Introduction
Ewing-sarcoom (ES) is een agressieve maligniteit bij kinderen en adolescenten. 1 De tumoren in zachte weefsels en botten, gewoonlijk in de ledematen. Terwijl de aanwezigheid van metastasen is de meest krachtige prognostische factor voor ES patiënt, de onderliggende mechanismen hun ontwikkeling blijven onduidelijk. 2 Tumor hypoxie is een van de weinige factoren betrokken bij ES progressie. Bij ES patiënten, is de aanwezigheid van niet-geperfundeerde gebieden in het tumorweefsel geassocieerd met een slechte prognose. 3 In vitro verhoogt hypoxia invasiviteit van ES-cellen en triggers expressie van pro-metastatische genen. 4-6 Ondanks deze bewijslijnen, geen direct bewijs voor hypoxie geïnduceerde ES progressie en verspreiding bestaat. Bovendien, de mechanismen waarmee hypoxie uitoefent dergelijke effecten zijn momenteel onbekend. Daarom hebben we een in vivo model gemaakt om het gat te vullen tussen de bestaande in vitro data en klinische opmerkingen. Dit modelsysteem maakt direct testen van de effecten van hypoxie op tumoren die zich in hun natuurlijke omgeving, met behulp van magnetische resonantie beeldvorming (MRI) om tumorprogressie en metastase in vivo in combinatie met ex vivo pathologische en moleculaire analyses (figuur 1) te volgen.
Aangezien geen gevestigde transgeen model van ES is beschikbaar, de in vivo studies naar metastatische eigenschappen van deze tumoren afhankelijk injecties van menselijke cellen in immuungecompromitteerde muizen. Hoewel het gebruik van immunologisch verminderde dieren de effecten van het immuunsysteem het ziekteverloop kunnen onderschatten, het vermogen om menselijke cellen gebruiken verhoogt vertaalbaarheid van dergelijke studies. Tussen verschillende xenograft modellen, systemische injecties in de staartader zijn het makkelijkst uit te voeren, maar ze laat de eerste stappen van tumorcel intravasation en ontsnappen aan de primaire plaats van groei. 7-12 Anderzijds, orthoto pic xenografting, die injecties van tumorcellen omvat in bot (femur, rib) of spieren, is technisch uitdagend, maar ook biologisch menselijke kankerbestrijding. 13-16 In het verleden, de hoge morbiditeit geassocieerd met snelle groei van primaire tumoren vaak noodzakelijk euthanasie van dieren voor metastase ontwikkelen. In dit onderzoek gebruikten we een eerder vastgestelde model cel injecties in de gastrocnemiusspier gevolgd door excisie van de resulterende primaire tumor in combinatie met overlangse controle van metastatische progressie van MRI. 17,18 Dergelijke injecties in gastrocnemiusspier in de nabijheid van de tibia zorgen voor tumorgroei in twee natuurlijke milieus ES - spieren en botten - en leiden tot metastasen op afstand te plaatsen typisch getroffen mens. 18 Daardoor is dit model recapituleert nauwkeurig de metastatische processen in ES patiënten tijdens ziekteprogressie.
tent "> De lokalisatie van primaire tumoren bij de onderste achterbeen maakt ook de nauwkeurige regeling van de bloedtoevoer naar de tumor tissue. femorale slagader ligatie (FAL) is een gevestigde techniek gebruikt in angiogenese onderzoek bloedtoevoer naar distale gebieden van blokkeren het been en onderzoeken weefsel vascularisatie in reactie op ischemie. 19,20 Belangrijk is dat de initiële daling van de bloedstroom volgt collaterale tankopening en weefsel reperfusie geobserveerd ongeveer 3 dagen na FAL. 20 wanneer dus uitgevoerd in een tumordragende ledematen, dit model reproduceert hypoxie / reperfusie gebeurtenissen die van nature in snelgroeiende tumoren en maakt het ontsnappen van metastatische tumorcellen door herstel van de perfusie onderste achterbeen via nieuw geopende collaterale vaten. 21 Belangrijk is dat deze procedure moet worden uitgevoerd wanneer de tumorgrootte klein genoeg om buitensporige hypoxie controletumoren (typisch bij de tumordragende calf vol voorkomenume van 150-250 mm3) en zorgt voor aanzienlijke verschillen in tumorhypoxia tussen controle en FAL-behandelde groepen.Naast het longitudinaal volgen van het effect van hypoxia op ES latentie en de frequentie van metastasen, dit model maakt het ook voor het verzamelen van weefsel en de ontwikkeling van nieuwe cellijnen van zowel primaire tumoren en metastasen. Belangrijker eerdere werk vastgesteld dat-metastasen afgeleide cellijnen vertonen verbeterde metastatisch vermogen bij herintroductie dieren, wat aangeeft dat tumor verspreiding wordt geassocieerd met permanente veranderingen in de tumor cel fenotype, en waarbij het gebruik van deze cellijnen om de metastatische processen ontcijferen valideren. 18 Collectief kunnen deze modellen nu gebruikt worden voor de genetische en moleculaire analyses vereist voor het identificeren van hypoxie geïnduceerde metastatische trajecten.
Hypoxie is een pro-metastatische rol bij het versterken van de maligniteit van verschillende tumors, ons model kan worden gebruikt als een platform om de rol van hypoxie in andere tumortypen die van nature ontwikkelen ledematen, zoals osteosarcoom en rhabdomyosarcoom onderzoeken. 21-23 Bovendien kan dezelfde benadering worden toegepast maligniteiten groeien op andere anatomische locaties met een goed gedefinieerde route van bloedtoevoer. Uiteindelijk kan het model worden gemodificeerd en het nut verder uitgebreid, afhankelijk van de individuele behoeften aan onderzoek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedures werden goedgekeurd door de Georgetown University Institutional Animal Care en gebruik Comite.
1. Cell Voorbereiding voor Orthotope Injecties
- Cultuur menselijke embryonale cellen onder normale omstandigheden. Gebruik ongeveer een 15-cm celkweek plaat niet meer dan 70% van de samenvloeiing voor injectie van 5 muizen.
OPMERKING: Voor deze studie, SK-ES1 cellen werden gekweekt in McCoy's 5A medium met 15% foetaal runderserum (FBS) op met collageen beklede platen en TC71 cellen werden gekweekt in RPMI met 10% FBS en 1% 4- (2-hydroxyethyl ) -1-piperazineethaansulfonzuur (HEPES). Beide media werden aangevuld met antibiotica - penicilline (100 eenheden / ml), streptomycine (100 ug / ml) en fungizon (1 ug / ml). - Was de ES-cellen met met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) en trypsinize bij 70% confluentie met 0,25% trypsine / ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA) gedurende 5 min.
- Verwijder de ES-cellen van de plaat met celkweek media, centrifugeer 5 min bij 200 xg bij kamertemperatuur. Resuspendeer de ES-cellen in 10 ml koude PBS en tel het aantal cellen.
