Introduction
Sarcoma di Ewing (ES) è un tumore maligno aggressivo che colpisce i bambini e gli adolescenti. 1 I tumori si sviluppano nei tessuti molli e ossa, comunemente nelle arti. Mentre la presenza di metastasi è il più potente fattore prognostico sfavorevole unico dei pazienti ES, i meccanismi alla base del loro sviluppo rimangono poco chiari. 2 tumore ipossia è uno dei pochi fattori implicati nella progressione ES. Nei pazienti ES, la presenza di aree non perfuso nel tessuto tumorale è associata a prognosi infausta. 3 In vitro, ipossia aumenta l'invasività delle cellule ES e attiva l'espressione di geni pro-metastatico. 4-6 Tuttavia, nonostante queste linee di evidenza, nessuna prova diretta per ES indotta da ipossia progressione e diffusione esiste. Inoltre, i meccanismi attraverso i quali l'ipossia esercita tali effetti sono, al momento, sconosciute. Quindi, abbiamo creato un modello in vivo per colmare il divario tra esistente I dati in vitro e clinica osservazioni. Questo sistema modello consente verifica diretta degli effetti dell'ipossia sui tumori che si verificano nel loro ambiente naturale, mediante risonanza magnetica (MRI) per seguire la progressione tumorale e metastasi in vivo in combinazione con analisi ex vivo patologiche e molecolari (Figura 1).
Dal momento che nessun modello transgenico stabilito di ES è attualmente disponibile, gli studi in vivo sulle proprietà metastatiche di questi tumori si basano su iniezioni di cellule umane in topi immunocompromessi. Mentre l'uso di animali immunologicamente deteriorate può sottovalutare l'impatto del sistema immunitario sulla progressione della malattia, la possibilità di utilizzare cellule umane aumenta traducibilità di tali studi. Tra i diversi modelli di xenotrapianto, iniezioni sistemiche in vena della coda sono le più facili da eseguire, ma omettono le fasi iniziali di intravasation delle cellule tumorali e la fuga dal sito primario della crescita. 7-12 D'altra parte, orthoto pic xenotrapianto, che coinvolge le iniezioni di cellule tumorali nelle ossa (femore, costola) o ai muscoli, è più tecnicamente impegnativo, ma anche più biologicamente rilevanti per il cancro umano. 13-16 eutanasia animale Tuttavia, in passato, l'elevata morbilità associata con la rapida crescita di tumori primari è spesso richiesto prima dello sviluppo di metastasi. In questo studio, abbiamo impiegato un modello precostituito di iniezioni di cellule nel muscolo gastrocnemio seguita da escissione del tumore primitivo risultante in combinazione con il monitoraggio longitudinale della progressione metastatica dalla risonanza magnetica. 17,18 Tali iniezioni nel muscolo gastrocnemio in prossimità della tibia consentire la crescita del tumore in due ES ambienti naturali - muscoli e le ossa - e provocano metastasi a distanza in località tipicamente colpite negli esseri umani. 18 In tal modo, questo modello riassume con precisione i processi metastatici che si verificano in pazienti ES durante la progressione della malattia.
tenda "> La localizzazione dei tumori primari nel arti posteriori più bassa facilita anche il controllo preciso del afflusso di sangue al tessuto tumorale. femorale legatura (FAL) è una tecnica consolidata utilizzati nella ricerca angiogenesi per bloccare il flusso di sangue alle regioni distali la gamba e indagare la vascolarizzazione dei tessuti in risposta ad ischemia. 19,20 è importante sottolineare che il calo iniziale del flusso sanguigno è seguito da apertura nave garanzia e riperfusione del tessuto osservato circa 3 giorni dopo FAL. 20 Così, quando eseguito in un arto tumore cuscinetto, questo modello ricrea eventi ipossia / riperfusione che si trovano naturalmente nei tumori in rapida crescita e permette la fuga delle cellule tumorali metastatiche a causa di restauro della perfusione al arti posteriori inferiori tramite vasi collaterali di nuova apertura. 21 è importante sottolineare che questa procedura deve essere eseguita quando la dimensione del tumore è abbastanza piccolo per prevenire ipossia eccessivo in tumori di controllo (tipicamente il tumore-cuscinetto vitello volUme di 150-250 mm 3), assicurando significative differenze nei livelli di ipossia tumorale tra controllo e gruppi FAL-trattati.In aggiunta al monitoraggio longitudinale degli effetti dell'ipossia sulla latenza ES e la frequenza di metastasi, questo modello permette anche per la raccolta dei tessuti e lo sviluppo di nuove linee cellulari di entrambi i tumori primari e le metastasi. Importante, lavoro precedente stabilito che le linee cellulari metastasi-derivati presentano maggiore potenziale metastatico dopo la reintroduzione di animali, indicando che la diffusione del tumore è associata a cambiamenti permanenti nel fenotipo delle cellule tumorali, e convalida così l'uso di queste linee cellulari di decifrare i processi metastatici. 18 Collettivamente, questi modelli possono ora essere utilizzati per le analisi genetiche e molecolari necessarie per l'identificazione di percorsi metastatici indotta da ipossia.
Come ipossia è un fattore pro-metastatico migliorare la malignità di vari tumors, il modello può essere utilizzato come una piattaforma per studiare il ruolo dell'ipossia in altri tipi di tumore che si sviluppano naturalmente in arti, come osteosarcoma e rabdomiosarcoma. 21-23 Inoltre, un approccio simile può essere applicato a tumori maligni crescono in altre sedi anatomiche con un percorso ben definito di sangue. In definitiva, il modello può essere modificato e la sua utilità ulteriormente esteso, a seconda dei singoli esigenze di ricerca.
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Protocol
Tutte le procedure sono state approvate dal Comitato Istituzionale cura degli animali e Usa Georgetown University.
1. Preparazione delle cellule per ortotopico Iniezioni
- cellule staminali embrionali umane Cultura in condizioni standard. Utilizzare circa un piatto di coltura cellulare di 15 cm non superiore al 70% di confluenza per l'iniezione di 5 topi.
