Introduction
ユーイング肉腫（ES）は、小児および青年に影響を与える積極的な悪性腫瘍です。 1腫瘍は一般的に手足に、軟部組織および骨に開発しています。転移の存在が、ES患者のための単一の最も強力な予後不良因子であるが、その開発の基礎となるメカニズムは不明です。 2腫瘍の低酸素状態は、ESの進行に関与するいくつかの要因の一つです。 ES患者において、腫瘍組織内の非灌流領域の存在は、予後不良と関連しています。 図3は、 インビトロにおいて 、低酸素症は、ES細胞の侵襲性を増加させ、プロ転移性遺伝子の発現を誘発します。しかし、証拠のこれらの行にもかかわらず、低酸素誘導ESの進行および普及のためには直接の証拠が存在しない4-6。また、低酸素症は、このような効果を発揮する機構は、現時点では不明です。したがって、我々は、in vitroデータおよび臨床obser に既存の間のギャップを埋めるためにin vivoモデルを作成しましたvations。このモデル系は、ex vivoでの病理学的および分子分析（ 図1）と組み合わせて、 インビボでの腫瘍の進行と転移に追従するように、磁気共鳴イメージング（MRI）を使用して、それらの自然環境で発生する腫瘍の低酸素の影響の直接的検査を可能にします。
ESの確立さトランスジェニックモデルは、現在利用可能ではないので、これらの腫瘍の転移特性に関するin vivo試験は、免疫不全マウスにヒト細胞の注射に依存しています。免疫学的障害の動物の使用は、疾患の進行の免疫系の影響を過小評価することができるが、ヒト細胞を使用する能力は、このような研究の翻訳可能を増加させます。異なる異種移植モデルの中では、尾静脈への全身注射は、実行するのが最も簡単です、まだ彼らは、腫瘍細胞の血管内の最初のステップを省略し、成長のプライマリサイトから脱出します。一方7-12、orthoto骨への腫瘍細胞の注射を伴うPICの異種移植、（大腿骨、肋骨）または筋肉は、より技術的に困難なだけでなく、より生物学的に関連するヒト癌のです。 13-16しかし、過去には、原発腫瘍の急速な成長に関連した高い罹患率は、多くの場合、転移の開発の前に殺処分を必要としています。本研究では、MRIによって転移進行の長手方向の監視と合わせ、得られた原発腫瘍の切除に続いて腓腹筋への細胞注射の以前に確立されたモデルを採用しました。筋肉や骨- -脛骨に近接した腓腹筋に17,18このような注射は、2つの固有のES環境において腫瘍増殖を可能にし、一般的にヒトでの影響を受けた場所に遠隔転移が生じます。 18これにより、このモデルが正確に疾患の進行中に、ES患者に発生する転移プロセスを再現します。
テント ">下側後肢における原発腫瘍の局在化は、腫瘍組織への血液供給の正確な制御を容易にする。大腿動脈結紮（FAL）が遠位領域への血流を遮断するために、血管新生の研究に利用されるよく確立された技術であります脚部と虚血に応答して、組織の血管新生を調査する。19,20重要なのは、血流の初期低下が担保血管の開口部と、ほぼ3日FAL後に観察される組織の再灌流が続いている。20このように、腫瘍を有する肢で実行、このモデルは、急速に成長する腫瘍で自然に発生する低酸素/再灌流イベントを再作成し、新しくオープンした側副血管を経由して下位後肢への灌流の回復による転移性腫瘍細胞の脱出を可能にします。21腫瘍サイズがある場合に重要なのは、この手順を実行する必要があります（典型的には、腫瘍を有するウシ容量で対照腫瘍における過剰な低酸素症を防止するのに十分に小さいですコントロールとFAL処置群間の腫瘍低酸素のレベルの有意な差を確保し250 mm 3で）、 - 150の梅。ES待ち時間および転移の頻度の低酸素の影響の長手方向の監視に加えて、このモデルは、組織の収集および原発腫瘍および転移の両方から新たな細胞系の開発を可能にします。重要なことには、以前の研究は、転移由来の細胞株は、腫瘍の播種は、腫瘍細胞の表現型の永久的な変化に関連し、それによって転移プロセスを解読するために、これらの細胞株の使用を検証していることを示す、動物に再導入時に強化転移の可能性を示すことを確立しました。 図18は、集合的に、これらのモデルは、現在、低酸素誘導性の転移の経路を識別するために必要な遺伝的および分子分析のために使用することができます。
低酸素症のような様々なトンの悪性度を高めるプロ転移因子でありますumors、我々のモデルは、例えば、骨肉腫および横紋筋肉腫のような自然に手足に発症する他の腫瘍タイプにおける低酸素の役割を調査するためのプラットフォームとして使用することができます。 21-23はまた、同様のアプローチは、血液供給の明確に定義された経路と他の解剖学的部位で増殖する悪性腫瘍に適用することができます。最終的に、モデルを変更することができ、その有用性はさらに、個々の研究の必要性に応じて、延長しました。
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Protocol
すべての手順は、ジョージタウン大学施設内動物管理使用委員会によって承認されました。
同所注射用1.細胞調製
- 標準条件下での培養ヒトES細胞。ない5匹のマウスの注射のための密集度の70％を超えて約1 15cmの細胞培養プレートを使用します。
注：この研究のために、SK-ES1細胞は、コラーゲンコートしたプレート上で、15％ウシ胎児血清（FBS）とマッコイの5A培地で培養し、TC71の細胞を、10％FBSおよび1％の4-（2-ヒドロキシエチルを含むRPMI中で培養しました）-1-ピペラジンエタンスルホン酸（HEPES）。両方の培地は、抗生物質を補充した - ペニシリン（100単位/ ml）、ストレプトマイシン（100μg/ ml）およびファンギゾン（1μg/ ml）を入れます。 - リン酸緩衝生理食塩水（PBS）を用いてES細胞を洗浄し、5分間、0.25％トリプシン/エチレンジアミン四酢酸（EDTA）で70％コンフルエンスでトリプシン処理。