- Centrifugeer ES cellen gedurende 5 min bij 200 xg bij kamertemperatuur, en vervolgens opnieuw te suspenderen in 2 x 10 7 (SK-ES1) of 10 7 (TC71) cellen per ml in koude PBS. Houd de uiteindelijke celsuspensie op het ijs tijdens het uitvoeren van injecties.
2. Orthotope Injectie van ES-cellen in Gastrocnemius Muscle
- Gebruik 4-6 weken oude vrouwelijke SCID / beige muizen.
- ES cellen te injecteren, zachte hand de muis en stabiliseren het linkerbeen tussen de vierde en vijfde vingers, waardoor de mediale zijde van het onderste achterbeen.
- Met behulp van een 28 G ½, injecteer 0,1 ml van de vooraf bereide celsuspensie die ofwel 2 x 10 6 (SK-ES1) of 10 6 (TC71) ES-cellen in de gastrocnemius spier (Figuur 2A) bevat.
LET OP: Hoewel het maximale volume voor intramusculaire injreflecties typisch 0,05 ml, voor deze procedure de volumetoename aan 0,1 ml is nodig vanwege het grote aantal cellen geïnjecteerd. Deze procedure is goedgekeurd door de Georgetown University Institutional Animal Care en gebruik Comite.- Steek de naald in de gastrocnemiusspier voren bij ongeveer 30 - 45 graden in de richting van het tibiale kam / tuberositas.
- Iets van de naald terug te trekken als het eenmaal het scheenbeen kuif / tuberosity raakt. Injecteer langzaam de celsuspensie oplossing, geleidelijk terugtrekken van de naald om de druk vrij te geven.
- Bewaken van de geïnjecteerde muizen in de komende 24 uur op tekenen van nood.
LET OP: Onderzoekers met minder ervaring in het omgaan met dieren zou moeten overwegen verlamming muizen voor tumorcel injecties. Sommige instellingen kan anesthesie om veiligheidsredenen nodig is.
3. Monitoring Primaire tumorgroei
- Bewaken van de groei van de primaire tumoren dAily totdat de tumorgrootte bereikt het gewenste volume.
Opmerking: In de huidige studie, een kalf volume van 250 mm3 werd gebruikt als uitgangspunt voor het experiment (figuur 2B). Gewoonlijk duurt het ongeveer 1-2 weken voor de tumoren om deze grootte te bereiken.- Meet het kalf omvang dagelijks met digitale schuifmaat via de mediale-laterale en anterior-posterior lengtes.
- Bepaal het kalf volume door de formule (D xd 2/6) x 3,14, waarbij D de grootste diameter en d is de kortere diameter van de tumordragende lagere achterbeen.
OPMERKING: De grootte van de normale volwassen muis kalf van ongeveer 40-50 mm3. Het volume toenemen door tumorgroei en op het vervolg zal het kalf hoofdzaak bestaan uit tumorweefsel.
4. Femorale Artery Ligatie (FAL) voor het induceren van hypoxie in de tumor-dragende achterbeen
- Bereid de chirurgische instrumenten die nodig zijn voor deze operatie: curved of wees fijne tang, wees tang, chirurgische schaar en een naald houder. Steriliseren deze tools voorafgaand aan de operatie met behulp van een autoclaaf of een hot-bead sterilisator. Daarnaast hebben mooie wattenstaafjes klaar voor deze operatie.
LET OP: Het wordt aanbevolen dat de instrumenten die opnieuw worden gesteriliseerd bij de tips die nodig zijn tijdens de procedure. - Injecteer analgetisch middel (Carprofen 5 mg / kg) subcutaan (SQ). Op te sporen en te bevestigen hypoxie Injecteer hypoxyprobe-1 (pimonidazole, 60 mg / kg).
Opmerking: Deze dosis komt overeen met 1,5 mg per muis en wordt bereikt door het injecteren van 0,1 ml van 15 mg / ml hypoxyprobe oplossing in PBS intraperitoneaal (IP). De hypoxyprobe is dan detecteerbaar postmortem in dierlijk weefsel door immunohistochemie. - Plaats de muis in een anesthesie inductie kamer met 3-5% isofluraan in 100% zuurstof bij een debiet van 1 l / min.
- Laat de muis in de inductie kamer tot deze reageert op externe stimuli. Verwijder vervolgens het dier uit de induction kamer. Plaats het dier in rugligging op een steriel laken geplaatst boven op een warming pad op het bedrijfsresultaat oppervlak. Gebruik een neuskegel aan te sluiten op een continue stroom van 1-3% isofluraan in 100% zuurstof bij een stroomsnelheid van 0,8 l / min.
- Breng een steriel niet-medicinale oogzalf om elk oog om het hoornvlies uitdroging te voorkomen. Om grondig ontharen de chirurgische gebied, van toepassing ontharingscrème, waardoor het op de huid niet meer dan 10 sec. Veeg uit de ontharingscrème met behulp van een ethanol prep pad.
- Uit te breiden en te beveiligen het achterbeen met een stuk tape ongeveer 45 graden vanaf de middellijn van de muis. Zodra het achterbeen veilig is, veegt u de blootgestelde huid met 10% povidon / jood wattenstaafje / oplossing, gevolgd door ethanol, het herhalen van twee keer per stuk. Voor de rest van de chirurgische procedure, gebruikt een stereomicroscoop om een vergroot aanzicht van het achterbeen regio te krijgen.
- Met behulp van puntige pincet en chirurgische schaar, maken een incisie van het skin, ongeveer 1 cm lang, van halverwege de dij in de richting van de liesstreek. Met behulp van een zoutoplossing bevochtigde fijne wattenstaafjes, zachtjes borstelen weg onderhuids vetweefsel rondom de dijspier.
- Zorgvuldig onthullen de onderliggende femoralis via stompe dissectie door het onderhuidse vetweefsel. Stabiliseren van de wond en chirurgische veld aan het vaatstelsel van de mid-upper adductor bloot te leggen.
- Met behulp van fijne tang voorzichtig doorboren door de membraneuze dij schede aan de neurovasculaire bundel bloot te leggen. Met behulp van een schone set van fijne tang, ontleden en scheiden de dijbeenslagader van de femorale ader en zenuw aan het proximale locatie in de buurt van de lies, distale aan de lies ligament. Wees voorzichtig om te voorkomen dat het doorboren van de lies muur.
- Na dissectie, langs een streng van 6-0 zijden hechtdraad onder de dij slagader en distaal van de tak van de laterale circumflex dijbeenslagader (LCFA). Afsluiten van de dij slagader met behulp van dubbele knopen (figuur 3). Sluit de incisie met behulp van 6-0 polypropyleen hechtingen. Na het sluiten van de incisie, injecteren SQ 0,5 ml warm zoutoplossing voor de vochtbalans therapie. Plaats het dier op een warm kussen gedrapeerd in het herstel kooi en controleren continu tot wakker.