NOTA: Per questo studio, le cellule SK-ES1 sono state coltivate in terreno 5A McCoy con siero fetale bovino 15% (FBS) su piastre di collagene rivestite e cellule TC71 state coltivate in RPMI con 10% FBS e 1% 4- (2-idrossietil ) L'acido -1-piperazineethanesulfonic (HEPES). Entrambi i mezzi sono stati integrati con antibiotici - penicillina (100 unità / ml), streptomicina (100 mg / ml) e Fungizone (1 mg / ml). - Lavare le cellule ES con tampone fosfato salino (PBS) e trypsinize al 70% di confluenza con 0,25% tripsina / acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) per 5 min.
- Rimuovere le cellule staminali dalla piastra con colture cellulari media, quindi si centrifuga per 5 minuti a 200 xg a temperatura ambiente. Risospendere le cellule ES in 10 ml di PBS freddo e poi contare il numero di cellule.
- Cellule ES centrifuga per 5 minuti a 200 xg a temperatura ambiente, e poi ri-sospendere a 10 7 (TC71), le cellule per ml in PBS freddo 2 x 10 7 (SK-ES1) o. Mantenere la sospensione cellulare finale sul ghiaccio durante l'esecuzione di iniezioni.
2. iniezione ortotopico di cellule ES in muscolo gastrocnemio
- Utilizzare 4-6 settimana femminile SCID / topi beige vecchi.
- Per iniettare cellule ES Premere delicatamente il mouse e stabilizzare la sua gamba sinistra tra il quarto e quinto dito, esponendo il lato mediale del arti posteriori inferiore.
- Utilizzando un ago 28 G ½, iniettare 0,1 ml di sospensione cellulare precedentemente preparato che contiene o 2 x 10 6 (SK-ES1) o 10 6 cellule (TC71) ES nel muscolo gastrocnemio (Figura 2A).
NOTA: Anche se il volume massimo per inj intramuscolareriflessioni è tipicamente 0,05 ml, per questa particolare procedura l'aumento di volume di 0,1 ml è necessaria a causa del numero elevato di cellule iniettate. Questa procedura è stata approvata dal Comitato Istituzionale cura degli animali e Usa Georgetown University.- Inserire l'ago nel muscolo gastrocnemio anteriormente una a circa 30 - 45 gradi nella direzione del tibiale crest / tuberosità.
- Leggermente ritirare l'ago una volta che tocca il tibiale stemma / tuberosità. Iniettare lentamente la soluzione sospensione cellulare, ritirando gradualmente l'ago per scaricare la pressione.
- Monitorare i topi iniettati corso dei prossimi 24 ore per segni di sofferenza.
NOTA: Gli investigatori con meno esperienza nella gestione degli animali dovrebbe prendere in considerazione anestetizzare topi per le iniezioni di cellule tumorali. Alcuni istituti possono richiedere l'anestesia per motivi di sicurezza.
3. Monitoraggio crescita del tumore primario
- Monitorare la crescita dei tumori primari dAily finché le dimensioni del tumore raggiunge il volume desiderato.
NOTA: In questo studio, un volume vitello di 250 mm 3 è stato utilizzato come punto di partenza dell'esperimento (Figura 2B). In genere, ci vogliono circa 1-2 settimane per i tumori per raggiungere queste dimensioni.- Misurare la dimensione del vitello al giorno con pinze digitali tramite le sue lunghezze medio-laterale e anteriore-posteriore.
- Determinare il volume vitello dalla formula (D xd 2/6) x 3,14, dove D è il diametro più lungo e d è il diametro minore del tumore-cuscinetto hindlimb inferiore.
NOTA: La dimensione del normale vitello topo adulto è di circa 40 - 50 mm 3. Il suo volume aumenterà a causa della crescita del tumore e alle fasi successive il vitello sarà composto principalmente da tessuto tumorale.
4. arteria femorale legatura (FAL) per indurre ipossia nel tumore-cuscinetto degli arti posteriori
- Preparare gli strumenti chirurgici necessari per questa operazione: curved o una pinza sottile appuntito, ha sottolineato pinze, forbici chirurgiche e un porta-aghi. Sterilizzare questi strumenti prima di un intervento chirurgico mediante autoclave o uno sterilizzatore a caldo tallone. Inoltre, hanno tamponi di cotone sottili pronti per questa chirurgia.
NOTA: Si raccomanda che gli strumenti di essere ri-sterilizzati alle punte come necessario durante la procedura. - Iniettare agente analgesico (Carprofen 5 mg / kg) per via sottocutanea (SQ). Per rilevare e confermare ipossia, iniettare hypoxyprobe-1 (pimonidazole, 60 mg / kg).
NOTA: Questa dose equivale a 1,5 mg per mouse e si ottiene iniettando 0,1 ml di soluzione di hypoxyprobe 15 mg / ml in PBS per via intraperitoneale (IP). Il hypoxyprobe è poi postmortem rilevabile nei tessuti animali di immunoistochimica. - Posizionare il mouse in una camera di induzione dell'anestesia contenente 3 - 5% isoflurano in 100% di ossigeno ad un flusso di 1 l / min.
- Lasciare il mouse nella camera di induzione finché non risponde agli stimoli esterni. Quindi rimuovere l'animale dalla Icamera di nduction. Posto l'animale in posizione supina su un telo sterile posto in cima ad un rilievo di riscaldamento sulla superficie operativa. Utilizzare un cono per collegarlo ad un flusso continuo di 1 - 3% isoflurano in 100% di ossigeno ad un flusso di 0,8 L / min.
- Applicare pomata oftalmica sterile non medicati per ciascun occhio per evitare l'essiccazione della cornea. Per depilare accuratamente l'area chirurgica, applicare la crema di rimozione dei capelli, lasciando sulla pelle per non più di 10 secondi. Poi pulire la crema di rimozione dei capelli usando un tampone di etanolo prep.
- Estendere e fissare la arti posteriori con un pezzo di nastro adesivo circa 45 gradi dalla linea mediana del mouse. Una volta che il arti posteriori è sicuro, pulire la pelle esposta con il 10% povidone / iodio tampone / soluzione, seguita da etanolo, ripetendo due volte ciascuno. Per il resto della procedura chirurgica, utilizzare un microscopio stereo per ottenere una vista ingrandita della regione arti posteriori.
