Introduction
Sarcoma de Ewing (ES) é uma neoplasia agressiva que afectam as crianças e adolescentes. 1 Os tumores se desenvolvem em tecidos moles e ossos, comumente nos membros. Embora a presença de metástases é o factor adverso mais forte único prognóstico para pacientes ES, os mecanismos subjacentes ao seu desenvolvimento permanecem obscuros. 2 tumor hipoxia é um dos poucos factores implicados na progressão ES. Em pacientes ES, a presença de áreas não perfundidas no interior do tecido do tumor está associada com mau prognóstico. 3 In vitro, a hipoxia aumenta a capacidade de invasão de células ES e desencadeia a expressão de genes pró-metastáticos. 4-6 No entanto, apesar destas linhas de evidência, nenhuma prova direta para a progressão ES induzido por hipoxia ea propagação existe. Além disso, os mecanismos pelos quais a hipoxia exerce tais efeitos são, presentemente, desconhecido. Por isso, criamos um modelo in vivo para preencher a lacuna entre o existente dados in vitro e obser clínicavações. Este sistema modelo permite testar directa dos efeitos de hipoxia em tumores que ocorrem no seu ambiente natural, utilizando imagiologia de ressonância magnética (MRI) para seguir a progressão tumoral e metástases in vivo, em combinação com análise ex vivo patológicas e moleculares (Figura 1).
Uma vez que nenhum transgénico modelo estabelecido de ES está actualmente disponível, os estudos in vivo sobre as propriedades metastáticas destes tumores dependem de injeções de células humanas em ratinhos imunocomprometidos. Enquanto o uso de animais com deficiência imunologicamente pode subestimar o impacto do sistema imune na progressão da doença, a capacidade para utilizar células humanas aumenta tradutibilidade de tais estudos. Entre os diferentes modelos de xenotransplante, injeções sistêmicas na veia da cauda são mais fáceis de executar, mas omitem os passos iniciais da intravasation célula tumoral e fugir do local primário do crescimento. 12/07 Por outro lado, orthoto xeno pic, que envolve injeções de células tumorais em ossos (fêmur, costela) ou nos músculos, é mais um desafio técnico, mas também biologicamente mais relevantes para câncer humano. 13-16 eutanásia dos animais No entanto, no passado, a altas taxas de morbidade associada a um rápido crescimento de tumores primários foi frequentemente necessária antes do desenvolvimento de metástases. Neste estudo, que empregou um modelo previamente estabelecido de injecções de células no músculo gastrocnémio seguida por excisão do tumor primário resultante combinada com a monitorização longitudinal de progressão metastático por MRI. 17,18 Essas injecções no músculo gastrocnémio em estreita proximidade com a tíbia permitir o crescimento do tumor em dois ambientes naturais ES - músculos e ossos - e resultar em metástases para locais distantes normalmente atingidas em seres humanos. 18 Deste modo, este modelo recapitula com precisão os processos metastáticos que ocorrem em pacientes ES durante a progressão da doença.
tenda "> A localização de tumores primários no membro posterior inferior também facilita o controle preciso do fornecimento de sangue ao tecido do tumor. A ligação da artéria femoral (FAL) é uma técnica bem estabelecida utilizada na investigação da angiogénese para bloquear o fluxo de sangue para as regiões distais do a perna e investigar vascularização do tecido em resposta a isquemia 19,20. é importante ressaltar que a queda inicial no fluxo sanguíneo é seguido por abertura vaso colateral e reperfusão de tecidos observa-se aproximadamente 3 dias após FAL. 20 Assim, quando realizada em um membro portador de tumor, este modelo recria eventos hipoxia / reperfusão que ocorrem naturalmente nos tumores de crescimento rápido e permite o escape de células tumorais metastáticas, devido ao restabelecimento da perfusão para o membro posterior inferior através de vasos colaterais recentemente abertas. 21 importante, este processo deve ser executado quando o tamanho do tumor está pequena o suficiente para evitar a excessiva hipoxia em tumores de controlo (tipicamente no bezerro vol portador de tumorume de 150-250 mm3), garantindo diferenças significativas nos níveis de hipoxia tumor entre grupos de controlo e tratados com FAL.Além disso a monitorização longitudinal do efeito de hipoxia na latência ES e a frequência de metástases, este modelo também permite a recolha de tecidos e o desenvolvimento de novas linhas de células de ambos os tumores primários e metástases. Importante, trabalho anterior demonstrou que as linhas celulares metástases derivadas exibem potencial metastático melhorada mediante a reintrodução para animais, indicando que a disseminação do tumor está associada com alterações permanentes no fenótipo de células de tumor, e validando assim a utilização destas linhas celulares para decifrar os processos metastáticos. 18 Em conjunto, estes modelos podem agora ser usados para as análises genéticas e moleculares necessários para a identificação de vias metastáticos induzida por hipoxia.
Como a hipóxia é um factor pró-metastático melhorar a malignidade de vários tumors, o nosso modelo pode ser usado como uma plataforma para investigar o papel de hipoxia em outros tipos de tumores que se desenvolvem naturalmente nos membros, tais como o osteossarcoma e rabdomiossarcoma. 21-23 Por outro lado, uma abordagem similar pode ser aplicada a outras doenças malignas que crescem em localizações anatómicas com um percurso bem definido de fornecimento de sangue. Em última análise, o modelo pode ser modificada e a sua utilidade mais alargado, dependendo das necessidades individuais de investigação.
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Protocol
Todos os procedimentos foram aprovados pelo Comitê Animal Care Institucional e Use da Universidade Georgetown.
1. Preparação de células para ortotópico Injeções
- células ES Cultura humanos sob condições padrão. Usar cerca de uma placa de cultura celular de 15 cm não superior a 70% de confluência para injecção de 5 ratinhos.
