Introduction
유잉 육종 (ES)은 어린이와 청소년에 영향을 미치는 공격적인 악성 종양이다. 1 종양은 일반적으로 사지에, 연부 조직과 뼈에 개발할 수 있습니다. 전이의 존재 ES 환자를위한 가장 강력한 부작용 예후 인자이지만, 그 현상의 기초가되는 메카니즘은 불분명. 이 종양의 저산소증은 ES의 진행에 연루 몇 가지 요소 중 하나입니다. ES 환자의 종양 조직 내에서 비 - 관류 영역의 존재는 불량한 예후와 연관된다. (3) 시험관에서 저산소증은 ES 세포의 침윤을 증가시키고 프로 전이 유전자의 발현을 트리거합니다. 4-6 그러나, 증거의이 라인에도 불구하고, 저산소증 유도 ES 진행 및 확산에 대한 직접적인 증거는 존재하지 않는다. 또한, 미지의 저산소증은 현재, 이러한 효과가 발휘되는 메커니즘. 따라서, 우리는 시험 관내 데이터와 임상 obser에 존재 사이의 갭을 채우기 위해 생체 내 모델을 만들었습니다적인 혁신. 이 모델 시스템은 생체 병리학 적 및 분자 분석 (도 1)와 결합하여 생체 내에서 종양 진행 및 전이를 수행하는 자기 공명 영상 (MRI)를 사용하여, 자연 환경에서 발생하는 종양에 대한 저산소증의 효과를 직접 테스트 할 수있다.
ES의 확립 된 형질 전환 모델은 현재 사용할 수 없기 때문에, 이러한 종양의 전이 특성에 대한 생체 내 연구는 면역 저하 쥐에 인간 세포의 주사에 의존하고 있습니다. 면역 손상 동물 사용은 질병의 진행에 대한 면역계의 영향을 과소 평가할 수 있지만, 인간의 세포를 사용하는 기능 연구는 번역 가능성을 증가시킨다. 다른 이종 이식 모델 중에서, 꼬리 정맥에 전신 주사를 수행하는 가장 쉬운 아직 이들은 종양 세포 intravasation의 초기 단계를 생략하고 성장 차 사이트에서 탈출. 한편 7-12, orthoto 뼈 (대퇴골, 리브) 또는 근육으로 종양 세포의 주입을 포함 PIC는 xenografting은보다 생물학적으로 인간 암에 관련된 기술적으로 어려운 물론이다. 전이 현상 전에 13-16 그러나, 과거에, 일차 종양의 급속한 성장과 관련된 높은 질병 율을 종종 필요로했다 동물 안락사. 본 연구에서는 MRI에 의해 전이성 진행의 길이 모니터링과 결합 된 결과 원발 종양의 절제 다음에 비복근 근육에 세포 주사의 이전에 설립 모델을 고용했다. 근육과 뼈 - - 경골에 근접 비복근 근육에 (17, 18) 이러한 주사는이 자연 ES 환경에서 종양의 성장을 허용하고 일반적으로 인간에 영향을받는 위치에 원격 전이가 발생. (18) 따라서,이 모델은 정확하게 질병 진행 동안 ES 환자에서 발생하는 전이 과정을 되풀이되었습니다.
텐트 "> 하부 사지 일차 종양의 위치 파악은 종양 조직에 혈액 공급의 정확한 제어를 용이하게한다. 대퇴 동맥 결찰 (FAL)은 원위 영역에 혈액 흐름을 차단하는 혈관 신생 연구에서 이용되는 잘 확립 된 기법이다 레그 및 허혈에 응답 조직 혈관을 조사. 19-20를 중요한 혈류 초기 드롭 3 일 정도 FAL 후에 관찰 담보 용기 개구 조직 재관류 따른다. (20) 이와 같이, 담암 사지에서 수행되면 이 모델은 빠르게 성장하는 종양에서 자연적으로 발생하는 저산소증 / 재관류 이벤트를 재현하고 새로 열린 측부 혈관을 통해 하부 사지에 관류의 복원으로 인한 전이성 종양 세포의 이탈을 가능하게한다. (21) 중요한 것은, 종양의 크기 인 경우,이 절차가 수행되어야 일반적 담암 소 부피의 제어 종양에서 과잉 저산소증 (방지하기에 충분히 작은제어 FAL 투여군간에 종양 저산소증의 수준에서 상당한 차이를 확보 250mm 3) - (150)의 UME.ES 지연에 저산소증의 효과 및 전이의 주파수의 길이 모니터링에 더하여,이 모델은 또한 조직 수집 및 차 종양 및 전이에서 모두 새로운 세포주의 개발을 허용한다. 중요한 것은, 이전의 연구는 전이 유래 세포주는 종양 보급 영구 종양 세포 표현형의 변화시킴으로써 전이 프로세스를 해독하는데이 세포주의 사용을 검증과 연결되어 있는지를 나타내는 동물에 재 도입에 향상된 전이 가능성을 나타내는 것을 설치했다. 총체적으로 18이 모델은 이제 저산소증 유발 전이 경로를 식별하기 위해 필요한 유전 및 분자 분석을 위해 사용될 수있다.
저산소증으로 다양한 t의 악성 종양을 향상 프로 전이성 요인이다umors, 우리의 모델은 골육종 및 횡문근 자연스럽게 사지 발전 다른 유형의 종양에서 저산소증의 역할을 조사하기위한 플랫폼으로 사용될 수있다. 21-23 또한, 유사한 접근법은 혈액 공급이 잘 정의 된 경로와 다른 해부학 적 위치에서 성장하는 악성 종양에 적용 할 수있다. 궁극적으로, 모델이 수정 될 수 및 유틸리티는 또한 개별 연구 필요에 따라 확장.
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Protocol
모든 절차는 조지 타운 대학 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다.
동소 이식 주입 1. 셀 준비
- 표준 조건에서 배양 인간 ES 세포. 하지 5 마우스의 주입을위한 포화 상태의 70 %를 초과하는 약 15 cm 세포 배양 접시를 사용합니다.
주 :이 연구에서, SK-ES1 세포는 10 % FBS와 1 % 4- (2- 히드 록시 에틸로 RPMI에서 콜라겐 - 코팅 된 플레이트 및 TC71 세포를 15 % 소 태아 혈청 (FBS)로 배양 된 맥코이 5A 배지에서 배양 하였다이었다 ) -1- 피페 라진 에탄 술폰산 (HEPES). 두 매체는 항생제가 보충 된 - 페니실린 (100 단위 / ml), 스트렙토 마이신 (100 μg의 / mL) 및 fungizone (1 μg의 / ㎖). - 5 분 동안 0.25 % 트립신 / 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA)와 70 %의 합류에 인산염 완충 생리 식염수 (PBS)과를 Trypsinize으로 ES 세포를 씻으십시오.