- Con pinze a punta e forbici chirurgiche, fare un'incisione del skdi, lunga circa 1 cm, da metà coscia verso la regione inguinale. Utilizzando tamponi di cotone fine saline-inumidito, delicatamente spazzare via sottocutaneo tessuto adiposo che circonda il muscolo della coscia.
- rivelare con attenzione l'arteria femorale sottostante via smussa attraverso il tessuto adiposo sottocutaneo. Stabilizzare la ferita e campo chirurgico per esporre la vascolarizzazione del muscolo adduttore medio-superiore.
- Utilizzando una pinza sottile, delicatamente forare attraverso la guaina femorale membranosa per esporre il fascio neurovascolare. Utilizzando un set pulito di una pinza sottile, sezionare e separare l'arteria femorale dalla vena femorale e del nervo nella posizione prossimale vicino al inguine, distale al legamento inguinale. Usare cautela per evitare forare il muro vena femorale.
- A seguito di dissezione, passare un filo di sutura 6-0 seta sotto l'arteria femorale e distale al ramo dell'arteria femorale circonflessa laterale (LCFA). Occludere l'arteria femorale con doppi nodi (Figura 3). Chiudere l'incisione con 6-0 punti di sutura in polipropilene. Dopo aver chiuso l'incisione, iniettare SQ 0,5 ml di soluzione salina calda per la terapia di equilibrio dei fluidi. Posto l'animale in cima a un pad calda avvolta nella gabbia recupero e monitorare continuamente fino sveglio.
- Monitorare gli animali durante prime 6 ore dopo l'intervento e iniettare l'agente analgesico (Carprofen 5 mg / kg, SQ) ogni giorno per 3 giorni. Rimuovere suture 10 giorni post-intervento chirurgico con le forbici sterili.
5. L'asportazione del tumore primario per l'amputazione della gamba
NOTA: Amputare il arti posteriori inferiori tumore-cuscinetto quando la dimensione vitello raggiunge i 250 mm 3 per il gruppo di controllo o 3 giorni dopo FAL per il gruppo ipossico.
- Radere i capelli dal arto tumore-cuscinetto dalla tibia distale alla regione pelvica con tosatrici mentre delicatamente tenendo l'animale. Iniettare l'agente analgesico (Carprofen 5 mg / kg, SQ) prima della procedura.
- Posizionare il mouse in una ch induzione dell'anestesiaambra contenente 3 - 5% isoflurano in 100% di ossigeno ad un flusso di 1 l / min. Lasciare il mouse nella camera di induzione finché non risponde agli stimoli esterni. Quindi rimuovere l'animale dalla camera di induzione.
- Posto l'animale in posizione di decubito laterale destro su un telo sterile posto su un tappetino di riscaldamento sulla superficie operativa. Utilizzare un cono per collegarlo ad un flusso continuo di isoflurano 1 - 3% in 100% di ossigeno ad un flusso di 0,8 L / min. Applicare pomata oftalmica sterile non medicati per ciascun occhio per evitare l'essiccazione della cornea
- Preparare il sito chirurgico utilizzando 10% povidone / iodio tampone / soluzione, seguita da etanolo, ripetendo 3 volte. Applicare una garza sterile (ad esempio, telo chirurgico) sopra il mouse per ottenere un campo chirurgico sterile.
- Fare un mezzo femorale incisione cutanea circonferenziale, seguita da dissezione e la scomparsa della pelle prossimale. Esporre mediale peduncolo neurovascolare femorale sul lato mediana della gamba, e poi legarevicino al legamento inguinale utilizzando 4-0 rivestito (Polyglactin 910) materiale di sutura assorbibile.
- Eseguire un mid-femorale transection dei gruppi muscolari con le forbici, seguita da dissezione dei tessuti molli al coxofemorale. Utilizzando un cutter osso, eseguire una osteotomia mid-femorale. Usando un batuffolo di cotone fine sterile o una spugna di gelatina riassorbibile, premere delicatamente il sito osteotomia per minimizzare e prevenire le emorragie.
- Chiudere la pelle sovrastante mediante clip della ferita chirurgica e iniettare 0,5 ml di soluzione salina calda SQ per la terapia di equilibrio dei fluidi. Posto l'animale in cima a un pad calda avvolta nella gabbia recupero e monitorare continuamente fino sveglio.
- Al momento l'intervento chirurgico, raccogliere campioni di tessuto da tumori primari per l'RNA, DNA o isolamento delle proteine, scatto congelare in azoto liquido e conservare a -80 ° C. Per colture cellulari primarie, raccogliere campioni di tessuto in questa fase, come descritto nella sezione 9 di seguito. Fissare il tessuto arto rimasto in formalina neutra tamponata al 10% per l'istologia e immunochemisprovare, tra cui hypoxyprobe-1 di rilevamento.
- Monitorare gli animali di locomozione, il dolore e il consumo di cibo durante le prime 6 ore dopo l'intervento, poi ogni giorno per 3 giorni. Iniettare l'agente analgesico (Carprofen 5 mg / kg, SQ) al giorno per 3 giorni. Rimuovere le clip ferita 10 giorni dopo l'amputazione utilizzando un dispositivo di rimozione della clip ferita.
6. I topi di monitoraggio per la presenza di metastasi
- Osservare i topi quotidiana e valutarli per segni clinici di metastasi, almeno due volte a settimana.
- Osservare gli animali per la presenza di macrometastasi presentano come masse che si sviluppano in varie località, tipicamente spalle, gambe controlaterale e mascelle. A tal fine, palpare con cura la testa, il collo e le regioni ascellari, e degli arti posteriori controlaterale. Verificare la presenza di metastasi degli organi interni tramite distensione addominale insieme con scansione MRI.
- Controllare la presenza di metastasi polmonari premendo il processo xifoideo (l'estremità inferiore dello sterno) con index dito. 24
NOTA: Questa pressione diminuisce la capacità di respirazione diaframmatica. I topi con metastasi polmonari avanzate mostrano segni di difficoltà respiratoria si manifesta con la respirazione laboriosa. - Osservare gli animali per i sintomi neurologici, come la paralisi delle gambe e l'atassia suggerendo metastasi al sistema nervoso centrale.
