Introduction
يوينغ ساركوما (ES) هي خباثة العدوانية التي تؤثر على الأطفال والمراهقين. 1 الأورام تنمو في الأنسجة الرخوة والعظام، عادة في الأطراف. في حين وجود نقائل هو أقوى عامل النذير سلبي واحد للمرضى وفاق، لا تزال الآليات الكامنة وراء تنميتها واضحة. 2 ورم نقص الأكسجة هو واحد من العوامل القليلة المتورطين في ES التقدم. في المرضى الذين فاق، ويرتبط وجود مناطق غير perfused داخل أنسجة الورم مع سوء أحوال الطقس. 3 في المختبر، نقص الأكسجين يزيد من غزو خلايا ES ويطلق تعبير عن الجينات الموالية للالنقيلي. 4-6 ومع ذلك، على الرغم من هذه الأسطر من الأدلة، لا يوجد دليل مباشر على وفاق الناجم عن نقص الأكسجة تطور وانتشار موجودا. وعلاوة على ذلك، فإن الآليات التي نقص الأكسجة يمارس هذه الآثار هي، في الوقت الحاضر، غير معروفة. ومن هنا، قمنا بإنشاء نموذج في الجسم الحي لملء الفجوة بين القائمة في بيانات المختبر وobser السريريالأرصاد. هذا النظام النموذجي تمكن من اختبار مباشر من آثار نقص الأكسجين على الأورام التي تحدث في بيئتها الطبيعية، وذلك باستخدام التصوير بالرنين المغناطيسي (MRI) لمتابعة تطور الورم والانبثاث في الجسم الحي في تركيبة مع خارج الحي التحليلات المرضية والجزيئية (الشكل 1).
منذ لا يوجد نموذج المعدلة وراثيا المعمول بها ES متاح حاليا، فإن الدراسات المجراة على خصائص النقيلي من هذه الأورام تعتمد على حقن الخلايا البشرية في الفئران المناعة. في حين أن استخدام الحيوانات ضعف المناعة قد نقلل من تأثير على الجهاز المناعي على تطور المرض، والقدرة على استخدام الخلايا البشرية يزيد ترجمتها من هذه الدراسات. ومن بين النماذج طعم أجنبي المختلفة، والحقن النظامية إلى الوريد الذيل هي أسهل للأداء، ولكنها حذفت الخطوات الأولية من ورم الخلايا دخول الوعاء والهروب من الموقع الرئيسي للنمو. 7-12 من ناحية أخرى، orthoto الموافقة المسبقة عن علم xenografting، الذي ينطوي على حقن الخلايا السرطانية في العظام (عظم الفخذ، الضلع) أو العضلات، هو أكثر تحديا من الناحية الفنية، ولكن أيضا أكثر بيولوجيا ذات الصلة لسرطان البشري. 13-16 القتل الرحيم الحيوانات ومع ذلك، في الماضي، وارتفاع معدلات المراضة المرتبطة بالنمو السريع للأورام الأولية وكثيرا ما استلزم قبل تطور ورم خبيث. في هذه الدراسة، قمنا بتوظيف نموذج المحددة سابقا من حقن الخلايا في عضلة الساق تليها استئصال الورم الرئيسي مما أدى جنبا إلى جنب مع مراقبة الطولي للتطور المنتشر طريق التصوير بالرنين المغناطيسي. 17،18 مثل هذه الحقن في عضلة الساق على مقربة من الساق تسمح لنمو الورم في بيئتين ES الطبيعية - العضلات والعظام - وينتج عن النقائل البعيدة إلى الأماكن المتضررة عادة في البشر. 18 وبالتالي، فإن هذا النموذج يلخص بدقة العمليات النقيلي التي تحدث في المرضى الذين يعانون ES أثناء تطور المرض.