NOTA: Para este estudo, as células SK-ES1 foram cultivadas em meio 5A de McCoy com soro de bovino fetal a 15% (FBS) em placas revestidas com colagénio e células TC71 foram cultivadas em RPMI com 10% de FBS e 1% de 4- (2-hidroxietil ) -1-piperazinoetanossulfónico (HEPES). Ambos os meios foram suplementados com antibióticos - penicilina (100 unidades / ml), estreptomicina (100 ug / ml) e fungizona (1 ug / ml). - Lavam-se as células ES com fosfato salino tamponado (PBS) e trypsinize a 70% de confluência com 0,25% de ácido tripsina / etilenodiaminotetracético (EDTA) durante 5 min.
- Remover as células ES a partir da placa de cultura celular com Medium, depois centrifugar durante 5 minutos a 200 xg à temperatura ambiente. Re-suspender as células ES em 10 ml de PBS frio e depois contar o número de células.
- Células centrífuga ES por 5 min a 200 xg à temperatura ambiente, e então re-suspensão em 10 7 (TC71) células por ml em PBS frio 2 x 10 7 (SK-ES1) ou. Manter a suspensão de células final sobre gelo durante a realização de injecções.
2. injeção ortotópico de células ES em músculo gastrocnêmio
- Use camundongos 4-6 semanas de idade SCID Mulher / bege.
- Para injetar células-tronco embrionárias, segure suavemente o mouse e estabilizar a sua perna esquerda entre o quarto e quinto dedos, expondo o lado medial do membro posterior inferior.
- Usando uma agulha de 28 G ½, injectar 0,1 ml da suspensão de células previamente preparada que contém quer de 2 x 10 6 (SK-ES1) ou 10 células (6 TC71) ES no músculo gastrocnémio (Figura 2A).
NOTA: Embora o volume máximo para inj intramuscularexões é tipicamente de 0,05 mL, por este procedimento particular, o aumento de volume de 0,1 ml é necessária devido ao elevado número de células injectadas. Este procedimento foi aprovado pelo Comitê Animal Care Institucional e Use da Universidade Georgetown.- Inserir a agulha no músculo gastrocnêmio anteriormente a aproximadamente a 30 - ângulo de 45 graus na direção do tibial crista / tubérculo.
- Ligeiramente retirar a agulha, uma vez que toca o tibial crista / tubérculo. Lentamente injetar a solução de suspensão de células, retirando gradualmente a agulha para liberar a pressão.
- Monitorar os camundongos injetados durante as próximas 24 horas para sinais de sofrimento.
NOTA: Os investigadores com menos experiência no manejo dos animais deve considerar anestesiar ratos para injeções de células de tumor. Algumas instituições podem requerer anestesia por razões de segurança.
3. Monitoramento crescimento do tumor primário
- Monitorar o crescimento de tumores primários dAily até que o tamanho do tumor alcança o volume desejado.
Nota: No estudo actual, um volume de vitelo de 250 mm, 3 foi usado como um ponto da experiência (Figura 2B) de partida. Normalmente, leva cerca de 1-2 semanas para os tumores atingirem esse tamanho.- Medir o tamanho bezerro diariamente com paquímetro digital via seus comprimentos médio-lateral e ântero-posterior.
- Determinar o volume de vitelo pela fórmula (D xd 6/2) x 3,14, onde D é o diâmetro mais longo e d é o diâmetro mais curto do membro posterior inferior portador de tumor.
NOTA: O tamanho do vitelo normal do rato adulto é de aproximadamente 40 - 50 mm3. O seu volume irá aumentar devido ao crescimento do tumor e nas fases posteriores do bezerro será composto, principalmente do tecido tumoral.
4. Artéria Femoral Ligadura (FAL) para induzir hipóxia em pata portadores de tumor
- Prepare os instrumentos cirúrgicos necessários para esta operação: curved ou uma pinça fina apontados, apontou fórceps, tesouras cirúrgicas e um suporte de agulha. Esterilizar estas ferramentas antes da cirurgia usando uma autoclave ou esterilizador talão quente. Além disso, tem cotonetes finos prontos para esta cirurgia.
NOTA: É recomendado que as ferramentas de ser re-esterilizado nas pontas conforme necessário durante o procedimento. - Injectar agente analgésico (carprofeno 5 mg / kg) por via subcutânea (SQ). Para detectar e confirmar a hipóxia, injectar hypoxyprobe-1 (pimonidazole, 60 mg / kg).
NOTA: Esta dose corresponde a 1,5 mg por rato e é conseguido através da injecção de 0,1 ml de solução hypoxyprobe 15 mg / ml em PBS por via intraperitoneal (IP). O hypoxyprobe é, em seguida, post-mortem detectável em tecidos animais por imuno-histoquímica. - Colocar o rato numa câmara de indução de anestesia contendo 3-5% de isoflurano em 100% de oxigénio a um caudal de 1 L / min.
- Deixar o mouse na câmara de indução até que ele não responde a estímulos externos. Em seguida, retire o animal do icâmara de nduction. Colocar o animal em decúbito dorsal em uma cortina estéril colocado em cima de uma almofada de aquecimento na superfície da operação. Usar um cone de nariz para o ligar a um fluxo contínuo de 1 - 3% de isoflurano em 100% de oxigénio a um caudal de 0,8 L / min.
- Aplicar pomada oftálmica estéril não-medicamentoso para cada olho para evitar a secagem da córnea. Para depilar completamente a área cirúrgica, aplique creme de depilação, deixando-o na pele por não mais do que 10 segundos. Em seguida, limpe o creme de depilação usando uma almofada de etanol prep.
- Ampliar e garantir o membro posterior com um pedaço de fita de aproximadamente 45 graus da linha média do mouse. Uma vez que o membro posterior é seguro, limpe a pele exposta com 10% de povidona / iodo cotonete / solução, seguido pelo etanol, repetindo mais duas vezes cada. Para o resto do procedimento cirúrgico, usar um microscópio estéreo para obter uma vista ampliada da região de membro posterior.