- Monitorare il mouse almeno una volta a settimana per la perdita di peso, come un'indicazione della progressione della malattia potenziale. perdita di peso corporeo superiore al 15% del peso pre-procedurale è considerato un endpoint umana.
7. risonanza magnetica (MRI) per la rilevazione di metastasi
- Eseguire la risonanza magnetica per rilevare metastasi in momenti desiderati. 18
NOTA: Nel corso di studio, uno spettrometro orizzontale 7 Tesla è stato utilizzato. MRI è stata effettuata a giorni 15 e 35 di post-amputazione per le cellule SK-ES1 e al giorno 15 per TC71 cellule. - Posizionare il mouse in un Chambe induzione dell'anestesiar contenente 1 - 3% isoflurano in una miscela gassosa di 30% di ossigeno e protossido di azoto 70%.
- Lasciare il mouse nella camera di induzione finché non risponde agli stimoli esterni. Quindi rimuovere l'animale dalla camera di induzione.
- Trasferire il mouse anestetizzato su un supporto stereotassica con la respirazione e la temperatura monitorization con la somministrazione continua di 1,5% isoflurano e protossido di azoto del 30%. Applicare pomata oftalmica sterile non medicati per ciascun occhio per prevenire la secchezza della cornea. Immagine l'animale sia in 40 o 23 millimetri Bruker bobina di volume del mouse per tutto il corpo o imaging cerebrale, rispettivamente.
- Utilizzare un bidimensionale, T2-weighted sequenza RARE: TR = 3.000 msec, TE = 24 msec, matrice = 256, FOV = 4,35 x 3,0 cm, spessore dello strato = 0,5 mm fattore RARE = 4 e medie = 4. 18
- Posto l'animale in una gabbia di recupero caldo e monitorare continuamente fino a quando sveglio.
NOTA: I topi si riprenderà rapidamente da quando si utilizza un piano superficiale di anestesia. Monitorare gli animali durante le prime 6 ore dopo l'imaging per assicurarsi che non vi siano effetti negativi della anestesia.
8. L'eutanasia e Necropsy
- Euthanize i topi una volta gli animali presenti con metastasi rilevabili dalla risonanza magnetica e / o sintomi clinici di progressione della malattia.
NOTA: Nel corso di studio, i topi sono stati sacrificati a giorni 50 e 25 di post-amputazione per gli animali che portano SK-ES1 e TC71 xenotrapianti, rispettivamente. In alcuni casi, prima dell'eutanasia era necessario a causa di un elevato carico metastasi. - Euthanize i topi da esposizione a CO 2 a 1,5 L / min (CO 2 a 10 - 30% della camera dell'eutanasia vol / min). Per garantire la morte degli animali, eseguire dislocazione cervicale dopo l'esposizione di CO 2.
- Spruzzare l'intero mouse con 70% etanolo e posizionarlo nella cappa a flusso laminare. Raccogliere il sangue mediante puntura cardiaca utilizzando un ago da 25 G ½ con una siringa da 1 ml e il trasferimento ad un prelievo di sangue tuessere contenente 2 mg di EDTA.
- Raccogliere i seguenti tessuti: milza, ghiandole surrenali, ovaie, reni, fegato, polmoni, cervello, gamba destra, del midollo osseo sia da omeri e della colonna vertebrale, così come metastasi macroscopiche presenti in altri luoghi. 25,26
- Fissare la metà di ogni tessuto in formalina neutra tamponata al 10% per l'istologia e immunochimica, tra cui hypoxyprobe-1 di rilevamento. Snap congelare l'altra metà in azoto liquido, quindi memorizzare a -80 C per RNA, DNA o isolamento delle proteine. 25,26 per colture cellulari primarie, raccogliere campioni di tessuto come descritto nella sezione 9 di seguito.
9. coltura cellulare primaria
- Per eseguire colture cellulari primarie, sezionare i tessuti dal arto amputato (precedente punto 5) o durante la necroscopia (precedente punto 8) in condizioni sterili in una cappa a flusso laminare.
- Preparare coltura cellulare di supporto appropriato per la linea cellulare utilizzato per le iniezioni ortotopico, integrato con la penicillina (200 unità / ml),streptomicina (200 mcg / ml), fungizone (1 ug / ml), e 0,2% micoplasma profilassi antibiotica. Collocare 2,5 ml del terreno di coltura primaria in una piastra di coltura cellulare 6-cm.
- Selezionare aree di tessuto tumorale vitali da tumori primari o metastasi, e quindi isolare due o tre segmenti a 2-3 mm ciascuno con le forbici sterili.
NOTA: tessuto tumorale valida si trova di solito sui bordi del tumore e può essere discriminata dalla necrosi dal suo colore rosa o rossastro, lucentezza significativa e l'aspetto bagnato complessivo. Al contrario, il tessuto necrotico è comunemente visto nel centro del tumore e presenta come / massa biancastra colore crema con un ottuso, aspetto scadente. 27 - Trasferire i segmenti isolati ad una piastra di coltura cellulare di 6 cm contenente terreno di coltura primaria descritto al punto 9.2.
- cellule di coltura in condizioni standard, come descritto nella sezione 1 (NOTA) e 9.2. 18,28 Controllare la cultura per escrescenza cellulare derivante dai pezzi di tessuto, which deve rilevare nel giro di pochi giorni. Una volta che le cellule raggiungono confluenza, trypsinize e propagare loro secondo le tecniche di coltura cellulare standard.