- 세포 배양 메디칼와 함께 접시에서 ES 세포를 제거A, 실온에서 200 × g으로 5 분 동안 원심 분리. 다시 일시 차가운 PBS 10 ㎖에 ES 세포 후 세포의 수를 계산.
- 다음 원심 분리기 ES의 실온에서 200 XG에 5 분 동안 세포 및 일시 중지 다시 2 × 10 7 (SK-ES1) 또는 차가운 PBS에서 ml의 당 10 7 (TC71) 세포에서. 주사를 수행하는 동안 얼음에 최종 세포 현탁액을 유지합니다.
비장근 근육 ES 세포의 2 동소 이식 주입
- 4-6주 세 여성 SCID / 베이지 색 마우스를 사용합니다.
- ES 세포를 주입, 부드럽게 낮은 사지의 내측을 노출, 마우스를 잡고 네 번째와 다섯 번째 손가락 사이의 왼쪽 다리를 안정.
- 28 G ½ 바늘을 사용하여, 어느 비복근 근육에 2 × 106 (SK-ES1) 또는 106 (TC71) ES 세포 (도 2a)를 포함하는 미리 제조 한 세포 현탁액 0.1 ml를 주입.
참고 : 비록 근육 INJ 최대 볼륨ections 인해 주입 높은 세포 수에이 특정 절차, 일반적으로 0.1 ml의 필요에 볼륨 증가 0.05 ml 인 것을. 이 절차는 조지 타운 대학 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다.- 경골 가문 / 결절의 방향으로 45도 각도 - 비복근 근육에 전방에서 약 30 바늘을 삽입합니다.
- 이 경골 문장 / 결절을 터치하면 약간 바늘을 철회. 천천히 압력을 서서히 방출 바늘 인출, 세포 현탁액을 주사.
- 고통의 흔적이 다음 24 시간 동안 주입 된 쥐를 모니터링합니다.
참고 : 동물 취급 적은 경험이있는 연구자들은 종양 세포 주사에 대한 쥐를 마취 고려해야합니다. 일부 기관은 안전상의 이유로 마취가 필요할 수 있습니다.
3. 주요 종양의 성장을 모니터링
- D 차 종양의 성장을 모니터링aily 종양 크기는 원하는 양에 도달 할 때까지.
참고 : 본 연구에서, 250mm (3)의 커프 용적 실험 (도 2B)의 시작점으로 사용 하였다. 종양이 크기에 도달하는 이주 - 일반적으로는 약 1 소요됩니다.- 그-중간 측면과 전후방 길이를 통해 디지털 캘리퍼스 매일 송아지 크기를 측정한다.
- D는 긴 직경이고, d는 종양 - 함유 낮은 사지의 짧은 직경 3.14 X 화학식 (D XD는 6분의 2)에 의한 종아리의 볼륨을 결정한다.
참고 : - 50mm 3 일반 성인 마우스 송아지의 크기는 약 40이다. 부피 의한 종양 성장 및 종아리 주로 종양 조직으로 구성되는 나중 단계에서 증가 할 것이다.
종양 베어링 뒷다리에 저산소증을 유도 4. 대퇴 동맥 결찰 (FAL)
- 이 작업에 필요한 수술 도구를 준비 : CURVED 또는 지적 미세 집게는 집게, 외과 가위와 바늘 홀더를 지적했다. 오토 클레이브 또는 핫 비드 살균기를 사용하여 수술하기 전에 이러한 도구를 소독. 또한이 수술에 대한 준비가 잘 면봉 있습니다.
주 : 도구이 절차를 수행하는 동안 필요에 따라 끝을 다시 소독하는 것이 좋습니다. - 진통제 (카프로 펜 5 ㎎ / ㎏) 피하 (SQ)를 주입한다. 검색 및 저산소증을 확인하려면, hypoxyprobe-1 (pimonidazole, 60 ㎎ / ㎏)을 주입.
주 :이 투여 량은 마우스 당 1.5 mg의 총점 및 PBS를 복강 내 (IP)에 15 ㎎ / ㎖ hypoxyprobe 용액 0.1㎖를 주입함으로써 달성된다. hypoxyprobe는 면역 조직 화학 염색에 의한 동물의 조직에서 검출 사후이다. - 1 L / min의 유속에서 100 % 산소, 5 % 이소 플루 란 - (3)을 포함하는 마취 유도 챔버에 마우스를 놓는다.
- 그것은 외부 자극에 응답하지 않는 때까지 유도 챔버에서 마우스를 둡니다. 다음 i에서 동물을 제거nduction 실. 운영 표면에 온난 패드 위에 배치 멸균 드레이프의 부정사 위치에 동물을 배치합니다. 0.8 L / 분의 유속에서 100 % 산소 3 % 이소 플루 란 - (1)의 연속적인 흐름으로 연결하는 노즈 콘 (nose cone)을 사용한다.
- 각막 건조를 방지하기 위해 각각의 눈에 멸균 비 약용 안과 연고를 적용합니다. 철저하게 수술 영역을 털을 뽑다하려면 더 이상 10 초 동안 피부에 그것을 떠나, 머리 제거 크림을 적용합니다. 그런 다음 에탄올 준비 패드를 사용하여 머리 제거 크림을 닦아.
- 확장 및 약 45도 마우스의 중간 선에서 테이프의 조각으로 사지를 고정합니다. 사지가 안전하면, 두 번 더 각을 반복, 에탄올 다음 10 % 포비돈 / 요오드 면봉 / 솔루션에 노출 된 피부를 닦아냅니다. 수술의 나머지 부분은 사지의 영역의 확대도를 얻기 위해 스테레오 현미경을 사용한다.
- 뾰족한 집게, 외과 가위를 사용하면은 SK의 절개를약 1cm 길이에, 사타구니 지역으로 허벅지 중간에서. 생리 식염수에 적신 고급 면봉을 사용하여 부드럽게 허벅지 근육을 둘러싼 피하 지방 조직을 멀리 브러시.
- 조심스럽게 피하 지방 조직을 통해 무딘 절개를 통해 기본 대퇴 동맥을 알 수있다. 중앙 상부 내전근 근육의 혈관을 노출 상처 및 수술 필드를 안정화.
- 부드럽게 피어스 멤브레인 대퇴 칼집을 통해 미세 집게를 사용하면 신경 혈관 다발을 노출. 미세 집게의 깨끗한 세트를 사용하여 해부와 사타구니 인대에 말단 사타구니 근처 근위 위치에서 대퇴 정맥과 신경의 대퇴 동맥을 분리합니다. 대퇴 정맥 벽을 관통하지 않도록주의하십시오.
- 해부에 따라, 측면 곡절 대퇴 동맥 (LCFA)의 분기에 대퇴 동맥 및 말초 아래에 6-0 실크 봉합사의 가닥을 전달합니다. 더블 노트 (그림 3)를 사용하여 대퇴 동맥을 폐색. 6-0 폴리 프로필렌 봉합사를 사용하여 절개를 닫습니다. 절개를 닫은 후, 유체 균형 치료를위한 따뜻한 식염수 SQ 0.5 ml를 주입. 복구 케이지에 드리 워진 따뜻한 패드의 상단에있는 동물을 놓고 깨어 때까지 지속적으로 모니터링 할 수 있습니다.
