Introduction
Саркома Юинга (ES) является агрессивным злокачественности среди детей и подростков. 1 Опухоли развиваются в мягких тканей и костей, обычно в конечностях. В то время как наличие метастазов является наиболее мощным неблагоприятным прогностическим фактором для пациентов ES, механизмы, лежащие в основе их развития остаются неясными. 2 Опухоль гипоксия является одним из немногих факторов , вовлеченных в ES прогрессии. У пациентов, ES, присутствие не-перфузию областей в ткани опухоли ассоциируется с плохим прогнозом. 3 В пробирке, гипоксия увеличивает инвазивность ЭС клеток и запускает экспрессию про-метастатических генов. 4-6 Тем не менее, несмотря на эти линии доказательств, нет прямых доказательств для гипоксия-индуцированного ES прогрессии и распространения не существует. Кроме того, механизмы, с помощью которых гипоксия оказывает такие эффекты, в настоящее время, неизвестно. Таким образом, мы создали модель в естественных условиях , чтобы заполнить пробел между существующими в пробирке данные и клинической obserдений. Эта модель система позволяет осуществлять прямое тестирование последствий гипоксии на опухолях , происходящих в их естественной среде, с помощью магнитно - резонансной томографии (МРТ) , чтобы следовать прогрессии опухоли и метастазирование в естественных условиях в сочетании с экс естественных условиях патологических и молекулярных анализов (рисунок 1).
Так как не создана трансгенная модель ES в настоящее время доступна, исследования в естественных условиях на метастатических свойств этих опухолей полагаются на инъекции человеческих клеток в иммунодефицитом мышей. В то время как использование иммунологически обесцененных животных может недооценивать влияние иммунной системы на прогрессирование заболевания, способность использовать человеческие клетки увеличивает переводимость таких исследований. Среди различных моделей ксенотрансплантатов, системные инъекции в хвостовую вену легче всего выполнить, но они опускают начальные этапы клеточного intravasation опухоли и уйти от основного сайта роста. 7-12 С другой стороны, orthoto ПИК ксенотрансплантации, которая включает в себя инъекции опухолевых клеток в кости (бедренной кости, ребра) или мышц, является более технически сложными, но и более биологически отношение к раку человека. 13-16 Тем не менее, в прошлом, высокая заболеваемость , связанная с быстрым ростом первичных опухолей часто требовали эвтаназии животных до развития метастазов. В данном исследовании мы использовали ранее установленную модель клеточных инъекций в икроножной мышцы с последующим удалением полученной первичной опухоли в сочетании с продольным мониторингом метастатической прогрессии с помощью МРТ. 17,18 Такие инъекции в икроножной мышцы в непосредственной близости к большеберцовой кости позволяют для роста опухоли в двух природных средах - ES мышц и костей - и в результате отдаленных метастазов в местах , как правило , пострадавших в организме человека. 18 Таким образом, эта модель точно повторяет метастатического процессы , происходящие у больных ES во время прогрессирования заболевания.
палатка "> Локализация первичной опухоли в нижней задней конечности также облегчает точное управление кровоснабжения ткани опухоли. бедренную артерию лигирование (FAL) является хорошо отработанной технологией используется в исследованиях ангиогенеза, чтобы блокировать приток крови к дистальных отделах нога и исследовать васкуляризации тканей в ответ на ишемию. 19,20 Важно отметить, что первоначальное снижение кровотока сопровождается залоговой открытия сосуда и реперфузии тканей наблюдается примерно через 3 дня после FAL. 20 Таким образом, когда выполняется в несущей опухоль конечности, эта модель воссоздает гипоксия / реперфузии события , которые происходят естественным образом в быстро растущих опухолей и позволяет вылету метастатических опухолевых клеток вследствие восстановления перфузии к нижней задней конечности через вновь открытые коллатеральные сосуды. 21 Важно отметить, что эта процедура должна быть выполнена , когда размер опухоли достаточно мал, чтобы предотвратить чрезмерное гипоксию в контрольных опухолей (как правило, на несущей опухоль телячьей Volумэ 150 - 250 мм 3), что обеспечивает значительные различия в уровнях опухоли гипоксии между контрольной и FAL-обработанных группах.В дополнение к продольной мониторинга влияния гипоксии на ES задержки и частоты метастазов, эта модель также позволяет осуществлять сбор тканей и развитие новых клеточных линий из обоих первичных опухолей и метастазов. Важно отметить, что предыдущие работы было установлено, что метастазы полученные из клеточных линий демонстрировать повышенную метастатический потенциал по реинтродукции животных, что свидетельствует о том, что распространение опухоли связано с постоянными изменениями в формировании опухолевого фенотипа клеток, и, таким образом, проверки использования этих клеточных линий расшифровывать процессов метастазирования. 18 Итак , эти модели теперь могут быть использованы для генетических и молекулярных анализов , необходимых для идентификации индуцированных гипоксией метастатических путей.
Как гипоксии является про-метастатического фактор повышения пагубность различных тumors, наша модель может быть использована в качестве платформы для изучения роли гипоксии в других типах опухолей, которые естественным образом развиваются в конечностях, такие как остеосаркома и рабдомиосаркома. 21-23 Кроме того, подобный подход может быть применен к злокачественных опухолей , растущих в других местах , с анатомическими четко определенного маршрута кровоснабжения. В конечном счете, модель может быть изменена, и ее полезность продлен, в зависимости от индивидуальных потребностей в области исследований.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все процедуры были одобрены Институциональные уходу и использованию животных комитета Джорджтаунского университета по.
1. Cell Подготовка к Ортотопическая Инъекции
- ЭС клетки культуры человека в стандартных условиях. Используйте примерно одну 15-сантиметровым культуральный планшет, не превышающую 70% сплошности для инъекции 5 мышей.
Примечание: Для данного исследования, СК-ES1 клетки культивировали в 5A среде McCoy с 15% фетальной телячьей сыворотки (FBS) на коллагене покрытых пластин и клеток TC71 культивировали в среде RPMI с добавлением 10% FBS и 1% 4- (2-гидроксиэтил ) -1-пиперазинэтансульфонова кислота (HEPES). Оба средства массовой информации были дополнены антибиотиками - пенициллином (100 ед / мл), стрептомицина (100 мкг / мл) и Fungizone (1 мкг / мл). - Промывают клетки ES с фосфатным буферным раствором (PBS) и Trypsinize на 70% слияния с 0,25% трипсина / этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) в течение 5 мин.
