando a través de la musculatura torácica y la caja torácica.
   5. Asegure el corazón que late con unas pinzas romas y hacer un 1 - 2 mm incisión en el ventrículo izquierdo.
   6. Inmediatamente inserte una aguja de mariposa en la aurícula derecha. Comience la infusión de solución salina 20 ml empujando la jeringa lentamente.
   7. Cambiar de solución salina al 4% de paraformaldehído. Continuar la perfusión con 20 ml de paraformaldehído.
   8. Decapitar al ratón y quitar la piel con unas tijeras. Aislar el cerebro del cráneo siguiendo un cortador de hueso.
2. doryostat seccionar
   1. tejidos cerebrales incrustar en la formulación temperatura óptima de corte (OCT) y la congelación a -80 ° C. Coloque el cerebro en el criostato en una orientación sagital. secciones de cerebro de corte 5 m de espesor.
3. tinción
   1. Secar las secciones congeladas a temperatura ambiente durante 1 hr.
   2. Incubar los portaobjetos con 100 l de suero de cabra 2% y 0,1% de Triton X-100 en tampón fosfato salino (PBS) durante 1 hr a RT.
   3. Se lavan los portas 3 veces con 300 l de PBS. Entonces se incuban los portaobjetos con anti-GFAP (1: 200) o anticuerpo anti-ferritina (1: 200) por separado durante la noche a 4 ° C.
   4. Se lavan los portas 3 veces con 300 l de PBS. Entonces se incuban los portaobjetos durante 2 hr a temperatura ambiente con anticuerpo secundario conjugado con biotina.
   5. Se lavan los portas 3 veces con 300 l de PBS. Entonces se incuban los portaobjetos con solución de complejo avidina-biotina (ABC) (1:50) a temperatura ambiente durante 30 min.
   6. Se lavan los portas 3 veces con 300 l de PBS. A continuación se incuban en 3,3 '-Diaminobencidina solución (DAB) sustrato (50 ml de PBS, 10 l _de H ₂ O _2, 10 mg pastillas DAB, filtro antes de usar) durante 5 - 8 minutos. Los portaobjetos bajo el microscopio hasta que aparezcan las células positivas.
   7. Enjuague los portaobjetos en agua del grifo funcionamiento lento durante 5 minutos. diapositivas limpias con un laboratorio de borrado. A continuación, montar las secciones con medio de montaje y cubreobjetos.

Representative Results

En este modelo (Figura 1 AC), hubo breves períodos de jadeos y respiraciones superficiales. Una pérdida de la conciencia (inconsciente) se define como una disminución en el ritmo de la respiración o la terminación transitoria de la respiración antes de reanudar una respiración normal. Un impacto en el centro de la cabeza causado inconsciencia a corto plazo (7,5 ± 4,7, 7,8 ± 5,5, 10,2 ± 8,8, 9,5 ± 8,0 seg en cada impacto por separado, la Figura 1D). Cerebros de los ratones mostraron una morfología normal por H & E tinción histológica, que indicó que no había lesiones estructurales o tejidos daños evidentes resultante del impacto (Figura 2A). En respuesta a la lesión cerebral traumática, se sabe que los astrocitos a someterse a ciertos cambios, incluyendo la activación, proliferación, o gliosis reactiva ^11,12. El aumento de la proteína glial fibrilar (GFAP) células positivas ácidos con cuerpos de células grandes y gruesas sinapsis son los astrocitos activados. el corpus calloso de rCHI cerebros de los ratones mostraron signos evidentes de la activación de astrocitos a los 7 días después del último impacto (Figura 2B).

Microscópicos en el tejido son comunes en LCTL y pueden conducir a la liberación de hierro de la hemoglobina ^13. La sobrecarga de hierro en el suero se puede detectar mediante pruebas de ferritina en entornos clínicos ^13. Las células immunopositive de ferritina en la corteza del ratón se encontraron un día después del último impacto y duraron al menos siete días, lo que sugiere que múltiples retenciones pueden provocar sangrados microscópicos corticales (Figura 2C).