- Utilizando uma pinça de pontas e tesouras cirúrgicas, fazer uma incisão do skem, aproximadamente 1 cm de comprimento, a partir de meio da coxa para a região inguinal. Usando cotonetes fino de algodão umedecido com solução salina, escove delicadamente o tecido adiposo subcutâneo em torno do músculo da coxa.
- Cuidadosamente revelar a artéria femural subjacente através de dissecção romba através do tecido adiposo subcutâneo. Estabilizar a ferida e campo cirúrgico para expor a vasculatura do músculo adutor médio-superior.
- Usando uma pinça fina, delicadamente Pierce através da bainha femoral membranoso para expor o feixe neurovascular. Usando um conjunto limpo de uma pinça fina, dissecar e separar a artéria femoral a partir da veia femoral e do nervo no local proximal perto da virilha, distal ao ligamento inguinal. Tenha cuidado para evitar a perfuração da parede da veia femoral.
- Na sequência de dissecação, passar um fio de 6-0 sutura de seda por baixo da artéria femoral e distal para o ramo da artéria femoral circunflexa lateral (AGCL). Oclusão da artéria femoral usando nós dobro (Figura 3). Fechar a incisão utilizando 6-0 de polipropileno. Depois de fechar a incisão, injeta SQ 0,5 ml de solução salina morna para a terapia de equilíbrio de fluidos. Colocar o animal no topo de uma almofada quente envolto na gaiola de recuperação e monitorizar continuamente até acordado.
- Monitorizar os animais durante o primeiro 6 h após a cirurgia e injectar o agente analgésico (carprofeno 5 mg / kg, SQ) todos os dias durante 3 dias. Remover suturas 10 dias pós-cirurgia usando uma tesoura esterilizada.
5. retirada do tumor primário por amputação do pé
NOTA: Amputar do membro posterior inferior portador de tumor quando o tamanho de vitelo atinge 250 milímetros 3 para o grupo de controlo ou 3 dias após FAL para o grupo hipóxico.
- Raspar o cabelo do membro portador de tumor da tíbia distal à região pélvica com cortar cabelo com suavidade, enquanto segurando o animal. Injectar o agente analgésico (carprofeno 5 mg / kg, SQ) antes do procedimento.
- Posicione o mouse em um ch indução da anestesiaâmbar contendo 3-5% de isoflurano em 100% de oxigénio a um caudal de 1 L / min. Deixar o mouse na câmara de indução até que ele não responde a estímulos externos. Em seguida, retire o animal da câmara de indução.
- Colocar o animal na posição de decúbito lateral direito em uma cortina estéril colocado sobre uma almofada de aquecimento na superfície da operação. Usar um cone de nariz para o ligar a um fluxo contínuo de isoflurano 1-3% em 100% de oxigénio a um caudal de 0,8 L / min. Aplicar pomada oftálmica estéril não-medicamentoso para cada olho para evitar a secagem da córnea
- Prepare o local da cirurgia usando 10% de povidona / iodo cotonete / solução, seguido pelo etanol, repetindo 3 vezes. Aplicar uma gaze estéril (por exemplo, campo cirúrgico) sobre o mouse para obter um campo cirúrgico estéril.
- Faça uma incisão na pele meio femoral circunferencial, seguido por dissecção romba e retração da pele proximal. Expor o pedículo neurovascular femoral medial no lado médio do pé, e, em seguida, ligarperto do ligamento inguinal usando 4-0 revestido (poliglactina 910) material de sutura absorvível.
- Executar uma transecção mid-femoral de grupos musculares com uma tesoura, seguido por dissecção romba dos tecidos moles para a articulação coxo-femoral. Usando um cortador de osso, realizar uma osteotomia mid-femoral. Usando um cotonete fina estéril ou uma esponja de gelatina absorvível, pressione suavemente o local da osteotomia para minimizar e prevenir o sangramento.
- Feche a pele sobrejacente usando clipes de feridas cirúrgicas e injectar 0,5 ml de SQ salina morna para a terapia de equilíbrio de fluidos. Colocar o animal no topo de uma almofada quente envolto na gaiola de recuperação e monitorizar continuamente até acordado.
- Após a cirurgia, recolher amostras de tecido de tumores primários para RNA, DNA ou o isolamento de proteínas, encaixe congelamento em nitrogênio líquido e armazenar a -80 C. Para a cultura de células primárias, recolher amostras de tecido nesta etapa, como descrito na secção 9 abaixo. Fixe o tecido do membro remanescente em 10% de formalina neutra tamponada para histologia e immunochemistente, incluindo hypoxyprobe-1 de detecção.
- Monitorar os animais para a locomoção, a dor eo consumo de alimentos durante as primeiras 6 horas após a cirurgia, em seguida, a cada dia, durante 3 dias. Injectar o agente analgésico (carprofeno 5 mg / kg, SQ) diariamente durante 3 dias. Retire os agrafos 10 dias após a amputação usando um removedor ferida clipe.
6. Ratos A monitorização da presença de metástases
- Observe os ratos diariamente e avaliá-los para sinais clínicos de metástase, pelo menos, duas vezes por semana.
- Observar os animais para a presença de macrometástases que apresentam como massas que se desenvolvem em vários locais, tipicamente ombros, pernas contralateral e mandíbulas. Para este fim, palpar cuidadosamente regiões axilares cabeça, pescoço e e membro posterior contralateral. Verificar a existência de metástases de órgãos internos através de distensão abdominal, juntamente com ressonância magnética.
- Verificar a presença de metástases do pulmão, premindo o processo xifóide (a extremidade inferior do esterno) com index dedo. 24
NOTA: Esta pressão diminui a capacidade de respiração diafragmática. Os ratos com metástases pulmonares avançadas mostrar sinais de desconforto respiratório manifestada pela respiração trabalhosa. - Observar os animais para os sintomas neurológicos, tais como a paralisia de perna e ataxia sugerindo metástases no sistema nervoso central.