- 진통 에이전트를 수술 후 처음 6 시간 동안 동물을 모니터링하고 주입 (카프로 펜 5 ㎎ / ㎏, SQ) 3 일간 매일. 봉합을 멸균 가위를 사용하여 십일 후 수술을 제거합니다.
다리 절단 수술 5. 차 종양 절제술
주 : 송아지 크기가 대조군 250mm 3 저산소 그룹 FAL 후 3 일에 도달했을 때 종양 베어링 하부 사지 절단 될.
- 부드럽게 동물을 잡고 머리를 가위로 골반 영역으로 원위 경골에서 종양 베어링 다리에서 머리를 면도. 절차 전에 진통제를 (카프로 펜 5 ㎎ / ㎏, SQ) 주입한다.
- 마취 유도 채널에 마우스를 놓고1 L / min의 유속에서 100 % 산소, 5 % 이소 플루 란 - 황색 3을 함유. 그것은 외부 자극에 응답하지 않는 때까지 유도 챔버에서 마우스를 둡니다. 그런 다음 유도 챔버에서 동물을 제거합니다.
- 운영 표면에 온난 패드에 배치 멸균 드레이프에 오른쪽 측면 기댄 위치에있는 동물을 놓습니다. 0.8 L / 분의 유속에서 100 % 산소 3 % - 이소 플루 란 (1)의 연속적인 흐름으로 연결하는 노즈 콘 (nose cone)을 사용한다. 각막 건조를 방지하기 위해 각각의 눈에 멸균 비 약용 안과 연고를 적용
- 3 회 반복 한 다음, 에탄올 10 % 포비돈 / 요오드 면봉 / 용액을 사용하여 수술 부위를 준비. 멸균 된 수술 부위를 얻기 위해 마우스를 통해 멸균 거즈 (예를 들어, 수술 드레이프)을 적용한다.
- 무딘 해부 및 근위 피부의 수축 다음에 중간 대퇴 원주 피부 절개를합니다. 다리의 중간 측의 내측 대퇴 신경 혈관 척추 경을 노출하고 결찰4-0 코팅 (polyglactin 910) 흡수성 봉합사를 이용하여 서혜부 인대 근처.
- coxofemoral 관절 연부 조직의 무딘 절개 한 다음 가위로 근육 그룹의 중간 대퇴부 절개를 수행합니다. 뼈 커터를 사용하여, 중간 대퇴골 절골술을 수행합니다. 멸균 고급 면봉이나 흡수성 젤라틴 스폰지를 사용하여 부드럽게 최소화하고 출혈을 방지하기 위해 절골술 사이트를 누릅니다.
- 수술 상처 클립을 사용하여 상부의 피부를 닫고 유체 균형 치료에 따뜻한 식염수 SQ 0.5 ml를 주입. 복구 케이지에 드리 워진 따뜻한 패드의 상단에있는 동물을 놓고 깨어 때까지 지속적으로 모니터링 할 수 있습니다.
- 수술시, RNA, DNA 또는 단백질 분리를위한 기본 종양에서 조직 샘플을 수집 -80 ℃에서 액체 질소 저장에서 동결 스냅. 아래의 9 절에 설명 된 바와 같이 일차 세포 배양의 경우,이 단계에서 조직 샘플을 수집한다. 조직학 및 immunochemis 10 % 중성 완충 포르말린에 남아있는 사지 조직을 수정hypoxyprobe-1 검출을 포함 해보십시오.
- 3 일간 후 매일, 수술 후 처음 6 시간에 운동, 통증과 식품 소비에 대한 동물을 모니터링합니다. 3 일간 매일 진통제를 (카프로 펜 5 ㎎ / ㎏, SQ) 주입한다. 상처 클립 제거제를 사용하여 절단 후 상처 클립 10 일 제거합니다.
전이의 존재 6. 모니터링 마우스
- 매일 쥐를 관찰하고 적어도 일주일에 두 번 전이의 임상 적 징후를 평가합니다.
- 다양한 위치, 일반적으로 어깨, 반대편 다리와 턱에 개발 질량으로 제시 macrometastases의 존재 동물을 관찰한다. 이를 위해 조심스럽게 머리, 목, 겨드랑이 지역과 반대측 사지를 만져. MRI 검사와 함께 복부 팽만을 통해 내부 장기의 전이를 확인합니다.
- 색인 전압으로 xyphoid 처리 (흉골의 하단)을 눌러 폐 전이의 존재를 확인X 손가락. (24)
참고 :이 압력은 횡격막 호흡 용량을 감소. 고급 폐 전이와 마우스는 힘든 호흡에 의해 나타난 호흡 곤란의 징후를 보여줍니다. - 이러한 중추 신경계에 전이을 제안 다리 마비 및 운동 장애 등의 신경 학적 증상의 동물을 관찰한다.
- 잠재적 인 질병 진행의 표시로, 체중 감량을 위해 적어도 일주일에 한 번 마우스를 모니터링합니다. 예비 절차 중량의 15 %를 초과하는 체중 감소는 인간 엔드 여겨진다.
7. 자기 공명 영상 감지 전이에 대한 (MRI)
- 목적하는 시점에서 전이를 검출하는 MRI를 수행한다. (18)
참고 : 본 연구에서는 7 테슬라 수평 분광계를 사용 하였다. MRI는 일 (15)에서 수행하고 SK-ES1 세포 및 TC71 세포 일 15시 35 후 절단되었다. - 마취 유도 chambe에 마우스를 놓고30 %의 산소 및 70 %의 산화 질소의 혼합 가스에 3 % 이소 플루 란 1 - 함유 R.
- 그것은 외부 자극에 응답하지 않는 때까지 유도 챔버에서 마우스를 둡니다. 그런 다음 유도 챔버에서 동물을 제거합니다.
- 1.5 %의 이소 플루 란의 지속적인 관리와 30 % 질소 산화물과 호흡 및 온도 monitorization와 정위 홀더 위에 마취 마우스를 전송합니다. 각막 건조를 방지하기 위해 각각의 눈에 멸균 비 약용 안과 연고를 적용합니다. 이미지 동물 중 하나를 각각 몸 전체 또는 뇌 영상을위한 40 또는 23mm 브루 커 마우스 볼륨 코일입니다.
- TR = 3000 밀리 초, TE = 24 밀리 초, 매트릭스 = 256, FOV = 4.35 X 3.0 cm, 슬라이스 두께 = 0.5 mm, RARE 요인 = 4 평균 = 4. 18 : 이차원, T2 강조 RARE 시퀀스를 사용하여
- 따뜻한 복구 케이지에 동물을 놓고 깨어 때까지 지속적으로 모니터링 할 수 있습니다.