- Удалить клетки ES из пластины с клеточной культуры Mediа, затем центрифугировать в течение 5 мин при 200g при комнатной температуре. Повторное приостановить клеток ES в 10 мл холодного PBS, а затем подсчитывают количество клеток.
- Центрифуга ЭС клетки в течение 5 мин при 200g при комнатной температуре, а затем вновь приостановить на 2 х 10 7 (SK-ES1) или 10 7 (TC71) клеток на мл в холодном PBS. Держите конечной суспензии клеток на льду во время выполнения инъекций.
2. Ортотопическая инъекция ЭС клеток в икроножной мышцы
- Используйте 4-6 недельных самок SCID / бежевых мышей.
- Для того, чтобы придать ЭС клеток, мягко держать мышь и стабилизировать свою левую ногу между четвертым и пятым пальцами, обнажая медиальной стороны нижней задней конечности.
- С помощью иглы 28 G ½, вводят 0,1 мл предварительно приготовленной суспензии клеток, содержащей либо 2 х 10 6 (SK-ES1) или 10 6 (TC71) ES клеток в икроножной мышцы (фиг.2А).
Примечание: Хотя максимальный объем для внутримышечного инъекцections, как правило, 0,05 мл, для этой конкретной процедуре, увеличение объема до 0,1 мл необходимо из-за большого количества клеток вводили. Эта процедура была одобрена Institutional уходу и использованию животных комитета Джорджтаунского университета по.- Вставьте иглу в икроножной мышцы кпереди примерно в 30 - под углом 45 градусов в направлении гребня большеберцовой кости / бугра.
- Слегка снять иглу, как только она касается гребня большеберцовой кости / бугристости. Медленно вводят раствора клеточной суспензии, постепенно извлечение иглы для сброса давления.
- Мониторинг вводили мышам в течение ближайших 24 часов на признаки бедствия.
Примечание: Исследователи с меньшим опытом в обработке животных следует рассмотреть вопрос о обезболивающее мышей для инъекций опухолевых клеток. Некоторые учреждения могут потребовать анестезии по соображениям безопасности.
3. Мониторинг роста первичной опухоли
- Контролировать рост первичных опухолей dAily, пока размер опухоли не достигнет желаемого объема.
Примечание: В настоящем исследовании, объем теленок 250 мм 3, использовали в качестве отправной точки эксперимента (Фигура 2В). Как правило, она занимает около 1 - 2 недели для опухоли, чтобы достичь такого размера.- Измерьте размер теленка ежедневно с цифровыми измерителями через его медиальной-боковых и передне-задней длины.
- Определить объем теленка по формуле (Д ж ^ 2/6) х 3,14, где D является более длинный диаметр и d является более короткий диаметр несущих опухоль нижней задней конечности.
Примечание: Размер нормального теленка взрослых мышей составляет приблизительно 40 - 50 мм 3. Его объем будет увеличиваться за счет роста опухоли и на более поздних стадиях теленок будет в основном состоит из опухолевой ткани.
4. бедренной артерии Лигирование (FAL) для индуцирования гипоксией в условиях опухолевого роста задних конечностей
- Подготовьте хирургические инструменты, необходимые для этой операции: текущвед или заостренные тонким пинцетом, заостренные щипцы, хирургические ножницы и держатель иглы. Стерилизовать эти инструменты перед операцией с использованием автоклава или горячего шарика стерилизатор. Кроме того, есть прекрасные ватные тампоны готовы к этой операции.
Примечание: Рекомендуется, чтобы инструменты повторно стерилизуют при кончиков по мере необходимости во время процедуры. - Вводят анальгетика (Карпрофен 5 мг / кг) подкожно (SQ). Для того, чтобы обнаружить и подтвердить, гипоксию, впрыснуть hypoxyprobe-1 (pimonidazole, 60 мг / кг).
Примечание: Эта доза соответствует 1,5 мг на мышь и достигается путем инъекции 0,1 мл 15 мг / мл раствора hypoxyprobe в PBS внутрибрюшинно (IP). Hypoxyprobe затем обнаруживается посмертных в тканях животных с помощью иммуногистохимии. - Поместите мышь в наркоз индукционной камере, содержащей 3 - 5% изофлуран в 100% кислорода, при скорости потока 1 л / мин.
- Оставьте мышь в индукционной камере до тех пор, пока не реагирует на внешние раздражители. Затем удалите животное из Induction камера. Поместите животное в положении лежа на спине на стерильной драпировки расположен на вершине согревающей площадку на рабочей поверхности. Используйте носовой конус, чтобы подключить его к непрерывному потоку 1 - 3% изофлуран в 100% кислорода при расходе 0,8 л / мин.
- Применяют стерильные немедикаментозным глазной мази для каждого глаза, чтобы предотвратить высыхание роговицы. Тщательно депилировать хирургическую область, нанесите крем для удаления волос, оставляя его на коже в течение не более 10 сек. Затем вытрите крем для удаления волос с использованием этанола подготовительную площадку.
- Расширить и закрепить задней конечности с куском ленты примерно 45 градусов от средней линии мыши. После того, как задних конечностей безопасно, протереть пораженный участок кожи с 10% повидон / йода тампоном / раствор, затем этанолом, повторяя еще два раза каждый. В течение оставшейся части хирургической процедуры, использовать стерео микроскоп для получения увеличенного изображения области задней конечности.
- Используя острые щипцы и хирургические ножницы, надрезать в скв, длиной около 1 см, от середины бедра по направлению к паховой области. Использование засоленных увлажненных тонкой ватные тампоны, аккуратно смахнуть подкожно-жировой ткани вокруг мышцу бедра.
- Тщательно выявить основные бедренной артерии с помощью тупой диссекции через подкожной жировой ткани. Стабилизировать рану и операционное поле, чтобы выставить сосудистую верхне-средней части приводящей мышцы.
- Использование тонких щипцов, осторожно прокалывают через мембранозной бедренной оболочки подвергать сосудисто-нервного пучка. С помощью чистого набора тонких щипцов, рассекают и отделяют бедренную артерию из бедренной вены и нерва на проксимальном месте вблизи паховой области, дистальный к паховой связкой. Соблюдайте осторожность, чтобы избежать прокалывания бедренной вены стенки.
- После рассечения, пройти прядь 6-0 шелковой нити под бедренную артерию и дистальнее ветви латеральной огибающей бедренную артерию (LCFA). Закупоривать бедренной артерии с использованием двойных узлов (рисунок 3). Закрыть разрез с помощью 6-0 полипропиленовых наложения швов. После закрытия надрез, вводят SQ 0,5 мл теплого физиологического раствора для баланса жидкости терапии. Место животное на вершине завернуто теплой площадку в клетке восстановления и непрерывно контролировать до бодрствования.