- Monitor de dieren gedurende eerste 6 uur na de operatie en injecteer het analgetisch middel (Carprofen 5 mg / kg SQ) elke dag gedurende 3 dagen. Verwijder hechtingen 10 dagen na de operatie met behulp van steriele schaar.
5. primaire tumor Excision door beenamputatie
OPMERKING: amputeren de tumordragende lagere achterbeen wanneer de kuitomvang 250 mm3 voor de controlegroep of 3 dagen na FAL de hypoxische groep bereikt.
- Scheer haar van de tumor-dragende ledematen van de distale tibia aan het bekkengebied met tondeuses, terwijl zachtjes houden van het dier. Injecteer de analgetisch middel (Carprofen 5 mg / kg SQ) voor de behandeling.
- Plaats de muis in een anesthesie inductie chamber met 3-5% isofluraan in 100% zuurstof bij een debiet van 1 l / min. Laat de muis in de inductie kamer tot deze reageert op externe stimuli. Verwijder vervolgens het dier uit de inductie kamer.
- Plaats het dier in de juiste zijligging op een steriele doek geplaatst op een verwarmingskussen op het werkoppervlak. Gebruik een neuskegel aan te sluiten op een continue stroom van isofluraan 1-3% in 100% zuurstof bij een stroomsnelheid van 0,8 l / min. Breng een steriel niet-medicinale oogzalf om elk oog om het hoornvlies uitdroging te voorkomen
- Bereid de operatieplaats via 10% povidon / jood wattenstaafje / oplossing, gevolgd door ethanol, 3 keer herhalen. Breng een steriel gaas (bijvoorbeeld chirurgische doek) via muis een steriele chirurgische veld te verkrijgen.
- Wordt middelste femorale omtrek incisie, gevolgd door stompe dissectie en intrekken van de huid proximaal. Maak de mediale femorale neurovasculaire pedikel op de middelste zijde van het been, en ligerenin de buurt van de lies ligament met behulp van 4-0 gecoate (polyglactin 910) absorbeerbare hechtmateriaal.
- Voer een mid-femorale doorsnijding van spiergroepen met een schaar, gevolgd door stompe dissectie van zacht weefsel aan de coxofemorale gewricht. Met behulp van een bot mes, het uitvoeren van een mid-femorale osteotomie. Met behulp van een steriele fijne wattenstaafje of een absorbeerbare gelatine spons, voorzichtig op de osteotomie site om een minimum te beperken en te voorkomen bloeden.
- Sluit de bovenliggende huid met behulp van chirurgische wond clips en injecteer 0,5 ml warm zoutoplossing SQ voor vochtbalans therapie. Plaats het dier op een warm kussen gedrapeerd in het herstel kooi en controleren continu tot wakker.
- Bij chirurgie, verzamel weefselmonsters uit primaire tumoren RNA, DNA of eiwit isolatie snap bevriezen in vloeibare stikstof en bewaar bij -80 ° C. Voor primaire celkweek, verzamelen van weefselmonsters bij deze stap, zoals beschreven in hoofdstuk 9 hieronder. Bevestig de resterende ledematen weefsel in 10% neutraal gebufferde formaline voor histologie en immunochemisproberen, waaronder hypoxyprobe-1 detectie.
- Controleer de dieren voor vervoer, pijn en voedselconsumptie tijdens de eerste 6 uur na de operatie en vervolgens dagelijks gedurende 3 dagen. Injecteer de analgetisch middel (Carprofen 5 mg / kg SQ) dagelijks gedurende 3 dagen. Verwijder de wond clips 10 dagen na amputatie met behulp van een wond clip remover.
6. Monitoring muizen voor de aanwezigheid van metastasen
- Let op de muizen elke dag en een week te evalueren ze klinische tekenen van een metastase ten minste tweemaal.
- Observeer de dieren op de aanwezigheid van macrometastases presenteren als massa's die zich ontwikkelen op verschillende locaties, typisch schouders, contralaterale poten en kaken. Daartoe zorgvuldig palperen hoofd, nek en okselstreek en contralaterale achterbeen. Controleer op inwendige organen uitzaaiingen via een opgezette buik, samen met MRI-scan.
- Controleren op de aanwezigheid van longmetastasen door de xyphoid proces (de onderkant van het borstbeen) met index vinger. 24
LET OP: Deze druk vermindert het middenrif ademhaling capaciteit. Muizen met geavanceerde longmetastasen vertonen tekenen van ademnood gemanifesteerd door moeizame ademhaling. - Observeer de dieren neurologische symptomen, zoals verlamming en ataxie suggereren metastasen aan het centrale zenuwstelsel.
- Controleer de muizen ten minste eenmaal per week voor gewichtsverlies, als indicatie van potentiële ziekteprogressie. Gewichtsverlies van meer dan 15% van de pre-procedure gewicht wordt beschouwd als een humaan eindpunt.
7. Magnetic Resonance Imaging (MRI) voor het detecteren van Metastases
- Voer MRI om uitzaaiingen op gewenste tijdstippen te detecteren. 18
LET OP: In de huidige studie werd een 7-Tesla horizontale spectrometer gebruikt. MRI werd uitgevoerd op dag 15 en 35 na de amputatie voor SK-ES1 cellen en op dag 15 voor TC71 cellen. - Plaats de muis in een anesthesie inductie chamber met 1-3% isofluraan in een gasmengsel van 30% zuurstof en 70% stikstofoxide.
- Laat de muis in de inductie kamer tot deze reageert op externe stimuli. Verwijder vervolgens het dier uit de inductie kamer.
- Breng de verdoofde muis op een stereotaxische houder met ademhaling en temperatuur monitorization met continue toediening van 1,5% isofluraan en 30% lachgas. Breng een steriel niet-medicinale oogzalf om elk oog om het hoornvlies uitdroging te voorkomen. Afbeelding van het dier, hetzij in een 40 of 23 mm Bruker muis volume spoel voor het gehele lichaam of brain imaging, respectievelijk.
- Gebruik een tweedimensionale, T2-gewogen RARE sequentie: TR = 3000 msec, TE = 24 msec, matrijs = 256, FOV = 4,35 x 3,0 cm, plakdikte = 0,5 mm, RARE factor = 4 en gemiddelde = 4. 18
- Plaats het dier in een warme herstel kooi en monitoren continu tot wakker.
NB: De muizen zal snel herstellen, omdat een ondiepe vlak van anesthesie wordt gebruikt. Bewaken van de dieren tijdens de eerste 6 uur na beeldvorming om ervoor te zorgen dat er geen nadelige effecten van de narcose.
8. euthanasie en autopsie
- Euthanaseren de muizen eenmaal het heden met uitzaaiingen aantoonbaar met MRI en / of klinische symptomen van progressie van de ziekte dieren.