주 : 마취의 얕은면을 사용하기 때문에 마우스는 빠르게 회복됩니다. 마취의 부작용이 없는지 확인하기 위해 촬영 후 처음 6 시간 동안 동물을 모니터링합니다.
8. 안락사와 부검
- MRI 및 / 또는 질병 진행의 임상 증상에 의해 검출 전이에 존재하는 동물 한 번 쥐를 안락사.
참고 : 현재의 연구에서, 마우스 일 (50)에 희생 된 각각 SK-ES1 및 TC71 이종 이식 베어링 동물 25 후 절단. 어떤 경우에는, 이전에 안락사 인해 높은 전이 부담 할 필요가 있었다. - (- 안락사 실 부피 / 분 30 ~ 10 %의 CO 2) / 분 1.5 L에서 2 CO에 노출 쥐를 안락사. 동물의 죽음을 보장하기 위해, CO 2에 노출 된 후 자궁 전위를 수행합니다.
- 70 % 에탄올로 전체 마우스 스프레이와 층류 후드에 배치합니다. 혈액 수집 TU에 1 ML의 주사기 및 전송로 25 G ½ 바늘을 사용하여 심장 천자하여 혈액을 수집EDTA 2 ㎎을 함유 할.
- 상완골 (humeri) 및 척추뿐만 아니라 다른 위치에 존재하는 거시적 전이 모두에서 비장, 부신, 난소, 신장, 간, 폐, 뇌, 오른쪽 다리, 골수 다음 조직을 수집합니다. 25, 26
- hypoxyprobe-1 검출을 포함 조직학 및 면역 화학, 10 % 중성 완충 포르말린의 각 조직의 절반을 수정합니다. 스냅는 RNA, DNA 또는 단백질 분리를위한 -80 ℃에서 저장, 액체 질소에 나머지 절반을 동결. 아래의 9 절에 설명 된 바와 같이 일차 세포 배양 용 25, 26는 조직 샘플을 수집한다.
9 차 세포 배양
- 차 세포 배양을 수행하려면, 층류 후드에서 무균 조건에서 검시 (위의 섹션 8) 중에 절단 된 사지 (위의 섹션 5) 또는에서 조직을 해부하다.
- 페니실린 소성을 주사에 사용 된 세포주 (200 단위 / ㎖)를위한 세포 배양 배지에 적절한 준비스트렙토 마이신 (200 μg의 / ㎖) fungizone (1 μg의 / ㎖), 0.2 %의 마이코 플라즈마 예방 항생제. 6 cm 세포 배양 접시에 차 배양액 2.5 ml에 놓습니다.
- 차 종양이나 전이에서 가능한 종양 조직 영역을 선택하고 멸균 가위를 사용하여 각 2-3mm에 두세 세그먼트를 분리.
참고 유력한 종양 조직은 일반적으로 종양의 가장자리에서 볼 때, 그 분홍 또는 붉은 색 상당한 광택 및 전체 습식 외모 괴사로부터 판별 될 수있다. 반대로, 괴사 조직은 일반적으로 종양의 중심에서 볼 및 무딘, 치즈 외관 희끄무레 / 크림색 질량으로 제시한다. (27) - 단계 9.2에 설명 된 기본 배지를 함유하는 6 cm 세포 배양 판에 절연 세그먼트를 전송합니다.
- 표준 조건 하에서 배양 세포로 부 1 (주) 9.2에 기재. 18, 28 ㅁ 조직 조각에서 발생하는 세포 부산물의 문화를 확인무형 문화 유산은 몇 일 이내에 관찰해야한다. 세포가 합류점에 도달하면를 Trypsinize 표준 세포 배양 기술에 따라이를 전달.
주 : 일차 세포 배양 물은이어서 전술 한 바와 같이, 성장 제어 및 저산소 종양뿐만 아니라 분자 특성으로부터 유도 된 세포의 전이 특성을 평가하는 데 사용될 수있다. (18)
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Representative Results
비복근 근육에 ES 세포의 주입 후, 일차 종양 250mm (3)의 소 사이즈로 성장할 수있다 (도 1, 2). 각각 SK-ES1 이종 이식에 대한 TC71 20 ~ 25 일 15 일 - 종양에 필요한 시간이 볼륨은 일반적으로 10 범위에 도달합니다. 250mm 3 전시 내인성 저산소증의 비교적 낮은 레벨의 체적 소에서의 종양 hypoxybrobe -1- (pimonidazole)에 기초하여, (종양 조직의 약 3 %) (도 4a, C)를 염색. 중요한 것은, 이들 제어 종양, hypoxyprobe-1에 대한 양성 염색은 혈관으로부터 먼 세포 사멸 (도 4a)를 거쳐 시작 종양 세포에서 전적으로 즉 생리 저산소증의 영역에서 관찰되었다. 건강한 종양 조직의 대부분이 hypoxyprobe-1에 대한 부정적인 남아있는 동안 이러한 염색, 특성 "에어 브러쉬"패턴을 나타낸다. <hypoxyprobe -1- 4 시간 후 FAL (도 4b)에서 종양 세포의 대부분 관찰 용 포지티브 염색에 의해 입증 SUP> 6 대조적 FAL이 단계에서 수행이 깊은 저산소증을 생성한다. 특히, hypoxyprobe-1 양성 종양 세포는 혈관 가까이 근접 생리 저산소증의 특징 패턴이 손실에서 관찰된다. 이 FAL 처리 된 종양에서 조직의 73 %는 저산소 종양 세포 (그림 4C)로 구성되어 있습니다. 종양 조직은 세포의 수축 및 삽입 구조 (도 4b)를 포함 저산소증 - 유도 된 손상의 첫번째 징후를 나타낸다.