- Monitorar a ratinhos, pelo menos, uma vez por semana para perda de peso, como uma indicação de progressão da doença potencial. perda de peso corporal superior a 15% do peso pré-processual é considerado um ponto final humano.
7. Magnetic Resonance Imaging (MRI) para detectar metástases
- Realizar ressonância magnética para detectar metástases em pontos de tempo desejados. 18
NOTA: No presente estudo, foi utilizado um espectrômetro horizontal de 7 Tesla. MRI foi realizada nos dias 15 e 35 de pós-amputação por células SK-ES1 e no dia 15 para TC71 células. - Posicione o mouse em um chambe indução da anestesiaR contendo 1-3% de isoflurano em uma mistura gasosa de 30% de oxigénio e óxido nitroso a 70%.
- Deixar o mouse na câmara de indução até que ele não responde a estímulos externos. Em seguida, retire o animal da câmara de indução.
- Transferir o rato anestesiado em um suporte estereotáxico com a respiração e a monitorização da temperatura com a administração contínua de 1,5% de isoflurano e óxido nitroso a 30%. Aplicar pomada oftálmica estéril não-medicamentoso para cada olho para evitar o ressecamento da córnea. Imagem do animal ou em um 40 ou 23 milímetros Bruker bobina volume de rato para o corpo inteiro ou imagens do cérebro, respectivamente.
- Use, uma sequência de duas dimensões em T2 RARE: TR = 3.000 ms, TE = 24 ms, matriz = 256, FOV = 4,35 x 3,0 cm, espessura de corte = 0,5 mm, fator RARE = 4 e médias = 4. 18
- Colocar o animal em uma gaiola de recuperação quente e monitorar continuamente até acordado.
NOTA: Os ratos vão se recuperar rapidamente desde um avião da anestesia rasa é usado. Monitorar os animais durante as primeiras 6 horas após a imagem ter certeza de que não existem efeitos adversos da anestesia.
8. A eutanásia e necropsia
- Eutanásia os ratos uma vez que os animais apresentam-se com metástases detectáveis por ressonância magnética e / ou sintomas clínicos de progressão da doença.
NOTA: No presente estudo, os ratos foram sacrificados nos dias 50 e 25 de pós-amputação por animais portadores SK-ES1 e TC71 xenotransplantes, respectivamente. Em alguns casos, a eutanásia anterior era necessária devido a uma elevada carga metástase. - Eutanásia os ratos por exposição a CO2 a 1,5 L / min (CO 2 a 10 - 30% da câmara eutanásia vol / min). Para garantir a morte do animal, execute deslocamento cervical após a exposição ao CO 2.
- Spray de todo o rato com 70% de etanol e colocá-lo na câmara de fluxo laminar. Coletar o sangue por punção cardíaca utilizando uma agulha de 25 G ½ com uma seringa de 1 ml e transferir para uma coleta de sangue tuser contendo 2 mg de EDTA.
- Recolher os seguintes tecidos: baço, glândulas adrenais, ovários, rins, fígado, pulmões, cérebro, perna direita, de medula óssea de ambos os úmeros e coluna vertebral, bem como metástases macroscópicas presentes em outros locais. 25,26
- Fix metade de cada tecido em formalina 10% neutra tamponada para histologia e imunoquímica, incluindo hypoxyprobe-1 detecção. Snap congelar a outra metade em nitrogênio líquido, em seguida, armazenar a -80 ° C para o RNA, DNA ou o isolamento de proteínas. 25,26 Para a cultura de células primárias, recolher amostras de tecido, como descrito na secção 9 abaixo.
9. Cultura de células primárias
- Para realizar a cultura de células primárias, dissecar tecidos do membro amputado (seção 5 acima) ou durante a necropsia (seção 8 acima) em condições estéreis em uma capela de fluxo laminar.
- Prepare a cultura de células de suporte adequado para a linha celular utilizada para injecções ortotópicos, suplementado com penicilina (200 unidades / ml),estreptomicina (200 ug / ml), fungizona (1 ug / ml), e 0,2% micoplasma antibiótico profilático. Colocar 2,5 mL de meio de cultura primária em uma placa de cultura celular de 6 cm.
- Selecionar áreas de tecido de tumor viáveis de tumores primários ou metástases, e em seguida isolar dois a três segmentos de 2-3 mm cada um usando uma tesoura esterilizada.
NOTA: O tecido de tumor viáveis é normalmente encontrada nas extremidades do tumor e podem ser discriminados a partir de necrose pela sua cor rosada ou avermelhada, brilho e aparência molhada significativa global. Em contraste, o tecido necrótico é geralmente visto no centro do tumor e apresenta-se como uma massa de cor esbranquiçada / creme com uma aparência opaca, de queijo. 27 - Transferir os segmentos isolados para uma placa de cultura celular de 6 cm contendo meio de cultura Primária descrito no passo 9.2.
- células de cultura sob condições padrão, como descrito na seção 1 (NOTA) e 9,2. 18,28 Verifique a cultura para crescimento celular decorrente de os pedaços de tecido, which deve ser observado no prazo de alguns dias. Uma vez que as células atingem a confluência, trypsinize e propagar-los de acordo com técnicas de cultura de células padrão.