خيمة "> توطين الأورام الأولية في hindlimb أقل كما يسهل مراقبة دقيقة من وصول الدم إلى الأنسجة السرطانية. ربط الشريان الفخذي (فال) هي تقنية راسخة المستخدمة في البحوث الأوعية الدموية لمنع تدفق الدم إلى المناطق البعيدة المحطة والتحقيق في الأوعية الدموية الأنسجة استجابة لنقص التروية. 19،20 الأهم من ذلك، ويتبع الانخفاض الأولي في تدفق الدم عن طريق فتح السفينة الجانبية وضخه الأنسجة لوحظ بعد حوالي 3 أيام فال. 20 وهكذا، عندما أجريت في أحد أطرافه الورم الحاملة، هذا النموذج بإعادة الأحداث نقص الأكسجة / ضخه التي تحدث بشكل طبيعي في الأورام التي تنمو بسرعة وتمكن من الهروب من خلايا الورم النقيلي بسبب إعادة التروية إلى انخفاض hindlimb عبر السفن الضمانات الذي افتتح حديثا. 21 والأهم من ذلك يجب أن يتم تنفيذ هذا الإجراء عندما يكون حجم الورم صغيرة بما يكفي لمنع نقص الأكسجين الزائد في الأورام التحكم (عادة في الساق المجلد الورم الحاملةأوميا من 150-250 مم 3)، وضمان اختلافات كبيرة في مستويات نقص الأكسجة الورم بين السيطرة والمجموعات المعالجة فال.بالإضافة إلى مراقبة الطولي للتأثير نقص الأكسجين على وفاق الكمون وتيرة الانبثاث، وهذا النموذج يسمح أيضا لجمع الأنسجة وتطوير خطوط الخلايا الجديدة من كل من الأورام الابتدائية والانبثاث. الأهم من ذلك، العمل السابق نص على أن خطوط الخلايا المشتقة الانبثاث، معرضا تعزيز إمكانات المنتشر على إعادتها إلى الحيوانات، مشيرا إلى أن نشر ورم يرتبط مع تغييرات دائمة في الخلية النمط الظاهري الورم، وبالتالي التحقق من صحة استخدام هذه خطوط الخلايا فك العمليات النقيلي. 18 مجتمعة، وهذه النماذج يمكن الآن أن تستخدم في التحليلات الوراثية والجزيئية اللازمة لتحديد مسارات المنتشر الناجم عن نقص الأكسجين.
كما نقص الأكسجين هو أحد العوامل المؤيدة للالمنتشر تعزيز الورم الخبيث من مختلف رumors، لدينا نموذج يمكن أن تستخدم كمنصة للتحقيق في دور نقص الأكسجة في أنواع الأورام الأخرى التي تتطور بشكل طبيعي في أطرافه، مثل عظمية والعضلية المخططة. 21-23 وعلاوة على ذلك، يمكن تطبيق نهج مماثل لالأورام الخبيثة المتزايدة في مواقع تشريحية أخرى مع طريق واضحة المعالم من إمدادات الدم. في نهاية المطاف، فإن النموذج يمكن تعديل وفائدتها تمديدها، وهذا يتوقف على الاحتياجات البحثية الفردية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وقد وافق جميع الإجراءات من قبل لجنة رعاية الحيوان المؤسسية واستخدم جامعة جورج تاون.
1. إعداد الخلايا لمثلي الحقن
- خلايا ES الثقافة البشرية في ظل ظروف قياسية. استخدام ما يقرب من واحد لوحة خلية ثقافة 15 سم لا تتجاوز 70٪ من confluency للحقن من 5 الفئران.
ملاحظة: للحصول على هذه الدراسة، كانت الخلايا SK-ES1 مثقف في المتوسط 5A مكوي مع 15٪ مصل بقري جنيني (FBS) على لوحات المغلفة الكولاجين وخلايا TC71 تم تربيتها في RPMI مع FBS 10٪ و 1٪ 4- (2-هيدروكسي ) حامض -1-piperazineethanesulfonic (HEPES). واستكملت كل من وسائل الإعلام مع المضادات الحيوية - البنسلين (100 وحدة / مل)، الستربتومايسين (100 ميكروغرام / مل)، وfungizone (1 ميكروغرام / مل). - غسل خلايا ES مع الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) ويعرض للتريبسين في 70٪ التقاء مع 0.25٪ التربسين ثنائي أمين الإيثيلين رباعي حمض الخل / (EDTA) لمدة 5 دقائق.
- إزالة خلايا ES من لوحة مع ميدي ثقافة الخليةلذلك، ثم الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 200 x ج في درجة حرارة الغرفة. إعادة تعليق الخلايا ES في 10 مل من برنامج تلفزيوني الباردة ومن ثم حساب عدد الخلايا.
- خلايا الطرد المركزي ES لمدة 5 دقائق في 200 x ج في درجة حرارة الغرفة، ثم إعادة تعليق في 2 × 10 7 (SK-ES1) أو 10 7 (TC71) خلايا لكل مل في برنامج تلفزيوني الباردة. الحفاظ على تعليق خلية النهائي على الجليد أثناء أداء الحقن.
2. حقن مثلي الخلايا ES في عضلة الساق
- استخدام 4-6 الاسبوع القديمة الإناث SCID / الفئران البيج.
- لحقن الخلايا الجذعية الجنينية، وعقد بلطف الماوس وتحقيق الاستقرار في الساق اليسرى ما بين الأصابع الرابع والخامس، وفضح الجانب الإنسي من hindlimb أقل.
- باستخدام إبرة 28 G ونصف، حقن 0.1 مل من تعليق خلية معدة مسبقا التي تحتوي إما 2 × 10 6 (SK-ES1) أو 10 6 خلايا (TC71) ES في عضلة الساق (الشكل 2A).