- Наблюдение за животными в течение первых 6 ч после операции и вводят анальгезирующее средство (Carprofen 5 мг / кг, SQ) каждый день в течение 3-х дней. Удалить швами 10 дней после операции с использованием стерильных ножниц.
5. Первичная Опухоль Иссечение по ампутации ноги
Примечание: ампутацию несущих опухоль нижнего задней конечности , когда размер теленок достигает 250 мм 3 для контрольной группы , или через 3 дня после FAL для гипоксического группы.
- Бритье волос от несущей опухоль конечности от дистальной большеберцовой кости к тазовой области с машинки для стрижки волос, осторожно держа животное. Вводят анальгетика (Carprofen 5 мг / кг, SQ) перед процедурой.
- Поместите мышь в анестезии индукции чянтарный, содержащий 3 - 5% изофлуран в 100% кислорода, при скорости потока 1 л / мин. Оставьте мышь в индукционной камере до тех пор, пока не реагирует на внешние раздражители. Затем удалите животное от индукции камеры.
- Место животное в правом боковом лежачем положении на стерильной драпировки, помещенном на согревающего площадку на своей рабочей поверхности. Используйте носовой конус, чтобы подключить его к непрерывному потоку изофлюрана 1 - 3% в 100% кислорода при расходе 0,8 л / мин. Применяют стерильные немедикаментозным глазной мази для каждого глаза, чтобы предотвратить высыхание роговицы
- Подготовьте место операции с использованием 10% повидон / йода тампон / раствор, затем этанолом, с повторением 3 раза. Нанесите стерильную марлю (например, хирургическое драпировку) над мышью , чтобы получить стерильный операционного поля.
- Сделать средней бедренной кости окружную разрез кожи, а затем тупым и втягивание кожи проксимальнее. Выставляют медиальной бедренной кости сосудисто-нервный ножку на срединный стороне ноги, а затем перевязатьрядом с паховой связки с использованием 4-0 с покрытием (полиглактином 910) рассасывающийся шовный материал.
- Выполните середины бедренной рассечение мышечных групп с ножницами, а затем тупым рассечением мягких тканей до тазобедренного сустава. Используя резак кости, выполнить середины бедренной остеотомии. С помощью стерильной тонкой ватным тампоном или губкой впитывающийся желатина, слегка нажмите на сайт остеотомии, чтобы свести к минимуму и предотвратить кровотечение.
- Закройте покрывающей кожи с помощью хирургической раны клипов и вводят 0,5 мл теплого солевого баланса SQ для инфузионной терапии. Место животное на вершине завернуто теплой площадку в клетке восстановления и непрерывно контролировать до бодрствования.
- После операции, собирают образцы тканей от первичных опухолей для РНК, ДНК или выделения белка, оснастки заморозить в жидком азоте и хранят при -80 ° С. Для получения первичной культуры клеток, собирают образцы ткани на этом этапе, как это описано в разделе 9 ниже. Закрепить оставшиеся ткани конечности в 10% нейтральном буферном формалине для гистологии и immunochemisпопробуйте, включая обнаружение hypoxyprobe-1.
- Монитор животных для передвижения, боли и потребления пищи в течение первых 6 часов после операции, а затем каждый день в течение 3-х дней. Вводят анальгетика (Carprofen 5 мг / кг, SQ) ежедневно в течение 3-х дней. Удалить раны клипы через 10 дней после ампутации, используя для удаления Рана клипа.
6. Мыши для мониторинга наличия метастазов
- Обратите внимание на мышей ежедневно, и оценивать их для клинических признаков метастазирования, по крайней мере два раза в неделю.
- Обратите внимание животных на наличие macrometastases, представляющих как массы, которые развиваются в различных местах, как правило, плечи контралатеральной ноги и челюсти. С этой целью, тщательно ощупывать головы, шеи и области подмышек и контралатеральной задних конечностей. Проверьте наличие метастазов внутренних органов через вздутие живота наряду с МРТ сканирования.
- Проверка на наличие метастазов в легких путем нажатия мечевидный отросток (нижний конец грудины) с незах пальцев. 24
ПРИМЕЧАНИЕ: Это давление уменьшает диафрагменное способность дыхания. Мыши с развитыми метастазами в легкие признаки дыхательной недостаточности проявляется кропотливой дыхания. - Наблюдать за животными для неврологических симптомов, таких как паралич ног и атаксия предлагая метастазы в центральную нервную систему.
- Монитор мышей по крайней мере один раз в неделю для потери веса, как признак прогрессирования потенциального заболевания. Тело потеря веса более чем на 15% от предварительно процедурного веса считается гуманным конечной точки.
7. Магнитно-резонансная томография (МРТ) для обнаружения Метастазы
- Выполните МРТ для обнаружения метастазов в требуемых временных точках. 18
Примечание: В данном исследовании был использован горизонтальный спектрометр 7-Тесла. МРТ проводили в дни 15 и 35 после ампутации для клеток SK-ES1 и на 15-й день для TC71 клеток. - Поместите мышь в анестезии индукции ChambeR, содержащий 1 - 3% изофлуран в газовой смеси 30% кислорода и 70% закиси азота.
- Оставьте мышь в индукционной камере до тех пор, пока не реагирует на внешние раздражители. Затем удалите животное от индукции камеры.
- Передача под наркозом мыши на стереотаксической держатель с дыханием и температуры monitorization с непрерывным введением 1,5% изофлуран и 30% закиси азота. Применяют стерильные немедикаментозным глазной мази для каждого глаза, чтобы предотвратить сухость роговицы. Изображение животного или в 40 или 23 мм Bruker объема мыши катушки для всего тела или визуализации головного мозга, соответственно в.
- Используйте двумерную, T2-взвешенные RARE последовательность: TR = 3000 мсек, TE = 24 мс, матрица = 256, FOV = 4,35 х 3,0 см, толщина среза = 0,5 мм, Rare коэффициент = 4 и средние = 4. 18
- Поместите животное в теплой клетке восстановления и непрерывно контролировать до бодрствования.
ПРИМЕЧАНИЕ: Мыши быстро восстанавливаться, так как неглубокий плоскость анестезии используется. Наблюдение за животными в течение первых 6 часов после того, как изображения, чтобы убедиться, что нет никаких побочных эффектов анестезии.
8. Эвтаназия и аутопсия
- Усыпить мышей один раз животных, присутствующих с метастазами обнаруживаемых с помощью МРТ и / или клинических симптомов прогрессирования заболевания.
