Introduction
Ewing sarkom (ES) är en aggressiv malignitet drabbar barn och ungdomar. 1 Tumörerna utvecklas i mjukdelar och ben, vanligen i armar och ben. Medan närvaron av metastaser är den enskilt mest kraftfulla negativa prognostisk faktor för ES patienter, de mekanismer som ligger bakom deras utveckling fortfarande oklara. 2 Tumör hypoxi är en av de få faktorer som är inblandade i ES progression. I ES patienter är förekomsten av icke-perfusion områden inom tumörvävnaden i samband med dålig prognos. 3 In vitro ökar hypoxi invasions av ES-celler och utlöser expression av pro-metastaserande gener. 4-6 Trots dessa rader av bevis, finns det ingen direkt bevis för hypoxi-inducerad ES progression och spridning. Dessutom de mekanismer genom vilka hypoxi utövar sådana effekter är för närvarande okänd. Därför har vi skapat en in vivo-modell för att fylla gapet mellan befintliga in vitro-data och klinisk observationer. Detta modellsystem möjliggör direkt kontroll av effekterna av hypoxi på tumörer som förekommer i deras naturliga miljö, med hjälp av magnetisk resonanstomografi (MRT) för att följa tumörprogression och metastas in vivo i kombination med ex vivo patologiska och molekylära analyser (Figur 1).
Eftersom ingen etablerad transgen modell av ES är för närvarande tillgängliga, studier på metastaserande egenskaperna hos dessa tumörer in vivo beroende av injektioner av humana celler i nedsatt immunförsvar möss. Även om användningen av immunologiskt nedsatt djur kan underskatta effekterna av immunsystemet på sjukdomsförloppet, ökar möjligheten att använda mänskliga celler översättbarhet av sådana studier. Bland olika xenograft-modeller, systemiska injektioner i svansvenen är lättast att utföra, men de utelämnar de första stegen av tumörcell intravasering och fly från den primära platsen för tillväxt. 7-12 Å andra sidan, orthoto pic xenografting, vilket innebär injektioner av tumörceller i ben (lårbenet, revben) och muskler, är mer tekniskt utmanande, men också mer biologiskt relevanta för människors cancer. 13-16 Men i det förflutna, hög sjuklighet i samband med en snabb tillväxt av primära tumörer har ofta nödvändig avlivning innan metastaser utveckling. I denna studie använde vi en tidigare etablerad modell av cellinjektioner i gastrocnemiusmuskeln följt av excision av den resulterande primära tumören i kombination med längsgående övervakning av metastasutvecklingen med MRI. 17,18 Sådana injektioner i gastrocnemius i närheten av skenbenet tillåter tumörtillväxt i två naturliga ES miljöer - muskler och ben - och leda till fjärrmetastaser till platser typiskt påverkas i människor. 18 Därigenom denna modell rekapitulerar noggrant metastaserande processer som sker i ES patienter under sjukdomsförloppet.
tält "> Lokaliseringen av primära tumörer i den nedre bakdelen underlättar också exakt kontroll av blodtillförsel till tumörvävnad. Femoralartärlinje ligering (FAL) är en väl etablerad teknik utnyttjas i angiogenes forskning för att blockera blodflödet till distala regioner av benet och undersöka vävnads vaskularisering som svar på ischemi. 19,20 Viktigt den initiala nedgången i blodflödet följs av säkerheter behållaröppningen och vävnads reperfusion observer ungefär tre dagar efter FAL. 20 Således när de utförs i en tumörbärande lem, denna modell åter hypoxi / reperfusion händelser som förekommer naturligt i snabbt växande tumörer och möjliggör utsläpp av metastatiska tumörceller på grund av återställande av perfusion till den nedre bakdelen via nyöppnade kollaterala kärl. 21 Viktigt denna procedur måste utföras när tumörstorleken är tillräckligt liten för att förhindra överdriven hypoxi i tumörer kontroll (vanligen vid tumörbärande kalv volUME av 150-250 mm 3), se signifikanta skillnader i tumörhypoxi mellan kontroll och FAL-behandlade grupper.Förutom längd övervakning av effekten av hypoxi på ES latens och frekvens av metastaser, denna modell gör det också möjligt för insamling av vävnader och utvecklingen av nya cellinjer från både primära tumörer och metastaser. Viktigt är tidigare arbete fastställt att metastaser-härledda cellinjer uppvisar förbättrad metastatisk potential på återinförande till djur, vilket tyder på att tumörspridning är förknippad med permanenta förändringar i tumörcellen fenotypen och därigenom validera användningen av dessa cellinjer för att dechiffrera metastaser processer. 18 Tillsammans kan dessa modeller nu användas för genetiska och molekylära analyser som krävs för att identifiera hypoxi-inducerad metastaserande vägar.
Som hypoxi är en pro-metastaserande faktor öka malignitet av olika tumors kan vår modell kan användas som en plattform för att undersöka vilken roll hypoxi i andra tumörtyper som naturligt utvecklas i armar och ben, såsom osteosarkom och rabdomyosarkom. 21-23 Dessutom kan tillämpas ett liknande tillvägagångssätt för maligniteter som växer i andra anatomiska platser med en väldefinierad väg blodtillförsel. I slutändan kan modellen ändras och dess användbarhet utökas ytterligare, beroende på individuella forskningsbehov.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla förfaranden har godkänts av Georgetown University Institutional Animal Care och användning kommittén.
1. Cellberedning för orthotopic Injektioner
- Kultur humana ES-celler under normala förhållanden. Använd ungefär en 15-cm cellkulturplatta högst 70% av sammanväxning för injicering av 5 möss.
OBS: För denna studie, SK-ES1-celler odlades i McCoys 5A-medium med 15% fetalt bovint serum (FBS) på kollagenbelagda plattor och TC71-celler odlades i RPMI med 10% FBS och 1% 4- (2-hydroxietyl ) -1-piperazinetansulfonsyra (HEPES). Båda medierna kompletterades med antibiotika - penicillin (100 enheter / ml), streptomycin (100 | ig / ml) och fungizon (1 | j, g / ml). - Tvätta ES-cellerna med fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och trypsinize vid 70% sammanflytning med 0,25% trypsin / etylendiamintetraättiksyra (EDTA) under 5 min.
- Ta bort ES-celler från plattan med cellodlings media, centrifugera sedan i 5 min vid 200 xg vid rumstemperatur. Återsuspendera ES-cellerna i 10 ml kall PBS och sedan räkna antalet celler.