ملاحظة: على الرغم من حجم الحد الأقصى لينج العضليections عادة 0.05 مل، لهذا الإجراء بشكل خاص في زيادة حجم 0.1 مل هو ضروري نظرا لعدد الخلايا عالية حقن. تمت الموافقة على هذا الإجراء من قبل لجنة رعاية الحيوان المؤسسية واستخدم جامعة جورج تاون.- ادخال الإبرة في العضلة الأمامية في ما يقرب من 30 - زاوية 45 درجة في اتجاه قمة عظام الساق / الحدبة.
- سحب قليلا الإبرة مرة واحدة أنها تمس قمة عظام الساق / الحدبة. حقن ببطء الحل تعليق خلية، والانسحاب تدريجيا الإبرة للافراج عن الضغط.
- رصد حقن الفئران على مدى ال 24 ساعة القادمة لعلامات الضيق.
ملاحظة: يجب أن المحققون مع أقل خبرة في التعامل مع الحيوانات تنظر التخدير الفئران لحقن الخلايا السرطانية. قد تتطلب بعض المؤسسات التخدير لأسباب تتعلق بالسلامة.
3. مراقبة نمو الأورام الأولية
- مراقبة نمو الأورام الأولية دaily حتى حجم الورم يصل حجم المطلوب.
ملاحظة: في هذه الدراسة، تم استخدام حجم العجل من 250 مم 3 كنقطة انطلاق التجربة (الشكل 2B). عادة، فإنه يأخذ حوالي 1-2 أسابيع للأورام للوصول إلى هذا الحجم.- قياس حجم العجل يوميا مع الفرجار الرقمية عبر أطوال لها سطي الاطراف والأمامي الخلفي.
- تحديد حجم العجل بواسطة الصيغة (D XD 2/6) × 3.14، حيث D هو القطر الطويل ود هو قطر أقصر من انخفاض hindlimb الحاملة للورم.
ملاحظة: حجم العادي العجل الماوس البالغين حوالي 40 - 50 مم 3. سوف حجمه زيادة نظرا لنمو الورم وفي مراحل لاحقة العجل وسيتألف أساسا من أنسجة الورم.
4. الشريان الفخذي من ربط (فال) لإحداث نقص الأكسجة في Hindlimb الحاملة للورم
- إعداد الأدوات الجراحية اللازمة لهذه العملية: لئيموأشار فيد أو ملقط غرامة أشار، ملقط، مقص جراحي وحامل إبرة. تعقيم هذه الأدوات قبل الجراحة باستخدام الأوتوكلاف أو معقم الساخنة حبة. بالإضافة إلى ذلك، لدينا مسحات القطن غرامة على استعداد لهذه الجراحة.
ملاحظة: من المستحسن أن الأدوات يعاد تعقيمها على نصائح حسب الحاجة أثناء العملية. - حقن كيل مسكن (كاربروفين 5 ملغ / كلغ) تحت الجلد (SQ). للكشف والتأكد من نقص الأكسجين، وضخ hypoxyprobe-1 (pimonidazole، 60 ملغ / كلغ).
ملاحظة: هذه الجرعة تعادل 1.5 ملغ في الماوس، وحققت من خلال ضخ 0.1 مل من محلول مل / 15 ملغ hypoxyprobe في برنامج تلفزيوني داخل الصفاق (IP). وhypoxyprobe هو ثم بعد الوفاة التي يمكن اكتشافها في الأنسجة الحيوانية المناعية. - ضع الماوس في غرفة تحريض التخدير التي تحتوي على 3-5٪ الأيزوفلورين في الأكسجين 100٪ في معدل التدفق من 1 لتر / دقيقة.
- ترك الماوس في غرفة تحريض حتى يصبح غير قادر على الاستجابة للمؤثرات الخارجية. ثم إزالة الحيوان من أناnduction غرفة. وضع الحيوان في موقف ضعيف على ثنى العقيمة وضعت فوق وسادة الاحترار على سطح التشغيل. استخدام مخروط الأنف لتوصيله إلى تدفق مستمر من 1-3٪ الأيزوفلورين في الأكسجين 100٪ بمعدل تدفق 0.8 لتر / دقيقة.
- تطبيق العقيمة مرهم للعين غير بالأدوية إلى كل عين لمنع جفاف القرنية. ليزيل الشعر تماما على منطقة العمليات الجراحية، وتطبيق كريم إزالة الشعر، تركها على البشرة لمدة لا تزيد عن 10 ثانية. ثم تمحو كريم إزالة الشعر باستخدام وسادة الإيثانول الإعدادية.