ПРИМЕЧАНИЕ: В настоящем исследовании мышей умерщвляли в дни 50 и 25 после ампутации для животных, несущих SK-ES1 и TC71 ксенотрансплантаты соответственно. В некоторых случаях, ранее эвтаназии было необходимо из-за высокой заболеваемостью метастаз. - Усыпить мышей под воздействием CO 2 на уровне 1,5 л / мин (CO 2 на 10 - 30% от эвтаназии камеры объем / мин). Для обеспечения гибели животных, выполнять шейки дислокации после воздействия CO 2.
- Спрей всю мышь с 70% этанола и поместить его в ламинарный. Собирают кровь путем сердечной пункции с помощью иглы 25 G ½ с 1 мл шприца и передачи сбора крови втбыть, содержащий 2 мг ЭДТА.
- Соберите следующие ткани: селезенка, надпочечники, яичники, почки, печень, легкие, мозг, правая нога, костный мозг от обоих плечевые кости и позвоночника, а также макроскопических метастазов, присутствующих в других местах. 25,26
- Закрепить половину каждой ткани в 10% нейтральном буферном формалине для гистологии и иммунохимии, включая обнаружение hypoxyprobe-1. Привязка заморозить другую половину в жидком азоте, а затем хранят при -80 ° С для РНК, ДНК или белка изоляции. 25,26 Для получения первичной культуры клеток, собирают образцы ткани , как описано в разделе 9 ниже.
9. Первичные культуры клеток
- Для выполнения первичной культуры клеток, рассекают ткани от ампутированной конечности (раздел 5 выше), или во время аутопсии (раздел 8 выше) в стерильных условиях в вытяжном шкафу с ламинарным потоком.
- Подготовка среды для культивирования клеток, подходящие для клеточной линии, используемой для ортотопических инъекций, с добавлением пенициллина (200 ед / мл),стрептомицин (200 мкг / мл), Fungizone (1 мкг / мл), и 0,2% Mycoplasma профилактический антибиотик. Поместите 2,5 мл среды первичной культуры в 6-см клеточной культуральный планшет.
- Выберите жизнеспособные участки опухоли тканей от первичных опухолей или метастазов, а затем изолировать от двух до трех сегментов на 2-3 мм каждый с помощью стерильных ножниц.
Примечание: жизнеспособные ткани опухоли обычно находится на краях опухоли и может быть различен с некрозом ее розоватого или красноватого цвета, значительный блеск и общий внешний вид влажного. В противоположность этому, некротические ткани обычно наблюдается в центре опухоли и представляет в виде беловато-кремового цвета / массы с тусклым, сырный внешний вид. 27 - Перенесите выделенные сегменты в 6-см для культивирования клеток планшет, содержащий первичную культуральную среду, описанную в шаге 9.2.
- Культуры клеток при стандартных условиях, как описано в разделе 1 (примечание) и 9.2. 18,28 Проверьте культуру для клеточного выроста , вытекающий из кусочков ткани, ВГIch должны наблюдаться в течение нескольких дней. После того, как клетки достигают слияния, Trypsinize и распространять их в соответствии со стандартными методами культивирования клеток.
Примечание: Первичная культура клеток может быть в дальнейшем использован для оценки роста и метастатических свойств клеток, полученных из контрольных и гипоксических опухолей, а также их молекулярных характеристик, как было описано выше. 18
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
После инъекции ES клеток в икроножной мышцы, первичные опухоли могут расти до размера теленка 250 мм 3 (фиг.1, 2). Время, необходимое для опухолей, чтобы достичь этого объема, как правило, находится в диапазоне от 10 - 15 дней для TC71 до 20-25 дней для SK-ES1 ксенографтов соответственно. Опухоли в объеме теленка 250 мм 3 демонстрируют относительно низкий уровень эндогенного гипоксии (приблизительно 3% опухолевой ткани), основанный на hypoxybrobe-1 (pimonidazole) окрашивания (рис 4A, C). Важно отметить, что в этих контрольных опухолей наблюдалось положительное окрашивание на hypoxyprobe-1 , исключительно в области физиологической гипоксии, то есть, в опухолевых клетках, удаленных от сосудистую систему и начинают подвергаются клеточной гибели (фиг.4А). Такое окрашивание демонстрирует характерный «воздух-кисть" шаблон, в то время как основная часть здоровой ткани опухоли остается отрицательным для hypoxyprobe-1. <SUP> 6 В отличие от этого , FAL осуществляется на данном этапе создает глубокую гипоксию, о чем свидетельствует положительное окрашивание на hypoxyprobe-1 , наблюдаемого в подавляющем большинстве опухолевых клеток в 4 ч после FAL (4В). Следует отметить, что hypoxyprobe-1-позитивных опухолевых клеток наблюдается также в непосредственной близости от кровеносных сосудов и характерный образец физиологической гипоксии теряется. В этих FAL-обработанных опухолей, 73% ткани состоит из гипоксических опухолевых клеток (рис 4в). Ткани опухоли также демонстрирует первые признаки гипоксии , вызванной повреждением клеток, в том числе усадка и рыхлой структуры (рис 4б).