- Centrifugera ES-celler för 5 min vid 200 xg vid rumstemperatur, och sedan återsuspendera vid 2 x 10 7 (SK-ES1) eller 10 7 (TC71) celler per ml i kall PBS. Håll den slutliga cellsuspensionen på is när de utför injektioner.
2. Orthotopic Injektion av ES-celler i gastrocnemius
- Använd 4-6 veckor gamla kvinnliga SCID / beige-möss.
- Att injicera ES-celler, försiktigt hålla musen och stabilisera sin vänstra ben mellan den fjärde och femte fingrar, utsätta den mediala sidan av den nedre bakbenen.
- Med användning av en 28 G ½ nål, injicera 0,1 ml av den tidigare framställda cellsuspensionen som innehåller antingen 2 x 10 6 (SK-ES1) eller 10 6 (TC71) ES-celler in i gastrocnemiusmuskeln (Figur 2A).
OBS: Även om maximal volym för intramuskulär injections är typiskt 0,05 ml, för detta särskilda förfarande volymökningen till 0,1 ml erfordras på grund av det höga antalet celler injiceras. Detta förfarande har godkänts av Georgetown University Institutional Animal Care och användning kommittén.- För in nålen i gastrocnemiusmuskeln framtill på cirka 30 - 45 graders vinkel i riktning mot tibial krönet / tuberositas.
- Något dra nålen när den vidrör tibial krönet / tuberositas. Injicera långsamt cellsuspensionen lösning, gradvis dra tillbaka nålen att minska trycket.
- Övervaka de injicerade mössen under de kommande 24 timmar för tecken på ångest.
OBS: Utredare med mindre erfarenhet av djurhantering bör överväga anesthetizing möss för tumörcellinjektioner. Vissa institutioner kan kräva bedövning av säkerhetsskäl.
3. Övervakning Primär tumörtillväxt
- Övervaka tillväxten av primära tumörer dAily tills tumörstorleken når den önskade volymen.
OBS: I den aktuella studien var en kalv volym av 250 mm 3 användes som en utgångspunkt av experimentet (Figur 2B). Typiskt tar det cirka 1 - 2 veckor för tumörerna att nå denna storlek.- Mät vaden storlek dagligen med digitala passare via dess mediala-laterala och främre-bakre längder.
- Bestämma kalv volymen av formeln (D xd 2/6) x 3,14, där D är den längre diametern och d är den kortare diametern hos tumörbärande nedre bakdelen.
OBS: Storleken på den normala vuxen mus kalv är av ungefär 40 till 50 mm 3. Dess volym kommer att öka på grund av tumörtillväxt och vid de senare stadierna kalven kommer huvudsakligen består av tumörvävnad.
4. femoralartären Ligering (FAL) för att inducera hypoxi i den tumörbärande bakdelen
- Förbered kirurgiska verktyg som behövs för denna operation: curved eller spetsiga fin pincett, spetsiga tänger, kirurgiska saxar och en nålhållare. Sterilisera dessa verktyg före operation med hjälp av en autoklav eller en varm-pärla autoklav. Dessutom har fina bomullspinnar redo för denna operation.
OBS: Vi rekommenderar att verktygen omsteriliseras på tips som behövs under förfarandet. - Injicera smärtstillande medel (Karprofen 5 mg / kg) subkutant (SQ). För att detektera och bekräfta hypoxi, injicera hypoxyprobe-1 (pimonidazole, 60 mg / kg).
OBS: Denna dos motsvarar 1,5 mg per mus och uppnås genom att injicera 0,1 ml av 15-mg / ml hypoxyprobe lösning i PBS intraperitonealt (IP). Den hypoxyprobe är sedan detekterbar obduktion i djurvävnader genom immunhistokemi. - Placera musen i en anestesiinduktionskammare innehållande 3-5% isofluran i 100% syre vid en flödeshastighet av 1 l / min.
- Låt musen i induktionskammaren tills den inte svarar på yttre stimuli. Sedan bort djuret från den i:nduction kammaren. Placera djuret i ryggläge på en steril duk placeras ovanpå en värmande dyna på rörelseytan. Använda en noskon för att ansluta den till ett kontinuerligt flöde av 1 - 3% isofluran i 100% syre vid en flödeshastighet av 0,8 l / min.
- Applicera sterilt icke-medicinska oftalmologiska salva till varje öga för att förhindra hornhinnan torkning. Att grundligt Vaxning operationsområdet, tillämpa hårborttagningskräm, lämna den på huden i högst 10 sekunder. Torka sedan bort hårborttagningskräm med hjälp av en etanol prep pad.
- Förläng och säkra bakbenen med en tejpbit ungefär 45 grader från mittlinjen av musen. När bakdelen är säker, torka av exponerad hud med 10% povidon / jod kompress / lösning, följt av etanol, upprepa två gånger vardera. För återstoden av det kirurgiska ingreppet, använd en stereo mikroskop för att få en förstorad vy av bakbenen regionen.
- Med hjälp av spetsiga pincett och kirurgisk sax, gör ett snitt av ski ca 1 cm lång, från mitten av låret mot inguinal regionen. Använda saltlösning fuktad fin bomullspinnar, försiktigt borsta bort subkutan fettvävnad som omger lårmuskeln.
- avslöja noga underliggande lårbensartären via trubbig dissektion genom den subkutana fettvävnaden. Stabilisera såret och kirurgiska området för att exponera kärl av mitten av övre muskel.
- Med fin pincett, försiktigt tränga genom den membranösa lårbens slida att exponera neurovaskulära bunt. Med användning av en ren uppsättning fin pincett, dissekera och separera den femorala artären från lårbensvenen och nerv vid den proximala läge nära ljumsken, distalt till det inguinala ligamentet. Var försiktig för att undvika piercing lårbensvenen väggen.
- Efter dissektion, passera en sträng av 6-0 siden sutur under lårbensartären och distalt den gren av den laterala cirkumflex lårbensartären (LCFA). Ockludera den femorala artären med hjälp av dubbla knutar (Figur 3). Stäng snitt med hjälp av 6-0 polypropylen suturer. Efter att ha stängt snittet, injicera SQ 0,5 ml varm koksaltlösning för vätskebalansen terapi. Placera djuret på toppen av en draperad varm dyna i återhämtningen buren och övervaka kontinuerligt tills vaken.