LET OP: In de huidige studie werden de muizen op dag 50 gedood en 25 post-amputatie voor dieren die SK-ES1 en TC71 xenotransplantaten, respectievelijk. In sommige gevallen eerder euthanasie noodzakelijk vanwege een hoge belasting metastase. - Euthanaseren de muizen door blootstelling aan CO2 op 1,5 l / min (CO 2 bij 10 - 30% van de euthanasie kamer vol / min). Om dier dood te garanderen, uit te voeren cervicale dislocatie na CO 2 blootstelling.
- Spuit de hele muis met 70% ethanol en plaats deze in de laminaire stroming kap. Verzamel het bloed door het hart doorboren met behulp van een 25 G ½ naald met een 1 ml spuit en transfer naar een bloedinzameling tuzijn die 2 mg van EDTA.
- Verzamel de volgende weefsels: milt, bijnieren, eierstokken, nieren, lever, longen, hersenen, rechterbeen, beenmerg zowel humeri en de wervelkolom, alsmede macroscopische metastasen aanwezig in andere locaties. 25,26
- Fix helft van elk weefsel in 10% neutraal gebufferde formaline voor histologie en immunochemische, waaronder hypoxyprobe-1-detectie. Snap bevriezen de andere helft in vloeibare stikstof en bewaar bij -80 ° C voor RNA, DNA of eiwit isolatie. 25,26 Voor primaire celkweek, het verzamelen van weefselmonsters zoals beschreven in hoofdstuk 9 hieronder.
9. Primaire Cell Culture
- Om primaire celkweek te voeren, ontleden weefsel van de geamputeerde ledemaat (paragraaf 5 hierboven) of tijdens de autopsie (paragraaf 8 hierboven) onder steriele omstandigheden in een laminaire stroming kap.
- Bereid celkweekmedia geschikt is voor de cellijn die voor orthotope injecties, aangevuld met penicilline (200 eenheden / ml),streptomycine (200 ug / ml), fungizon (1 ug / ml) en 0,2% mycoplasma profylactische antibiotica. Plaats 2,5 ml van de primaire kweekmedium in een 6-cm celkweek plaat.
- Selecteer levensvatbaar tumorweefsel gebieden uit primaire tumoren of metastasen, en vervolgens 2-3 segmenten van 2-3 mm elk met behulp van steriele schaar te isoleren.
OPMERKING: vitaal tumorweefsel wordt meestal aan de randen van de tumor en kan necrose worden onderscheiden door zijn roze of rode kleur, glans en significante algehele natte uitstraling. Daarentegen wordt necrotisch weefsel vaak gezien in het midden van de tumor en presenteert als een witachtige / crème kleur massa met een doffe, kaasachtige verschijning. 27 - Breng de geïsoleerde segmenten om een 6-cm celkweek plaat die primaire kweekmedium in stap 9.2 beschreven.
- Kweekcellen onder standaard condities, zoals beschreven in hoofdstuk 1 (NB) en 9.2. 18,28 Controleer de cultuur voor mobiele uitgroei die voortvloeien uit het weefsel stukken, which worden waargenomen binnen een paar dagen. Zodra cellen te bereiken samenvloeiing, trypsinize en propageren ze volgens de standaard celcultuur technieken.
OPMERKING: De primaire celkweek kan vervolgens worden gebruikt om groei en metastatische eigenschappen van de cellen afkomstig van controle- en hypoxische tumoren, en hun moleculaire functies te evalueren, zoals eerder beschreven. 18
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Na injectie van ES-cellen in gastrocnemiusspier, worden de primaire tumoren kunnen groeien tot een kuitomvang van 250 mm 3 (figuur 1, 2). De tijd die nodig is voor de tumoren bereikt dit volume varieert kenmerkend 10-15 dagen TC71 20-25 dagen SK-ES1 xenotransplantaten, respectievelijk. Tumoren op een kalf volume van 250 mm3 vertonen een relatief lage endogene hypoxie (ongeveer 3% van tumorweefsel), gebaseerd op hypoxybrobe-1 (pimonidazole) kleuring (Figuur 4A, C). Belangrijk in deze controletumoren de positieve kleuring voor hypoxyprobe-1 werd waargenomen slechts in het gebied van fysiologische hypoxie, dat wil zeggen in tumorcellen die ver van bloedvatstelsel en beginnen celdood (Figuur 4A) ondergaan. Dergelijke vlekken vertoont een karakteristieke "air-brush" patroon, terwijl het grootste deel van gezonde tumorweefsel negatief voor hypoxyprobe-1 blijft. <sup> 6 Daarentegen FAL uitgevoerd in dit stadium zorgt globale hypoxie, zoals blijkt uit de positieve kleuring voor hypoxyprobe-1 waargenomen in de overgrote meerderheid van de tumorcellen bij 4 uur na FAL (Figuur 4B). Met name worden de hypoxyprobe-1-positieve tumorcellen ook waargenomen in de nabijheid van bloedvaten en het karakteristieke patroon van fysiologische hypoxia verloren. In deze FAL behandelde tumoren 73% van weefsel uit hypoxische tumorcellen (Figuur 4C). Het tumorweefsel laat ook de eerste tekenen van hypoxie geïnduceerde schade, zoals mobiele krimp en losse structuur (Figuur 4B).