- توسيع وتأمين hindlimb مع قطعة من الشريط ما يقرب من 45 درجة من خط الوسط من الفأرة. وبمجرد أن hindlimb آمنة، ومسح البشرة المكشوفة مع 10٪ البوفيدون / اليود مسحة / الحل، تليها الإيثانول، وتكرار مرتين أخريين لكل منهما. للفترة المتبقية من العملية الجراحية، واستخدام المجهر ستيريو للحصول على عرض موسع للمنطقة hindlimb.
- باستخدام ملقط وأشار ومقص جراحي، وجعل شق من كورونافي ما يقرب من 1 سم، من منتصف الفخذ نحو المنطقة الأربية. باستخدام قطعة قطن مبللة غرامة المالحة، وفرشاة بلطف بعيدا تحت الجلد الأنسجة الدهنية المحيطة عضلة الفخذ.
- كشف بعناية الشريان الفخذي الأساسي عن طريق تشريح حادة خلال النسيج الدهني تحت الجلد. استقرار الجرح والجراحي الميداني لفضح الأوعية الدموية في العضلات المقربة منتصف العليا.
- باستخدام ملقط غرامة، بلطف بيرس خلال غمد الفخذ غشائي لفضح حزمة وعائية عصبية. باستخدام مجموعة نظيف من ملقط غرامة، تشريح وفصل الشريان الفخذي من الوريد الفخذي والعصب في الموقع القريب قرب الفخذ، البعيدة إلى الرباط الإربي. توخي الحذر لتجنب اختراق جدار الوريد الفخذي.
- وبعد تشريح، تمر بنوع من 6-0 خياطة الحرير تحت الشريان الفخذي والبعيدة إلى فرع من الشريان الفخذي المنعطف الجانبي (LCFA). انسداد الشريان الفخذي باستخدام عقدة مزدوجة (الشكل 3). إغلاق شق باستخدام 6-0 خيوط البولي بروبلين. بعد إغلاق الجرح، وحقن SQ 0.5 مل من المياه المالحة الدافئة لعلاج توازن السوائل. وضع الحيوان على رأس وسادة دافئة رايات في قفص الانتعاش ومراقبة مستمرة حتى مستيقظا.
- مراقبة الحيوانات خلال ساعة 6 الأولى بعد الجراحة وحقن عامل مسكن (كاربروفين 5 ملغ / كغ، SQ) كل يوم لمدة 3 أيام. إزالة الغرز 10 أيام بعد الجراحة باستخدام مقص العقيمة.
5. استئصال الورم الرئيسي من بتر الساق
ملاحظة: بتر انخفاض hindlimb الحاملة للورم عندما يصل حجم العجل 250 ملم 3 للمجموعة الضابطة أو 3 أيام بعد FAL للمجموعة ميتة.
- حلاقة الشعر من الأطراف الورم الحاملة من الساق البعيدة لمنطقة الحوض مع الشعر كليبرز في حين عقد بلطف الحيوان. حقن عامل مسكن (كاربروفين 5 ملغ / كغ، SQ) قبل إجراء العملية.
- ضع الماوس في لمحة تعريفية الفصل التخديرالعنبر التي تحتوي على 3-5٪ الأيزوفلورين في الأكسجين 100٪ في معدل التدفق من 1 لتر / دقيقة. ترك الماوس في غرفة تحريض حتى يصبح غير قادر على الاستجابة للمؤثرات الخارجية. ثم إزالة الحيوان من غرفة تحريض.
- وضع الحيوان في حق وضعية الاضطجاع الجانبي على ثنى العقيمة وضعها على وسادة الاحترار على سطح التشغيل. استخدام مخروط الأنف لتوصيله إلى تدفق مستمر من الأيزوفلورين 1-3٪ في 100٪ من الأكسجين بمعدل تدفق 0.8 لتر / دقيقة. تطبيق العقيمة مرهم للعين غير بالأدوية إلى كل عين لمنع جفاف القرنية
- تحضير موقع الجراحة باستخدام 10٪ البوفيدون / اليود مسحة / الحل، تليها الإيثانول، وتكرار 3 مرات. تطبيق شاش معقم (على سبيل المثال، ثنى الجراحية) على الماوس للحصول على الجراحي الميداني العقيمة.
- جعل الفخذ كفافي شق الجلد المتوسطة، تليها تشريح حادة وتراجع من الجلد قريب. فضح عنيق عائية عصبية الفخذ وسطي على الجانب متوسط الساق، ثم ligateبالقرب من الرباط الإربي باستخدام 4-0 المغلفة (polyglactin 910) امتصاص مواد خياطة الجروح.
- إجراء transection منتصف الفخذ من المجموعات العضلية مع مقص، تليها تشريح حادة من الأنسجة اللينة إلى المفصل الوركي الفخذي بحسب. استخدام قطع العظام، وإجراء العظم منتصف الفخذ. باستخدام العقيمة مسحة القطن غرامة أو الإسفنج الجيلاتين امتصاص، اضغط بلطف الموقع العظم لتقليل ومنع النزيف.