- Övervaka djuren under första 6 h efter operationen och injicera den smärtstillande medel (Karprofen 5 mg / kg, SQ) varje dag under 3 dagar. Ta bort suturer 10 dagar efter operation med hjälp av steril sax.
5. primärtumör Excision av benamputation
OBS: amputera tumörbärande nedre bakdelen när kalven storleken når 250 mm 3 för kontrollgruppen eller 3 dagar efter FAL för den hypoxiska gruppen.
- Raka bort hår från tumörbärande lem från den distala tibia till bäckenregionen med hårklippningsmaskiner under försiktig håller djuret. Injicera smärtstillande medel (Karprofen 5 mg / kg, SQ) före ingreppet.
- Placera musen i en anestesi induktions chamber innehållande 3-5% isofluran i 100% syre vid en flödeshastighet av 1 l / min. Låt musen i induktionskammaren tills den inte svarar på yttre stimuli. Sedan bort djuret från induktionskammaren.
- Placera djuret i den högra laterala liggande ställning på en steril duk placerades på en värmande dyna på rörelseytan. Använda en noskon för att ansluta den till ett kontinuerligt flöde av isofluran 1 - 3% i 100% syre vid en flödeshastighet av 0,8 l / min. Applicera sterilt icke-medicinska oftalmologiska salva till varje öga för att förhindra hornhinnan torkning
- Förbered operationsområdet med 10% povidon / jod kompress / lösning, följt av etanol, upprepa 3 gånger. Tillämpa en steril gasväv (t.ex., operationslakan) över mus för att erhålla ett sterilt kirurgiska området.
- Göra ett mittlårbensomkrets hud snitt, följt av trubbig dissektion och indragning av hud proximalt. Exponera den mediala femorala neurovaskulära pediculus på median sidan av benet, och sedan ligeranära inguinal ligament använder 4-0 belagd (polyglaktin 910) absorber suturmaterial.
- Utför en mid-lårbenstran av muskelgrupper med sax, följt av dissektion av mjukvävnad till coxofemoral leden. Med hjälp av ett ben cutter, utför en mid-lårbens osteotomi. Med hjälp av en steril fin bomullspinne eller en absorbergelatinsvamp, tryck försiktigt osteotomi plats för att minimera och förhindra blödning.
- Stäng liggande huden med hjälp av operationssåret klipp och injicera 0,5 ml varm koksalt SQ för vätskebalansen terapi. Placera djuret på toppen av en draperad varm dyna i återhämtningen buren och övervaka kontinuerligt tills vaken.
- Vid kirurgi, ta vävnadsprover från primära tumörer för RNA, DNA eller proteinisolering, snap frysa i flytande kväve och förvaras vid -80 C. För primär cellodling, ta vävnadsprover i detta steg, som beskrivs i avsnitt 9 nedan. Fäst resterande lem vävnad i 10% neutral formalin för histologi och immunochemisförsök, inklusive hypoxyprobe-1-detektion.
- Övervaka djur för transport, smärta och matkonsumtion under de första 6 timmarna efter operationen, sedan varje dag i 3 dagar. Injicera smärtstillande medel (Karprofen 5 mg / kg, SQ) dagligen under 3 dagar. Ta bort sårklämmor 10 dagar efter amputation använder ett sår klipp remover.
6. Övervaknings möss för förekomst av metastaser
- Observera mössen dagligen och utvärdera dem för kliniska tecken på metastaser åtminstone två gånger i veckan.
- Observera djuren med avseende på förekomst av macrometastases presenterar som massorna som utvecklas på olika platser, typiskt axlar, kontralaterala ben och käkar. För detta ändamål noggrant palpera huvud, nacke och axillära områden, och det kontra bakbenen. Kontrollera om interna metastaser organ via utspänd buk tillsammans med MRI-skanning.
- Kontrollerar förekomsten av lungmetastaser genom att trycka på xyphoid processen (den nedre änden av bröstbenet) med index finger. 24
OBS: Detta tryck minskar diafragma andning kapacitet. Möss med avancerade lungmetastaser visar tecken på andnöd manifesteras genom mödosam andning. - Observera djuren för neurologiska symtom såsom ben förlamning och ataxi tyder metastaser till det centrala nervsystemet.
- Övervaka möss minst en gång per vecka för viktminskning, som en indikation på potentiell sjukdomsprogression. Viktminskning mer än 15% av pre-procedur vikt anses vara en human slutpunkt.
7. Magnetisk resonanstomografi (MRI) för att detektera Metastaser
- Utför MRI för att upptäcka metastaser vid önskade tidpunkter. 18
OBS: I den aktuella studien var en 7-Tesla horisontell spektrometer används. MRI utfördes på dag 15 och 35 efter amputation för SK-ES1 celler och på dag 15 för TC71 celler. - Placera musen i en anestesiinduktion chamber som innehåller 1 - 3% isofluran i en gasblandning av 30% syre och 70% kväveoxid.
- Låt musen i induktionskammaren tills den inte svarar på yttre stimuli. Sedan bort djuret från induktionskammaren.
- Överför sövda musen på en stereotaktisk hållare med andning och temperatur monitorization med kontinuerlig tillförsel av 1,5% isofluran och 30% kväveoxid. Applicera sterilt icke-medicinska oftalmologiska salva till varje öga för att förhindra hornhinnan torrhet. Bild djuret antingen en 40 eller 23 mm Bruker mus volympole för hela kroppen eller hjärnröntgen, respektive.
- Använda en två-dimensionell, T2-viktad RARE sekvens: TR = 3000 ms, TE = 24 ms, matris = 256, FOV = 4,35 x 3,0 cm, snittjocklek = 0,5 mm, RARE faktor = 4 och är i genomsnitt = 4. 18
- Placera djuret i en varm återhämtning bur och övervaka kontinuerligt tills vaken.
OBS: Mössen återhämtar sig snabbt sedan en ytlig plan anestesi används. Övervaka djur under de första 6 h efter avbildning för att se till att det inte finns några negativa effekter av bedövningen.
8. dödshjälp och obduktion
- Avliva möss när djuren med metastaser detekterbara med MRI och / eller kliniska symptom på sjukdomsprogression.
OBS: I den aktuella studien, avlivades mössen på dag 50 och 25 efter amputation för djur som bär SK-ES1 och TC71 xenografter, respektive. I vissa fall var nödvändigt tidigare eutanasi på grund av en hög metastas börda. - Avliva mössen genom exponering för CO2 vid 1,5 L / min (CO2 vid 10-30% av den dödshjälp kammarvolymer / min). För att säkerställa djurens död, utföra halsdislokation efter CO2 exponering.