De effectiviteit van FAL werd verder ondersteund door de volledige remming van primaire tumorgroei. Tijdens de 3-daagse periode tussen FAL en amputatie, heeft de grootte van de primaire tumoren niet te verhogen (Figuur 5A). In tegenstelling primaire tumoren van muizen blootgesteld aan surger shamy bleef snel groeien tot een volume van ongeveer 650 mm 3, waardoor het nabootsen van de groei van tumoren in controlemuizen niet onderworpen aan chirurgie (figuur 5A). 18 In lijn met deze data, histopathologische analyse bleek uitgestrekte gebieden van necrose in FAL-behandelde primaire tumoren geoogst 3 dagen na de operatie (Figuur 5B). Toch waren er groepen van levensvatbare tumorcellen aanwezig in het tumorweefsel, zich meestal aan de randen van de tumor, dichtbij het vaatstelsel (Figuur 5B). Om de oxygenatie status van deze cellen gebruikten we hypoxyprobes, die geactiveerd levende hypoxische cellen, vervolgens wint het vermogen om covalent binden aan eiwitten in deze cellen te onderzoeken. 29 Als zodanig zijn deze probes dienen als een permanente marker van de cellen die hypoxie ervaren aan enig moment. Dus veranderingen in het zuurstofgehalte van de tumorcellen tijdens de duur van de experim detecterenent, gebruikten we twee verschillende hypoxyprobes die onafhankelijk door immunohistochemie kan worden gedetecteerd. De probes werden toegediend op twee tijdstippen - onmiddellijk vóór FAL (hypoxyprobe-1) en vóór amputatie (hypoxyprobe-2, CCI-103F) - en hun lokalisatie werd waargenomen in tumoren geoogst 3 dagen na FAL (figuur 1). Hypoxyprobe-1, die in het systeem aanwezig zijn FAL was, betekende een meerderheid van de tumorcellen, zoals het weefsel ernstig hypoxische (figuur 5C) werd. Deze kenmerken zich ook in gebieden van necrose / apoptose, aangezien deze cellen in leven waren op het moment van FAL en dus permanent kan binden hypoxyprobe-1, zie figuur 4B. Daarentegen hypoxyprobe-2 toegediend 2 dagen na FAL alleen gekleurde levende cellen, zoals de cellen in necrotische gebieden dood en krijgt de sonde ten tijde van de toediening (figuur 5D) activeren reeds. Interessant is dat we obse ookrved vitaal tumorweefsel naast de vasculatuur die aanvankelijk was hypoxische (hypoxyprobe-1-positief), maar voldoende zuurstof in de latere tijdstip (hypoxyprobe-2-negatief) (Figuur 5C, D). Deze bevinding is in overeenstemming met eerdere rapporten waaruit blijkt dat onderpand vaartuig-afhankelijke weefsel reperfusie herstelt de bloedstroom in het achterbeen 3 dagen na de FAL. 20 De levensvatbare tumorcellen die nog in het tumorweefsel 3 dagen na FAL waren zeer invasieve, zoals blijkt uit hun enorme intravasation op gevasculariseerde randen van de tumor (figuur 5E). Sommige van de cellen in het vat lumen positief voor hypoxyprobe-1, wat aangeeft dat zij op FAL hypoxische geworden, maar in stand bleef. Gezamenlijk suggereren deze gegevens dat weefsel reperfusie na ernstige hypoxie kan het ontsnappen van cellen uit de primaire tumor te vergemakkelijken.
Gebaseerd op het proefproject wijdverspreide metastasendetecteerbaar door middel van MRI ongeveer 35 dagen na de amputatie voor SK-ES1 xenotransplantaten, terwijl TC71 cellen meestal uitzaaiing binnen 15 dagen. Bijgevolg, voor een vergelijkende analyse van metastase latency en frequentie, werd MRI uitgevoerd op dag 15 en 35 na de amputatie van de dieren die SK-ES1 tumoren, terwijl één imaging op dag 15 voldoende is voor muizen met TC71 tumoren was. Euthanasie werd uitgevoerd op dag 50 en dag 25 voor de dieren met SK-ES1 en TC71 xenotransplantaten, respectievelijk. Zoals eerder gemeld, de meest voorkomende vormen van uitzaaiingen opgenomen weke massa in de schouder, evenals botmetastasen tot contralaterale poten, bovenkaak gebied en de wervelkolom voor SK-ES1 cellen, en longen en het bekken tumoren TC71. 18 Bovendien frequent metastasen aan inwendige organen, waaronder bijnieren, longen en lever, evenals beenmerg infiltratie werden waargenomen bij muizen met FAL behandelde SK-ES1 xenotransplantaten (Figuur 6). In het algemeen, hypoxie aanzienlijk toegenomende totale (SK-ES1) of site-specifieke (TC71) frequentie en het veelvoud van uitzaaiingen in beide cellijnen. Echter, TC71 xenotransplantaten ontwikkelde ook frequent terugkerende massa op de plaats van amputatie (25% voor de controle en 40% voor FAL-behandelde tumoren), zoals eerder beschreven voor de grote TC71 primaire tumoren. 18
De weefsels van controle en FAL behandelde primaire tumoren en metastasen kunnen ook een bron van materiaal voor een volledige moleculaire analyses gericht op de identificatie van hypoxie geactiveerde routes betrokken bij ES verspreid zijn. We bijvoorbeeld significante verschillen in metabolomic profielen van controle en hypoxische primaire tumoren waargenomen (gegevens niet getoond). We waren ook in staat om meerdere cellijnen van alle bovengenoemde weefsels succes isoleren. In veel gevallen, de cellen afkomstig van FAL-behandelde tumoren vertoonden merkbare veranderingen in morfologie, vergeleken met de oorspronkelijke cellen en de afgeleiden van controle tumors (Figuur 7A). De zuiverheid van deze celcultures werd bevestigd door positieve immunokleuring voor Ewing sarcoom marker, CD99 (Figuur 7B). Bovendien, 100% van de cellen in de gevestigde cellijnen had een positief signaal in fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) met menselijke centromere probes, vaak voorkomend met verhoogde chromosoomaantallen (figuur 8A). De humane oorsprong van deze cellen werd verder bevestigd door analyse van de metafase chromosomen (figuur 8B) die cytogenetische herschikkingen eerder beschreven voor SK-ES1 cellen in zowel de oorspronkelijke cellijn en cellen afkomstig van FAL-behandelde tumoren (Figuur 8B) vertoonde. 30
Figuur 1. Overzicht van de ES Hypoxie Model. ES-cellen (1-2 x 10 6) werden geïnjecteerd in gastrocnemius spieren van SCID / beige muizen. Als het uiteindelijke primaire tumoren een kalf volume van 250 mm3 bereikten werden de muizen verdeeld in twee experimentele groepen. Muizen uit de controlegroep werden geïnjecteerd met hypoxyprobe-1 (HP-1) en de primaire tumoren werden uitgesneden door amputatie. Muizen uit de hypoxische groep werden geïnjecteerd met hypoxyprobe-1 en vervolgens onderworpen aan dijbeenslagader ligatie (FAL). Twee dagen later werden de muizen geïnjecteerd met hypoxyprobe-2 (HP-2), en vervolgens werden de tumordragende ledematen amputatie drie dagen na FAL. Dieren uit beide groepen werden gevolgd door periodieke magnetische resonantie beeldvorming (MRI). Zodra metastasen bleek gebaseerd op beeldvorming en klinische symptomen, werden de muizen gedood en de aanwezigheid van metastasen werd bevestigd door autopsie en histopathologische analyses. Het tijdstip van tumorgroei, beeldvorming en euthanasie is gebaseerd op de SK-ES1 cel groei en metastase. Merk op dat hoewel hypoxyprobe-2 noodzakelijk was de werkwijze en visu vastgesteldAlize verandert in hypoxie niveaus in de periode tussen FAL en ledematen, het gebruik ervan is niet essentieel voor de eigenlijke experimenten. Daarom wordt deze stap in het protocol. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Primaire tumorgroei. Image A. magnetische resonantie (MRI) van een intact achterbeen. De rode pijl geeft de plaats en richting van de tumorcel orthotope injectie. B. primaire tumor bij een kalf volume van ongeveer 250 mm 3 groeien in de gastrocnemius spier (rode contour). Rode pijlpunten geven aan websites van botafbraak. T - scheenbeen. Gelieve clik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. De Site van Femorale Artery Ligatie. Een representatieve postmortem röntgenstraal arteriogram van een 129S1 / svj muizen geperfuseerd met bariumsulfaat onmiddellijk na ligatie wordt aangetoond dat de aanwezigheid van reeds bestaande collaterale vaten te markeren. Merk op dat terwijl het beeld toont twee ligations (Xs), één distaal van de laterale circumflex dijbeenslagader (LCFA) (rode X) en een ander proximaal van de genu slagader (wit X), de tumor hypoxie model alleen gebruikt het proximale ligatie, in de buurt het inguinale ligament en distaal van het LCFA (rode X). Het gebied van de ontwikkeling van het onderpand vaartuig wordt getoond zoals beschreven (zwakke schepen), en ze worden geïdentificeerd door hun moeizame, kurk-schroef vorm. Klik hijopnieuw voor een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4. tumorhypoxia geïnduceerd door Femorale Artery Ligatie (FAL). A. Een controle tumor bij een kalf volume van 250 mm 3 gekleurd met hematoxyline en eosine (H & E) en immunostained voor hypoxyprobe-1 (bruin). Hypoxyprobe-1 immunokleuring uitsluitend waargenomen in het gebied van fysiologische tumorhypoxia, waarbij de tumorcellen afstand van vasculatuur zijn verstoken van zuurstof en beginnen te celdood. B. FAL-behandelde primaire tumor bij een vergelijkbare grootte geoogst 4 uur na ligatie en gekleurd met H & E en immunostained voor hypoxyprobe-1. De meeste tumorcellen sterk positief voor hypoxyprobe-1, ook in de nabijheid van de vasculatuur. V - bloedvat. C. Het oppervlak van positieve kleuring voor hypoxyprobe-1 was quantified controle en FAL-behandelde tumoren behulp ImageJ software. Foutbalken vertegenwoordigen SEM. *** - P <0,001 Klik hier voor een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5. Effect van Femorale Artery Ligatie (FAL) op de primaire tumor groei. A. groei primaire tumorplaats gedurende de 3 dagen tussen operatie en amputatie FAL- (n = 4) en sham-operatie behandeld (n = 4) dieren, in vergelijking met gezonde controle tumoren (n = 6). Error bars vertegenwoordigt SD. *** - P <0,001, in vergelijking met zowel controle als sham-operatie behandelde tumoren. B. hematoxyline en eosine (H & E) kleuring van een FAL-behandelde tumor geoogst 3 dagen na ligatie onthult wijdverspreide necrose binnen de tumor. De rode contour geeft een oppervlakte van levensvatbare tumor cells in de nabijheid van een sterk gevasculariseerd gebied doorbloed 3 dagen na FAL. C. FAL-behandelde tumorweefsel geoogst 3 dagen na de operatie immunostained voor hypoxyprobe-1. Hypoxyprobe-1 werd ingespoten vóór FAL. Daarom is de positieve immunokleuring wijst op het bestaan van uitgebreide weefselhypoxie onmiddellijk na de ingreep. D. Hypoxyprobe-2 werd geïnjecteerd 2 dagen na de FAL, en het weefsel verzameld 24 uur later, op amputatie. Positieve hypoxyprobe-2 kleuring identificeert weefselhypoxie op het moment van amputatie. De rode pijl geeft weefsel dat hypoxische op beide tijdstippen tijdens de gele pijl geeft de ruimte naast de vasculatuur die hypoxische onmiddellijk na was FAL (hypoxyprobe-1-positief), maar negatief voor hypoxyprobe-2 bij de excisie, waarvan duidt op weefsel reperfusie. Het gebrek aan hypoxyprobe-2 kleuring in necrotische gebieden suggereert dat de cellen in dit gebied niet levensvatbaar waren ten tijde van de toediening en derhalveniet de probe actief binden. De kleuring die in panelen BD werd uitgevoerd op seriële weefselcoupes. E. intravasation in FAL-behandelde tumor 3 dagen na de FAL. De immunokleuring identificeert levensvatbare cellen positief voor hypoxyprobe-1 in het vat lumen (rode pijl). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6. Voorbeelden van uitzaaiingen in muizen met FAL-behandelde SK-ES1 tumoren. De metastasen werden gedetecteerd door magnetische resonantie beeldvorming (MRI) en bevestigd door autopsie en histopathologische analyses (hematoxyline & eosine kleuring, H & E). M - metastase. Klik hier om een grotere vers bekijken ion van dit cijfer.
Figuur 7. Kenmerken van cellen afkomstig van FAL-behandelde primaire tumoren. A. levensvatbare celkweken werden vastgesteld uit weefsels geoogst uit controle- en hypoxische primaire tumoren en hun morfologie vergeleken met de oorspronkelijke cellijnen bij het eerste orthotope injecties. De cellen afkomstig van FAL behandelde primaire tumoren vertonen dramatische veranderingen in hun grootte en morfologie. Vertegenwoordiger beelden van het origineel en primaire tumor afkomstig SK-ES1 cellen worden getoond. B. Representatieve beelden van cellen afkomstig van FAL-behandelde tumoren immuno de ES marker, CD99, en tegengekleurd met het DNA-bindende kleurstof, DAPI. Alle cellen worden CD99-positief zijn, met inbegrip van hypertrofische cellen met vergrote kernen (witte pijl). oad / 54532 / 54532fig7large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 8. Chromosomale analyse van de cellen afkomstig van FAL-behandelde tumoren. A. Fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) analyse interfase cellen die twee kernen met signalen voor menselijke centromere 4 probe. De grote kern met vier signalen duidt op een tetraploïde (4N) cel (witte pijl). B. FISH analyse in representatieve metafasen van de SK-ES1 originele cellijn en van de cel afgeleid van FAL-behandelde primaire tumor. Rode pijlen geven inv (1) (p13.1q21), een niet-willekeurige cytogenetische herschikking kenmerk van de SK-ES1 cellen. Red signalen: de menselijke centromere 4 probe; Groene signalen in het oorspronkelijke SK-cellen ES1: NPY5R probe op chromosoom 4q32.2.e.com/files/ftp_upload/54532/54532fig8large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ons model omvat de vergelijking van metastase in twee experimentele groepen - een controlegroep, waarbij tumoren kunnen ontwikkelen in de achterpoot, gevolgd door amputatie van een kalf volume van 250 mm3 bereiken en een hypoxie blootgestelde groep, waarbij de tumor lager achterbeen wordt onderworpen aan FAL hetzelfde volume, gevolgd door amputatie 3 dagen later. Hoewel in deze experimenten de FAL behandelde tumoren worden geamputeerd met enige vertraging ten opzichte van de controlegroep tumoren, is hun grootte niet toeneemt gedurende de 3 dagen tussen ligatie en amputatie. Daarom is deze benadering maakt de vergelijking van metastatische potentiaal tussen tumoren met een vergelijkbaar, maar met dramatisch verschillende niveaus van hypoxie. Daarentegen gebruiken sham operatie, een gewoonlijk gebruikt controle voor chirurgische ingrepen, gevolgd door 3 dagen van tumorgroei zou resulteren in significante verschillen in tumorgrootte tussen de experimentele groepen met de sham operatie-treated primaire tumoren bezit van een aanzienlijke mate van endogene hypoxie. Op basis van de proefprojecten, heeft sham operatie geen significante invloed op de tumorgroei of de hypoxie niveaus en kan dus worden geëlimineerd uit de experimentele opzet. In plaats daarvan, de strategie van het vergelijken tumoren van gelijkaardige grootte en verschillende niveaus hypoxie is een zeer relevant model voor het ophelderen van de effecten van hypoxie op verspreiding van de ziekte. Belangrijker, in tegenstelling tot eerdere in vitro studies, deze benadering maakt uitgebreide evaluatie van de pro-metastatische werking van hypoxie in een tumor micro natuurlijke. 4-6