- 細胞培養メディ付きプレートからES細胞を削除します、その後、室温で200×gで5分間遠心します。再懸濁冷PBS 10mlのES細胞を、次いで、細胞数を数えます。
- その後、遠心分離機のES室温で200×gで5分間、細胞、および冷PBS 1ml当たり2×10 7（SK-ES1）または10 7（TC71）の細胞で再懸濁します。注射を行いながら、氷上で最終的な細胞懸濁液を保管してください。
腓腹筋へのES細胞の2同所注射
- 4-6週齢の雌SCID /ベージュマウスを使用してください。
- ES細胞を注入するために、そっと下後肢の内側を露出させ、マウスを保持し、第四および第五指の間にその左足を安定させます。
- 28 G 1/2針を用いて、いずれかの腓腹筋に2×10 6（SK-ES1）または10 6（TC71）ES細胞（ 図2A）を含んで 、以前に調製した細胞懸濁液を0.1ml注入します。
注：なお、筋肉内INJの最大音量ectionsこの特定の手順0.1 mlまでの体積の増加が原因で注入高い細胞数が必要であり、通常は0.05 mlです。この手順は、ジョージタウン大学の施設内動物管理使用委員会によって承認されています。- 脛骨稜/結節の方向に45度の角度 - 腓腹筋に前方に約30の針を挿入します。
- それは脛骨稜/結節を触れたら、少し針を撤回。ゆっくりと徐々に圧力を解放するために針を引き抜く、細胞懸濁液を注入します。
- 苦痛の徴候のための次の24時間かけて注入したマウスを監視します。
注：動物の取り扱いにはあまり経験を持つ研究者らは、腫瘍細胞注射のためのマウスを麻酔検討する必要があります。いくつかの機関は、安全上の理由から麻酔が必要な場合があります。
3.原発腫瘍の増殖を監視
- D原発腫瘍の成長を監視しますaily腫瘍の大きさは、所望の体積に達するまで。
注：現在の研究では250 mm 3でのウシ体積は実験（ 図2B）の出発点として使用しました。このサイズに到達するために腫瘍のため2週間 - 一般的に、それはおよそ1かかります。- その内側 - 外側と前後長を介してデジタルノギスで毎日ふくらはぎのサイズを測定します。
- Dは長い直径であり、dは担癌下後肢の短径である3.14をxは式（D XDを2月6日 ）によるふくらはぎのボリュームを、決定します。
注： - 50ミリメートル3正常な成体マウスのふくらはぎのサイズは約40です。そのボリュームは、腫瘍の成長にとふくらはぎが主に腫瘍組織で構成され、後の段階で増加します。
腫瘍を有する後肢に低酸素症を誘発するため4.大腿動脈結紮（FAL）
- CUR：この操作に必要な手術器具を準備VEDや細かい鉗子を指摘し、鉗子、手術用はさみと針ホルダを指摘しました。オートクレーブまたはホットビーズ滅菌器を使用して、手術前にこれらのツールを滅菌します。また、この手術の準備ができて細かい綿棒を持っています。
注：手順の間に、必要に応じてツールがヒントで再滅菌することをお勧めします。 - 鎮痛剤を注入し（カルプロフェンは5mg / kg）を皮下（SQ）。検出し、低酸素状態を確認するために、hypoxyprobe-1（ピモニダゾール、60ミリグラム/キログラム）を注入します。
注：この用量は、マウス当たり1.5ミリグラムに相当し、腹腔内（IP）、PBS中の15 mg / mlでhypoxyprobe溶液0.1mlを注入することによって達成されます。 hypoxyprobeその後、免疫組織化学による動物組織において検出可能死後です。 - 1 L /分の流速で100％酸素中の5％イソフルラン - 3を含む麻酔導入チャンバー内にマウスを置き。
- それは、外部刺激に応答しなくなるまで誘導チャンバ内でマウスを残します。それから私から動物を削除しますnduction室。操作面での温暖化パッドの上に配置された滅菌ドレープ上仰臥位で動物を置きます。 0.8 L /分の流速で100％酸素中3％イソフルラン - 1の連続的な流れに接続するためにノーズコーンを使用します。
- 角膜の乾燥を防ぐために、それぞれの目に、無菌非薬用の眼軟膏を適用します。徹底的に手術領域を脱毛するためには、せいぜい10秒のための皮膚の上にそれを残して、脱毛クリームを適用します。その後、エタノールプレップパッドを使用して脱毛クリームを拭き取ります。
- 約45度のマウスの正中線からテープの切れ端で後肢を拡張し、固定します。後肢が安全になると、さらに2回ずつ繰り返し、10％のポビドン/ヨウ素綿棒/ソリューション、エタノール、続いて露出した皮膚を拭いてください。手術手順の残りの部分については、後肢た領域の拡大図を得るために、立体顕微鏡を使用しています。
- 尖ったピンセットおよび外科ハサミを使用して、SKの切開を行います約1cmの長、中、鼠径部に向かって半ば腿から。生理食塩水で湿らせた上質なコットンの綿棒を使用して、静かに太ももの筋肉を取り巻く皮下脂肪組織を離れて磨きます。
- 慎重に皮下脂肪組織を通って鈍的切開を介して下層の大腿動脈を明らかにしました。半ば上部転筋の血管系を露出するために傷や手術野を安定させます。
- 穏やかピアス膜性大腿シースを通って、微細なピンセットを使用して神経血管束を露出させます。細かい鉗子のクリーンセットを使用して、鼠径靱帯の遠位に、脚の付け根に近い近位の位置で大腿静脈や神経から大腿動脈を解剖し、分離します。大腿静脈壁を貫通しないように注意してください。
- 解剖の後、横方向の回旋大腿動脈（LCFA）の枝に大腿動脈および遠位の下に6-0絹縫合糸のストランドを渡します。ダブルノット（ 図3）を使用して大腿動脈を閉塞します。 6-0ポリプロピレン縫合糸を使用して切開部を閉じます。切開を閉じた後、体液バランスの治療のために温かい生理食塩水のSQ 0.5ミリリットルを注入。回復ケージにドレープ暖かいパッドの上に動物を置き、目を覚ましまで継続的に監視します。