NOTA: La coltura cellulare primaria può essere successivamente utilizzato per valutare la crescita e le proprietà metastatiche delle cellule derivate da controllo e ipossiche tumori, così come le loro caratteristiche molecolari, come precedentemente descritto. 18
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Representative Results
Dopo l'iniezione di cellule staminali nel muscolo gastrocnemio, i tumori primari possono crescere a una dimensione vitello di 250 mm 3 (figura 1, 2). Il tempo necessario per i tumori raggiungere questo volume varia tipicamente da 10 - 15 giorni per TC71 a 20-25 giorni per eterotrapianti SK-ES1, rispettivamente. I tumori in un volume vitello 250 mm 3 mostra un livello relativamente basso di ipossia endogena (circa il 3% del tessuto tumorale), basato su hypoxybrobe-1 (pimonidazole) colorazione (Figura 4A, C). È importante sottolineare che, in questi tumori di controllo, la positività per hypoxyprobe-1 è stata osservata solo nelle aree di ipossia fisiologica, cioè, in cellule tumorali che sono distanti dalla vascolatura e iniziano a subire morte cellulare (Figura 4A). Tale colorazione mostra un pattern caratteristico "air-brush", mentre la massa di tessuto tumorale sano rimane negativo per hypoxyprobe-1. <sup> 6 Al contrario, FAL eseguiti in questa fase crea profonda ipossia, come dimostra la positività per hypoxyprobe-1 osservato nella maggior parte delle cellule tumorali a 4 ore post-FAL (Figura 4B). In particolare, le cellule tumorali hypoxyprobe-1-positive si osservano anche in prossimità di vasi sanguigni e il modello caratteristico di ipossia fisiologica è perduto. In questi tumori FAL-trattati, il 73% del tessuto è costituito da cellule tumorali ipossiche (Figura 4C). Il tessuto tumorale mostra anche i primi segni di danni ipossia-indotto, tra cui il restringimento delle cellule e struttura flessibile (Figura 4B).
L'efficacia di FAL è ulteriormente supportato dalla completa inibizione della crescita del tumore primario. Durante il periodo di 3 giorni tra FAL e amputazione, la dimensione dei tumori primari non aumenta (Figura 5A). Al contrario, i tumori primari di topi sottoposti a sham Surgery continuato a crescere rapidamente, raggiungendo un volume di circa 650 mm 3, imitando così il tasso di crescita dei tumori nei topi di controllo non sottoposti a intervento chirurgico (Figura 5A). 18 In linea con questi dati, l'analisi istopatologica ha rivelato vaste aree di necrosi nei tumori primari FAL-trattati raccolte 3 giorni dopo l'intervento chirurgico (Figura 5B). Tuttavia, ci sono gruppi di cellule tumorali vitali presenti nel tessuto tumorale, solitamente poste ai bordi del tumore, vicino alla vascolare (Figura 5B). Per studiare lo stato di ossigenazione di queste cellule che abbiamo usato hypoxyprobes, che vengono attivati nelle cellule ipossiche dal vivo, successivamente acquisendo la capacità di legarsi in modo covalente alle proteine all'interno di queste cellule. 29 In quanto tali, queste sonde servono come marcatore permanente delle cellule che hanno subito ipossia in qualsiasi punto nel tempo. Così, per rilevare cambiamenti nei livelli di ossigeno delle cellule tumorali per tutta la durata della speriment, abbiamo utilizzato due hypoxyprobes differenti che possono essere rilevati in modo indipendente da immunoistochimica. Le sonde sono stati somministrati in due punti temporali - immediatamente prima FAL (hypoxyprobe-1) e prima amputazione (hypoxyprobe-2, CCI-103F) - e la loro localizzazione è stata rilevata nei tumori raccolto 3 giorni post-FAL (Figura 1). Hypoxyprobe-1, che era presente nel sistema al momento del FAL, segnato la maggioranza delle cellule tumorali, come il tessuto divenne gravemente ipossico (Figura 5C). Tale etichettatura è evidente anche in aree di necrosi / apoptosi, poiché queste cellule erano ancora vivi al momento del FAL e quindi in grado di vincolare in modo permanente hypoxyprobe-1, come mostrato nella Figura 4B. Al contrario, hypoxyprobe-2 somministrato 2 giorni post-FAL colorato solo cellule vitali, come le cellule in aree necrotiche erano già morti e in grado di attivare la sonda al momento della sua somministrazione (Figura 5D). È interessante notare che, anche noi observ ati tessuto tumorale vitale adiacente alla vascolarizzazione che era inizialmente ipossico (hypoxyprobe-1-positive), ma ben ossigenato al punto successivamente (hypoxyprobe-2-negativo) (Figura 5C, D). Questo risultato è in accordo con precedenti relazioni che indicano che le garanzie riperfusione del tessuto nave-dipendente ripristina il flusso di sangue nel arti posteriori 3 giorni post-FAL. 20 Le cellule tumorali vitali rimanenti nel tessuto tumorale 3 giorni post-FAL erano altamente invasiva, come dimostra il loro massiccia intravasation sui bordi vascolarizzati del tumore (Figura 5E). Alcune delle cellule all'interno del lume del vaso sono risultati positivi per hypoxyprobe-1, che indica che essi erano diventati ipossico su FAL, ma sono rimasti vitali. Collettivamente, questi dati suggeriscono che la riperfusione dei tessuti dopo una grave ipossia può facilitare la fuga delle cellule dai tumori primari.