Эффективность FAL была дополнительно поддержана полного ингибирования роста первичной опухоли. В течение 3-дневный срок между FAL и ампутации, размер первичных опухолей не увеличивалась (рис 5А). В отличие от этого, первичные опухоли мышей подвергали фиктивный Surgerу продолжали быстро расти, достигнув объема приблизительно 650 мм 3, имитируя таким образом скорость роста опухолей у контрольных мышей , не подвергнутых операции (рис 5А). 18 В соответствии с этими данными, гистопатологические анализ выявил обширные зоны некроза в FAL-обработанных первичных опухолей заготовленной 3 дней после операции (рис 5B). Тем не менее, существуют группы жизнеспособных опухолевых клеток , присутствующих в ткани опухоли, как правило , расположенные на краях опухоли, близкие к сосудистой сети (Фиг.5В). Для изучения состояния оксигенации этих клеток мы использовали hypoxyprobes, которые активируются в живых гипоксических клеток, впоследствии получая способность ковалентно связываться с белками в этих клетках. 29 Таким образом , эти зонды служат постоянным маркером клеток , которые испытали гипоксию в любой момент времени. Таким образом, для обнаружения изменений в уровнях кислорода опухолевых клеток на протяжении всего срока действия experimлор, мы использовали два различных hypoxyprobes, которые могут быть обнаружены независимо друг от друга с помощью иммуногистохимии. Зонды были введены в двух временных точках - непосредственно перед FAL (hypoxyprobe-1) и до ампутации (hypoxyprobe-2, CCI-103F) - и их локализация была обнаружена в опухолях собирали 3 дня после FAL (рисунок 1). Hypoxyprobe-1, которая присутствовала в системе в момент FAL, отмечено большинство опухолевых клеток, так как ткань стала сильно гипоксическая (5С). Эта маркировка также очевидна в областях некроза / апоптоза, так как эти клетки были еще живы в момент FAL и , следовательно , способны постоянно связывание hypoxyprobe-1, как показано на рисунке 4B. В противоположность этому , hypoxyprobe-2 вводят 2 дня после FAL только окрашивали жизнеспособных клеток, а клетки в некротических областях , были уже мертвы и не могут активировать датчик в момент его введения (рис 5D). Интересно, что мы также OBSErved жизнеспособной опухолевой ткани , прилегающей к сосудистой системе, который был первоначально гипоксическая (hypoxyprobe-1-положительных), но адекватно окисленный в более поздний момент времени (hypoxyprobe-2-отрицательными) (рис 5C, D). Этот вывод согласуется с предыдущими сообщениями о том, что коллатеральный сосуд-зависимой реперфузии тканей восстанавливает кровоток в задних конечностей 3 дня после FAL. 20 жизнеспособные опухолевые клетки , остающиеся в опухолевой ткани 3 дня после FAL были весьма инвазивными, о чем свидетельствует их массовым intravasation по васкуляризованных краям опухоли (рис 5д). Некоторые из клеток в просвет сосуда были положительными для hypoxyprobe-1, что свидетельствует о том, что они стали гипоксическая на FAL, но остаются жизнеспособными. Итак, эти данные указывают на то, что реперфузии тканей после тяжелой гипоксии может облегчать утечку клеток из первичных опухолей.
На основе пилотного эксперимента, широко распространенные метастазыобнаружить с помощью МРТ примерно через 35 дней после ампутации для SK-ES1 ксенотрансплантатов, в то время как TC71 клетки обычно метастаз в течение 15 дней. Следовательно, для сравнительного анализа метастаз задержки и частоты, МРТ проводили на 15-й день и 35 после ампутации для животных, несущих опухоли SK-ES1, в то время как один изображений на 15-й день было достаточно для мышей с опухолями TC71. Эвтаназия была выполнена в 50-й день и 25-й день у животных с SK-ES1 и TC71 ксенографтов соответственно. Как сообщалось ранее, наиболее распространенные типы метастазов включены мягкие массы ткани в плечевой зоне, а также метастазы в кости на контралатеральной ноги, верхнечелюстной области и позвоночника для клеток SK-ES1, а также легких и тазовых опухолей для TC71. 18 Кроме того, частые метастазы во внутренние органы, в том числе надпочечниках, легких и печени, а также инфильтрации костного мозга, наблюдались у мышей , несущих FAL обработанных ксенотрансплантаты SK-ES1 (рисунок 6). В общем, гипоксия значительно увеличилосьобщая (SK-ES1) или сайт-специфические (TC71) частота и кратность метастазов в обеих клеточных линиях. Тем не менее, TC71 ксенографты также разработаны частые рецидивирующие массы на месте ампутации (25% для контроля и 40% для FAL-обработанных опухолей), как описано ранее для крупных TC71 первичных опухолей. 18
Ткани из-под контроля и FAL-обработанных первичных опухолей и метастазов также могут быть источником материала для комплексных молекулярных анализов, направленных на выявление гипоксией активируемые путей, участвующих в распространении ES. Например, мы наблюдали существенные различия в метаболомики профилях контроля и гипоксических первичных опухолей (данные не показаны). Мы также смогли успешно изолировать несколько клеточных линий, от всех вышеуказанных тканей. Во многих случаях клетки, полученные из FAL-обработанных опухолей выставлены заметные изменения в морфологии, по сравнению с исходными клетками и соли, полученные из управления Tuморс (7А). Чистота этих клеточных культур было подтверждено положительным иммунным окрашиванием для саркомы Юинга маркера, CD99 (Рисунок 7b). Кроме того, 100% клеток в установленных клеточных линий имели положительный сигнал флуоресценции в гибридизация (FISH) с зондами центромерных человека в, часто представляя с увеличением числа хромосом (рис 8a). Человеческое происхождение этих клеток было дополнительно подтверждено анализом метафазных хромосом (фиг.8В) , которые выставляются цитогенетических перестроек , описанных ранее для клеток SK-ES1 как в исходной линии клеток и клетки , полученные из FAL-обработанных опухолей (фиг.8В). 30
Рисунок 1. очертание ES модели гипоксии. ES - клетки (1 - 2 х 10 6) инъецировали в gastrocnemius мышцы SCID / бежевых мышей. После того , как в результате первичные опухоли достигали объема телячью 250 мм 3, мышей разделили на две экспериментальные группы. Мыши из контрольной группы вводили hypoxyprobe-1 (HP-1), а также первичные опухоли вырезали по ампутации конечностей. Мыши из гипоксического группы вводили hypoxyprobe-1, а затем подвергали перевязки бедренной артерии (FAL). Через два дня мышам вводили hypoxyprobe-2 (HP-2), а затем опухолевые несущие конечности были ампутированы три дня после FAL. Животных из обеих групп контролировали с помощью периодического магнитно-резонансной томографии (МРТ). После того, как стало очевидно, метастазах основана на визуализации и клинических признаков, мышей забивали и наличие метастазов было подтверждено аутопсии и гистологических анализов. Время роста опухоли, визуализации и эвтаназии на основе скорости клеток SK-ES1 роста и метастазирования. Обратите внимание, что в то время как hypoxyprobe-2 необходимо установить способ и видеотехникаАлизе изменения в уровнях гипоксии в период между FAL и ампутации конечностей, его использование не является существенным для реальных экспериментов. Таким образом, этот шаг не включен в протокол. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2. Первичный рост опухоли. А. Магнитный резонанс изображений (МРТ) неповрежденной задних конечностей. Красная стрелка указывает на место и направление опухолевых клеток ортотопической инъекции. B. Первичная опухоль в объеме теленка приблизительно 250 мм 3 растет в икроножной мышцы (красный контур). Красные наконечники стрел указывают на участки разрушения кости. T - большая берцовая кость. Пожалуйста слизать здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3. Структура сайта бедренную артерию Лигирование. Представитель посмертных рентгеновского артериограмма мышки 129S1 / SVJ перфузируемом с сульфатом бария сразу после перевязки показано, чтобы подчеркнуть наличие ранее существовавших коллатеральных сосудов. Обратите внимание, что в то время как изображение изображает две лигатуры (Xs), один дистальнее латеральной огибающей бедренную артерию (LCFA) (красный X) и другой проксимальных по отношению к колену артерии (белый X), модель опухоли гипоксия используется только проксимального лигирования, рядом паховой связки и дистально по отношению к LCFA (красный X). Область развития коллатерального сосуда показано, как описано (слабые сосуды), и они идентифицируются по их извилистый, штопор формы. Пожалуйста , нажмите онповторно просмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4. Опухоль Гипоксия , индуцированный бедренную артерию Лигирование (FAL). A. Опухоль контроль в объеме теленка 250 мм 3 окрашивали гематоксилином и эозином (H & E) и иммунологически для hypoxyprobe-1 (коричневый). Hypoxyprobe-1 наличие иммунологической исключительно наблюдается в области физиологической гипоксии опухоли, где опухолевые клетки, удаленные от сосудистую сеть, лишенные кислорода и начинают подвергаются клеточной гибели. B. FAL лечение первичной опухоли в аналогичном размере заготовленной 4 ч после лигирования и окрашивали H & E и иммунологически для hypoxyprobe-1. Большинство опухолевых клеток весьма положительно для hypoxyprobe-1, в том числе и в непосредственной близости от сосудистую сеть. V - кровеносный сосуд. C. Область позитивного окрашивания для hypoxyprobe-1 был quantifсамодельное взрывное устройство в контрольных и FAL-обработанных опухолей с использованием программного обеспечения ImageJ. Усы представляют собой SEM. *** - Р <0,001 Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 5. Влияние бедренную артерию Лигирование (FAL) по первичному опухолевого роста. А. Рост первичная опухоль в течение 3-дневный срок между хирургии и ампутации в FAL- (п = 4) и имитацией хирургии лечение (n = 4) животные, по сравнению с интактными контрольных опухолей (п = 6). Усы представляют SD. *** - Р <0,001 по сравнению с двумя контрольными и мнимых хирургии лечение опухолей. Б. гематоксилином и эозином (Н & Е) окрашивание в FAL опухоль , обработанную собирали 3 дня после перевязки обнаруживает широко распространенную некроза опухоли внутри. Красный контур указывает на область жизнеспособной опухоли CELLS в непосредственной близости от насыщена сосудами области перфузировались 3 дня после FAL. C. FAL обработанной ткани опухоли собирали 3 -х дней после операции иммуноокрашиванию для hypoxyprobe-1. Hypoxyprobe-1 был введен ранее FAL. Таким образом, положительное иммунное указывает на существование обширной тканевой гипоксии сразу после операции. Д. Hypoxyprobe-2 вводили 2 дня после FAL, и ткань собрали 24 ч позже, при ампутации. Положительный hypoxyprobe-2 окрашивание идентифицирует тканевую гипоксию во время ампутации. Красная стрелка указывает на ткань, которая гипоксическая в обеих временных точках в то время как желтая стрелка указывает на область, смежную с сосудистой сетью, которая была гипоксически сразу после того, как FAL (hypoxyprobe-1-положительных), но отрицательное для hypoxyprobe-2 в момент иссечение, которое свидетельствует о реперфузии тканей. Отсутствие hypoxyprobe-2 окрашивания в некротических областях предполагает, что клетки в этой области не были жизнеспособными в момент его введения и, следовательно,не в состоянии активно связывать зонд. Окрашивание представлены в панели BD проводили на участках серийных ткани. E. Intravasation в FAL лечение опухоли 3 дня после FAL. Иммунное идентифицирует жизнеспособных клеток положительные для hypoxyprobe-1 внутри просвета сосуда (красная стрелка). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 6. Примеры метастазами в мышей , несущих FAL обработанных SK-ES1 опухолям. Метастазах были обнаружены при магнитно-резонансной томографии (МРТ) и подтверждены аутопсии и гистологических анализов (гематоксилин и эозином, H & E). М - метастазирование. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы увидеть увеличенное верс ион этой фигуры.
Рисунок 7. Характеристика клеток , полученных из FAL-обработанных первичных опухолей. A. культуры живых клеток были созданы из тканей добытых из -под контроля и гипоксических первичных опухолей и их морфология сравнивали с исходными линиями клеток , используемых для начальных ортотопических инъекций. Клетки, полученные из FAL-обработанных первичных опухолей обнаруживают резкие изменения их размеров и морфологии. Типичные изображения исходной и первичных опухолевых клеток, полученных SK-ES1 показаны. B. Характерные изображения клеток , полученных из FAL-обработанных опухолей иммуноокрашиванию для маркера ES, CD99 и контрастно с ДНК-связывающего красителя, DAPI в. Все клетки являются CD99-положительными, в том числе гипертрофированных клеток, содержащих ядра увеличенный (белая стрелка). OAD / 54532 / 54532fig7large.jpg "целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 8. Хромосомный анализ клеток , полученных из FAL-обработанных опухолей. А. Флуоресцентная гибридизация (FISH) анализ в интерфазных клетках показаны два ядра с сигналами для человеческого центромерная 4 зонда. Крупное ядро с четырьмя сигналами указывает на тетраплоидный (4N) ячейку (белая стрелка). B. Анализ FISH в представительных метафазах оригинальной линии клеток SK-ES1 и клетки , полученной из FAL обработанной первичной опухоли. Красные стрелки указывают на ОБР (1) (p13.1q21), неслучайную цитогенетическую перегруппировки характеристику клеток SK-ES1. Красные сигналы: человеческий центромерная 4 зонда; Зеленые сигналы в исходных клетках SK-ES1: NPY5R зонд на хромосоме 4q32.2.e.com/files/ftp_upload/54532/54532fig8large.jpg "целевых =" _blank "> Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Наша модель предполагает сравнение метастаза в двух экспериментальных группах - контрольной группы, где опухоли разрешено развиваться в задней конечности с последующей ампутацией при достижении объема теленка 250 мм 3, и гипоксия-облученной группе, в которой tumor- подшипник задней конечности подвергается FAL в том же объеме, с последующим отсечением через 3 дня. Даже если в этих опытах FAL-обработанные опухоли ампутированы с небольшой задержкой, по сравнению с контрольными опухолями, их размер не увеличивается в течение периода 3-дневного между перевязки и ампутации. Таким образом, этот подход позволяет сравнивать метастатического потенциала между опухолями сравнимых размеров, но с существенно различными уровнями гипоксии. В противоположность этому, с помощью мнимого хирургии, обычно используемый контроль за хирургических вмешательств, а затем 3-х дней роста опухоли может привести к значительным различиям в размере опухоли между экспериментальными группами с мнимым хирургии лечиEd первичные опухоли, обладающие значительные уровни эндогенного гипоксии. На основании предварительных экспериментов, фиктивный операция не оказывает существенного влияния роста опухоли или ее уровни гипоксией и, таким образом, могут быть исключены из эксперимента. Вместо этого, стратегия сравнения опухоли подобных размеров и различных уровней гипоксией является весьма актуальной моделью для выяснения влияния гипоксии на распространение болезни. Важно отметить, что в отличие от предыдущих в пробирке исследования, этот подход позволяет комплексной оценки про-метастатических действия гипоксии в естественном микросреды опухоли. 4-6