- 手術後の最初の6時間の間、動物を監視し、3日間毎日の鎮痛剤（カルプロフェン5ミリグラム/キログラム、SQ）を注入します。滅菌はさみを使用して、手術後10日縫合糸を取り外します。
脚切断術5.原発腫瘍切除
注：ふくらはぎのサイズは、対照群のための250ミリメートル3または低酸素グループのFALの3日後に到達したときに、腫瘍を有する下後肢を切断します。
- 優しく動物を保持しながら、バリカンで骨盤領域に遠位脛骨から腫瘍を有する四肢から毛を剃ります。手続きの前に鎮痛薬（カルプロフェン5ミリグラム/キログラム、SQ）を注入します。
- 麻酔誘導chの上にマウスを置きます1 L /分の流速で100％酸素中の5％イソフルラン - 琥珀3を含みます。それは、外部刺激に応答しなくなるまで誘導チャンバ内でマウスを残します。そして、誘導チャンバーから動物を削除します。
- 操作面での温暖化パッドの上に配置された無菌ドレープを右側臥位で動物を置きます。 0.8 L /分の流量で100％酸素中3％ - イソフルラン1の連続的な流れに接続するためにノーズコーンを使用します。角膜の乾燥を防ぐために、それぞれの目に、無菌非薬用の眼軟膏を適用します。
- 3回繰り返し、10％のポビドン/ヨウ素綿棒/ソリューション、続いてエタノールを使用して手術部位を準備します。無菌手術野を得るために、マウスの上に滅菌ガーゼ（ 例えば 、外科用ドレープ）を適用します。
- 近位皮膚の鈍的切開と後退が続くミドル大腿周皮膚切開を、作ります。脚部の中央側の内側大腿神経血管椎弓根を露出させ、その後、連結4-0コーティングされた（ポリグラクチン910）吸収性縫合糸材料を使用して、鼠径靱帯の近く。
- 寛骨大腿の関節への軟部組織の鈍的切開に続いてはさみで筋肉群の半ば大腿切断を実行します。骨カッターを使用して、半ば大腿骨骨切り術を行います。滅菌細かい綿棒または吸収性ゼラチンスポンジを使用して、静かに最小限に抑え、出血を防ぐために、骨切り術部位を押してください。
- 手術創クリップを使用して覆っている皮膚を閉じ、体液バランスの治療のために温かい生理食塩水SQの0.5ミリリットルを注入。回復ケージにドレープ暖かいパッドの上に動物を置き、目を覚ましまで継続的に監視します。
- 手術時には、-80℃の液体窒素とストア内の凍結スナップ、RNA、DNAまたはタンパク質の単離のために原発腫瘍から組織サンプルを収集します。初代細胞培養については、セクション9以下で説明するように、この段階で組織サンプルを収集します。組織学およびimmunochemis 10％中性緩衝ホルマリン中の残りの四肢の組織を修正hypoxyprobe-1の検出を含む、試してみてください。
- 3日間毎日、その後、手術後最初の6時間の間に移動、痛みや食料消費のために動物を監視します。 3日間毎日の鎮痛剤（カルプロフェン5ミリグラム/キログラム、SQ）を注入します。創傷クリップリムーバーを使用して、10日間の切断後に創傷クリップを削除します。
転移の存在6.監視マウス
- 毎日マウスを観察し、少なくとも週に二回転移の臨床徴候のためにそれらを評価します。
- 様々な場所、通常、肩、反対側の脚とジョーに開発塊として提示マクロ転移の存在のために動物を観察します。この目的を達成するために、慎重に頭、首、腋窩領域、および対側後肢を触診します。 MRIスキャンと一緒に腹部膨満を介して内部臓器転移を確認してください。
- INDEで剣状突起（胸骨の下端）を押して肺転移の有無を確認してくださいX指。 24
注：この圧力は、横隔膜呼吸容量を減少させます。高度な肺転移を有するマウスは、面倒な呼吸によって明らかに呼吸困難の兆候を示しています。 - このような中枢神経系への転移を示唆する脚麻痺や運動失調などの神経症状、のために動物を観察します。
- 潜在的な疾患進行の指標として、減量のために少なくとも一週間に一度、マウスを監視します。事前手続き重量の15％を超える体重減少を人道的エンドポイントとみなされます。
7磁気共鳴イメージング検出転移に対する（MRI）
- 所望の時点で転移を検出するために、MRIを実行します。 18
注：現在の研究では、7テスラの水平分光器を使用しました。 MRIは、SK-ES1細胞のためとTC71細胞のための15日目の日15および35後の切断で行いました。 - 麻酔誘導chambeにマウスを置きます30％の酸素および70％一酸化二窒素の混合ガス中の3％イソフルラン - 1を含むR。
- それは、外部刺激に応答しなくなるまで誘導チャンバ内でマウスを残します。そして、誘導チャンバーから動物を削除します。
- 1.5％イソフルランと30％亜酸化窒素の連続投与と呼吸と温度monitorizationで定位ホルダーに麻酔をかけたマウスを転送します。角膜の乾燥を防ぐために、それぞれの目に、無菌非薬用の眼軟膏を適用します。画像動物のいずれかをそれぞれ、全身または脳イメージングのための40または23ミリメートルブルカーマウスボリュームコイルインチ
- TR = 3000ミリ秒、TE = 24ミリ秒、マトリックス= 256、FOV = 4.35 X 3.0センチ、スライス厚= 0.5ミリメートル、RAREファクター= 4、平均値= 4. 18：2次元、T2強調RAREシーケンスを使用します
- 暖かい回復ケージに動物を置き、目を覚ましまで継続的に監視します。
注：麻酔の浅い面が使用されているので、マウスは急速に回復します。 麻酔の悪影響がないことを確認するために、イメージング後の最初の6時間の間に動物を監視します。
8.安楽死と剖検