- Bespruta hela mus med 70% etanol och placera den i dragskåp med laminärt flöde. Samla blodet genom hjärtat punktering med hjälp av en 25 G ½ nål med en 1 ml spruta och överföring till en blodsamling tuvara innehållande 2 mg EDTA.
- Samla följande vävnader: mjälte, binjurar, äggstockar, njurar, lever, lungor, hjärna, höger ben, benmärg från både överarmsben och ryggrad, liksom makroskopiska metastaser förekommer på andra platser. 25,26
- Fäst hälften av varje vävnad i 10% neutral formalin för histologi och immun, inklusive hypoxyprobe-en upptäckt. Snap frysa den andra hälften i flytande kväve och förvara vid -80 ˚C för RNA, DNA eller proteinisolering. 25,26 För primär cellodling, ta vävnadsprover som beskrivs i avsnitt 9 nedan.
9. Primär Cell Culture
- För att utföra primär cellodling, dissekera vävnader från den amputerade kroppsdelen (avsnitt 5 ovan) eller under obduktion (avsnitt 8 ovan) under sterila förhållanden i ett laminärt flöde huva.
- Förbered cellodlingsmedia lämpliga för cellinje som användes för orthotopic injektioner, kompletterat med penicillin (200 enheter / ml),streptomycin (200 | ig / ml), fungizon (1 | ig / ml), och 0,2% mykoplasma profylaktisk antibiotika. Placera 2,5 ml av den primära odlingsmedium in i en 6-cm cellkulturplatta.
- Välj livskraftiga tumörvävnadsområden från primära tumörer eller metastaser, och sedan isolera två till tre segment på 2-3 mm vardera med hjälp av steril sax.
OBS: Livskraftiga tumörvävnad brukar finnas på kanterna av tumören och kan särskiljas från nekros genom sin rosa eller rödaktig färg, betydande lyster och övergripande våt utseende. Däremot är nekrotisk vävnad vanliga i centrum av tumören och presenterar som en vitaktig / grädde färg massa med en matt, ostliknande utseende. 27 - Överför de isolerade segmenten till en 6-cm cellkulturplatta innehållande primär odlingsmedium beskrivs i steg 9,2.
- Kultur celler under standardbetingelser, som beskrivs i avsnitt 1 (OBS) och 9,2. 18,28 Kontrollera kulturen för cellulära utväxt som härrör från vävnadsbitar, WHich bör observeras inom några dagar. När cellerna når sammanflödet, trypsinize och sprida dem enligt standardcellodlingstekniker.
OBS: Den primära cellkulturen kan därefter användas för att utvärdera tillväxt och metastatiska egenskaperna hos de celler härledda från kontroll- och hypoxiska tumörer, såväl som deras molekylära egenskaper, såsom tidigare beskrivits. 18
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Efter injektion av ES-celler in i gastrocnemiusmuskeln är de primära tumörerna tilläts växa till en kalv storlek på 250 mm 3 (figur 1, 2). Den tid som krävs för tumörerna att nå denna volym varierar vanligtvis från 10 - 15 dagar för TC71 till 20-25 dagar för SK-ES1 xenografter, respektive. Tumörer vid en kalv volym av 250 mm 3 uppvisar en relativt låg nivå av endogen hypoxi (ca 3% av tumörvävnad), baserat på hypoxybrobe-1 (pimonidazole) färgning (figur 4A, C). Viktigt är i dessa kontrolltumörerna var positiv färgning för hypoxyprobe-1 observerades endast i de områden av fysiologisk hypoxi, dvs, i tumörceller som är på avstånd från vaskulaturen och börja att undergå celldöd (Figur 4A). Sådan färgning uppvisar en karakteristisk "air-brush" mönster, medan huvuddelen av frisk tumörvävnad förblir negativ för hypoxyprobe-1. <sup> 6 Däremot FAL utförs vid detta stadium skapar djupgående hypoxi, vilket framgår av den positiv färgning för hypoxyprobe-1 observerades i den stora majoriteten av tumörcellerna vid 4 h efter FAL (Figur 4B). Noterbart är de hypoxyprobe-1-positiva tumörceller också observerats i nära anslutning till blodkärlen och det karaktäristiska mönstret av fysiologisk hypoxi går förlorad. I dessa FAL-behandlade tumörer, 73% av vävnad består av hypoxiska tumörceller (Figur 4C). Tumörvävnaden uppvisar också de första tecknen på hypoxi-inducerad skada, inklusive cellkrympning och lös struktur (Figur 4B).
Effektiviteten av FAL stöddes ytterligare av det fullständig inhibition av primärtumörtillväxt. Under perioden 3 dagar mellan FAL och amputation, gjorde storleken på primära tumörer inte öka (Figur 5A). Däremot primära tumörer från möss utsattes för sken surgery fortsatte att växa snabbt och nådde en volym av cirka 650 mm 3, således härma tillväxten av tumörer i kontrollmöss som inte utsatts för kirurgi (Figur 5A). 18 I linje med dessa uppgifter, avslöjade histopatologisk analys stora områden av nekros i FAL-behandlade primära tumörer skördas 3 dagar efter operation (Figur 5B). Ändå fanns det grupper av livskraftiga tumörceller som finns inuti tumörvävnaden, som vanligtvis finns vid kanterna av tumören, nära vaskulaturen (Figur 5B). För att undersöka den syresättning statusen för dessa celler använde vi hypoxyprobes, som aktiveras i levande hypoxiska celler, därefter vinner förmågan att kovalent binda till proteiner inom dessa celler. 29 Som sådana dessa sönder fungera som en permanent markör för de celler som upplevt hypoxi vid någon tidpunkt. Således, för att detektera förändringar i syrenivåer av tumörcellerna under hela varaktigheten av experiment, använde vi två olika hypoxyprobes som kan detekteras oberoende av immunohistokemi. Sonderna administrerades vid två tidpunkter - omedelbart före FAL (hypoxyprobe-1) och före amputation (hypoxyprobe-2, CCI-103F) - och deras lokalisering detekterades i tumörer skördades 3 dagar efter FAL (Figur 1). Hypoxyprobe-1, som var närvarande i systemet vid tiden för FAL, markerade en majoritet av tumörcellerna, eftersom vävnaden blev allvarligt hypoxisk (figur 5C). Denna märkning är också tydligt i områden med nekros / apoptos, eftersom dessa celler fortfarande levde vid tidpunkten för FAL och kan därför permanent binda hypoxyprobe-1, som visas i figur 4B. I motsats härtill hypoxyprobe-2 administrerades 2 dagar efter FAL endast färgade viabla celler, såsom cellerna i nekrotiska områden var redan döda och oförmögen att aktivera sonden vid tidpunkten för dess administration (figur 5D). Interestingly, vi också observed livsduglig tumörvävnad intill kärlsystemet som var initialt hypoxiska (hypoxyprobe-1-positiv), men tillräckligt syresatt vid den senare tidpunkten (hypoxyprobe-2-negativ) (Figur 5C, D). Denna upptäckt är i överensstämmelse med tidigare rapporter indikerar att säkerheter fartyg beroende vävnad reperfusion åter blodflödet i bakbenen 3 dagar efter FAL. 20 • De livskraftiga tumörceller som finns kvar i tumörvävnaden 3 dagar post-FAL var mycket invasiva, vilket framgår av deras massiva intravasering på vaskulariserade kanterna av tumören (Figur 5E). Några av cellerna i kärllumen var positiva för hypoxyprobe-1, vilket tyder på att de hade blivit hypoxisk på FAL, men förblev livskraftiga. Kollektivt antyder dessa data att vävnads reperfusion efter svår hypoxi kan underlätta läckage av celler från primära tumörer.