NOTA: A cultura de células primária pode ser utilizado subsequentemente para avaliar o crescimento e propriedades metastáticas de células derivadas de tumores de controlo e hipóxicos, bem como as suas características moleculares, tal como anteriormente descrito. 18
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Representative Results
Após a injecção de células ES em músculo gastrocnémio, os tumores primários são deixadas crescer até um tamanho de bezerro de 250 mm, 3 (Figura 1, 2). O tempo necessário para os tumores se atingir este volume varia tipicamente de 10 - 15 dias para TC71 para 20-25 dias para xenoenxertos SK-ES1, respectivamente. Os tumores em um volume de vitelo de 250 mm, 3 exibem um nível relativamente baixo de hipoxia endógena (cerca de 3% de tecido de tumor), com base em hypoxybrobe-1 (pimonidazole) coloração (Figura 4A, C). Importante, nestes tumores de controlo, observou-se a coloração positiva para hypoxyprobe-1 exclusivamente nas áreas de hipóxia fisiológica, ou seja, em células tumorais que se encontram distantes do sistema vascular e começam a sofrer morte celular (Figura 4A). Essa coloração exibe um padrão "air-brush" característica, enquanto a maior parte do tecido tumoral saudável permanece negativo para hypoxyprobe-1. <sup> 6 Em contraste, FAL realizada nesta fase cria profunda hipoxia, tal como evidenciado pela coloração positiva para hypoxyprobe-1 observada na grande maioria das células tumorais a 4 horas pós-FAL (Figura 4B). Notavelmente, as células tumorais hypoxyprobe-1-positivas também são observados em estreita proximidade com os vasos sanguíneos e o padrão característico de hipoxia fisiológica é perdida. Nestes tumores tratados com FAL, 73% do tecido consiste de células tumorais hipóxicas (Figura 4C). O tecido tumoral também apresenta os primeiros sinais de danos induzidos pela hipoxia, incluindo encolhimento celular e estrutura frouxa (Figura 4B).
A eficácia de FAL foi ainda apoiada pela inibição completa do crescimento do tumor primário. Durante o período de 3 dias entre FAL e amputações, o tamanho dos tumores primários não aumentou (Figura 5A). Em contraste, os tumores primários de ratinhos submetidos a sham surgerY continuaram a crescer rapidamente, atingindo um volume de aproximadamente 650 mm3, imitando, assim, a taxa de crescimento dos tumores em murganhos de controlo não submetidos a cirurgia (Figura 5A). 18 De acordo com estes dados, a análise histopatológica revelou extensas áreas de necrose nos tumores primários tratados FAL colhidas 3 dias de pós-operatório (Figura 5B). No entanto, havia grupos de células tumorais viáveis presentes no interior do tecido do tumor, geralmente localizadas nas extremidades do tumor, perto da vasculatura (Figura 5B). Para investigar o estádio de oxigenação de células essas que hypoxyprobes utilizados, que são activados em células hipóxicas vivo, subsequentemente ganhar a capacidade para se ligar covalentemente a proteínas no interior dessas células. 29 Como tal, estas sondas servir como um marcador permanente das células que sofreram hipoxia em qualquer ponto no tempo. Assim, para detectar alterações nos níveis de oxigénio das células de tumor durante a duração da experimenent, foram utilizados dois hypoxyprobes diferentes que podem ser detectados de forma independente por imuno-histoquímica. As sondas foram administradas em dois pontos de tempo - imediatamente antes FAL (hypoxyprobe-1) e antes de amputação (hypoxyprobe-2, CCI-103F) - e a sua localização foi detectada em tumores colhidos 3 dias pós-FAL (Figura 1). Hypoxyprobe-1, que estava presente no sistema no momento da FAL, marcou a maioria das células tumorais, como o tecido tornou-se severamente hipóxico (Figura 5C). Esta marcação é também evidente em áreas de necrose / apoptose, uma vez que estas células estavam ainda vivos no momento de FAL e, por conseguinte, capaz de hypoxyprobe-1 de forma permanente de ligação, como mostrado na Figura 4B. Em contraste, hypoxyprobe-2 administrado 2 dias pós-FAL única coradas células viáveis, como as células em áreas necróticas estavam mortos e incapaz de activar a sonda no momento da sua administração (Figura 5D). Curiosamente, também OBSErved tecido de tumor viável adjacente à vasculatura que foi inicialmente hipóxico (hypoxyprobe-1-positivo), mas adequadamente oxigenada no ponto de tempo posterior (hypoxyprobe-2-negativa) (Figura 5C, D). Esse achado está de acordo com estudos anteriores que indicam que garantia reperfusão tecidual dependente do navio restaura o fluxo sanguíneo no membro posterior 3 dias pós-FAL. 20 As células de tumor viáveis remanescentes no tecido do tumor de 3 dias pós-FAL eram altamente invasivas, como evidenciado pela sua intravasamento maciça em bordas vascularizados do tumor (Figura 5E). Algumas das células dentro do lúmen do vaso foram positivos para hypoxyprobe-1, indicando que eles haviam se tornado hipóxico mediante FAL, mas manteve-se viável. Colectivamente, estes dados sugerem que a reperfusão de tecidos após hipoxia grave pode facilitar a fuga de células a partir dos tumores primários.