Sulla base di questo esperimento pilota, metastasi diffuse eranorilevabile con risonanza magnetica di circa 35 giorni post-amputazione per xenotrapianti SK-ES1, mentre le cellule TC71 tipicamente metastasi entro 15 giorni. Di conseguenza, per l'analisi comparativa della latenza metastasi e la frequenza, la risonanza magnetica è stata eseguita a giorno 15 e 35 post-amputazione per gli animali che portano tumori SK-ES1, mentre uno di imaging al giorno 15 era sufficiente per topi con tumori TC71. L'eutanasia è stata effettuata a giorno 50 e il giorno 25 per gli animali con SK-ES1 e TC71 xenotrapianti, rispettivamente. Come riportato in precedenza, i tipi più comuni di metastasi inclusi masse dei tessuti molli nella zona delle spalle, così come le metastasi ossee a gambe controlaterale, zona mascellare e della colonna vertebrale per le cellule SK-ES1, e del polmone e tumori pelvici per TC71. 18 Inoltre, frequenti metastasi agli organi interni, tra cui le ghiandole surrenali, i polmoni e il fegato, così come infiltrazione del midollo osseo, sono stati osservati nei topi portatori di FAL-trattati eterotrapianti SK-ES1 (Figura 6). In generale, ipossia significativamente aumentatail (SK-ES1) o sito-specifico (TC71) frequenza complessiva e molteplicità delle metastasi in entrambe le linee cellulari. Tuttavia, xenotrapianti TC71 anche sviluppato frequenti masse ricorrenti nel sito di amputazione (25% per il controllo e il 40% per i tumori FAL-trattati), come precedentemente descritto per i grandi tumori primari TC71. 18
I tessuti di controllo e tumori e le metastasi primarie FAL-trattati possono anche essere una fonte di materiale per analisi molecolari complete finalizzate alla individuazione di percorsi di ipossia attivati coinvolti nella diffusione ES. Ad esempio, abbiamo osservato differenze significative nei profili metabolomica di controllo e di tumori primari ipossiche (dati non riportati). Siamo stati anche in grado di isolare con successo diverse linee cellulari da tutti i tessuti di cui sopra. In molti casi, le cellule derivate da tumori FAL-trattati hanno mostrato notevoli cambiamenti nella morfologia, rispetto alle celle originali e quelli derivati dal controllo tumors (Figura 7A). La purezza di queste colture cellulari è stata confermata mediante immunocolorazione positiva per il marcatore sarcoma di Ewing, CD99 (Figura 7B). Inoltre, il 100% delle cellule nelle linee cellulari stabilizzate ha avuto un segnale positivo in ibridazione in situ fluorescente (FISH) con sonde centromeriche umani, spesso si presentano con un aumento del numero di cromosomi (Figura 8a). L'origine umana di queste cellule è stata ulteriormente confermata mediante analisi dei cromosomi in metafase (Figura 8B) che mostravano riarrangiamenti citogenetica precedentemente descritti per le cellule SK-ES1 sia nella linea cellulare originale e le cellule derivate da tumori FAL-trattate (Figura 8B). 30
Figura 1. Schema della ES ipossia modello. Cellule ES (1 - 2 x 10 6) sono state iniettate in gastrocnmuscoli emius di SCID / topo beige. Una volta che i tumori primari derivanti raggiunto un volume vitello di 250 mm 3, i topi sono stati divisi in due gruppi sperimentali. I topi del gruppo di controllo è stato iniettato con hypoxyprobe-1 (HP-1), ed i tumori primari sono state escisse da amputazione. I topi del gruppo ipossica sono stati iniettati con hypoxyprobe-1 e quindi sottoposto a legatura dell'arteria femorale (FAL). Due giorni dopo, i topi sono stati iniettati con hypoxyprobe-2 (HP-2), e quindi gli arti di tumore sono state amputate tre giorni post-FAL. Gli animali di entrambi i gruppi sono stati monitorati con la risonanza magnetica periodica (MRI). Una volta metastasi divennero evidenti sulla base di imaging e segni clinici, i topi sono stati sacrificati e la presenza di metastasi è stata confermata da autopsia e le analisi istopatologiche. Il tempo della crescita tumorale, imaging e l'eutanasia è basato sul tasso cellule SK-ES1 di crescita e metastasi. Si noti che mentre hypoxyprobe-2 era necessario stabilire il metodo e visuAlize cambiamenti nei livelli di ipossia nel periodo compreso tra FAL e amputazione degli arti, il suo uso non è indispensabile per gli esperimenti attuali. Pertanto, questo passo non è incluso nel protocollo. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. la crescita del tumore primario. Immagine A. risonanza magnetica (MRI) di un arti posteriori intatto. La freccia rossa indica il luogo e la direzione di iniezione ortotopico cellule tumorali. B. Il tumore primitivo a un volume vitello di circa 250 mm 3 in crescita nel muscolo gastrocnemio (contorno rosso). frecce rosse indicano i siti di distruzione di tessuto osseo. T - tibia. Si prega di cleccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. Il Sito di arteria femorale legatura. Un post-mortem rappresentante x-ray arteriogram di un mouse 129S1 / SVJ perfuso con solfato di bario immediatamente dopo la legatura viene mostrato per evidenziare la presenza di vasi collaterali pre-esistenti. Si noti che mentre l'immagine raffigura due legature (Xs), distale rispetto all'arteria circonflessa laterale femorale (LCFA) (X rossa) e un altro prossimale all'arteria ginocchio (bianco X), il modello di tumore ipossia utilizzata solo la legatura prossimale, vicino il legamento inguinale e distale al LCFA (X rossa). La regione di sviluppo dei vasi collaterali è mostrato come descritto (vasi deboli), e sono identificati da loro, la forma tortuosa cavatappi. Si prega di cliccare luinuovamente per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4. Tumore ipossia indotta da Arteria femorale legatura (FAL). A. Un tumore controllo in un volume vitello di 250 mm 3 macchiato da ematossilina e eosina (H & E) e immunostained per hypoxyprobe-1 (marrone). Hypoxyprobe-1 immunocolorazione è osservato solo nelle aree di ipossia tumorale fisiologica, in cui le cellule tumorali lontane dalla vascolatura sono privati di ossigeno e cominciano a subire morte cellulare. B. FAL-trattata tumore primario in un formato simile raccolto 4 ore post-legatura e colorati con H & E e immunostained per hypoxyprobe-1. La maggior parte delle cellule tumorali sono altamente positivi per hypoxyprobe-1, incluse quelle in prossimità della vascolarizzazione. V - vaso sanguigno. C. L'area di colorazione positiva per hypoxyprobe-1 era quantifIED di controllo e FAL-trattati i tumori utilizzando il software ImageJ. Le barre di errore rappresentano SEM. *** - P <0.001 Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 5. Effetto della femorale Arteria legatura (FAL) sulla crescita del tumore primario. A. crescita del tumore primario nei 3 giorni tra chirurgia e amputazione FAL- (n = 4) e sham chirurgia trattati (n = 4) animali, rispetto ai tumori di controllo intatti (n = 6). Le barre