FAL의 효과는 상기 주 종양 성장의 완전한 억제에 의해 지원되었다. FAL 및 절단 사이 3 일 동안 일차 종양의 크기는 (도 5A)을 증가시키지 않았다. 반면, 마우스의 일차 종양 surger을 행하여 샴Y 따라서 수술 (도 5a)을받지 않는 대조군에서 종양의 성장 속도를 모방 약 650mm (3)의 부피에 도달 급속 성장을 계속했다. (18)는이 데이터 라인에서 조직 병리학 적 분석 3 일 수술 후 (그림 5B) 수확 FAL 처리 기본 종양 괴사의 광범위한 분야를 한 것으로 밝혀졌습니다. 그럼에도 불구하고, 혈관 (도 5B) 부근에 일반적으로 종양의 가장자리에있는 종양 조직 내에 존재하는 생존 가능한 종양 세포의 그룹은,이 있었다. 이어서 공유 결합이 세포 내에서 단백질과 결합하는 능력을 얻고, 실시간 저산소 세포 활성화 우리 hypoxyprobes 사용이 세포의 산소 상태를 조사한다. (29) 등이 프로브는 어느 시점에서 저산소증을 경험하는 세포의 영구 마커 역할을한다. 따라서, experim 기간 내내 종양 세포의 산소 농도의 변화를 검출하도록천만에, 우리는 면역 조직 화학에 의해 독립적으로 검출 할 수있는 두 가지 서로 다른 hypoxyprobes을 사용했다. 프로브는이 시점에서 투여 하였다 - FAL은 (hypoxyprobe-1) 이전 절단에 (hypoxyprobe-2, CCI-103F) 직전 - 및 현지화 수확 종양에서 삼일 후 FAL (그림 1) 검출되었다. 티슈는 (도 5C)에 심각한 저산소되면서 Hypoxyprobe-1 FAL시 시스템의 존재, 종양 세포의 대부분을 표시했다. 이들 세포는 FAL시 여전히 살아 영구적 hypoxyprobe -1- 결합 할 수 있으므로 이후도 4b에 도시 된 바와 같이,이 라벨은 또한 괴사 / 세포 사멸의 영역에서 분명하다. 괴사 영역에서 세포가 죽은 이미 그 투여 (도 5D)시에 프로브를 활성화 할 수 없었다 같이 반대로 hypoxyprobe-2 포스트 FAL 만 생존 세포 염색이 일 투여 될 수있다. 흥미롭게도, 우리는 또한 obse(hypoxyprobe-1 양성)이었다 저산소 초기 혈관 인접 가능한 종양 조직을 rved하지만 적절 이후 시점에서 산소 (hypoxyprobe -2- 음극) (도 5c, D). 이 발견은 담보 용기에 의존하는 조직 재관류가 뒷다리 삼일 후 FAL에서 혈액의 흐름을 복원 나타내는 이전 보고서와 일치한다. 종양 (도 5E)의 가장자리 혈관에 미치는 막대한 intravasation 의해 입증 20 종양 조직 삼일 후 FAL에 남아있는 살아있는 종양 세포는 고도로 침윤성이었다. 혈관 내강 내에서 세포의 일부는 FAL에 저산소증이되었다 있음을 나타냅니다 hypoxyprobe-1 양성했다, 아직 실행 가능한 남아 있었다. 종합적으로, 이러한 데이터는 기본 종양에서 세포의 탈출을 용이하게 할 수있다 심한 저산소증에 따라 그 조직의 재관류를 제안한다.
파일럿 실험을 바탕으로, 광범위 전이이었다TC71 세포는 일반적으로 15 일 이내에 전이하면서 SK-ES1 이종 이식에 대한 검출 MRI로 약 삼십오일 후 절단. 15 일째에 한 촬상 TC71 종양을 가진 마우스에 충분한 동안 따라서, 전이 대기 시간 및 주파수의 비교 분석을 위해, MRI는 15 일째와 SK-ES1 종양을 갖는 동물을 35 후 절단 수행 하였다. 안락사는 각각 SK-ES1 및 TC71 이종 이식과 동물 일 50 일 25 일에 실시 하였다. 이전에보고 된 바와 같이, 전이의 가장 일반적인 유형은 소프트 숄더 영역에서 조직 질량뿐만 아니라, 반대측의 다리, SK-ES1 세포 상악 영역 및 척추 및 폐 및 TC71 골반 종양 골전이 포함되었다. 또한도 18은, 부신, 폐, 간,뿐만 아니라 골수 침윤을 포함한 내부 장기에 자주 전이는 FAL 처리 SK-ES1 이종 이식 베어링 마우스 (도 6)에서 관찰되었다. 일반적으로 저산소증 크게 증가두 세포주의 전반적인 (SK-ES1) 또는 특정 사이트 (TC71) 주파수 및 전이의 다양성. 이전에 큰 TC71 차 종양에 대한 설명 그러나, TC71 이종 이식은, (FAL 처리 된 종양 제어를위한 25 % 및 40 %) 절단의 사이트에 자주 재발 질량을 개발했다. (18)
제어 및 FAL 처리 기본 종양과 전이에서 조직은 ES 보급에 관련된 저산소증 활성화 경로를 식별하기위한 포괄적 인 분자 분석을위한 데이터의 소스가 될 수 있습니다. 예를 들어, 제어 및 저산소 차 종양의 대사 물질의 상당한 차이를 관찰 (데이터는 보이지 않음). 우리는 또한 성공적으로 위의 조직 모두에서 여러 세포 라인을 분리 할 수 있었다. 원래의 세포에 비해 그 제어 TU로부터 유도로 많은 경우, FAL 처리 종양 유래의 세포 형태에 띄는 변화를 나타내mors (도 7a). 이러한 세포 배양의 순도는 유잉 육종 마커, CD99 (도 7b)에 대한 긍정적 인 면역 염색에 의해 확인되었다. 또한, 기존의 세포주에서 세포 100 % 늘어난 염색체 번호 (도 8a)으로 제시하고, 인간 센트로 미어 프로브 계내 혼성화 (FISH)의 형광 양성 신호를 가졌다. 이러한 세포는 인간 기원은 또한 이전 FAL 처리 된 종양 (도 8b)로부터 유도 된 원래 세포주 및 세포 모두에서 SK-ES1 세포에 대해 기재된 염색체 재 배열을 나타내 중기 염색체 (도 8b)의 분석에 의해 확인되었다. (30)
배아 줄기 저산소증 모델 1. 개요도. ES 세포 (1-2 × 10 6) gastrocn에 주입했다SCID / 베이지 색 마우스의 emius 근육. 얻어진 일차 종양 250mm (3)의 소 부피에 도달하면, 마우스를 두 그룹으로 나누어 실험 하였다. 대조군 마우스는 hypoxyprobe -1- (HP-1)를 주사하고, 일차 종양 사지 절단에 의해 절제 하였다. 저산소 그룹 쥐 hypoxyprobe 1 주입 후 대퇴 동맥 결찰 (FAL)를 실시 하였다. 이틀 후에 마우스 hypoxyprobe -2- (HP-2)를 주사 한 후, 종양을 담지 사지 사흘 후 FAL을 절단 하였다. 두 그룹에서 동물 주기적 자기 공명 영상 (MRI)에 의해 모니터링 하였다. 전이 이미징 및 임상 증상에 기초하여 명백하게되었다하면, 마우스를 안락사시키고, 전이의 존재는 검시 및 조직 병리학 적 분석에 의해 확인 하였다. 종양 성장, 이미징 안락사 시간은 성장 및 전이의 SK-ES1 셀 레이트에 기초한다. hypoxyprobe -2- 필요 동안 방법 및 VISU을 확립 유의ALIZE은 FAL 및 사지 절단 사이의 기간 동안 저산소증 수준의 변화, 그것의 사용은 실제 실험에 필수적인 것은 아니다. 따라서,이 단계는 프로토콜에 포함되지 않는다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
2 차 종양의 성장을 그림. 손상되지 않은 뒷다리의 A. 자기 공명 영상 (MRI). 빨간색 화살표는 종양 세포 소성을 주사 부위와 방향을 나타냅니다. 약 250mm 3 비복근 근육 (빨간색 테두리)에서 성장의 송아지 볼륨에서 B. 기본 종양. 레드 화살촉은 골 파괴의 위치를 나타냅니다. T - 경골. 하십시오 C이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 핥아.