Com base na experiência piloto, foram metástases generalizadasdetectável por MRI aproximadamente 35 dias pós-amputação por xenotransplantes SK-ES1, enquanto as células TC71 normalmente metástase no prazo de 15 dias. Consequentemente, para análise comparativa da latência metástase e frequência, ressonância magnética foi realizada no dia 15 e 35 de pós-amputação para os animais portadores de tumores SK-ES1, enquanto uma imagem no dia 15 foi suficiente para os ratos com tumores TC71. A eutanásia foi realizada no dia 50 e dia 25 para os animais com SK-ES1 e TC71 xenoenxertos, respectivamente. Como relatado anteriormente, os tipos mais comuns de metástases incluídos massas de tecidos moles na região do ombro, assim como metástases ósseas para as pernas contralateral, região maxilar e da coluna de células SK-ES1, e de pulmão e tumores pélvicos para TC71. 18 Além disso, as metástases frequentes para órgãos internos, incluindo glândulas adrenais, pulmões e fígado, assim como a infiltração da medula óssea, foram observados em ratinhos portadores de xenoenxertos tratados com FAL SK-ES1 (Figura 6). Em geral, hipóxia aumentou significativamentea geral (SK-ES1) ou específica do local (TC71) frequência e multiplicidade de metástases em ambas as linhas celulares. No entanto, também desenvolvido xenoenxertos TC71 massas recorrentes frequentes no local de amputação (25% para o controlo e de 40% para os tumores tratados com FAL), tal como anteriormente descrito para as grandes tumores primários TC71. 18
Os tecidos de controlo e de tumores e metástases primários tratados FAL também pode ser uma fonte de material para análises moleculares abrangentes para a identificação de percursos activados por hipoxia envolvidos na disseminação ES. Por exemplo, foram observadas diferenças significativas nos perfis de controlo metabolômicos e tumores primários de hipóxia (dados não mostrados). Nós também foram capazes de isolar com sucesso várias linhas celulares de todos os tecidos acima. Em muitos casos, as células derivadas de tumores tratados com FAL exibiram alterações notáveis na morfologia, em comparação com as células originais e aqueles derivados de controlo TUmors (Figura 7A). A pureza destas culturas de células foi confirmada por imunocoloração positiva para o marcador do sarcoma de Ewing, CD99 (Figura 7B). Além disso, 100% das células nas linhas de células estabelecidas tinha um sinal positivo na hibridação in situ fluorescente (FISH) com sonda centromérica humanos, apresentando frequentemente com números de cromossomas aumentou (Figura 8A). A origem humana destas células foi ainda confirmada por análise dos cromossomas em metafase (Figura 8B) que exibiram rearranjos citogenéticas anteriormente descritas para as células SK-ES1, tanto na linha celular original e células derivadas a partir de tumores tratados com FAL (Figura 8B). 30
Figura 1. Esquema da hipóxia Modelo ES. As células ES (1-2 x 10 6) foram injectadas em gastrocnmúsculos emius de ratinhos bege SCID /. Uma vez que os tumores primários resultantes atingiram um volume de vitela a 250 mm3, os ratinhos foram divididos em dois grupos experimentais. Os ratinhos do grupo de controlo foram injectados com hypoxyprobe-1 (HP-1), e os tumores foram excisados primários por amputação do membro. Os ratinhos do grupo foram injectados com hipóxico hypoxyprobe-1 e, em seguida, submetido a ligação da artéria femoral (FAL). Dois dias mais tarde, os ratinhos foram injectados com hypoxyprobe-2 (HP-2), e, em seguida, os membros portadores de tumor foram amputadas três dias pós-FAL. Os animais de ambos os grupos foram acompanhados por ressonância magnética periódica (MRI). Uma vez metástases tornou-se aparente com base em imagiologia e sinais clínicos, os ratinhos foram sacrificados e a presença de metástases foi confirmada por necropsia e análises histopatológicas. O tempo de crescimento tumoral, imagiologia e eutanásia baseia-se na taxa de célula SK-ES1 de crescimento e metástase. Note-se que enquanto que foi necessário hypoxyprobe-2 para determinar o método e visuAlize muda em níveis de hipoxia durante o período entre FAL e amputação de membros, a sua utilização não é essencial para os experimentos reais. Portanto, este passo não é incluído no protocolo. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. crescimento do tumor primário. Imagem A. por ressonância magnética (MRI) de um membro posterior intacta. A seta vermelha indica o local ea direção da injeção ortotópico de células tumorais. B. O tumor primário em um volume bezerro de aproximadamente 250 mm3 em crescimento no músculo gastrocnêmio (contorno vermelho). setas vermelhas indicam locais de destruição óssea. T - tíbia. Por favor, clamber aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. O Site da artéria femoral ligadura. Um post-mortem representante arteriogram raio-x de um mouse 129S1 / SvJ perfundidos com sulfato de bário imediatamente após a ligadura é mostrado para destacar a presença de vasos colaterais pré-existentes. Note-se que enquanto a imagem mostra duas ligaduras (xs), um distal à artéria circunflexa lateral femoral (AGCL) (X vermelho) e outra proximal da artéria genu (branco X), o modelo de hipoxia tumor só usou a ligadura proximal, próximo o ligamento inguinal e distal ao AGCL (X vermelho). A região de desenvolvimento de vasos colaterais é mostrado como descritos (vasos fracos), e eles são identificados pela sua forma tortuosa, saca-rolhas. Por favor, clique elere para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. Tumor hipóxia induzida por Femoral ligação da artéria (FAL). A. Um tumor controle em um volume bezerro de 250 mm3 corados pela hematoxilina e eosina (H & E) e histoquímica para hypoxyprobe-1 (marrom). Hypoxyprobe-1 imunocoloração é apenas observada nas áreas de hipoxia tumoral fisiológica, onde as células tumorais distantes da vasculatura são privadas de oxigénio e começam a sofrer morte celular. B. FAL-tratados tumor primário em um tamanho semelhante colhidas 4 h pós-ligadura e corados com H & E e histoquímica para hypoxyprobe-1. A maioria das células tumorais são altamente positiva para hypoxyprobe-1, incluindo aqueles em estreita proximidade com a vasculatura. V - vaso sanguíneo. C. A área de coloração positiva para hypoxyprobe-1 era quantifIED no controle e FAL-tratados tumores usando software ImageJ. As barras de erro representam SEM. *** - P <0,001 Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5. Efeito da Femoral ligação da artéria (FAL), sobre crescimento do tumor primário. Crescimento do tumor primário A. durante o período de 3 dias entre a cirurgia e a amputação em FAL- (n = 4) e com tratamento simulado-cirurgia (n = 4) os animais, em comparação com tumores de controlo intactos (n = 6). As barras de erro representam SD. *** - P <0,001, em comparação com ambos os tumores tratados com cirurgia de controlo e de placebo. B. hematoxilina e eosina (H & E) coloração de um tumor tratado com FAL colhidas 3 dias pós-ligadura revela necrose generalizada dentro do tumor. O contorno vermelho indica uma área de ce tumor viávellls na proximidade de uma região altamente vascularizado perfusão 3 dias pós-FAL. Tecido do tumor tratado FAL C. colhidas 3 dias pós-cirurgia histoquímica para hypoxyprobe-1. Hypoxyprobe-1 foi injetada antes FAL. Portanto, a imunocoloração positiva indica a existência de uma extensa hipóxia tecidual imediatamente pós-cirurgia. D. Hypoxyprobe-2 foi injectado 2 dias pós-FAL, e o tecido recolhido 24 horas depois, a amputação. Positivo hypoxyprobe-2 coloração identifica hipóxia dos tecidos no momento da amputação. A seta vermelha indica tecido que está hipóxico em ambos os pontos de tempo, enquanto a seta amarela indica uma área adjacente à vasculatura que foi hipóxico imediatamente após FAL (hypoxyprobe-1-positivo), mas negativa para hypoxyprobe-2 na altura da excisão, a qual é indicativa de reperfusão do tecido. A falta de coloração hypoxyprobe-2 em áreas necróticas sugere que as células nesta região não eram viáveis no momento da sua administração e, por conseguinte,incapaz de se ligar activamente a sonda. A coloração apresentado em painéis BD foi realizada em secções de tecido em série. E. intravasation na FAL-tratados tumor 3 dias pós-FAL. A marcação identifica células viáveis positivos para hypoxyprobe-1 dentro do lúmen do vaso (seta vermelha). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6. Exemplos de metástases em ratinhos portadores de tratados FAL tumores SK-ES1. As metástases foram detectados por ressonância magnética (MRI) e confirmada por necropsia e análises histopatológicas (coloração hematoxilina e eosina, H & E). H - metástase. Por favor clique aqui para ver uma vers maiores ion desta figura.