- إغلاق الجلد المغطي باستخدام مقاطع الجرح الجراحية وحقن 0.5 مل من SQ المالحة الدافئة لعلاج توازن السوائل. وضع الحيوان على رأس وسادة دافئة رايات في قفص الانتعاش ومراقبة مستمرة حتى مستيقظا.
- على الجراحة، وجمع عينات من أنسجة الأورام الأولية لRNA، DNA أو عزل بروتين، والمفاجئة التجميد في النيتروجين السائل وتخزينه في -80 مئوية. للثقافة الخلية الأولية، وجمع عينات الأنسجة في هذه الخطوة، كما هو موضح في القسم 9 أدناه. إصلاح الأنسجة أطرافهم المتبقية في 10٪ من الفورمالين محايدة مخزنة لالأنسجة وimmunochemisمحاولة، بما في ذلك الكشف hypoxyprobe-1.
- مراقبة الحيوانات لتحرك والألم واستهلاك الغذاء خلال 6 ساعات الأولى بعد الجراحة، ثم كل يوم لمدة 3 أيام. حقن عامل مسكن (كاربروفين 5 ملغ / كغ، SQ) يوميا لمدة 3 أيام. إزالة مقاطع الجرح 10 أيام بعد بتر باستخدام مزيل الجرح كليب.
6. الفئران رصد لوجود الانبثاث
- مراقبة الفئران يوميا وتقييمها للعلامات سريرية للورم خبيث على الأقل مرتين في الأسبوع.
- مراقبة الحيوانات لوجود macrometastases كما عرض الجماهير التي تتطور في أماكن مختلفة، وعادة ما الكتفين والساقين المقابل والفكين. تحقيقا لهذه الغاية، جس بعناية الرأس والعنق ومنطقة الإبطين، وhindlimb المقابل. تحقق من وجود نقائل الجهاز الداخلية عن طريق انتفاخ في البطن مع التصوير بالرنين المغناطيسي المسح.
- تحقق من وجود الانبثاث الرئة عن طريق الضغط على عملية سيفي الشكل (الطرف الأدنى من القص) مع INDEالإصبع العاشر. 24
ملاحظة: هذا الضغط يقلل من قدرة التنفس حجابي. الفئران مع الانبثاث الرئة المتقدمة تظهر علامات الضائقة التنفسية يتجلى في التنفس شاقة. - مراقبة الحيوانات لأعراض عصبية مثل الشلل الساق وترنح يشير الانبثاث إلى الجهاز العصبي المركزي.
- مراقبة الفئران مرة واحدة في الأسبوع على الأقل لفقدان الوزن، ومؤشرا على تطور المرض المحتملين. يعتبر الجسم وفقدان الوزن تزيد عن 15٪ من وزن ما قبل الإجرائية نقطة نهاية إنسانية.
7. التصوير بالرنين المغناطيسي (MRI) للكشف الانبثاث
- أداء التصوير بالرنين المغناطيسي للكشف عن الانبثاث في نقاط الوقت المطلوب. 18
ملاحظة: في هذه الدراسة، تم استخدام مطياف الأفقي 7 تيسلا. تم إجراء التصوير بالرنين المغناطيسي في أيام 15 و 35 بعد بتر للخلايا SK-ES1 وفي يوم 15 لTC71 الخلايا. - ضع الماوس في لمحة تعريفية chambe التخديرص تحتوي على 1-3٪ الأيزوفلورين في خليط الغاز من 30٪ من الأكسجين وأكسيد النيتروز 70٪.
- ترك الماوس في غرفة تحريض حتى يصبح غير قادر على الاستجابة للمؤثرات الخارجية. ثم إزالة الحيوان من غرفة تحريض.
- نقل الماوس تخدير على حامل التجسيمي مع التنفس وmonitorization درجة الحرارة مع الادارة مستمرة من 1.5٪ الأيزوفلورين وأكسيد النيتروز بنسبة 30٪. تطبيق العقيمة مرهم للعين غير بالأدوية إلى كل عين لمنع جفاف القرنية. صورة الحيوان إما في 40 أو 23 ملم بروكر حجم الماوس لفائف الجسم كله أو تصوير الدماغ، على التوالي.
- استخدام ثنائي الأبعاد، T2 المرجحة نادر تسلسل: TR = 3000 ميللي ثانية، TE = 24 ميللي ثانية، مصفوفة = 256، فوف = 4.35 س 3.0 سم، وسمك شريحة = 0.5 مم، عامل نادر = 4 والمتوسطات = 4. 18
- وضع الحيوانات في قفص الانتعاش الحار ومراقبة مستمرة حتى مستيقظا.
ملاحظة: إن الفئران على التعافي سريعا منذ يستخدم طائرة الضحلة من التخدير. مراقبة الحيوانات خلال ساعة 6 الأولى بعد التصوير للتأكد من عدم وجود أي آثار سلبية من التخدير.