Baserat på pilotförsök, utbredda metastaser vardetekterbar genom MRI cirka 35 dagar efter amputation för SK-ES1 xenografter, medan TC71 celler typiskt metastaserat inom 15 dagar. Följaktligen för jämförande analys av metastaser latens och frekvens, var MRI utfördes på dag 15 och 35 efter amputation för djur som bär SK-ES1 tumörer medan en avbildning i dag 15 var tillräcklig för möss med TC71 tumörer. Eutanasi utfördes vid dag 50 och dag 25 för djur med SK-ES1 och TC71 xenografter, respektive. Som tidigare rapporterats, de vanligaste typerna av metastaser ingår mjukdels massorna i skulderområdet, samt benmetastaser till kontralaterala ben, maxillary område och ryggrad för SK-ES1 celler och lunga och bäckentumörer för TC71. 18 Dessutom, ofta metastaser till inre organ, inklusive binjurar, lungor och lever, samt benmärgsinfiltration, observerades i möss med FAL-behandlade SK-ES1 xenotransplantat (Figur 6). I allmänhet, hypoxi ökade signifikantden totala (SK-ES1) eller platsspecifik (TC71) frekvens och mångfald av metastaser i båda cellinjerna. Emellertid utvecklade TC71 xenografter också ofta återkommande massorna vid platsen för amputation (25% för kontroll och 40% för FAL-behandlade tumörer), såsom tidigare beskrivits för de stora TC71 primära tumörer. 18
Vävnaderna från kontroll och FAL-behandlade primära tumörer och metastaser kan också vara en källa till material för omfattande molekylära analyser som syftar till att identifiera hypoxi aktiverade involverade i ES spridning. Till exempel, observerade vi signifikanta skillnader i metabolomic profiler för kontroll och hypoxiska primära tumörer (data visas ej). Vi kunde också framgångsrikt isolera flera cellinjer från alla ovanstående vävnaderna. I många fall är de celler härledda från FAL-behandlade tumörerna uppvisade märkbara förändringar i morfologi, i jämförelse med de ursprungliga cellerna och de som är härledda från kontroll tumors (Figur 7A). Renheten av dessa cellkulturer bekräftades genom positiv immunofärgning för Ewing sarkom markör, CD99 (figur 7B). Dessutom hade 100% av cellerna i de etablerade cellinjer en positiv signal i fluorescens in situ-hybridisering (FISH) med humana centro prober, ofta uppvisar ökad kromosomantal (figur 8A). Den mänskliga ursprunget till dessa celler bekräftades ytterligare genom analys av de metafaskromosomer (Figur 8B) som uppvisade cytogenetiska omlagringar som tidigare beskrivits för SK-ES1-celler i både den ursprungliga cellinjen och celler härledda från FAL-behandlade tumörerna (Figur 8B). 30
Figur 1. Översikt över ES Hypoxi Model. ES-celler (1 - 2 x 10 6) injicerades i gastrocnemius musklerna i SCID / beige-möss. När väl de resulterande primära tumörer nådde en kalv volym av 250 mm 3 mössen delas in i två experimentgrupper. Möss från kontrollgruppen injicerades med hypoxyprobe-1 (HP-1), och de primära tumörerna skars ut för lem amputation. Möss från den hypoxiska gruppen injicerades med hypoxyprobe-1 och underkastades därefter femoralartären ligering (FAL). Två dagar senare injicerades mössen med hypoxyprobe-2 (HP-2), och sedan de tumörbärande lemmar amputerade tre dagar efter FAL. Djur från båda grupperna övervakades genom periodisk magnetisk resonanstomografi (MRT). När metastaser blev uppenbart bygger på bildbehandling och kliniska tecken, mössen avlivades och närvaron av metastaser bekräftades genom obduktion och histopatologiska analyser. Tiden för tumörtillväxt, avbildning och eutanasi är baserat på celltillväxthastighet och metastas SK-ES1. Notera att medan hypoxyprobe-2 var nödvändigt att fastställa sättet och visuAlize förändringar i hypoxi nivåer under perioden mellan FAL och lem amputation, är dess användning inte är nödvändig för den verkliga experiment. Därför är det här steget inte ingår i protokollet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Primär tumörtillväxt. A. magnetresonansbild (MRI) av en intakt bakbenen. Den röda pilen visar platsen och riktningen för tumörcellen orthotopic injektion. B. primärtumör på en kalv volym på cirka 250 mm 3 växer i gastrocnemius (röd kontur). Röda pilspetsar visar platser ben förstörelse. T - tibia. Snälla Cslicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Platsen för lårbensartären Ligation. Ett representativt obduktion röntgen angiografi av en 129S1 / SVJ-mus perfusion med bariumsulfat omedelbart efter ligeringen visas för att markera närvaron av redan existerande kollaterala kärl. Observera att medan bilden visar två ligeringar (XS), ett distalt sido cirkumflex lårbensartären (LCFA) (rött X) och en annan proximal till Genu artären (vit X), tumör hypoxi modell som används endast den proximala ligation, nära inguinal ligament och distalt om LCFA (rött X). Regionen av säkerheter fartygsutveckling visas som beskrivs (svaga fartyg), och de identifieras genom sin slingrande, kork-skruv form. Klicka hanre att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Tumör Hypoxi inducerad av lårbensartären Ligation (FAL). A. En kontrolltumör på en kalv volym av 250 mm 3 färgades genom hematoxylin & eosin (H & E) och immunfärgades för hypoxyprobe-1 (brun). Hypoxyprobe-1 immunfärgning enbart observerats i de områden av fysiologisk tumörhypoxi, där tumörcellerna avlägsna från kärlsystemet berövas syre och börja undergå celldöd. B. FAL-behandlade primära tumören vid en liknande storlek skördas 4 h efter ligering och färgades med H & E och immunfärgades för hypoxyprobe-1. Majoriteten av tumörceller är mycket positivt för hypoxyprobe-1, inklusive de i omedelbar närhet till vaskulaturen. V - blodkärl. C. Området med positiv färgning för hypoxyprobe-1 var quantiferat i kontroll och FAL-behandlade tumörer med hjälp av ImageJ programvara. Felstaplar representerar SEM. *** - P <0,001 Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5. Effekt av lårbensartären Ligation (FAL) på primärtumörtillväxt. A. Primär tumörtillväxt under perioden 3 dagar mellan kirurgi och amputation i i träda (n = 4) och skenkirurgi-behandlade (n = 4) djur, jämfört med intakta kontrolltumörerna (n = 6). Felstaplar representerar SD. *** - P <0,001, jämfört med både kontroll- och skenkirurgi-behandlade tumörer. B. Hematoxylin