그림 3. 대퇴 동맥 결찰의 사이트. 황산 바륨으로 관류 129S1 / SVJ 쥐의 대표적인 사후 X 선 조영술 즉시 결찰 후 기존 측부 혈관의 존재를 강조하도록 도시되어있다. 근처 화상 개의 결찰 (X가) 횡 곡절 대퇴 동맥 (LCFA) (적색 X) 및 제누 동맥 (화이트 X)으로 서로 인접한 하나의 선단부를 도시하는 동안 종양 저산소증 모델 만 근위 결찰을 사용했다 LCFA에 사타구니 인대 및 원위부 (빨간색 X). 측부 혈관 발달의 영역은 기재 (희미한 용기)로서 도시되고, 이들은 비틀린 코르크 스크루 형상에 의해 식별된다. 그는를 클릭 해주세요이 그림의 더 큰 버전을 보려면 다시.
그림 4. 종양의 저산소증은 대퇴 동맥 결찰 (FAL)에 의해 유도. A. 헤 마톡 실린 및 에오신 (H & E)으로 염색 hypoxyprobe-1 (갈색)에 대한 면역 염색 250mm 3의 송아지 볼륨에서 제어 종양. Hypoxyprobe-1 면역 염색 단독 혈관으로부터 먼 종양 세포는 산소 박탈하고 세포 사멸을 겪는다 시작되는 생리 종양 저산소증의 영역에서 관찰된다. B. 수확 비슷한 크기의 4 시간의 후 결찰에 차 종양을 FAL은 처리 및 H & E 염색과 hypoxyprobe-1에 대한 면역 염색. 종양 세포의 대부분은 혈관에 근접 포함한 hypoxyprobe-1에 매우 긍정적이다. V - 혈관. C. hypoxyprobe-1 quantif했다 양성 염색의 영역ImageJ에 소프트웨어를 사용하여 제어 및 FAL 처리 된 종양에서 IED. 오차 막대는 SEM을 나타냅니다. *** - P <0.001 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
차 종양의 성장에 대퇴 동맥 결찰 (FAL) 그림 5. 효과. FAL- 수술 및 절단 사이 3 일 동안 A. 원발 종양의 성장 (N = 4), 모의 수술 처리 (N = 4) 동물 그대로 제어 종양에 비해 (N = 6). 오류 바 SD를 나타냅니다. *** - p <0.001, 두 제어 및 가짜 수술 - 처리 된 종양에 비하여. FAL 처리 된 종양의 B. 헤 마톡 실린 및 에오신 (H & E) 염색 후 결찰 종양 내에서 광범위하게 괴사를 보여 삼일 수확. 빨간색 윤곽이 가능한 종양 가전의 영역을 나타냅니다높은 혈관 영역에 근접 LLS 포스트 FAL 3 일 관류. C. FAL 처리 된 종양 조직 3 일을 hypoxyprobe-1에 대한 면역 염색 후 수술을 수확. Hypoxyprobe-1 FAL 전에 주입 하였다. 따라서, 양 면역 즉시 광범위한 조직 저산소증의 존재 수술 후를 나타낸다. D. Hypoxyprobe-2는 절단에서, 조직 수집 24 시간 이상 이일 후 FAL 주입 하였다. 긍정적 인 hypoxyprobe-2 염색 절단시 조직의 저산소증을 식별합니다. 노란 화살표 직후 저산소이었다 혈관에 인접한 영역을 나타내는 반면, 적색 화살표 저산소 두 시점에서 인 조직을 나타내는 FAL (hypoxyprobe-1 양성) 절단시 hypoxyprobe-2이지만 음수 어느 조직 재관류 나타낸다. 괴사 영역에서 hypoxyprobe -2- 염색의 부족은이 영역에서의 세포의 투여 따라서시 생존되지 않았 음을 암시적극적으로 프로브를 결합 할 수 없습니다. 패널 BD에 제시된 일련 염색 조직 절편에서 수행 하였다. 의 E. Intravasation 종양 삼일 후 FAL FAL은 처리. 면역 염색은 hypoxyprobe-1 혈관 내강 (빨간색 화살표) 내에서 긍정적 가능한 세포를 식별합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
FAL 처리 된 SK-ES1 종양 베어링 마우스의 전이 그림 6. 예. 전이는 자기 공명 영상 (MRI)에 의해 감지되고 검시 및 조직 병리학 분석 (헤 마톡 실린 및 에오신 염색, H & E)으로 확인 하였다. M - 전이. 더 큰 적이있는을 보려면 여기를 클릭하십시오 이 그림의 이온.
FAL 처리 기본 종양에서 파생 된 세포의 7 특성 그림. A. 생존 세포 배양 제어 저산소 차 종양으로부터 수확 된 조직으로부터 수립하고, 그 형태는 초기 소성을 주사에 사용 된 원래의 세포주와 비교 하였다. FAL 처리 차 종양으로부터 유래 세포는 그 크기 및 형태에서 극적인 변화를 나타낸다. 일본어 일차 종양 유래 SK-ES1 세포의 대표적인 이미지를 나타낸다. 배아 줄기 마커, CD99에 대한 면역 염색 FAL 처리 된 종양에서 유래하고, DNA 결합 염료, DAPI으로 대조 세포의 B. 대표 이미지. 모든 세포는 크게 핵 (흰색 화살표)를 포함 비대 세포를 포함, CD99 양성이다. OAD / 54532 / 54532fig7large.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
FAL 처리 된 종양으로부터 유도 된 세포의 제 염색체 분석 도표. 현장 하이브리드의 A. 형광 인간 센트로 미어 4 프로브 신호에 두 개의 핵을 나타내는 계면 세포 (FISH) 분석. 네 개의 신호에 큰 핵은 배체 (4N) 세포 (흰색 화살표)을 나타냅니다. SK-ES1 원래의 세포 라인의 대표 중기 및 FAL 처리 원발 종양에서 파생 된 세포의 B.의 FISH 분석. 빨간 화살표는 반전 (1) (p13.1q21)는 SK-ES1 세포의 비 랜덤 염색체 재정렬 특성을 나타낸다. 빨간 신호 : 인간 센트로 미어 4 프로브; 원래 SK-ES1 세포에서 녹색 신호 : 염색체 4q32.2에 NPY5R 프로브.e.com/files/ftp_upload/54532/54532fig8large.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
우리의 모델은 두 개의 실험 그룹 전이 비교 포함 - 종양 250mm (3)의 커프 용적에 도달시 절단 뒤에 뒷다리에서 개발 허용 대조군 및 저산소증 노출기를되는 tumor-에서 베어링 뒷다리 3 일 후에 절단 한 다음, 동일 볼륨 FAL 받는다. 제어 종양에 비해이 실험의 FAL 처리 된 종양은 약간의 지연과 함께 절단 된 경우에도, 그 사이즈 및 절단 결찰 사이 3 일 동안 증가하지 않는다. 따라서, 이러한 접근법은 유사한 크기이지만 저산소증 극적으로 다른 레벨 간의 전이성 암 전위의 비교를 가능하게한다. 대조적으로, 모의 수술을 이용하여 종양 성장 후 3 일 뒤에 수술 개입 흔히 이용 제어부는 모의 - 수술 치료와 실험군 간의 종양 크기에 유의 한 차이를 초래내인성 저산소증 유의 수준을 갖는 차 종양 에드. 파일럿 실험을 바탕으로, 모의 수술 크게 종양 성장 또는 저산소증 수준에 영향을주지 않으며, 따라서 실험 설계로부터 제거 될 수있다. 대신에, 유사한 크기의 다른 저산소 농도의 종양을 비교하는 전략은 질병의 보급에 저산소증의 효과를 밝히기위한 매우 중요한 모델이다. 중요한 것은, 시험관 연구에서 이전과는 달리,이 방법은 자연 종양 미세 환경에서 저산소증의 프로 전이성 행동의 포괄적 인 평가를 할 수 있습니다. 4-6
실험 설계의 목표는 그들의 형성에 저산소증 - 유도 자극 효과의 검출을 허용 전이 낮은 기저 수준을 달성 하였다. 우리는 송아지 FAL에서 250mm 3의 크기와 절단이 SK-ES1 차 종양에 대한 최적의 것을 설립했다. 그러나,이 파라미터는 EA에 대해 최적화 될 필요 채널 세포주, 자신의 전이성 잠재력과 지역의 침입에 따라. 높은 전이성 잠재력을 가진 종양의 경우, 절단의 주요 종양의 크기가 감소 될 필요가있다. 예를 들어, TC71 종양 절단 부위에서 종양 재발의 빈번한 형성에 의해 발현이 높은 지역의 침입을 나타낸다. 이러한 대중 개발 (18)되면, 동물 후속 원격 전이가 기본 종양 또는 자주 빠르게 성장하고 내인성 저산소증의 높은 수준을 보이는 재발 성 종양에서 유래하는 경우가 명확하지 않을 것 같은 분석에서 제외되어야한다. 이전의 경험에서, 세포주는 독립적 150mm 3 최소 담암 송아지를 신뢰성있게 측정 할 수있는 크기와 정규화 사용. FAL 및 절단에서 종양 크기를 감소하는 종양 재발을 제거 또는 충분히 기저 전이 속도가 감소하지 않을 경우, 해당 특정 세포주는 이들 실험에 적합하지 않을 수있다.