- MRIおよび/または疾患の進行の臨床症状によって検出可能な転移を有する本動物に一度、マウスを安楽死させます。
注：現在の研究では、マウスはそれぞれ、日50およびSK-ES1とTC71異種移植片を有する動物のための25のポスト切断で屠殺しました。いくつかのケースでは、以前の安楽死は、高い転移の負担に必要でした。 - （ -安楽死室容積/分の30％の10でCO 2）/分で1.5 LにCO 2に暴露することにより、マウスを安楽死させます。動物の死を確保するために、CO 2の暴露後に頸椎脱臼を行います。
- 70％エタノールでマウス全体をスプレーし、層流フード内に配置します。採血TUに1mlシリンジと転送に25 G 1/2針を使用して、心臓穿刺により血液を採取EDTAの2ミリグラムを含有します。
- 脾臓、副腎、卵巣、腎臓、肝臓、肺、脳、右脚、上腕骨や背骨だけでなく、他の場所に存在する巨視的な転移の両方から骨髄：以下の組織を収集します。 25,26
- hypoxyprobe-1の検出を含む、組織学および免疫化学、10％中性緩衝ホルマリン中で各組織の半分を修正しました。スナップは、RNA、DNAまたはタンパク質の単離のために-80℃で保存した後、液体窒素中で他の半分を凍結します。以下のセクション9に記載されるように、一次細胞培養25,26は 、組織サンプルを収集します。
9.初代細胞培養
- 初代細胞培養を行うためには、層流フード内で無菌条件下で切断肢（上記のセクション5）から、または剖検（上記セクション8）の間に組織を解剖。
- 、ペニシリン（200単位/ ml）を補充した同所注射用細胞株のための細胞培養培地に適切に調製ストレプトマイシン（200 / mlの）、ファンギゾン（を1μg/ ml）を、0.2％のマイコプラズマ予防的抗生物質。 6 cmの細胞培養プレートに初代培養培地の2.5ミリリットルを置きます。
- 原発腫瘍または転移からの生存腫瘍組織領域を選択し、滅菌したハサミを使用して、各2〜3ミリメートルで、2〜3のセグメントを分離します。
注：生存腫瘍組織は、通常、腫瘍の縁に見出され、そのピンクまたは赤みを帯びた色、かなりの光沢及び総合的なウェット出現により壊死を区別することができます。これとは対照的に、壊死組織は、一般的に、腫瘍の中心に見られ、鈍い、安っぽい外観と白っぽい/クリーム色の塊として現れます。 27 - ステップ9.2で説明した初代培養培地を含む6 cmの細胞培養プレートに分離されたセグメントを転送します。
- セクション1（注）および9.2に記載されているように標準的な条件下で培養細胞、。 18,28 WH組織片から生じる細胞性伸長のための培養をチェックICHは、数日以内に観察されるはずです。細胞がコンフルエントに達したら、トリプシン処理し、標準的な細胞培養技術に従って、それらを伝播します。
注：一次細胞培養物は、その後、前述のように、制御および低酸素性腫瘍由来の細胞、並びにそれらの分子構造の成長および転移特性を評価するために使用することができます。 18
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Representative Results
腓腹筋へのES細胞の注入後、原発腫瘍が250ミリメートル3のふくらはぎのサイズに成長することが許可されている（ 図1、2）。それぞれ、SK-ES1異種移植片のためTC71 20-25日間、15日間 - 腫瘍は、通常、このボリュームに到達するために必要な時間は、10の範囲です。 250 mm 3で展示内因性低酸素症の比較的低レベルのウシ体積における腫瘍はhypoxybrobe -1（ピモニダゾール）に基づいて、（腫瘍組織の約3％）（ 図4A、C）で染色します。重要なことに、これらの対照腫瘍において、hypoxyprobe-1についての陽性染色は、血管系から離れており、細胞死（ 図4A）を受けるように開始腫瘍細胞において、 すなわち 、生理学的低酸素領域でのみ観察されました。健常な腫瘍組織の大部分がhypoxyprobe-1に対して陰性のままで、このような染色は、特徴的な「エアーブラシ」パターンを示します。<4時間後-FAL（ 図4B）での腫瘍細胞の大部分で観察hypoxyprobe-1のための陽性染色によって証明されるように> 6 SUP対照的に、FALはこの段階で行うには、深遠な低酸素症を作成します。特に、hypoxyprobe-1陽性腫瘍細胞は、血管に近接して観察され、生理学的低酸素症の特徴的なパターンが失われます。これらのFAL処置腫瘍で、組織の73％が低酸素腫瘍細胞（ 図4C）で構成されています。腫瘍組織はまた、細胞収縮と緩い構造（ 図4B）を含む、低酸素誘導性損傷の最初の兆候を呈します。
FALの有効性は、一次腫瘍増殖の完全な阻害によって支持されました。 FALと切断の間に3日間の期間中は、原発腫瘍の大きさは（ 図5A）を増加させませんでした。これとは対照的に、マウスからの原発腫瘍は、偽のsurgerにかけYは、このように、手術（ 図5A）を施していない対照マウスにおける腫瘍の増殖速度を模倣する、約650 mm 3での体積に達し、急速に成長を続けました。 18は、これらのデータに沿って、組織病理学的分析は、3日後に手術（ 図5B）収穫FAL処理された原発腫瘍に壊死の広範な分野を明らかにしました。それにもかかわらず、血管系（ 図5B）に近い、通常、腫瘍の端に位置する腫瘍組織内に存在する生存腫瘍細胞のグループが、ありました。我々は、その後共有これらの細胞内のタンパク質に結合する能力を獲得し、生低酸素細胞において活性化されるhypoxyprobesを使用するこれらの細胞の酸素化状態を調べました。 29このように、これらのプローブは、任意の時点で低酸素症を経験した細胞の永久的なマーカーとして働きます。