Figura 1. Un modelo de ratón de repetitivo de conmoción lesión en la cabeza. (A) la punta revestida de silicona 1 mm de espesor por encargo mide 9 mm de diámetro con una punta de la sonda. (B) Un ratón es mounted en un marco estereotáxico en una posición de decúbito prono con una almohadilla térmica suave bajo el cuerpo. (C) El posicionamiento centro de impacto. El borde de la punta de impacto es vertical paralelo a una línea horizontal imaginaria trazada entre los dos oídos. El centro de impacto corresponde a medio camino entre suturas interfrontal y lamboidea (interaurales 9 mm a interauricular 0 mm, lateral 4,5 mm). (D) La apnea se define como breves períodos de terminación transitoria de la respiración. La media y SD se muestran en el panel inferior. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2. Histología de repetitivo de conmoción lesión en la cabeza. (A, izquierda) Un cerebro de ratón se retiró después de la perfusión con paraformaldehído al 4%. se ha encontrado ningún daño a los tejidos. (B) Aumento del marcador bioquímico de gliosis (GFAP) en el cuerpo calloso 7 días después de la última lesión. Barra de escala = 200 m. (C) Por inmunohistoquímica, se encontró que la cadena-H-ferritina que se expresa en la corteza cerebral después de la lesión. El inserto imágenes representan magnifican células positivas. Barra de escala = 200 micras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discussion

Para imitar las lesiones cerebrales morfológicamente similares a la condición clínica, se espera que los síntomas post-concusión. síntomas post-concusión generalmente incluyen dolores de cabeza, mareos, vértigo, fatiga, problemas de memoria y de sueño, dificultad para concentrarse, así como la ansiedad y estado de ánimo depresivo. Dado que los síntomas somáticos sin embargo, no pueden ser medibles en modelos animales, los cambios de motor y la función cognitiva y el comportamiento emocional se utilizan como criterios para evaluar racionalmente la conmoción cerebral en modelos animales. En un estudio publicado anterior, se demostró que el modelo de ratón rCHI induce déficit en el aprendizaje espacial, la memoria y la ansiedad ^8. Más importante aún, el modelo rCHI utilizado en este protocolo representa el entorno clínico sin lesión cerebral invasiva o fractura estructura del cerebro, ambos de los cuales pueden resultar en una hemorragia, hemorragia, edema, o la pérdida de células de la muerte / tejido aguda.

Los siguientes son los principales consejos para el modelado de éxito consistente concussion / LCTL utilizando un sistema de impacto imán electrónica:

Evitar una segunda lesión cerebral inmediatamente después de la primera lesión cerebral que puede ser causada por el movimiento durante el impacto. La cabeza del ratón se puede mover ligeramente hacia abajo durante el impacto. Para evitar una contusión cerebral causado por un movimiento rápido contra el suelo duro o en la cabeza de estiramiento, una resistencia de calentamiento suave se debe poner debajo del cuerpo del ratón. La cabeza y el cuerpo también deben mantenerse horizontal. Además, utilizar las barras de oído sin filo para fijar la cabeza del ratón en el marco estereotáxico, y no insertarlos dentro del canal auditivo. Esto protege el ratón de una lesión causada por los extremos afilados durante el movimiento.

Coloque correctamente el centro de impacto y establecer el cero. A diferencia de lesión en la cabeza abierta, el posicionamiento de la punta de impacto es relativamente difícil. El tamaño de la punta de impacto y el centro de impacto afecta a la gravedad de la lesión y las lesiones. Sobre la base de la anatomía del cerebro del ratón, el centro de impacto está diseñado para corresponder a mitad de caminoentre las suturas y interfrontal lamboidea (interaurales 9 mm a interauricular 0 mm, lateral 4,5 mm). Por lo tanto, se requiere una punta optimizado 9 mm. La punta de impacto deben ajustarse al objetivo coordina por encima de la mitad de la sutura sagital, y uno de los bordes de la punta de impacto será paralela verticalmente a una línea horizontal imaginaria trazada entre los dos oídos (Figura 1C). La punta de impacto de material aislante con un revestimiento de caucho de silicona bloquea el sensor de contacto y evita que el ajuste de la profundidad del impacto. Se necesita una punta de la sonda y debe ser paralelo a la superficie del botón en la punta de impacto. El centro del impacto se ajusta al sitio tocar punta de la sonda mediante el accionamiento del instrumento estereotáxico. Lavado de la cabeza con solución salina aumenta la electro-sensibilidad. Además, la sonda se puede quitar o diseñados para no dañar al cerebro durante el impacto. Una forma alternativa es la construcción de dos puntas con la misma longitud; una punta recubierta con caucho de silicona y la otra punta sería metal, que seráutilizado como una punta de la sonda. Las dos puntas deben cambiarse entre posicionamiento y de impacto.