ve_content는 "> 마찬가지로, 그 전이 지연에 따라 각각의 세포주에 대한 MRI의 타임 라인 안락사을 설정하는 것이 중요하다 없다. 특히, MRI 방해 수술 상처 클립 10 일 포스트보다 더 이전에 제거 될 수있다 수술이 기간 때로는 치유 의한 합병증으로 연장되어야한다. 따라서, 우리는 제 MRI의 시간으로 15 일이 확립 연구.이 모델의 또 다른 중요한 고려 사항은 종양 세포의 보급을 방해하는 전체 종양 괴사를 유발하지 않고 전이 과정을 유도 할 수있는 저산소증의 레벨을 유지하고있다. 우리는이 연구에서이 문제가 발생하지 않지만 필요한 경우, 저산소증의 정도는 같은 LCFA 및 제누 동맥과 대퇴 동맥의 가지에 관련하여 정확한 위치 및 결찰의 수를 변경하여 조절 될 수있다. 20 따라서, LCFA에 결찰 근위부는 안녕에 더 심한 허혈을 만듭니다ndlimb 순환시켜 원위 다리 저산소 상태를 증가시킨다. 대조적으로, 대퇴 동맥의 후속 분기 말단에 결찰하여 하부 사지에서 얻어진 저산소 감소된다.
중요한 것은, 결합 FAL 및 절단 절차의 더 심각한 부작용과 이전에 별도로 수행이 기술에 대해보고 된 바와 같이, 수술과 관련없이 사망은 없었다. 18-20 따라서, 상기 방법의 성공은 일차 종양 부위에서 인출 속도 및 세포주 의존 둘 재발 성 종양의 빈도에 의해 주로 제한된다.
저산소증은 다양한 종양 유형의 친 전이성 인자로서 연루되어,이 접근법은 또한 직접 효과를 테스트하고 사지 발전 다른 육종에서 행동의 메커니즘을 형성하기에 적합 할 수있다. (23) 또한, 유사한 전략 w 동소 환경에서 성장하는 다른 악성 종양에 적용 할 수있다잘 정의 된 혈액 공급 경로 번째. 따라서, 적절한 수정과,이 모델은 ES 생물학의 분야 이외의 연구에 유용한 도구가 될 수 있습니다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SK-ES1 Human Ewing sarcoma (ES) cells | ATCC | ||
| TC71 Human ES cells | Kindly provided from Dr. Toretsky | ||
| McCoy's 5A (modified) Medium | Gibco by Life Technologies | 12330-031 | |
| RPMI-1640 | ATCC | 30-2001 | |
| PBS | Corning Cellgro | 21-040-CV | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442-500mL | |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1x) | Gibco by Life Technologies | 25200-056 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco by Life Technologies | 15140-122 | |
| Fungizone® Antimycotic | Gibco by Life Technologies | 15290-018 | |
| MycoZap™ Prophylactic | Lonza | VZA-2032 | |
| Collagen Type I Rat tail high concetration | BD Biosciences | 354249 | |
| SCID/beige mice | Harlan or Charles River | 250 (Charles River) or 18602F (Harlan) | |
| 1 ml Insulin syringes with permanently attached 28 G ½ needle | BD | 329424 | |
| Saline (0.9% Sodium Chloride Injection, USP) | Hospira, INC | NDC 0409-7984-37 | |
| Digital calipers | World Precision Instruments, Inc | 501601 | |
| Surgical Tools | Fine Science Tools | ||
| Rimadyl (Carprofen) Injectable | Zoetis | ||
| Hypoxyprobe-1 (Pimonidazole Hydrochloride solid) | HPI, Inc | HP-100mg | |
| hypoxyprobe-2 (CCI-103F-250 mg) | HPI, Inc | CCI-103F-250mg | |
| Povidone-iodine Swabstick | PDI | S41350 | |
| Sterile alcohol prep pad | Fisher HealthCare | 22-363-750 | |
| LubriFresh P.M. (eye lubricant ointment) | Major Pharaceuticals | NDC 0904-5168-38 | |
| VWR Absorbent Underpads with Waterproof Moisture Barrier | VWR | 56617-014 | |
| Oster Golden A5 Single Speed Vet Clipper with size 50 blade | Oster | 078005-050-002 (clipper), 078919-006-005 (blade) | |
| Nair Lotion with baby oil | Church & Dwight Co., Inc. | ||
| Silk 6-0 | Surgical Specialties Corp | 752B | |
| Prolene (polypropylene) suture 6-0 | Ethicon | 8680G | |
| Vicryl (Polyglactin 910) suture 4-0 | Ethicon | J386H | |
| Fisherbrand Applicators (Purified cotton) | Fisher Scientific | 23-400-115 | |
| GelFoam Absorbable Dental Sponges - Size 4 | Pfizer Pharmaceutical | 9039605 | |
| Autoclip Wound Clip Applier | BD | 427630 | |
| Stereo Microscope | Olympus | SZ61 | |
| Autoclip remover | BD | 427637 | |
| Aound clip | BD | 427631 | |
| MRI 7 Tesla | Bruker Corporation | ||
| Paravision 5.0 software | Bruker Corporation | ||
| CO2 Euthanasia system | VetEquip | ||
| 25 G 5/8 Needle (for heart-puncture) | BD | 305122 | |
| 0.1 ml syringe (for heart-puncture) | Terumo | SS-01T | |
| K3-EDTA Micro tube 1.3 ml | Sarstedt | 41.1395.105 | |
| 10% Neutral Buttered Formalin | Fisher Scientific | SF100-4 |
References
- Lessnick, S. L., Ladanyi, M. Molecular pathogenesis of Ewing sarcoma: new therapeutic and transcriptional targets. Annu Rev Pathol. 7, 145-159 (2012).