したがって、experimの期間を通じて、腫瘍細胞の酸素レベルの変化を検出しますENT、我々は、免疫組織化学によって独立して検出することができる2つの異なるhypoxyprobesを用います。直ちにFAL（hypoxyprobe-1）の前に前切断（hypoxyprobe-2、CCI-103F）に- -プローブは、2つの時点で投与し、その局在を3日後FAL（ 図1）採取した腫瘍で検出されました。組織が（ 図5C）、低酸素厳しくなったとしてHypoxyprobe-1、FALの時にシステムに存在した、腫瘍細胞の大部分をマーク。 図4（b）に示すように 、これらの細胞は、まだFALの時に生きていると恒久的に結合hypoxyprobe-1の、したがってことができたので、この標識は、壊死/アポトーシスの分野でも明らかです。壊死領域内の細胞はすでに死ん及びその投与（ 図5D）の時にプローブを活性化することができなかったとして対照的に、hypoxyprobe-2投与2日後-FALは、生細胞を染色しました。興味深いことに、我々はまた、OBSE（hypoxyprobe-1陽性）最初は低酸素であったが、十分に遅い時点（hypoxyprobe-2陰性）（ 図5C、D）で酸素血管系に隣接する生存腫瘍組織をrved。この知見は、側副血管に依存する組織の再灌流は、後肢3日後-FALの血流を回復することを示す以前の報告と一致しています。腫瘍の血管新生したエッジ上での大規模な血管内（ 図5E）によって証明されるように3日間腫瘍組織にポスト-FALを残りの20生存腫瘍細胞は、侵襲性の高いでした。血管内腔内の細胞のいくつかは、彼らがFAL時に低酸素状態になっていたことを示す、hypoxyprobe-1陽性であった、まだ生存したままでした。まとめると、これらのデータは、重度の低酸素症後の組織の再灌流は、原発腫瘍からの細胞の脱出を容易にすることができることを示唆しています。
パイロット実験に基づいて、広範な転移がありましたSK-ES1の異種移植片のための約35日後に切断MRIによって検出可能な、TC71細胞は典型的には15日以内に転移しながら。 15日目での1つの撮像がTC71腫瘍を有するマウスのために十分であった結果、転移の遅延と周波数の比較分析のために、MRIは、SK-ES1の腫瘍を有する動物のために15日と35後の切断で行いました。安楽死は、それぞれ、SK-ES1とTC71異種移植片を有する動物のために50日目と25日目に行きました。以前に報告されているように、転移の最も一般的なタイプは、柔らかい肩の領域における組織塊だけでなく、反対側の足、SK-ES1細胞のための上顎エリア、脊椎、肺およびTC71のための骨盤の腫瘍に骨転移が含まれていました。また18は 、副腎、肺、肝臓、ならびに骨髄浸潤を含む内臓への頻繁な転移は、FAL処理したSK-ES1異種移植片を有するマウス（ 図6）で観察されました。一般的に、低酸素症が大幅に増加します両方の細胞株の全体的な（SK-ES1）もしくは部位特異的（TC71）の周波数および転移の多数。以前に大TC71原発腫瘍について説明したようにしかし、TC71異種移植片はまた、（FAL処置腫瘍のための制御のための25％および40％）切断部位での頻繁な再発塊を開発しました。 18
コントロールとFAL処理された原発腫瘍および転移由来の組織はまた、ESの普及に関与して低酸素活性化経路の同定を目的とした総合的な分子解析のための材料のソースにすることができます。例えば、我々は、コントロールと低酸素性原発腫瘍の代謝学的プロファイルに有意差を観察した（データは示さず）。また、正常に上記の組織のすべてから複数の細胞株を単離することができました。多くの場合、FALで処理した腫瘍に由来する細胞は、元のセルと制御TUに由来するものと比較して、形態の顕著な変化を示しモルス（ 図7A）。これらの細胞培養物の純度は、ユーイング肉腫マーカー、CD99（ 図7B）について陽性の免疫染色によって確認しました。また、確立された細胞株における細胞の100％が、多くの場合、増加した染色体数（ 図8A）を呈する、ヒトセントロメアプローブによる蛍光in situハイブリダイゼーション（FISH）において陽性シグナルを有していました。これらの細胞のヒト起源は、さらに、以前FAL処置腫瘍（ 図8B）に由来する元の細胞株および細胞の両方におけるSK-ES1細胞について記載した細胞遺伝学的再配列を示した中期染色体（ 図8B）の分析によって確認されました。 30
ES低酸素モデルの概要図 。 ES細胞（1 - 2×10 6）を gastrocnに注入しましたSCID /ベージュマウスのemiusの筋肉。得られた一次腫瘍250 mm 3でのウシ体積に達したら、マウスを2つの実験群に分けました。対照群のマウスはhypoxyprobe-1（HP-1）を注射し、そして原発性腫瘍は、手足の切断によって切り出しました。低酸素群のマウスはhypoxyprobe-1を注入した後、大腿動脈結紮（FAL）に供しました。二日後、マウスをhypoxyprobe-2（HP-2）を注入した後、腫瘍を有する肢を3日後、FAL切断しました。両群の動物は、周期的磁気共鳴画像法（MRI）によりモニターしました。転移は、イメージング及び臨床症状に基づいて明らかになった後、マウスを安楽死させ、転移の存在は、剖検および組織病理学的分析によって確認しました。腫瘍の成長、イメージングおよび安楽死の時間は、成長および転移のSK-ES1セルレートに基づいています。しばらくhypoxyprobe-2方式とVISUを確立することが必要であったことに注意してくださいFALと肢切断の期間中に低酸素レベルの変化をアリゼ、その使用は、実際の実験のために必須ではありません。従って、この手順は、プロトコルに含まれていません。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