di errore rappresentano SD. *** - P <0,001, rispetto sia ai tumori chirurgia trattati controllo e fittizi. B. ematossilina e eosina (H & E) colorazione di un tumore FAL-trattati raccolto 3 giorni post-legatura rivela necrosi diffusa all'interno del tumore. Il contorno rosso indica una zona di ce tumorali vitaliLLS in prossimità di una regione altamente vascolarizzato perfusi 3 giorni post-FAL. Tessuto tumorale C. FAL-trattati raccolto 3 giorni dopo l'intervento chirurgico per immunostained hypoxyprobe-1. Hypoxyprobe-1 è stato iniettato prima FAL. Pertanto, l'immunocolorazione positiva indica l'esistenza di una vasta ipossia tessuto immediatamente post-intervento chirurgico. D. Hypoxyprobe-2 è stato iniettato 2 giorni post-FAL, e il tessuto raccolti 24 ore dopo, alle amputazione. Positive hypoxyprobe-2 colorazione identifica ipossia tissutale al momento di amputazione. La freccia rossa indica tessuto che è ipossico in entrambi i punti di tempo mentre la freccia gialla indica un'area adiacente alla vascolarizzazione che era ipossico immediatamente dopo FAL (hypoxyprobe-1-positive), ma negativo hypoxyprobe-2 al momento della escissione, che è indicativo di riperfusione tissutale. La mancanza di hypoxyprobe-2 colorazione in aree necrotiche suggerisce che le cellule in questa regione non erano vitali al momento della sua amministrazione e quindiincapace di legare attivamente la sonda. La colorazione presentato in pannelli BD è stata eseguita su sezioni di tessuto seriali. E. intravasation nel tumore 3 giorni post-FAL FAL-trattata. L'immunostaining identifica cellule vitali positive per hypoxyprobe-1 entro il lume del vaso (freccia rossa). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 6. Esempi di metastasi in topi portatori di FAL-trattati SK-ES1 tumori. Le metastasi sono stati rilevati con la risonanza magnetica (MRI) e confermati da autopsia e le analisi istopatologiche (ematossilina e eosina, H & E). M - metastasi. Clicca qui per visualizzare un vers più grandi ione di questa figura.
Figura 7. Caratteristiche di cellule derivate da FAL-trattati tumori primari. A. colture di cellule vitali sono state stabilite dai tessuti raccolti dal controllo e tumori primari di ipossia e la loro morfologia è stato confrontato con le linee di cellule originali usati per le iniezioni ortotopici iniziali. Le cellule derivate da tumori primari FAL-trattati mostrano cambiamenti drammatici nella loro dimensione e morfologia. Immagini rappresentative delle celle originali e primarie tumore-derivato SK-ES1 sono mostrati. Immagini B. rappresentativi di cellule derivate da tumori FAL-trattati immunostained per il marcatore ES, CD99, e di contrasto con il colorante legame al DNA, DAPI. Tutte le cellule sono CD99-positive, comprese le cellule ipertrofiche contenenti nuclei allargata (freccia bianca). OAD / 54532 / 54532fig7large.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 8. analisi cromosomica delle cellule derivate da tumori FAL-trattati. A. ibridazione in situ fluorescente (FISH) Analisi nelle cellule in interfase che mostrano due nuclei con segnali per centromeric umano 4 sonda. La grande nucleo con quattro segnali indica una cella tetraploide (4n) (freccia bianca). B. Analisi FISH in metafasi rappresentativi della linea cellulare originale SK-ES1 e della cellula derivata da tumore primario FAL-trattata. Le frecce rosse indicano inv (1) (p13.1q21), un non casuale citogenetica riarrangiamento caratteristica delle cellule SK-ES1. Segnali rossi: centromeric umano 4 sonda; Segnali verdi in celle originali SK-ES1: sonda NPY5R sul cromosoma 4q32.2.e.com/files/ftp_upload/54532/54532fig8large.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Il nostro modello prevede il confronto delle metastasi nei due gruppi sperimentali - un gruppo di controllo, in cui i tumori possono svilupparsi nel hindlimb seguita da amputazione al raggiungimento di un volume di vitello 250 mm 3, e un gruppo ipossia esposti, in cui il tumore- hindlimb cuscinetto è sottoposto a FAL allo stesso volume, seguita da amputazione 3 giorni più tardi. Anche se in questi esperimenti tumori FAL-trattate vengono amputati con un leggero ritardo, rispetto ai tumori di controllo, le loro dimensioni non aumenta durante il periodo di 3 giorni tra legatura e amputazioni. Pertanto, questo approccio consente di comparare potenziale metastatico tra tumori di dimensioni paragonabili, ma con drammaticamente diversi livelli di ipossia. Al contrario, con la chirurgia sham, un controllo comunemente utilizzato per gli interventi chirurgici, seguito da 3 giorni di crescita tumorale comporterebbe differenze significative nelle dimensioni del tumore tra i gruppi sperimentali, con la sham chirurgia-treattumori primari Ed in possesso di livelli significativi di ipossia endogena. Sulla base delle esperienze pilota, chirurgia sham non influenza significativamente la crescita tumorale o suoi livelli ipossia e può quindi essere eliminato dal disegno sperimentale. Invece, la strategia di confronto tumori di dimensioni simili e diversi livelli di ipossia è un modello molto rilevante per chiarire gli effetti dell'ipossia sulla diffusione della malattia. È importante sottolineare che, a differenza di precedenti studi in vitro, questo approccio consente la valutazione complessiva delle azioni pro-metastatico di ipossia in un microambiente tumorale naturale. 4-6
L'obiettivo del modello sperimentale era raggiungere un livello basale basso di metastasi che consentirebbe l'individuazione di un effetto stimolante ipossia indotta sulla loro formazione. Abbiamo stabilito che una dimensione vitello di 250 mm 3 a FAL e amputazione era ottimale per SK-ES1 tumori primari. Tuttavia, questo parametro dovrà essere ottimizzato per EA linea cellulare ch, a seconda della loro metastatico invasività potenziale e locale. Per i tumori a più alto potenziale metastatico, la dimensione del tumore primario in amputazione può essere necessario diminuito. Ad esempio, tumori TC71 mostrano un alto invasività locale manifesta con formazione frequente di tumori ricorrenti nel sito di amputazione. 18 Una volta che tali masse sviluppano, gli animali devono essere esclusi dalle analisi, in quanto non sarebbe chiaro se le successive metastasi a distanza origine da tumori primari o da tumori ricorrenti che spesso crescono rapidamente e presentano alti livelli di ipossia endogena. Dalla precedente esperienza, indipendente dalla linea cellulare utilizzato, a 150 mm 3 è la dimensione vitello portatore di tumore minima che può essere misurato in modo affidabile e normalizzata. Se diminuendo la dimensione del tumore al FAL e amputazione non elimina i tumori ricorrenti o diminuire il tasso di metastasi basale a sufficienza, la linea cellulare particolare in questione non può essere adatto per questi esperimenti.