och eosin (H & E) färgning av en FAL-behandlade tumören skördas 3 dagar efter ligering avslöjar utbredd nekros inom tumören. Den röda konturen anger ett område av livskraftiga tumör cells i omedelbar närhet av en i hög grad vaskulariserade region perfuserades 3 dagar post-FAL. C. FAL-behandlade tumörvävnad skördades 3 dagar efter operation immunostained för hypoxyprobe-1. Hypoxyprobe-1 injicerades före FAL. Därför indikerar positiv immunfärgning förekomsten av omfattande vävnadshypoxi omedelbart efter operationen. D. Hypoxyprobe-2 injicerades 2 dagar efter FAL, och vävnaden uppsamlas 24h senare, vid amputation. Positiv hypoxyprobe-2 färgning identifierar hypoxi vid tidpunkten för amputation. Den röda pilen visar vävnad som är hypoxisk vid båda tidpunkterna medan den gula pilen anger ett område i anslutning till kärl som var hypoxisk omedelbart efter FAL (hypoxyprobe-1-positiv), men negativa för hypoxyprobe-2 vid tiden för excision, som är ett tecken på vävnads reperfusion. Bristen på hypoxyprobe-2 färgning i nekrotiska områden tyder på att cellerna i denna region inte var lönsamt vid tidpunkten för dess administration och därförinte aktivt binda sonden. Färgningen presenteras i paneler BD utfördes på serievävnadssnitt. E. intravasering i FAL-behandlade tumör 3 dagar post-FAL. Immunfärgning identifierar livsdugliga celler positivt för hypoxyprobe-1 inom kärllumen (röd pil). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6. Exempel på metastaser i möss med FAL-behandlade SK-ES1 tumörer. Metastaserna upptäcktes av magnetisk resonanstomografi (MRT) och bekräftades genom obduktion och histopatologiska analyser (hematoxylin & eosin färgning, H & E). M - metastas. Klicka här för att se en större vers ion av denna siffra.
Figur 7. Kännetecken av celler som härrör från FAL-behandlade primära tumörer. A. Livsdugliga cellkulturer upprättades från vävnader skördas från kontroll och hypoxiska primära tumörer och deras morfologi jämfördes med de ursprungliga cellinjer som används för inledande orthotopic injektioner. Cellerna härledda från FAL-behandlade primära tumörer uppvisar dramatiska förändringar i deras storlek och morfologi. Representativa bilder av de ursprungliga och primära tumörhärledda SK-ES1 celler visas. B. Representativa bilder av celler härledda från FAL-behandlade tumörer immunfärgades för ES markör, CD99, och motfärgades med den DNA-bindande färgämne, DAPI. Alla celler är CD99-positiva, inklusive hypertrofiska celler innehållande utvidgade kärnor (vit pil). OAD / 54.532 / 54532fig7large.jpg "target =" _blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 8. kromosomanalys av celler från FAL-behandlade tumörer. A. Fluorescens in situ hybridisering (FISH) analys i interfasceller visar två kärnor med signaler för mänsklig centro 4 sond. Den stora kärnan med fyra signaler indikerar en tetraploid (4n) cell (vit pil). B. FISH-analys i representativa metafaser för SK-ES1 ursprungliga cellinjen och av cellen härledd från FAL-behandlade primära tumören. Röda pilarna indikerar inv (1) (p13.1q21), en icke-slumpmässig cytogenetisk omlagring karakteristisk för SK-ES1 celler. Röda signaler: människa centro 4 sond; Gröna signaler i de ursprungliga SK-ES1 celler: NPY5R sond på kromosom 4q32.2.e.com/files/ftp_upload/54532/54532fig8large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vår modell innebär en jämförelse av metastaser i två experimentella grupper - en kontrollgrupp, där tumörer får utvecklas i bakbenet, följt av amputation på att nå en kalv volym av 250 mm 3, och en hypoxi-exponerade gruppen, där tumor- bärande bakben underkastas FAL med samma volym, följt av amputation 3 dagar senare. Även om det i dessa experiment FAL-behandlade tumörer amputerade med en viss fördröjning, jämfört med kontrolltumörer, inte deras storlek inte öka under perioden 3 dagar mellan ligation och amputation. Därför möjliggör detta tillvägagångssätt jämförelsen av metastatisk potential mellan tumörer av jämförbara storlekar men med dramatiskt olika nivåer av hypoxi. Däremot använder skenkirurgi, skulle en vanligen använd kontroll för kirurgiska ingrepp, följt av 3 dagar tumörtillväxt resultera i betydande skillnader i tumörstorlek mellan försöksgrupperna, med skenkirurgi-treated primära tumörer som har en hög grad av endogen hypoxi. Baserat på pilotförsök, inte sham operation inte signifikant påverka tumörtillväxt eller dess hypoxi nivåer och kan därmed elimineras ur experimentell design. Istället är strategin att jämföra tumörer av liknande storlek och olika hypoxi nivåer en mycket relevant modell för att belysa effekterna av hypoxi på spridningen av sjukdomen. Viktigt, till skillnad från tidigare in vitro-studier, ger detta tillvägagångssätt för omfattande utvärdering av pro-metastaserande åtgärder hypoxi i en naturlig tumör mikromiljö. 4-6
Målet för den experimentella designen var att uppnå en låg basal nivå av metastaser som skulle göra det möjligt för detektion av en hypoxi-inducerad stimulerande effekt på deras bildning. Vi konstaterade att en kalv storlek på 250 mm 3 vid FAL och amputation var optimalt för SK-ES1 primära tumörer. Dock kommer denna parameter måste optimeras för ea ch cellinje, beroende på deras metastatisk potential och lokal invasiv. För tumörer med högre metastatisk potential, kan den primära tumörstorleken vid amputation behöva minskas. Till exempel, TC71 tumörer uppvisar en hög lokal invasivitet manifesteras genom frekvent bildning av återkommande tumörer på platsen för amputation. 18 När sådana massor utvecklas, djuren måste undantas från analyser, eftersom det inte skulle vara klart om efterföljande fjärrmetastaser härstammar från primära tumörer eller av återkommande tumörer som ofta växer snabbt och uppvisar höga nivåer av endogen hypoxi. Från tidigare erfarenhet, oberoende av cellinje som användes, 150 mm 3 är den minimala tumörbärande kalv storlek som kan mätas på ett tillförlitligt och normaliseras. Om minskning av tumörstorleken vid FAL och amputation inte eliminerar återkommande tumörer eller minska basal metastas hastighet som är tillräckligt, kan den speciella cellinjen i fråga inte vara lämpliga för dessa experiment.