Figura 7. Características de células derivadas de tumores primários tratados FAL. A. Culturas de células viáveis foram estabelecidas a partir de tecidos colhidos a partir de controlo e tumores primários de hipoxia e a sua morfologia foi comparado com as linhas de células originais utilizadas para injecções iniciais ortotópicos. As células derivadas de tumores primários tratados FAL exibem alterações drásticas na morfologia e seus tamanhos. Imagens representativas das células SK-ES1 derivadas de tumores primários e originais são mostradas. B. imagens representativas de células derivadas de tumores tratados com FAL imunocoradas para o marcador ES, CD99, e contra-coradas com o corante de ligação a ADN, DAPI. Todas as células são CD99-positivas, incluindo as células hipertróficas contendo núcleos aumentados (seta branca). oad / 54532 / 54532fig7large.jpg "target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 8. Análise cromossómico das células derivadas a partir de tumores tratados com FAL. A. Hibridização in situ fluorescente (FISH) em análise de células de interfase que mostram dois núcleos com sinais para centromérica 4 humana sonda. A grande núcleo com quatro sinais indica uma célula tetraplóide (4n) (seta branca). Análise FISH B. em metafases representativos da linha celular SK-ES1 inicial e da célula derivada do tumor primário tratado FAL. As setas vermelhas indicam inv (1) (p13.1q21), uma característica rearranjo citogenética não aleatória das células SK-ES1. sinais vermelhos: centromérica humano 4 sonda; Sinais verdes nas células SK-ES1 originais: sonda NPY5R em 4q32.2 cromossomo.e.com/files/ftp_upload/54532/54532fig8large.jpg "target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
O nosso modelo envolve a comparação de metástases em dois grupos experimentais - um grupo de controlo, onde os tumores podem desenvolver-se no membro posterior seguido de amputação, ao atingir um volume de vitelo de 250 mm, 3, e um grupo exposto por hipoxia, em que o tumor- dos membros posteriores rolamento é submetido a FAL no mesmo volume, seguido por amputação 3 dias mais tarde. Embora nestas experiências os tumores tratados com FAL são amputados com um ligeiro atraso, em comparação com os tumores de controlo, a sua dimensão não aumenta durante o período de 3 dias entre a ligação e a amputação. Por conseguinte, esta abordagem permite a comparação de potencial metastático entre tumores de tamanhos comparáveis, mas dramaticamente com diferentes níveis de hipóxia. Em contraste, usando cirurgia simulada, um controle comumente utilizado para intervenções cirúrgicas, seguido de 3 dias de crescimento do tumor resultaria em diferenças significativas no tamanho do tumor entre os grupos experimentais, com a sham cirurgia-treated tumores primários que possuem níveis significativos de hipoxia endógeno. Com base nas experiências piloto, cirurgia simulada não afecta significativamente o crescimento do tumor ou os seus níveis de hipoxia e pode, assim, ser eliminado a partir do desenho experimental. Em vez disso, a estratégia de comparar tumores de tamanhos semelhantes e diferentes níveis de hipoxia é um modelo altamente relevante para elucidar os efeitos da hipóxia na disseminação da doença. Importante, ao contrário do anterior, em estudos in vitro, esta abordagem permite a avaliação de todas as acções pró-metastáticos de hipoxia em um microambiente tumoral natural. 4-6
O objectivo do desenho experimental foi o de conseguir um baixo nivel basal de metástases, que permitam a detecção de um efeito estimulador induzida por hipoxia em sua formação. Nós estabelecemos que um tamanho bezerro de 250 mm3 a FAL e amputação foi ótima para tumores primários SK-ES1. No entanto, este parâmetro terá de ser optimizada para EA linha celular de ch, em função da sua capacidade de invasão potencial metastático e local. Para os tumores com maior potencial metastático, o tamanho do tumor primário em amputação pode ter de ser diminuída. Por exemplo, tumores TC71 exibem um elevado invasividade local manifestada pela formação frequente de tumores recorrentes no local da amputação. 18 Uma vez que tais massas se desenvolver, os animais têm de ser excluídos da análise, pois não seria claro se metástases distantes subsequentes oriundos dos tumores primários ou de tumores recorrentes que muitas vezes crescem rapidamente e apresentam altos níveis de hipóxia endógeno. A partir da experiência anterior, independente da linha celular utilizada, a 150 mm3 é o tamanho mínimo de vitelo portador de tumor que pode ser medida com fiabilidade e normalizada. Se a diminuir o tamanho do tumor em amputação FAL e não elimina os tumores recorrentes ou diminuir a taxa de metástase basal suficientemente, a linha celular particular em questão pode não ser adequado para estas experiências.