8. القتل الرحيم والتشريح
- الموت ببطء الفئران مرة واحدة الحيوانات الحالية مع الانبثاث كشفها بواسطة التصوير بالرنين المغناطيسي و / أو الأعراض السريرية لتطور المرض.
ملاحظة: في هذه الدراسة، تمت التضحية الفئران في أيام 50 و 25 بعد بتر للحيوانات تحمل SK-ES1 وTC71 xenografts، على التوالي. في بعض الحالات، كان القتل الرحيم في وقت سابق ضرورية نظرا للعبء ورم خبيث عالية. - الموت ببطء الفئران عن طريق التعرض لثاني 2 في 1.5 لتر / دقيقة (CO 2 في 10-30٪ من غرفة القتل الرحيم المجلد / دقيقة). لضمان موت الحيوان، نفذ خلع عنق الرحم بعد التعرض CO 2.
- رش الماوس كامل مع 70٪ من الإيثانول ووضعه في غطاء تدفق الصفحي. جمع الدم عن طريق ثقب القلب باستخدام إبرة 25 G ونصف مع حقنة 1 مل ونقل إلى جمع الدم توأن تحتوي على 2 ملغ من EDTA.
- جمع الأنسجة التالية: الطحال والغدد الكظرية، والمبايض والكلى والكبد والرئتين والدماغ والساق اليمنى، ونخاع العظام من كل من العضد والعمود الفقري، وكذلك الانبثاث العيانية موجودة في مواقع أخرى. 25،26
- إصلاح نصف كل الأنسجة في 10٪ من الفورمالين محايدة مخزنة لالأنسجة وكيمياء المناعة، بما في ذلك الكشف hypoxyprobe-1. التقط تجميد النصف الآخر في النيتروجين السائل، ثم تخزينها في -80 مئوية لمدة RNA، DNA أو عزل بروتين. 25،26 لزراعة الخلايا الأولية، وجمع عينات الأنسجة كما هو موضح في القسم 9 أدناه.
9. الثقافة الخلية الأولية
- لأداء ثقافة الخلية الأولية، تشريح الأنسجة من الطرف بتر (القسم 5 أعلاه) أو أثناء التشريح (المادة 8 أعلاه) تحت ظروف معقمة في غطاء تدفق الصفحي.
- إعداد خلية ثقافة وسائل الإعلام يتناسب مع خط الخلية المستخدمة للحقن مثلي، على أن تستكمل مع البنسلين (200 وحدة / مل)،الستربتومايسين (200 ميكروغرام / مل)، fungizone (1 ميكروغرام / مل)، و 0.2٪ الميكوبلازما المضادات الحيوية الوقائية. ضع 2.5 مل من مستنبت الأساسي في لوحة خلية ثقافة 6 سم.
- تحديد المناطق الأنسجة السرطانية قابلة للحياة من الأورام الأولية أو الانبثاث، ثم عزل 2-3 شرائح بمعدل 2-3 ملم كل باستخدام مقص العقيمة.
ملاحظة: تم العثور على عادة الأنسجة السرطانية قابلة للحياة على حواف الورم ويمكن تميز من نخر من قبل ردي اللون أو يميل إلى الحمرة لها، بريق كبير والمظهر الرطب بشكل عام. في المقابل، يعتبر النسيج الميت عادة في مركز الورم، ويقدم باعتباره بيضاء / كريم كتلة اللون مع مملة، والمظهر جبني. 27 - نقل قطاعات معزولة إلى لوحة خلية ثقافة 6 سم تحتوي على مستنبت الأساسي هو موضح في الخطوة 9.2.
- ثقافة الخلايا تحت الظروف القياسية، كما وصفها في القسم 1 (ملاحظة) و 9.2. 18،28 تحقق من ثقافة لنمو الخلايا الناشئة عن قطعة نسيج، ذوي الخوذات البيضاءالتراث الثقافي غير المادي ينبغي مراعاتها في غضون أيام قليلة. مرة واحدة الخلايا الوصول إلى نقطة التقاء، ويعرض للتريبسين وترويجها وفقا للتقنيات زراعة الخلايا القياسية.