- Ladenstein, R. Primary disseminated multifocal Ewing sarcoma: results of the Euro-EWING 99 trial. J Clin Oncol. 28, 3284-3291 (2010).
- Dunst, J., Ahrens, S., Paulussen, M., Burdach, S., Jurgens, H. Prognostic impact of tumor perfusion in MR-imaging studies in Ewing tumors. Strahlenther Onkol. 177, 153-159 (2001).
- Aryee, D. N. Hypoxia modulates EWS-FLI1 transcriptional signature and enhances the malignant properties of Ewing's sarcoma cells in vitro. Cancer Research. 70, 4015-4023 (2010).
- Knowles, H. J., Schaefer, K. L., Dirksen, U., Athanasou, N. A. Hypoxia and hypoglycaemia in Ewing's sarcoma and osteosarcoma: regulation and phenotypic effects of Hypoxia-Inducible Factor. BMC cancer. 10, 372 (2010).
- Tilan, J. U. Hypoxia shifts activity of neuropeptide Y in Ewing sarcoma from growth-inhibitory to growth-promoting effects. Oncotarget. 4, 2487-2501 (2013).
- Franzius, C. Successful high-resolution animal positron emission tomography of human Ewing tumours and their metastases in a murine xenograft model. Eur J Nucl Med Mol Imaging. 33, 1432-1441 (2006).
- Hauer, K. DKK2 mediates osteolysis, invasiveness, and metastatic spread in Ewing sarcoma. Cancer Research. 73, 967-977 (2012).
- Manara, M. C. Preclinical in vivo study of new insulin-like growth factor-I receptor--specific inhibitor in Ewing's sarcoma. Clin Cancer Res. 13, 1322-1330 (2007).
- Scotlandi, K. Murine model for skeletal metastases of Ewing's sarcoma. J Orthop Res. 18, 959-966 (2000).
- Vormoor, J. Establishment of an in vivo model for pediatric Ewing tumors by transplantation into NOD/scid mice. Pediatr Res. 49, 332-341 (2001).
- Picarda, G. Preclinical evidence that use of TRAIL in Ewing's sarcoma and osteosarcoma therapy inhibits tumor growth, prevents osteolysis, and increases animal survival. Clin Cancer Res. 16, 2363-2374 (2010).
- Vormoor, B. Development of a preclinical orthotopic xenograft model of ewing sarcoma and other human malignant bone disease using advanced in vivo imaging. PLoS One. 9, e85128 (2014).
- Wang, Y. Platelet-derived growth factor receptor beta inhibition increases tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL) sensitivity: imatinib and TRAIL dual therapy. Cancer. 116, 3892-3902 (2010).
- Wang, Y. X. Inhibiting platelet-derived growth factor beta reduces Ewing's sarcoma growth and metastasis in a novel orthotopic human xenograft model. In Vivo. 23, 903-909 (2009).
- Odri, G. A. Zoledronic acid as a new adjuvant therapeutic strategy for Ewing's sarcoma patients. Cancer Research. 70, 7610-7619 (2010).
- Merchant, M. S. Interferon gamma enhances the effectiveness of tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand receptor agonists in a xenograft model of Ewing's sarcoma. Cancer Research. 64, 8349-8356 (2004).
- Hong, S. H. High neuropeptide Y release associates with Ewing sarcoma bone dissemination - in vivo model of site-specific metastases. Oncotarget. 6, 7151-7165 (2015).
- Lee, E. W. Neuropeptide Y induces ischemic angiogenesis and restores function of ischemic skeletal muscles. J Clin Invest. 111, 1853-1862 (2003).
- Tilan, J. U. Platelet neuropeptide Y is critical for ischemic revascularization in mice. FASEB J. , (2013).
- Toffoli, S., Michiels, C. Intermittent hypoxia is a key regulator of cancer cell and endothelial cell interplay in tumours. The FEBS journal. 275, 2991-3002 (2008).
- Das, B. Hypoxia enhances tumor stemness by increasing the invasive and tumorigenic side population fraction. Stem cells (Dayton, Ohio). 26, 1818-1830 (2008).
- Arndt, C. A., Rose, P. S., Folpe, A. L., Laack, N. N. Common musculoskeletal tumors of childhood and adolescence. Mayo Clin Proc. 87, 475-487 (2012).
- Mendoza, A. A novel noninvasive method for evaluating experimental lung metastasis in mice. J Am Assoc Lab Anim Sci. 52, 584-589 (2013).
- Feldman, D. B., Seely, J. C. Necropsy Guide: Rodents and the Rabbit. , CRC Press. (1988).
- Parkinson, C. M. Diagnostic necropsy and selected tissue and sample collection in rats and mice. J Vis Exp. , (2011).
- Raymond, A. K., Lazar, A. J. Bone Sarcoma. PP, L. in, S, P. atel , Springer. (2013).
- Dietel, M., Arps, H., Gerding, D., Trapp, M., Niendorf, A. Establishment of primary cell cultures: experiences with 155 cell strains. Klin Wochenschr. 65, 507-512 (1987).
- Varghese, A. J., Gulyas, S., Mohindra, J. K. Hypoxia-dependent reduction of 1-(2-nitro-1-imidazolyl)-3-methoxy-2-propanol by Chinese hamster ovary cells and KHT tumor cells in vitro and in vivo. Cancer Research. 36, 3761-3765 (1976).
- ATCC. , http://www.atcc.org/products/all/HTB-86.aspx#characteristics (2014).