2. 原発腫瘍増殖を 図 。無傷の後肢のA.磁気共鳴画像（MRI）。赤い矢印は、腫瘍細胞の同所注射部位と方向を示します。 B.約250ミリメートル3腓腹筋（赤い枠）で成長のふくらはぎのボリュームで原発腫瘍。レッド矢じりは、骨破壊の部位を示します。 T - 脛骨。 Cしてくださいこの図の拡大版をご覧になるにはこちらをなめます。
図3. 大腿動脈結紮のサイト。硫酸バリウムで灌流129S1 / SVJマウスの代表的な死後のX線動脈造影は、すぐにライゲーションした後、既存の側副血管の存在を強調するために示されています。近くに、画像は、2つのライゲーション（のX）、横方向の回旋大腿動脈（LCFA）（赤X）と膝動脈（白X）への別の近位に1遠位を示している一方で、腫瘍低酸素モデルのみ近位連結を使用していることに注意してくださいLCFAに鼠径靭帯および遠位（赤色のX）。側副血管発達の領域について説明（かすかな容器）として示され、それらはそれらの蛇行、コルクねじ形状によって識別されます。 彼をクリックしてくださいこの図の拡大版を表示するために再。
図4. 腫瘍低酸素状態は大腿動脈結紮（FAL）により誘導されます。 A. 250ミリメートル3のふくらはぎのボリュームで対照腫瘍は、ヘマトキシリン＆エオシン（H＆E）で染色し、hypoxyprobe-1（ブラウン）のために免疫染色しました。 Hypoxyprobe-1免疫染色は、単に血管系から離れた腫瘍細胞は、酸素を奪われた細胞死を受けるように開始された生理学的な腫瘍低酸素の領域で観察されます。同様のサイズでB. FAL処理された原発腫瘍は、4時間後に結紮を回収し、H＆Eで染色し、hypoxyprobe-1のために免疫染色しました。腫瘍細胞の大部分は、脈管構造に近接したものを含む、hypoxyprobe-1に対して高度に陽性です。 V - 血管。 C. hypoxyprobe-1のための陽性染色の面積はquantifましたImageJソフトウェアを使用して制御し、FAL処置腫瘍でIED。エラーバーはSEMを表します。 *** - P <0.001 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
原発腫瘍の増殖に大腿動脈結紮（FAL）の 図5. 効果。 FAL-における手術および切断の間に3日間の期間中A.原発腫瘍成長（N = 4）と偽手術処置（N = 4）動物、無傷対照腫瘍と比較した（n = 6）。エラーバーはSDを表します。 *** - P <0.001、両方の制御および偽手術処置腫瘍と比較しました。 FAL-処理された腫瘍のB.ヘマトキシリンおよびエオシン（H＆E）染色は、ポストライゲーションは腫瘍内の広範囲の壊死を明らかにし、3日に収穫しました。赤い枠は、生存腫瘍CEの領域を示しています高度に血管領域に近接しLLSは3日後-FALを灌流しました。 C. FAL処理された腫瘍組織は、手術後hypoxyprobe-1について免疫3日に収穫しました。 Hypoxyprobe-1は、FALの前に注入しました。したがって、正の免疫染色は、大規模な組織低酸素直後の手術が存在することを示しています。 D. Hypoxyprobe-2は、ポスト-FAL 2日間注射し、組織が切断で、24時間後に採取しました。正hypoxyprobe-2染色は切断時の組織低酸素症を識別します。赤い矢印は、切除の時に黄色の矢印は、直ちにFAL（hypoxyprobe-1陽性）の後に低酸素であった血管系に隣接する領域を示し、一方、両方の時点で低酸素である組織が、hypoxyprobe-2用の負を示し、組織の再灌流の指標です。壊死領域におけるhypoxyprobe-2染色の欠如は、この領域内のセルは、その投与時に生存していなかったことを示唆しているため、積極的にプローブを結合することができません。パネルBDに提示染色は連続組織切片上で行いました。 FAL-処理された腫瘍におけるE.血管内3日後-FAL。免疫染色は、血管内腔（赤い矢印）内hypoxyprobe-1について陽性の生細胞を識別します。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
FAL処理したSK-ES1腫瘍を有するマウスにおける転移の 図6. 例。転移は、磁気共鳴イメージング（MRI）によって検出され、剖検および病理組織学的分析（ヘマトキシリン＆エオシン染色、H＆E）により確認しました。 M - 転移。 より大きなVERSを表示するには、こちらをクリックしてください。この図のイオン。
FAL処理された原発腫瘍に由来する細胞の 7 特性図 。 A.生細胞培養物は、対照および低酸素性原発腫瘍から採取した組織から確立され、その形態は、最初の同所注射に使用した元の細胞株と比較しました。 FAL処理された原発腫瘍由来の細胞は、それらのサイズおよび形態の劇的な変化を示します。オリジナル及び原発腫瘍由来のSK-ES1細胞の代表的な画像が示されています。 ESマーカー、CD99のための免疫染色、およびDNA結合色素、DAPIで対比FAL処置腫瘍に由来する細胞のB.代表がイメージ。すべての細胞は、拡大核（白矢印）を含む肥大細胞を含む、CD99陽性です。 OAD / 54532 / 54532fig7large.jpg "ターゲット=" _空白 ">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