Целью эксперимента было достижение низкого базального уровня метастазов, которые позволили бы для обнаружения гипоксией индуцированную стимулирующий эффект на их формирование. Мы установили , что размер теленка 250 мм 3 при FAL и ампутация была оптимальной для первичных опухолей SK-ES1. Тем не менее, этот параметр необходимо будет оптимизирован для ЭА ч клеточная линия, в зависимости от их метастатического потенциала и местной инвазии. Для опухолей с более высоким метастатическим потенциалом, размер первичной опухоли при ампутации, возможно, должны быть уменьшены. Например, TC71 опухоли обнаруживают высокую локальную инвазивность, проявляющийся частым образованием рецидивирующих опухолей в месте ампутации. 18 После того, как такие массы развиваются, животные должны быть исключены из анализа, поскольку это не будет понятно , если последующие отдаленные метастазы происходят из первичных опухолей или рецидивирующих опухолей , которые часто растут быстро и демонстрируют высокий уровень эндогенного гипоксии. Из предыдущего опыта, независимо от клеточной линии используется, 150 мм 3 является минимальным-ОПУХОЛЕНОСИТЕЛЕЙ размер теленка , который может быть надежно оценена и нормализуется. Если уменьшение размера опухоли у FAL и ампутации не устраняет текущие опухоли или уменьшить базальную скорость метастазирования достаточно, конкретная клеточная линия о котором идет речь, не могут быть пригодны для этих экспериментов.
ve_content "> Кроме того, это не важно установить временную шкалу МРТ и эвтаназию для каждой отдельной клеточной линии, в зависимости от задержки его метастазирование. Следует отметить, что хирургические раны клипы, которые мешают МРТ могут быть удалены не ранее чем через 10 дней пост- хирургическое вмешательство, и этот период должен иногда быть продлен из-за осложнений с исцелением. Таким образом, в данном исследовании мы установили 15-й день, как во время первого МРТ.Еще одним важным фактором в данной модели является поддержание уровня гипоксии, способной индуцировать метастатические процессы, не вызывая некроз полный опухоли, что бы предотвратить распространение опухолевых клеток. Несмотря на то, что мы не сталкивались с этой проблемой в данном исследовании, в случае необходимости, тяжесть гипоксии, может регулироваться путем изменения точного сайта и количества лигирования по отношению к ветви бедренной артерии, таких как LCFA и Genu артерии. 20 Таким образом, лигирование проксимально по отношению к LCFA создаст более тяжелую ишемию в Hindlimb кровообращение, тем самым увеличивая гипоксические условия в дистальной ноге. В противоположность этому, лигирование дистальнее последующих ветвей бедренной артерии приведет к снижению в результате гипоксии в нижней задней конечности.
Важно отметить, что не было никаких серьезных побочных эффектов комбинированных процедур FAL и ампутации и никаких случаев смерти, связанных с хирургических операций, как сообщалось ранее для этих способов, выполненных отдельно. 18-20 Таким образом, успех метода ограничивается в основном скоростью взятия опухоли на основной сайт и частота рецидивов опухолей, оба из которых являются линия клеток-зависимыми.
Как гипоксия участвует в качестве про-метастатического фактором во многих типах опухолей, этот подход также может быть пригодным для непосредственного тестирования его последствий и определения механизмов его действий в других сарком, которые развиваются в конечностях. 23 Кроме того, подобная стратегия может быть применена к другим злокачественных опухолей , растущих в среде ортотопических шIth четко определенного маршрута поставок крови. Таким образом, с соответствующими изменениями, эта модель может быть полезным инструментом в исследованиях за пределами области биологии ES.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SK-ES1 Human Ewing sarcoma (ES) cells | ATCC | ||
| TC71 Human ES cells | Kindly provided from Dr. Toretsky | ||
| McCoy's 5A (modified) Medium | Gibco by Life Technologies | 12330-031 | |
| RPMI-1640 | ATCC | 30-2001 | |
| PBS | Corning Cellgro | 21-040-CV | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442-500mL | |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1x) | Gibco by Life Technologies | 25200-056 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco by Life Technologies | 15140-122 | |
| Fungizone® Antimycotic | Gibco by Life Technologies | 15290-018 | |
| MycoZap™ Prophylactic | Lonza | VZA-2032 | |
| Collagen Type I Rat tail high concetration | BD Biosciences | 354249 | |
| SCID/beige mice | Harlan or Charles River | 250 (Charles River) or 18602F (Harlan) | |
| 1 ml Insulin syringes with permanently attached 28 G ½ needle | BD | 329424 | |
| Saline (0.9% Sodium Chloride Injection, USP) | Hospira, INC | NDC 0409-7984-37 | |
| Digital calipers | World Precision Instruments, Inc | 501601 | |
| Surgical Tools | Fine Science Tools | ||
| Rimadyl (Carprofen) Injectable | Zoetis | ||
| Hypoxyprobe-1 (Pimonidazole Hydrochloride solid) | HPI, Inc | HP-100mg | |
| hypoxyprobe-2 (CCI-103F-250 mg) | HPI, Inc | CCI-103F-250mg | |
| Povidone-iodine Swabstick | PDI | S41350 | |
| Sterile alcohol prep pad | Fisher HealthCare | 22-363-750 | |
| LubriFresh P.M. (eye lubricant ointment) | Major Pharaceuticals | NDC 0904-5168-38 | |
| VWR Absorbent Underpads with Waterproof Moisture Barrier | VWR | 56617-014 | |
| Oster Golden A5 Single Speed Vet Clipper with size 50 blade | Oster | 078005-050-002 (clipper), 078919-006-005 (blade) | |
| Nair Lotion with baby oil | Church & Dwight Co., Inc. | ||
| Silk 6-0 | Surgical Specialties Corp | 752B | |
| Prolene (polypropylene) suture 6-0 | Ethicon | 8680G | |
| Vicryl (Polyglactin 910) suture 4-0 | Ethicon | J386H | |
| Fisherbrand Applicators (Purified cotton) | Fisher Scientific | 23-400-115 | |
| GelFoam Absorbable Dental Sponges - Size 4 | Pfizer Pharmaceutical | 9039605 | |
| Autoclip Wound Clip Applier | BD | 427630 | |
| Stereo Microscope | Olympus | SZ61 | |
| Autoclip remover | BD | 427637 | |
| Aound clip | BD | 427631 | |
| MRI 7 Tesla | Bruker Corporation | ||
| Paravision 5.0 software | Bruker Corporation | ||
| CO2 Euthanasia system | VetEquip | ||
| 25 G 5/8 Needle (for heart-puncture) | BD | 305122 | |
| 0.1 ml syringe (for heart-puncture) | Terumo | SS-01T | |
| K3-EDTA Micro tube 1.3 ml | Sarstedt | 41.1395.105 | |
| 10% Neutral Buttered Formalin | Fisher Scientific | SF100-4 |
References
- Lessnick, S. L., Ladanyi, M. Molecular pathogenesis of Ewing sarcoma: new therapeutic and transcriptional targets. Annu Rev Pathol. 7, 145-159 (2012).