ve_content "> Do mesmo modo, é importante estabelecer a linha de tempo de ressonância magnética e a eutanásia para cada linha de células individuais, dependendo da latência de suas metástases. Em particular, os agrafos cirúrgicos que interferem com a RM não pode ser removido mais cedo do que 10 dias pós- cirurgia, e este período deve por vezes ser prolongado devido a complicações de cicatrização. Assim, neste estudo nós estabelecemos dia 15 como o momento da primeira de ressonância magnética.Outra consideração importante neste modelo é a manutenção de um nível de hipoxia capazes de induzir processos metastáticos sem causar necrose tumoral completa, o que iria impedir a disseminação de células de tumor. Embora não se tenha encontrado esse problema neste estudo, se necessário, da gravidade da hipoxia pode ser regulado alterando o local exacto e o número de ligadura em relação aos ramos da artéria femoral, como a artéria e AGCL joelho. 20 Assim, uma proximal ligação à AGCL criará isquemia mais grave na oindlimb circulação, aumentando deste modo as condições de hipoxia na perna distal. Em contraste, a ligadura distal ao ramos subsequentes da artéria femoral irá diminuir a hipoxia resultante no membro posterior inferior.
É importante ressaltar que não houve efeitos adversos graves de procedimentos FAL e amputação combinados e sem mortes relacionadas com as cirurgias, como previamente relatado para estas técnicas realizadas separadamente. 18-20 Assim, o sucesso do método é limitada principalmente pela velocidade de tomada do tumor no local primário e a frequência de tumores recorrentes, ambos os quais são dependentes da linha celular.
Como hipoxia tem sido implicado como um factor pró-metastática em diversos tipos de tumores, esta abordagem também pode ser adequado para testar os seus efeitos directamente e definir os seus mecanismos de acções em outros sarcomas que se desenvolvem nos membros. 23 Por outro lado, uma estratégia semelhante pode ser aplicada a outras doenças malignas em crescimento em ambientes ortotópicos wom uma rota de fornecimento de sangue bem definido. Assim, com as modificações apropriadas, este modelo pode ser uma ferramenta útil na pesquisa além do campo da ES biologia.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SK-ES1 Human Ewing sarcoma (ES) cells | ATCC | ||
| TC71 Human ES cells | Kindly provided from Dr. Toretsky | ||
| McCoy's 5A (modified) Medium | Gibco by Life Technologies | 12330-031 | |
| RPMI-1640 | ATCC | 30-2001 | |
| PBS | Corning Cellgro | 21-040-CV | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442-500mL | |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1x) | Gibco by Life Technologies | 25200-056 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco by Life Technologies | 15140-122 | |
| Fungizone® Antimycotic | Gibco by Life Technologies | 15290-018 | |
| MycoZap™ Prophylactic | Lonza | VZA-2032 | |
| Collagen Type I Rat tail high concetration | BD Biosciences | 354249 | |
| SCID/beige mice | Harlan or Charles River | 250 (Charles River) or 18602F (Harlan) | |
| 1 ml Insulin syringes with permanently attached 28 G ½ needle | BD | 329424 | |
| Saline (0.9% Sodium Chloride Injection, USP) | Hospira, INC | NDC 0409-7984-37 | |
| Digital calipers | World Precision Instruments, Inc | 501601 | |
| Surgical Tools | Fine Science Tools | ||
| Rimadyl (Carprofen) Injectable | Zoetis | ||
| Hypoxyprobe-1 (Pimonidazole Hydrochloride solid) | HPI, Inc | HP-100mg | |
| hypoxyprobe-2 (CCI-103F-250 mg) | HPI, Inc | CCI-103F-250mg | |
| Povidone-iodine Swabstick | PDI | S41350 | |
| Sterile alcohol prep pad | Fisher HealthCare | 22-363-750 | |
| LubriFresh P.M. (eye lubricant ointment) | Major Pharaceuticals | NDC 0904-5168-38 | |
| VWR Absorbent Underpads with Waterproof Moisture Barrier | VWR | 56617-014 | |
| Oster Golden A5 Single Speed Vet Clipper with size 50 blade | Oster | 078005-050-002 (clipper), 078919-006-005 (blade) | |
| Nair Lotion with baby oil | Church & Dwight Co., Inc. | ||
| Silk 6-0 | Surgical Specialties Corp | 752B | |
| Prolene (polypropylene) suture 6-0 | Ethicon | 8680G | |
| Vicryl (Polyglactin 910) suture 4-0 | Ethicon | J386H | |
| Fisherbrand Applicators (Purified cotton) | Fisher Scientific | 23-400-115 | |
| GelFoam Absorbable Dental Sponges - Size 4 | Pfizer Pharmaceutical | 9039605 | |
| Autoclip Wound Clip Applier | BD | 427630 | |
| Stereo Microscope | Olympus | SZ61 | |
| Autoclip remover | BD | 427637 | |
| Aound clip | BD | 427631 | |
| MRI 7 Tesla | Bruker Corporation | ||
| Paravision 5.0 software | Bruker Corporation | ||
| CO2 Euthanasia system | VetEquip | ||
| 25 G 5/8 Needle (for heart-puncture) | BD | 305122 | |
| 0.1 ml syringe (for heart-puncture) | Terumo | SS-01T | |
| K3-EDTA Micro tube 1.3 ml | Sarstedt | 41.1395.105 | |
| 10% Neutral Buttered Formalin | Fisher Scientific | SF100-4 |
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