FAL処理した腫瘍に由来する細胞の 8 染色体分析図 。人間の動原体4のプローブのシグナルを有する2つの核を示す間期細胞でのin situハイブリダイゼーション（FISH）解析中 のA.蛍光。 4つの信号を持つ大規模な核四倍体（4N）細胞（白矢印）を示しています。 B. SK-ES1元の細胞株のとFAL処理された原発腫瘍由来の細胞の代表的な中期におけるFISH分析。赤い矢印は、INV（1）（p13.1q21）、SK-ES1細胞の非ランダム細胞遺伝学的再配置の特性を示しています。レッドシグナル：ヒトセントロメア4プローブ。元SK-ES1細胞におけるグリーン信号：染色体4q32.2上のNPY5Rプローブ 。e.com/files/ftp_upload/54532/54532fig8large.jpg "ターゲット=" _空白"> この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
腫瘍が250ミリメートル3のふくらはぎのボリュームに達したときに切断が続く後肢に開発することが許可されている対照群、および低酸素曝露群で腫瘍-我々のモデルは、2つの実験群における転移の比較を含みます軸受後肢は3日後に切断、続いて、同じ音量でFALに供されます。対照腫瘍と比較して、これらの実験でFAL処理された腫瘍は、少し遅れて切断されているにもかかわらず、その大きさは、連結および切断の間に3日間の期間中に増加しません。したがって、このアプローチは、同等サイズのが、低酸素症の劇的に異なるレベルを有する腫瘍間の転移能の比較を可能にします。対照的に、偽手術を使用して、腫瘍増殖を3日間、続いて外科的介入のために一般的に利用される制御は、偽手術治療で、実験群の間で腫瘍サイズの有意な差をもたらします内因性の低酸素症の有意なレベルを有する原発性腫瘍を編。パイロット実験に基づいて、偽手術が大幅に腫瘍増殖または低酸素レベルに影響を与えないので、実験の設計から除去することができます。代わりに、同様の大きさと異なる低酸素レベルの腫瘍を比較した戦略は、疾患の普及に低酸素の影響を解明するための関連性の高いモデルです。重要なことは、in vitro試験で 、前とは違って、このアプローチは、自然腫瘍微小環境における低酸素のプロ転移性行動を総合的に評価することができます。 4-6
実験計画の目標は、それらの形成に低酸素誘導刺激効果の検出を可能にする転移の低い基礎レベルを達成することでした。私たちは、ふくらはぎのFALで250ミリメートル3の大きさや切断がSK-ES1原発腫瘍のために最適であったことを確立しました。しかし、このパラメータは、EAのために最適化する必要があります chの細胞株、それらの転移の可能性、地域浸潤によって異なります。高い転移の可能性を有する腫瘍については、切断で原発腫瘍の大きさを小さくすることが必要になる場合があります。例えば、TC71の腫瘍は、切断部位での再発性腫瘍の頻繁な形成によって明らかに高い局所浸潤性を示します。このような質量が開発18たら、動物はその後の遠隔転移は原発腫瘍から、または、多くの場合、急速に成長し、内因性の低酸素症の高いレベルを示す再発性腫瘍に由来する場合、それは明確ではないであろうとして、分析から除外されなければなりません。以前の経験から、細胞系の独立した150 mm 3では、最小の腫瘍を有するウシ確実に測定することができる大きさと正規化され、使用されます。 FALおよび切断に腫瘍の大きさを小さくすることは再発腫瘍を除去又は十分基礎転移速度を低下させない場合、当該特定の細胞株は、これらの実験に適していないかもしれません。
ve_contentは ">同様に、その転移のレイテンシに応じて、個々のセルラインのためにMRIのタイムラインや安楽死を確立することが重要ではありません。特に、MRIを妨害する手術創クリップは10日後よりも早く除去することができ手術、そしてこの期間は時々により治癒との合併症に拡張されなければならない。したがって、本研究では、我々は最初のMRIの時間として15日に設立しました。このモデルにおける別の重要な考慮事項は、腫瘍細胞の播種を妨げる完全な腫瘍壊死を引き起こすことなく、転移のプロセスを誘導することができる低酸素のレベルを維持しています。我々はこの研究では、この問題が発生していないが、必要に応じて、低酸素症の重症度は、LCFAや膝の動脈として大腿動脈の枝に関連して正確な部位とライゲーションの数を変えることにより調節することができます。 20したがって、LCFAにライゲーション近位がhiで、より重度の虚血を作成します。ndlimb循環が、それによって遠位脚部に低酸素状態を増加させます。これとは対照的に、大腿動脈の後続ブランチに遠位を連結すると、下側の後肢の結果、低酸素を減少させます。
重要なことは、組み合わせFALと切断手順の重篤な有害作用し、以前に別々に行うこれらの技術について報告されているように、手術に関連した死亡例はなかったです。 18-20したがって、この方法の成功は、細胞株に依存しているどちらも、プライマリサイトの腫瘍取り込みの速度および再発腫瘍の頻度によって主に制限されています。
低酸素症は、多くの腫瘍型におけるプロ転移因子として関与しているように、このアプローチは、直接その効果を試験し、手足の開発他の肉腫でのアクションのメカニズムを定義するために適切であり得ます。 図23はまた、同様の戦略は、同所環境Wに成長する他の悪性腫瘍にも適用することができます明確に定義された血液供給経路番目。このように、適切な修正を加えて、このモデルは、ES生物学の分野を超えた研究に有用なツールであることができます。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SK-ES1 Human Ewing sarcoma (ES) cells | ATCC | ||
| TC71 Human ES cells | Kindly provided from Dr. Toretsky | ||