- Ladenstein, R. Primary disseminated multifocal Ewing sarcoma: results of the Euro-EWING 99 trial. J Clin Oncol. 28, 3284-3291 (2010).
- Dunst, J., Ahrens, S., Paulussen, M., Burdach, S., Jurgens, H. Prognostic impact of tumor perfusion in MR-imaging studies in Ewing tumors. Strahlenther Onkol. 177, 153-159 (2001).
- Aryee, D. N. Hypoxia modulates EWS-FLI1 transcriptional signature and enhances the malignant properties of Ewing's sarcoma cells in vitro. Cancer Research. 70, 4015-4023 (2010).
- Knowles, H. J., Schaefer, K. L., Dirksen, U., Athanasou, N. A. Hypoxia and hypoglycaemia in Ewing's sarcoma and osteosarcoma: regulation and phenotypic effects of Hypoxia-Inducible Factor. BMC cancer. 10, 372 (2010).
- Tilan, J. U. Hypoxia shifts activity of neuropeptide Y in Ewing sarcoma from growth-inhibitory to growth-promoting effects. Oncotarget. 4, 2487-2501 (2013).
- Franzius, C. Successful high-resolution animal positron emission tomography of human Ewing tumours and their metastases in a murine xenograft model. Eur J Nucl Med Mol Imaging. 33, 1432-1441 (2006).
- Hauer, K. DKK2 mediates osteolysis, invasiveness, and metastatic spread in Ewing sarcoma. Cancer Research. 73, 967-977 (2012).
- Manara, M. C. Preclinical in vivo study of new insulin-like growth factor-I receptor--specific inhibitor in Ewing's sarcoma. Clin Cancer Res. 13, 1322-1330 (2007).
- Scotlandi, K. Murine model for skeletal metastases of Ewing's sarcoma. J Orthop Res. 18, 959-966 (2000).
- Vormoor, J. Establishment of an in vivo model for pediatric Ewing tumors by transplantation into NOD/scid mice. Pediatr Res. 49, 332-341 (2001).
- Picarda, G. Preclinical evidence that use of TRAIL in Ewing's sarcoma and osteosarcoma therapy inhibits tumor growth, prevents osteolysis, and increases animal survival. Clin Cancer Res. 16, 2363-2374 (2010).
- Vormoor, B. Development of a preclinical orthotopic xenograft model of ewing sarcoma and other human malignant bone disease using advanced in vivo imaging. PLoS One. 9, e85128 (2014).
- Wang, Y. Platelet-derived growth factor receptor beta inhibition increases tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL) sensitivity: imatinib and TRAIL dual therapy. Cancer. 116, 3892-3902 (2010).
- Wang, Y. X. Inhibiting platelet-derived growth factor beta reduces Ewing's sarcoma growth and metastasis in a novel orthotopic human xenograft model. In Vivo. 23, 903-909 (2009).
- Odri, G. A. Zoledronic acid as a new adjuvant therapeutic strategy for Ewing's sarcoma patients. Cancer Research. 70, 7610-7619 (2010).
- Merchant, M. S. Interferon gamma enhances the effectiveness of tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand receptor agonists in a xenograft model of Ewing's sarcoma. Cancer Research. 64, 8349-8356 (2004).
- Hong, S. H. High neuropeptide Y release associates with Ewing sarcoma bone dissemination - in vivo model of site-specific metastases. Oncotarget. 6, 7151-7165 (2015).
- Lee, E. W. Neuropeptide Y induces ischemic angiogenesis and restores function of ischemic skeletal muscles. J Clin Invest. 111, 1853-1862 (2003).
- Tilan, J. U. Platelet neuropeptide Y is critical for ischemic revascularization in mice. FASEB J. , (2013).
- Toffoli, S., Michiels, C. Intermittent hypoxia is a key regulator of cancer cell and endothelial cell interplay in tumours. The FEBS journal. 275, 2991-3002 (2008).
- Das, B. Hypoxia enhances tumor stemness by increasing the invasive and tumorigenic side population fraction. Stem cells (Dayton, Ohio). 26, 1818-1830 (2008).
- Arndt, C. A., Rose, P. S., Folpe, A. L., Laack, N. N. Common musculoskeletal tumors of childhood and adolescence. Mayo Clin Proc. 87, 475-487 (2012).
- Mendoza, A. A novel noninvasive method for evaluating experimental lung metastasis in mice. J Am Assoc Lab Anim Sci. 52, 584-589 (2013).
- Feldman, D. B., Seely, J. C. Necropsy Guide: Rodents and the Rabbit. , CRC Press. (1988).
- Parkinson, C. M. Diagnostic necropsy and selected tissue and sample collection in rats and mice. J Vis Exp. , (2011).
- Raymond, A. K., Lazar, A. J. Bone Sarcoma. PP, L. in, S, P. atel , Springer. (2013).
- Dietel, M., Arps, H., Gerding, D., Trapp, M., Niendorf, A. Establishment of primary cell cultures: experiences with 155 cell strains. Klin Wochenschr. 65, 507-512 (1987).
- Varghese, A. J., Gulyas, S., Mohindra, J. K. Hypoxia-dependent reduction of 1-(2-nitro-1-imidazolyl)-3-methoxy-2-propanol by Chinese hamster ovary cells and KHT tumor cells in vitro and in vivo. Cancer Research. 36, 3761-3765 (1976).
- ATCC. , http://www.atcc.org/products/all/HTB-86.aspx#characteristics (2014).