ملاحظة: ثقافة الخلية الأولية يمكن استخدامها في وقت لاحق لتقييم النمو وخصائص المنتشر من الخلايا المشتقة من الرقابة ونقص الأوكسجين الأورام، وكذلك خصائصها الجزيئية، كما هو موضح سابقا. 18
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
بعد حقن الخلايا الجذعية الجنينية في عضلة الساق، ويسمح الأورام الأولية أن تنمو إلى حجم العجل من 250 مم 3 (الشكل 1 و 2). الوقت اللازم للأورام للوصول إلى هذا الحجم يتراوح عادة 10-15 يوما لTC71 إلى 20-25 يوما لxenografts SK-ES1، على التوالي. الأورام في حجم العجل من 250 مم 3 المعرض على مستوى منخفض نسبيا من نقص الأكسجة الذاتية (حوالي 3٪ من أنسجة الورم)، استنادا إلى hypoxybrobe-1 (pimonidazole) تلطيخ (الشكل 4A، C). الأهم من ذلك، في هذه الأورام السيطرة، لوحظ في تلطيخ إيجابية لhypoxyprobe-1 فقط في مجالات نقص الأكسجة الفسيولوجي، أي في الخلايا السرطانية التي هي بعيدة عن الأوعية الدموية والبدء في الخضوع لموت الخلايا (الشكل 4A). هذا تلطيخ يسلك مميزة "الهواء فرشاة" نمط، بينما يبقى الجزء الأكبر من نسيج الورم صحية سلبية بالنسبة hypoxyprobe-1. <سوب> 6 وفي المقابل، يقوم فال في هذه المرحلة يخلق نقص الأكسجة الشديد، كما يتضح من تلطيخ إيجابية لhypoxyprobe-1 لاحظ في الغالبية العظمى من الخلايا السرطانية في 4 ساعات ما بعد فال (الشكل 4B). والجدير بالذكر أن لوحظ أن الخلايا السرطانية-hypoxyprobe إيجابية (1) أيضا على مقربة من الأوعية الدموية وفقدان نمط مميز من نقص الأكسجة الفسيولوجية. في هذه الأورام تعامل FAL، 73٪ من نسيج يتكون من خلايا الورم نقص الأوكسجين (الشكل 4C). كما يسلك نسيج الورم البوادر الأولى للضرر الناجم عن نقص الأكسجين، بما في ذلك انكماش الخلايا وهيكلها فضفاض (الشكل 4B).
وأيد فعالية FAL مزيد من تثبيط كامل للنمو الورم الرئيسي. خلال الفترة التي استمرت 3 أيام بين FAL وبتر الأطراف، إلا أن حجم الأورام الأولية لا تزيد (الشكل 5A). في المقابل، الأورام الأولية من الفئران تعرض لصورية surgerاستمرار ذ أن ينمو سريعا ويصل إلى حجم ما يقرب من 650 ملم 3، وبالتالي محاكاة معدل نمو الأورام في السيطرة على الفئران لم يتعرض لعملية جراحية (الشكل 5A). 18 وتمشيا مع هذه البيانات، كشف تحليل الأنسجة مساحات واسعة من نخر في الأورام الأولية تعامل FAL-تحصد 3 أيام بعد الجراحة (الشكل 5B). ومع ذلك، كانت هناك مجموعات من الخلايا السرطانية قابلة للحياة موجودة داخل أنسجة الورم، وعادة ما تقع على حواف الورم، على مقربة من الأوعية الدموية (الشكل 5B). للتحقيق في وضع الأوكسجين في هذه الخلايا كنا hypoxyprobes، والتي يتم تفعيلها في خلايا ميتة حية، والحصول بعد ذلك القدرة على ربط تساهمي إلى البروتينات داخل هذه الخلايا. 29 وعلى هذا النحو، هذه التحقيقات بمثابة علامة دائمة من الخلايا التي شهدت نقص الأكسجة في أي نقطة في الوقت المناسب. وهكذا، للكشف عن تغيرات في مستويات الأكسجين في الخلايا السرطانية في جميع أنحاء مدة experimوالأنف والحنجرة، وكنا اثنين hypoxyprobes المختلفة التي يمكن الكشف عنها بشكل مستقل من قبل المناعية. كانت تدار تحقيقات في نقطتين الوقت - على الفور قبل FAL (hypoxyprobe-1) وقبل بتر (hypoxyprobe-2، CCI-103F) - تم الكشف عن والتعريب في الأورام تحصد 3 أيام بعد فال (الشكل 1). Hypoxyprobe-1، الذي كان حاضرا في النظام في وقت FAL، اتسمت غالبية الخلايا السرطانية، كما أصبحت أنسجة ميتة بشدة (الشكل 5C). هذا الوسم واضح أيضا في مناطق النخر / موت الخلايا المبرمج، منذ ما زالت هذه الخلايا على قيد الحياة في وقت فال، وبالتالي قادرة على ربط hypoxyprobe-1 بشكل دائم، كما هو مبين في الشكل 4B. في المقابل، hypoxyprobe-2 تدار 2 يوما بعد FAL الملون فقط خلايا قابلة للحياة، وكانت الخلايا في المناطق الميتة ميتة وغير قادرة على تفعيل لجنة التحقيق في وقت إدارتها (الشكل 5D) بالفعل. ومن المثير للاهتمام، ونحن obse أيضاrved الأنسجة السرطانية قابلة للحياة المتاخمة للالأوعية الدموية التي كانت ميتة في البداية (-إيجابية hypoxyprobe 1)، ولكن غنية بالأوكسجين بشكل كاف في نقطة زمنية لاحقة (hypoxyprobe-سالب 2) (الشكل 5C، D). هذه النتيجة تتفق مع تقارير سابقة قد أشارت إلى أن جانبية ضخه الأنسجة التي تعتمد على سفينة يعيد تدفق الدم في hindlimb 3 أيام بعد فال. 20 وكانت الخلايا السرطانية الحية القادرة على البقاء في نسيج الورم 3 أيام بعد FAL الغازية للغاية، كما يتضح من دخول الوعاء الضخم على حواف أوعية دموية من الورم (الشكل 5E). وكانت بعض الخلايا داخل التجويف سفينة إيجابية لhypoxyprobe-1، مما يشير إلى أنها قد تصبح ميتة على FAL، ولكن لا تزال قابلة للحياة. بشكل جماعي، وتشير هذه البيانات إلى أن ضخه الأنسجة التالية نقص الأكسجة الشديد قد تسهل هروب الخلايا من الأورام الأولية.