Het doel van de proefopzet was een laag basaal niveau van metastasen zou zijn voor de detectie van hypoxie geïnduceerde stimulerend effect op de vorming ervan te bereiken. We hebben vastgesteld dat een kalf grootte van 250 mm 3 bij FAL en amputatie was optimaal voor SK-ES1 primaire tumoren. Echter, deze parameter moet worden geoptimaliseerd voor ea ch-cellijn, afhankelijk van hun gemetastaseerde potentieel en lokale invasiviteit. Voor tumoren met hogere metastatisch vermogen, kan de primaire tumorgrootte bij amputatie verminderd moeten worden. Bijvoorbeeld TC71 tumoren vertonen een hoge plaatselijke invasiviteit gemanifesteerd door frequente vorming van terugkerende tumoren op de plaats van amputatie. 18 Zodra deze massa's te ontwikkelen, de dieren van de analyses worden uitgesloten, aangezien het niet duidelijk zou zijn als de daaropvolgende metastasen op afstand ontstaan vanuit de primaire tumoren of terugkerende tumoren die vaak snel groeien en vertonen een hoge mate van endogene hypoxie. Uit eerdere ervaringen, onafhankelijk van de gebruikte cellijn, 150 mm 3 is de minimale tumor-dragende kalf grootte die betrouwbaar kan worden gemeten en genormaliseerd. Als het verminderen van de grootte van de tumor bij FAL en amputatie niet terugkerende tumoren te elimineren of de basale metastase rate voldoende te verlagen, kan de bepaalde cellijn in kwestie niet geschikt zijn voor deze experimenten.
ve_content "> Evenzo is het belangrijk om de tijdslijn van MRI en euthanasie voor elk afzonderlijke cellijn, afhankelijk van de latentie van de metastase. Met name kan de chirurgische wond clips die interfereren met MRI niet eerder verwijderd dan 10 dagen post- operatie en deze periode moet soms uitgebreid als gevolg van complicaties met genezing. dus in deze studie dag 15 vastgesteld als de tijd van de eerste MRI.Een andere belangrijke overweging model is het handhaven van een mate van hypoxie kan induceren metastatische processen zonder dat volledige tumornecrose, die de verspreiding tumorcelverspreiding. Hoewel dit probleem zich voordoet in deze studie, indien nodig, de ernst van hypoxie kan worden geregeld door het veranderen van de juiste ligging en het aantal ligaties ten opzichte van de takken van de femorale slagader, zoals de LCFA en Genu slagader. 20 Aldus zal ligatie proximaal aan het LCFA ernstiger ischemie in de hi creërenndlimb circulatie, waardoor het verhogen van de hypoxische omstandigheden in de distale been. Daarentegen ligeren distale latere takken van de femorale arterie zal het resulterende hypoxie daling van het onderste achterbeen.
Belangrijker waren geen ernstige bijwerkingen Gecombineerd FAL en amputatie procedures en geen sterfgevallen door de operaties, zoals eerder gerapporteerd voor deze technieken afzonderlijk uitgevoerd. 18-20 Aldus wordt het succes van de werkwijze in hoofdzaak beperkt door de snelheid van tumor take op de primaire plaats en de frequentie van recidieven, die beide cellijn-afhankelijk.
Hypoxie is geïmpliceerd als een pro-metastatische factor in vele tumortypen, kan deze benadering tevens geschikt voor het direct testen van de effecten en bepalen de werkingsmechanismen in andere sarcomen ontwikkelen die ledematen. 23 Bovendien kan dezelfde strategie worden toegepast op andere maligniteiten groeien in omgevingen met orthotopeet een goed gedefinieerde bloedtoevoer route. Dus, met de nodige aanpassingen, kan dit model een nuttig instrument in het onderzoek buiten het gebied van ES biologie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SK-ES1 Human Ewing sarcoma (ES) cells | ATCC | ||
| TC71 Human ES cells | Kindly provided from Dr. Toretsky | ||
| McCoy's 5A (modified) Medium | Gibco by Life Technologies | 12330-031 | |
| RPMI-1640 | ATCC | 30-2001 | |
| PBS | Corning Cellgro | 21-040-CV | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442-500mL | |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1x) | Gibco by Life Technologies | 25200-056 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco by Life Technologies | 15140-122 | |
| Fungizone® Antimycotic | Gibco by Life Technologies | 15290-018 | |
| MycoZap™ Prophylactic | Lonza | VZA-2032 | |
| Collagen Type I Rat tail high concetration | BD Biosciences | 354249 | |
| SCID/beige mice | Harlan or Charles River | 250 (Charles River) or 18602F (Harlan) | |
| 1 ml Insulin syringes with permanently attached 28 G ½ needle | BD | 329424 | |
| Saline (0.9% Sodium Chloride Injection, USP) | Hospira, INC | NDC 0409-7984-37 | |
| Digital calipers | World Precision Instruments, Inc | 501601 | |
| Surgical Tools | Fine Science Tools | ||
| Rimadyl (Carprofen) Injectable | Zoetis | ||
| Hypoxyprobe-1 (Pimonidazole Hydrochloride solid) | HPI, Inc | HP-100mg | |
| hypoxyprobe-2 (CCI-103F-250 mg) | HPI, Inc | CCI-103F-250mg | |
| Povidone-iodine Swabstick | PDI | S41350 | |
| Sterile alcohol prep pad | Fisher HealthCare | 22-363-750 | |
| LubriFresh P.M. (eye lubricant ointment) | Major Pharaceuticals | NDC 0904-5168-38 | |
| VWR Absorbent Underpads with Waterproof Moisture Barrier | VWR | 56617-014 | |
| Oster Golden A5 Single Speed Vet Clipper with size 50 blade | Oster | 078005-050-002 (clipper), 078919-006-005 (blade) | |
| Nair Lotion with baby oil | Church & Dwight Co., Inc. | ||
| Silk 6-0 | Surgical Specialties Corp | 752B | |
| Prolene (polypropylene) suture 6-0 | Ethicon | 8680G | |
| Vicryl (Polyglactin 910) suture 4-0 | Ethicon | J386H | |
| Fisherbrand Applicators (Purified cotton) | Fisher Scientific | 23-400-115 | |
| GelFoam Absorbable Dental Sponges - Size 4 | Pfizer Pharmaceutical | 9039605 | |
| Autoclip Wound Clip Applier | BD | 427630 | |
| Stereo Microscope | Olympus | SZ61 | |
| Autoclip remover | BD | 427637 | |
| Aound clip | BD | 427631 | |
| MRI 7 Tesla | Bruker Corporation | ||
| Paravision 5.0 software | Bruker Corporation | ||
| CO2 Euthanasia system | VetEquip | ||
| 25 G 5/8 Needle (for heart-puncture) | BD | 305122 | |
| 0.1 ml syringe (for heart-puncture) | Terumo | SS-01T | |
| K3-EDTA Micro tube 1.3 ml | Sarstedt | 41.1395.105 | |
| 10% Neutral Buttered Formalin | Fisher Scientific | SF100-4 |
References
- Lessnick, S. L., Ladanyi, M. Molecular pathogenesis of Ewing sarcoma: new therapeutic and transcriptional targets. Annu Rev Pathol. 7, 145-159 (2012).