ve_content "> Analogamente, è importante stabilire la sequenza temporale di MRI e dell'eutanasia per ogni linea singola cella, a seconda della latenza della sua metastasi. In particolare, le clip ferita chirurgica che interferiscono con MRI possono essere rimossi non prima di 10 giorni post un intervento chirurgico, e questo periodo devono essere estesi a volte a causa di complicazioni con la guarigione. così, in questo studio abbiamo stabilito il giorno 15 come il tempo della prima risonanza magnetica.Un'altra considerazione importante in questo modello è il mantenimento di un livello di ipossia in grado di indurre processi metastatici senza provocare necrosi completa del tumore, che impedirebbe la diffusione delle cellule tumorali. Anche se non abbiamo riscontrato questo problema in questo studio, se necessario, la gravità dell'ipossia può essere regolato modificando il punto esatto e il numero di legature in relazione ai rami dell'arteria femorale, come il LCFA e genu arteria. 20 Così, una prossimale legatura al LCFA creerà più grave ischemia in hicircolazione ndlimb, aumentando così le condizioni di ipossia nella gamba distale. Al contrario, la legatura distale alle successive diramazioni dell'arteria femorale diminuirà l'ipossia conseguente hindlimb inferiore.
È importante sottolineare che non ci sono stati gravi effetti avversi di procedure FAL e amputazione uniti e nessun decessi correlati agli interventi chirurgici, come riportato in precedenza per queste tecniche eseguite separatamente. 18-20 Così, il successo del metodo è limitata principalmente dalla velocità di presa del tumore nel sito primario e la frequenza di tumori ricorrenti, che sono entrambi line-dipendente cellule.
Come ipossia è stato implicato come fattore pro-metastatico in molti tipi di tumore, questo approccio può anche essere adatto per testare direttamente i suoi effetti e la definizione dei suoi meccanismi di azione in altri sarcomi che si sviluppano negli arti. 23 Inoltre, una strategia simile può essere applicata ad altri tumori maligni crescono in ambienti ortotopiche won una via di rifornimento di sangue ben definito. Così, con le opportune modifiche, questo modello può essere uno strumento utile per la ricerca al di là del campo di ES biologia.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SK-ES1 Human Ewing sarcoma (ES) cells | ATCC | ||
| TC71 Human ES cells | Kindly provided from Dr. Toretsky | ||
| McCoy's 5A (modified) Medium | Gibco by Life Technologies | 12330-031 | |
| RPMI-1640 | ATCC | 30-2001 | |
| PBS | Corning Cellgro | 21-040-CV | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442-500mL | |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1x) | Gibco by Life Technologies | 25200-056 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco by Life Technologies | 15140-122 | |
| Fungizone® Antimycotic | Gibco by Life Technologies | 15290-018 | |
| MycoZap™ Prophylactic | Lonza | VZA-2032 | |
| Collagen Type I Rat tail high concetration | BD Biosciences | 354249 | |
| SCID/beige mice | Harlan or Charles River | 250 (Charles River) or 18602F (Harlan) | |
| 1 ml Insulin syringes with permanently attached 28 G ½ needle | BD | 329424 | |
| Saline (0.9% Sodium Chloride Injection, USP) | Hospira, INC | NDC 0409-7984-37 | |
| Digital calipers | World Precision Instruments, Inc | 501601 | |
| Surgical Tools | Fine Science Tools | ||
| Rimadyl (Carprofen) Injectable | Zoetis | ||
| Hypoxyprobe-1 (Pimonidazole Hydrochloride solid) | HPI, Inc | HP-100mg | |
| hypoxyprobe-2 (CCI-103F-250 mg) | HPI, Inc | CCI-103F-250mg | |
| Povidone-iodine Swabstick | PDI | S41350 | |
| Sterile alcohol prep pad | Fisher HealthCare | 22-363-750 | |
| LubriFresh P.M. (eye lubricant ointment) | Major Pharaceuticals | NDC 0904-5168-38 | |
| VWR Absorbent Underpads with Waterproof Moisture Barrier | VWR | 56617-014 | |
| Oster Golden A5 Single Speed Vet Clipper with size 50 blade | Oster | 078005-050-002 (clipper), 078919-006-005 (blade) | |
| Nair Lotion with baby oil | Church & Dwight Co., Inc. | ||
| Silk 6-0 | Surgical Specialties Corp | 752B | |
| Prolene (polypropylene) suture 6-0 | Ethicon | 8680G | |
| Vicryl (Polyglactin 910) suture 4-0 | Ethicon | J386H | |
| Fisherbrand Applicators (Purified cotton) | Fisher Scientific | 23-400-115 | |
| GelFoam Absorbable Dental Sponges - Size 4 | Pfizer Pharmaceutical | 9039605 | |
| Autoclip Wound Clip Applier | BD | 427630 | |
| Stereo Microscope | Olympus | SZ61 | |
| Autoclip remover | BD | 427637 | |
| Aound clip | BD | 427631 | |
| MRI 7 Tesla | Bruker Corporation | ||
| Paravision 5.0 software | Bruker Corporation | ||
| CO2 Euthanasia system | VetEquip | ||
| 25 G 5/8 Needle (for heart-puncture) | BD | 305122 | |
| 0.1 ml syringe (for heart-puncture) | Terumo | SS-01T | |
| K3-EDTA Micro tube 1.3 ml | Sarstedt | 41.1395.105 | |
| 10% Neutral Buttered Formalin | Fisher Scientific | SF100-4 |
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