Supervisar breves síntomas inconscientes del ratón inmediatamente después de un impacto. Como se discutió anteriormente, la mayoría de los síntomas post-conmoción cerebral son difíciles de observar inmediatamente en un modelo animal de ratón de laboratorio. LCTL pacientes pueden experimentar una pérdida breve de la conciencia después de la lesión. Para establecer los parámetros de lesiones visibles, una breve pérdida de conciencia era un síntoma utilizado para evaluar la validez de este modelo de TBI de conmoción. Pérdida de la conciencia (LOC) se utiliza habitualmente como criterios para clasificar la gravedad de las lesiones en los pacientes con TCE. En la mayoría de las conmociones cerebrales relacionadas con los deportes, la duración de LOC es menos de un minuto ^14. Mediante la optimización de las condiciones experimentales, tales como la velocidad de impacto y tiempo de permanencia, la LOC está a menos de 10 segundos después de un impacto. La condición impacto óptima es una profundidad de impacto 4 mm, 240 mseg de tiempo de reposo, y 4 m / s velocidad de impacto. Aumento de la velocidad de impacto y habitartiempo puede causar un aumento de la presión intracraneal aguda sobre una gran cantidad de tiempo, lo que puede resultar en una lesión cerebral grave o la muerte inmediata de la depresión respiratoria. Los ratones pierdan peso corporal después de cada impacto, sino que recuperar el peso después de 72 horas de recuperación. intervalos repetitivos 72 hr son elegidos para imitar un período de recuperación para los atletas lesionados antes de regresar a su deporte.

Junto a la pérdida de las cuestiones de conciencia y respiratorias, los síntomas clínicos de una conmoción cerebral pueden incluir convulsiones, dolor de cabeza, mareos, náuseas y vómitos. En el modelo, el dolor del cerebro puede ser la mayoría de los síntomas incómodos a los animales. Condición corporal y la descripción de la categoría dolor deben utilizarse como puntos finales. Además, otros parámetros neurológicos específicos, tales como convulsiones sin control, el comportamiento en circuito espontáneo, pérdida del equilibrio y no podía caminar o estar de pie deben ser considerados como puntos finales rCHI-específicas. Dado que este es un modelo de lesión leve, normalmente no signisignos de dolor significa- se observan posterior de cada impacto. Los analgésicos son típicamente innecesario en este nivel de la lesión cerebral. Este protocolo proporciona pasos clave detallados para el modelado de una lesión cerebral traumática leve conmoción repetitivo. La velocidad y la profundidad de cada impacto se pueden ajustar dependiendo de la severidad deseada de la lesión. Este modelo utiliza un sistema electrónico de impacto imán para entregar impactos. Es estable con una velocidad controlada con precisión, tiempo de permanencia, y la profundidad de deformación. Sin embargo, debido a que es una lesión en la cabeza cerrada sin una craneotomía, es imposible situar con precisión el impacto de cerebro de ratón usando coordenadas estereotáxica. Además de cambiar las puntas de impacto / sonda puede resultar en un cambio de lugar del impacto, que es la principal causa de lesiones inconsistentes. Teniendo en cuenta la lesión difusa y conmoción cerebral resultó como se esperaba, este modelo sigue siendo preciso y fácil de controlar.

Este modelo es beneficioso utilizar por su precisión y simplicidad en la determinación de los efectos del impactolesión cerebral leve -relacionado, especialmente conmoción cerebral relacionado con el deporte. Sirve como una plataforma para los estudios preclínicos, tales como la exploración de biomarcadores de diagnóstico y pronóstico, así como el ensayo de dispositivos médicos, medicamentos y solución de terapia génica. Este modelo también se puede utilizar para los estudios de la encefalopatía traumática crónica (CTE), que en la actualidad sólo es diagnosticable mediante el examen neuropatológico post-mortem.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
anesthesia machine	Eagle Eye Anesthesia, Inc	Model 150	anesthesia
Electromagnetic Impactor	LeicaBiosystems	Impact One Stereotaxic Impactor	perform impaction
Digital Stereotaxic instrument	LeicaBiosystems	39462501	mount mouse and positioning tips
Sicilone rubber-coated metal tip	Precision Tool & Engineering, Gainesvill FL	custom-made	impact tip
Lithium Ion All-in-One Trimmer	WAHL Home Products	9854-600	shave mouse hair
paper clips	custom-made		probe tip
Cotton tipped applicators	MEDLINE	MDS202055	scrub head with saline
Tissue Tek O.C.T.	ASKURA FINETEK USA INC	4583	tissue embedding
anti-GFAP	Dako	CA93013	antibody for IHC
anti Ferritin	Sigma	F6136	antibody for IHC
VECTASTAIN Elite ABC  kit	Vector laboratories	PK-6100	IHC detection system
Permount Mounting Medium	Fisher Scientific	SP15-100
Aperio XT ScanScope scanner	Leica Microsystems Inc,		slides scanning
Leica AutoStainer XL	Leica the pathology Company	ST2010	H&E staining
DAB	sigma	D3939	IHC detection system