- Ladenstein, R. Primary disseminated multifocal Ewing sarcoma: results of the Euro-EWING 99 trial. J Clin Oncol. 28, 3284-3291 (2010).
- Dunst, J., Ahrens, S., Paulussen, M., Burdach, S., Jurgens, H. Prognostic impact of tumor perfusion in MR-imaging studies in Ewing tumors. Strahlenther Onkol. 177, 153-159 (2001).
- Aryee, D. N. Hypoxia modulates EWS-FLI1 transcriptional signature and enhances the malignant properties of Ewing's sarcoma cells in vitro. Cancer Research. 70, 4015-4023 (2010).
- Knowles, H. J., Schaefer, K. L., Dirksen, U., Athanasou, N. A. Hypoxia and hypoglycaemia in Ewing's sarcoma and osteosarcoma: regulation and phenotypic effects of Hypoxia-Inducible Factor. BMC cancer. 10, 372 (2010).
- Tilan, J. U. Hypoxia shifts activity of neuropeptide Y in Ewing sarcoma from growth-inhibitory to growth-promoting effects. Oncotarget. 4, 2487-2501 (2013).
- Franzius, C. Successful high-resolution animal positron emission tomography of human Ewing tumours and their metastases in a murine xenograft model. Eur J Nucl Med Mol Imaging. 33, 1432-1441 (2006).
- Hauer, K. DKK2 mediates osteolysis, invasiveness, and metastatic spread in Ewing sarcoma. Cancer Research. 73, 967-977 (2012).
- Manara, M. C. Preclinical in vivo study of new insulin-like growth factor-I receptor--specific inhibitor in Ewing's sarcoma. Clin Cancer Res. 13, 1322-1330 (2007).
- Scotlandi, K. Murine model for skeletal metastases of Ewing's sarcoma. J Orthop Res. 18, 959-966 (2000).
- Vormoor, J. Establishment of an in vivo model for pediatric Ewing tumors by transplantation into NOD/scid mice. Pediatr Res. 49, 332-341 (2001).
- Picarda, G. Preclinical evidence that use of TRAIL in Ewing's sarcoma and osteosarcoma therapy inhibits tumor growth, prevents osteolysis, and increases animal survival. Clin Cancer Res. 16, 2363-2374 (2010).
- Vormoor, B. Development of a preclinical orthotopic xenograft model of ewing sarcoma and other human malignant bone disease using advanced in vivo imaging. PLoS One. 9, e85128 (2014).
- Wang, Y. Platelet-derived growth factor receptor beta inhibition increases tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL) sensitivity: imatinib and TRAIL dual therapy. Cancer. 116, 3892-3902 (2010).
- Wang, Y. X. Inhibiting platelet-derived growth factor beta reduces Ewing's sarcoma growth and metastasis in a novel orthotopic human xenograft model. In Vivo. 23, 903-909 (2009).
- Odri, G. A. Zoledronic acid as a new adjuvant therapeutic strategy for Ewing's sarcoma patients. Cancer Research. 70, 7610-7619 (2010).
- Merchant, M. S. Interferon gamma enhances the effectiveness of tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand receptor agonists in a xenograft model of Ewing's sarcoma. Cancer Research. 64, 8349-8356 (2004).
- Hong, S. H. High neuropeptide Y release associates with Ewing sarcoma bone dissemination - in vivo model of site-specific metastases. Oncotarget. 6, 7151-7165 (2015).
- Lee, E. W. Neuropeptide Y induces ischemic angiogenesis and restores function of ischemic skeletal muscles. J Clin Invest. 111, 1853-1862 (2003).
- Tilan, J. U. Platelet neuropeptide Y is critical for ischemic revascularization in mice. FASEB J. , (2013).
- Toffoli, S., Michiels, C. Intermittent hypoxia is a key regulator of cancer cell and endothelial cell interplay in tumours. The FEBS journal. 275, 2991-3002 (2008).
- Das, B. Hypoxia enhances tumor stemness by increasing the invasive and tumorigenic side population fraction. Stem cells (Dayton, Ohio). 26, 1818-1830 (2008).
- Arndt, C. A., Rose, P. S., Folpe, A. L., Laack, N. N. Common musculoskeletal tumors of childhood and adolescence. Mayo Clin Proc. 87, 475-487 (2012).
- Mendoza, A. A novel noninvasive method for evaluating experimental lung metastasis in mice. J Am Assoc Lab Anim Sci. 52, 584-589 (2013).
- Feldman, D. B., Seely, J. C. Necropsy Guide: Rodents and the Rabbit. , CRC Press. (1988).
- Parkinson, C. M. Diagnostic necropsy and selected tissue and sample collection in rats and mice. J Vis Exp. , (2011).
- Raymond, A. K., Lazar, A. J. Bone Sarcoma. PP, L. in, S, P. atel , Springer. (2013).
- Dietel, M., Arps, H., Gerding, D., Trapp, M., Niendorf, A. Establishment of primary cell cultures: experiences with 155 cell strains. Klin Wochenschr. 65, 507-512 (1987).
- Varghese, A. J., Gulyas, S., Mohindra, J. K. Hypoxia-dependent reduction of 1-(2-nitro-1-imidazolyl)-3-methoxy-2-propanol by Chinese hamster ovary cells and KHT tumor cells in vitro and in vivo. Cancer Research. 36, 3761-3765 (1976).
- ATCC. , http://www.atcc.org/products/all/HTB-86.aspx#characteristics (2014).