ve_content "> Likaså är det viktigt att fastställa tidslinjen för MRI och dödshjälp för varje enskild cell linje, beroende på latensen av dess metastaser. Noterbart kan operationssåret klipp som stör MRI tas bort tidigast 10 dagar efter avslutad kirurgi, och denna period måste ibland förlängas på grund av komplikationer med läkning. Således, i denna studie har vi etablerat dag 15, eftersom tiden för den första MRI.En annan viktig faktor i denna modell är att upprätthålla en nivå av hypoxi förmåga att inducera metastaser processer utan att orsaka fullständig tumörnekros, vilket skulle förhindra tumörcellspridning. Även om vi inte har stött på detta problem i denna studie, om det behövs, svårighetsgraden av hypoxi kan regleras genom att förändra den exakta platsen och antalet ligations i förhållande till de grenar av lårbensartären, såsom LCFA och genu artär. 20 Sålunda kommer en ligering proximalt till LCFA skapa mer allvarlig ischemi i hindlimb cirkulation, vilket ökar de hypoxiska betingelser i den distala benet. Däremot kommer ligering distalt efterföljande grenar av lårbensartären minska den resulterande hypoxi i den nedre bakbenen.
Viktigt, det fanns inga allvarliga biverkningar av kombinerade FAL och amputations förfaranden och inga dödsfall i samband med operationer, som tidigare rapporterats för dessa tekniker utföras separat. 18-20 Således är framgången av metoden huvudsakligen begränsad av hastigheten för tumör take vid den primära platsen och frekvensen av återkommande tumörer, av vilka båda är cellinje-beroende.
Som hypoxi har varit inblandad som en pro-metastaserande faktor i många tumörtyper, kan detta tillvägagångssätt också vara lämpliga för direkt testa dess effekter och att definiera dess mekanismer av åtgärder i andra sarkom som utvecklas i armar och ben. 23 Vidare kan en liknande strategi tillämpas på andra maligniteter växer i orthotopic miljöer wed en väldefinierad blodtillförsel vägen. Således, med lämpliga modifikationer, kan denna modell vara ett användbart verktyg i forskning utanför området ES biologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SK-ES1 Human Ewing sarcoma (ES) cells | ATCC | ||
| TC71 Human ES cells | Kindly provided from Dr. Toretsky | ||
| McCoy's 5A (modified) Medium | Gibco by Life Technologies | 12330-031 | |
| RPMI-1640 | ATCC | 30-2001 | |
| PBS | Corning Cellgro | 21-040-CV | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442-500mL | |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1x) | Gibco by Life Technologies | 25200-056 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco by Life Technologies | 15140-122 | |
| Fungizone® Antimycotic | Gibco by Life Technologies | 15290-018 | |
| MycoZap™ Prophylactic | Lonza | VZA-2032 | |
| Collagen Type I Rat tail high concetration | BD Biosciences | 354249 | |
| SCID/beige mice | Harlan or Charles River | 250 (Charles River) or 18602F (Harlan) | |
| 1 ml Insulin syringes with permanently attached 28 G ½ needle | BD | 329424 | |
| Saline (0.9% Sodium Chloride Injection, USP) | Hospira, INC | NDC 0409-7984-37 | |
| Digital calipers | World Precision Instruments, Inc | 501601 | |
| Surgical Tools | Fine Science Tools | ||
| Rimadyl (Carprofen) Injectable | Zoetis | ||
| Hypoxyprobe-1 (Pimonidazole Hydrochloride solid) | HPI, Inc | HP-100mg | |
| hypoxyprobe-2 (CCI-103F-250 mg) | HPI, Inc | CCI-103F-250mg | |
| Povidone-iodine Swabstick | PDI | S41350 | |
| Sterile alcohol prep pad | Fisher HealthCare | 22-363-750 | |
| LubriFresh P.M. (eye lubricant ointment) | Major Pharaceuticals | NDC 0904-5168-38 | |
| VWR Absorbent Underpads with Waterproof Moisture Barrier | VWR | 56617-014 | |
| Oster Golden A5 Single Speed Vet Clipper with size 50 blade | Oster | 078005-050-002 (clipper), 078919-006-005 (blade) | |
| Nair Lotion with baby oil | Church & Dwight Co., Inc. | ||
| Silk 6-0 | Surgical Specialties Corp | 752B | |
| Prolene (polypropylene) suture 6-0 | Ethicon | 8680G | |
| Vicryl (Polyglactin 910) suture 4-0 | Ethicon | J386H | |
| Fisherbrand Applicators (Purified cotton) | Fisher Scientific | 23-400-115 | |
| GelFoam Absorbable Dental Sponges - Size 4 | Pfizer Pharmaceutical | 9039605 | |
| Autoclip Wound Clip Applier | BD | 427630 | |
| Stereo Microscope | Olympus | SZ61 | |
| Autoclip remover | BD | 427637 | |
| Aound clip | BD | 427631 | |
| MRI 7 Tesla | Bruker Corporation | ||
| Paravision 5.0 software | Bruker Corporation | ||
| CO2 Euthanasia system | VetEquip | ||
| 25 G 5/8 Needle (for heart-puncture) | BD | 305122 | |
| 0.1 ml syringe (for heart-puncture) | Terumo | SS-01T | |
| K3-EDTA Micro tube 1.3 ml | Sarstedt | 41.1395.105 | |
| 10% Neutral Buttered Formalin | Fisher Scientific | SF100-4 |
References
- Lessnick, S. L., Ladanyi, M. Molecular pathogenesis of Ewing sarcoma: new therapeutic and transcriptional targets. Annu Rev Pathol. 7, 145-159 (2012).