| McCoy's 5A (modified) Medium | Gibco by Life Technologies | 12330-031 | |
| RPMI-1640 | ATCC | 30-2001 | |
| PBS | Corning Cellgro | 21-040-CV | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442-500mL | |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1x) | Gibco by Life Technologies | 25200-056 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco by Life Technologies | 15140-122 | |
| Fungizone® Antimycotic | Gibco by Life Technologies | 15290-018 | |
| MycoZap™ Prophylactic | Lonza | VZA-2032 | |
| Collagen Type I Rat tail high concetration | BD Biosciences | 354249 | |
| SCID/beige mice | Harlan or Charles River | 250 (Charles River) or 18602F (Harlan) | |
| 1 ml Insulin syringes with permanently attached 28 G ½ needle | BD | 329424 | |
| Saline (0.9% Sodium Chloride Injection, USP) | Hospira, INC | NDC 0409-7984-37 | |
| Digital calipers | World Precision Instruments, Inc | 501601 | |
| Surgical Tools | Fine Science Tools | ||
| Rimadyl (Carprofen) Injectable | Zoetis | ||
| Hypoxyprobe-1 (Pimonidazole Hydrochloride solid) | HPI, Inc | HP-100mg | |
| hypoxyprobe-2 (CCI-103F-250 mg) | HPI, Inc | CCI-103F-250mg | |
| Povidone-iodine Swabstick | PDI | S41350 | |
| Sterile alcohol prep pad | Fisher HealthCare | 22-363-750 | |
| LubriFresh P.M. (eye lubricant ointment) | Major Pharaceuticals | NDC 0904-5168-38 | |
| VWR Absorbent Underpads with Waterproof Moisture Barrier | VWR | 56617-014 | |
| Oster Golden A5 Single Speed Vet Clipper with size 50 blade | Oster | 078005-050-002 (clipper), 078919-006-005 (blade) | |
| Nair Lotion with baby oil | Church & Dwight Co., Inc. | ||
| Silk 6-0 | Surgical Specialties Corp | 752B | |
| Prolene (polypropylene) suture 6-0 | Ethicon | 8680G | |
| Vicryl (Polyglactin 910) suture 4-0 | Ethicon | J386H | |
| Fisherbrand Applicators (Purified cotton) | Fisher Scientific | 23-400-115 | |
| GelFoam Absorbable Dental Sponges - Size 4 | Pfizer Pharmaceutical | 9039605 | |
| Autoclip Wound Clip Applier | BD | 427630 | |
| Stereo Microscope | Olympus | SZ61 | |
| Autoclip remover | BD | 427637 | |
| Aound clip | BD | 427631 | |
| MRI 7 Tesla | Bruker Corporation | ||
| Paravision 5.0 software | Bruker Corporation | ||
| CO2 Euthanasia system | VetEquip | ||
| 25 G 5/8 Needle (for heart-puncture) | BD | 305122 | |
| 0.1 ml syringe (for heart-puncture) | Terumo | SS-01T | |
| K3-EDTA Micro tube 1.3 ml | Sarstedt | 41.1395.105 | |
| 10% Neutral Buttered Formalin | Fisher Scientific | SF100-4 |
References
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