- Ladenstein, R. Primary disseminated multifocal Ewing sarcoma: results of the Euro-EWING 99 trial. J Clin Oncol. 28, 3284-3291 (2010).
- Dunst, J., Ahrens, S., Paulussen, M., Burdach, S., Jurgens, H. Prognostic impact of tumor perfusion in MR-imaging studies in Ewing tumors. Strahlenther Onkol. 177, 153-159 (2001).
- Aryee, D. N. Hypoxia modulates EWS-FLI1 transcriptional signature and enhances the malignant properties of Ewing's sarcoma cells in vitro. Cancer Research. 70, 4015-4023 (2010).
- Knowles, H. J., Schaefer, K. L., Dirksen, U., Athanasou, N. A. Hypoxia and hypoglycaemia in Ewing's sarcoma and osteosarcoma: regulation and phenotypic effects of Hypoxia-Inducible Factor. BMC cancer. 10, 372 (2010).
- Tilan, J. U. Hypoxia shifts activity of neuropeptide Y in Ewing sarcoma from growth-inhibitory to growth-promoting effects. Oncotarget. 4, 2487-2501 (2013).
- Franzius, C. Successful high-resolution animal positron emission tomography of human Ewing tumours and their metastases in a murine xenograft model. Eur J Nucl Med Mol Imaging. 33, 1432-1441 (2006).
- Hauer, K. DKK2 mediates osteolysis, invasiveness, and metastatic spread in Ewing sarcoma. Cancer Research. 73, 967-977 (2012).
- Manara, M. C. Preclinical in vivo study of new insulin-like growth factor-I receptor--specific inhibitor in Ewing's sarcoma. Clin Cancer Res. 13, 1322-1330 (2007).
- Scotlandi, K. Murine model for skeletal metastases of Ewing's sarcoma. J Orthop Res. 18, 959-966 (2000).
- Vormoor, J. Establishment of an in vivo model for pediatric Ewing tumors by transplantation into NOD/scid mice. Pediatr Res. 49, 332-341 (2001).
- Picarda, G. Preclinical evidence that use of TRAIL in Ewing's sarcoma and osteosarcoma therapy inhibits tumor growth, prevents osteolysis, and increases animal survival. Clin Cancer Res. 16, 2363-2374 (2010).
- Vormoor, B. Development of a preclinical orthotopic xenograft model of ewing sarcoma and other human malignant bone disease using advanced in vivo imaging. PLoS One. 9, e85128 (2014).
- Wang, Y. Platelet-derived growth factor receptor beta inhibition increases tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL) sensitivity: imatinib and TRAIL dual therapy. Cancer. 116, 3892-3902 (2010).
- Wang, Y. X. Inhibiting platelet-derived growth factor beta reduces Ewing's sarcoma growth and metastasis in a novel orthotopic human xenograft model. In Vivo. 23, 903-909 (2009).
- Odri, G. A. Zoledronic acid as a new adjuvant therapeutic strategy for Ewing's sarcoma patients. Cancer Research. 70, 7610-7619 (2010).
- Merchant, M. S. Interferon gamma enhances the effectiveness of tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand receptor agonists in a xenograft model of Ewing's sarcoma. Cancer Research. 64, 8349-8356 (2004).
- Hong, S. H. High neuropeptide Y release associates with Ewing sarcoma bone dissemination - in vivo model of site-specific metastases. Oncotarget. 6, 7151-7165 (2015).
- Lee, E. W. Neuropeptide Y induces ischemic angiogenesis and restores function of ischemic skeletal muscles. J Clin Invest. 111, 1853-1862 (2003).
- Tilan, J. U. Platelet neuropeptide Y is critical for ischemic revascularization in mice. FASEB J. , (2013).
- Toffoli, S., Michiels, C. Intermittent hypoxia is a key regulator of cancer cell and endothelial cell interplay in tumours. The FEBS journal. 275, 2991-3002 (2008).
- Das, B. Hypoxia enhances tumor stemness by increasing the invasive and tumorigenic side population fraction. Stem cells (Dayton, Ohio). 26, 1818-1830 (2008).
- Arndt, C. A., Rose, P. S., Folpe, A. L., Laack, N. N. Common musculoskeletal tumors of childhood and adolescence. Mayo Clin Proc. 87, 475-487 (2012).
- Mendoza, A. A novel noninvasive method for evaluating experimental lung metastasis in mice. J Am Assoc Lab Anim Sci. 52, 584-589 (2013).
- Feldman, D. B., Seely, J. C. Necropsy Guide: Rodents and the Rabbit. , CRC Press. (1988).
- Parkinson, C. M. Diagnostic necropsy and selected tissue and sample collection in rats and mice. J Vis Exp. , (2011).
- Raymond, A. K., Lazar, A. J. Bone Sarcoma. PP, L. in, S, P. atel , Springer. (2013).
- Dietel, M., Arps, H., Gerding, D., Trapp, M., Niendorf, A. Establishment of primary cell cultures: experiences with 155 cell strains. Klin Wochenschr. 65, 507-512 (1987).
- Varghese, A. J., Gulyas, S., Mohindra, J. K. Hypoxia-dependent reduction of 1-(2-nitro-1-imidazolyl)-3-methoxy-2-propanol by Chinese hamster ovary cells and KHT tumor cells in vitro and in vivo. Cancer Research. 36, 3761-3765 (1976).
- ATCC. , http://www.atcc.org/products/all/HTB-86.aspx#characteristics (2014).