وبناء على التجربة الرائدة، كانت الانبثاث واسعة النطاقكشف عن طريق التصوير بالرنين المغناطيسي حوالي 35 يوما بعد بتر لxenografts SK-ES1، في حين أن الخلايا TC71 عادة انتشر غضون 15 يوما. ونتيجة لذلك، لتحليل مقارن للالكمون ورم خبيث والتردد، تم إجراء التصوير بالرنين المغناطيسي في يوم 15 و 35 بعد بتر للحيوانات تحمل الأورام SK-ES1، في حين كان التصوير واحدة في يوم 15 كافيا لفئران مصابة بأورام TC71. تم تنفيذ القتل الرحيم في يوم 50 ويوم 25 للحيوانات مع SK-ES1 وTC71 xenografts، على التوالي. كما ذكرت سابقا، وتشمل الأنواع الأكثر شيوعا من الانبثاث الجماهير الأنسجة اللينة في منطقة الكتف، وكذلك الانبثاث العظام إلى الساقين المقابل، منطقة الفك العلوي والعمود الفقري للخلايا SK-ES1، والرئة وأورام الحوض لTC71. 18 وبالإضافة إلى ذلك، الانبثاث المتكررة إلى الأعضاء الداخلية، بما في ذلك الغدد الكظرية، الرئتين والكبد، فضلا عن تسلل نخاع العظم، لوحظت في الفئران التي تحمل المعالجة FAL-xenografts SK-ES1 (الشكل 6). بشكل عام، نقص الأكسجة بشكل ملحوظفي العام (SK-ES1) أو نوعية الموقع (TC71) تردد وتعدد الانبثاث في كل من خطوط الخلايا. ومع ذلك، وضعت xenografts TC71 أيضا الجماهير المتكررة المتكررة في موقع البتر (25٪ للتحكم و 40٪ للأورام تعامل فال)، كما هو موضح سابقا عن الأورام الأولية TC71 كبيرة. 18
الأنسجة من السيطرة والأورام والانبثاث الأولية تعامل FAL-يمكن أيضا أن يكون مصدرا للمواد لالتحليلات الجزيئية شاملة تهدف إلى تحديد مسارات تنشيط نقص الأكسجة يشاركون في نشر ES. على سبيل المثال، لاحظنا فروق ذات دلالة إحصائية في لمحات metabolomic الرقابة والأورام الأولية ميتة (لا تظهر البيانات). كنا قادرين على عزل بنجاح خطوط الخلايا متعددة من جميع الأنسجة المذكورة أعلاه أيضا. في كثير من الحالات، والخلايا المشتقة من الأورام تعامل FAL-أظهرت تغيرات ملحوظة في التشكل، بالمقارنة مع الخلايا الأصلية وتلك المستمدة من السيطرة تومورس (7A الشكل). وأكد على نقاء هذه الثقافات الخلية المناعية إيجابية للساركوما علامة يوينغ، CD99 (الشكل 7B). وعلاوة على ذلك، كان 100٪ من الخلايا في خطوط الخلايا إنشاء إشارة إيجابية في مضان في الموقع التهجين (FISH) مع تحقيقات القسيم المركزي الإنسان، وغالبا ما يقدم مع زيادة عدد الكروموسومات (الشكل 8A). وأكد مصدر البشري من هذه الخلايا مزيد من تحليل الكروموسومات الطورية (الشكل 8B) التي أظهرت إعادة ترتيب الوراثية الخلوية التي سبق وصفها للخلايا SK-ES1 في كل خط الخلية الأصلي والخلايا المشتقة من الأورام تعامل فال (الشكل 8B). 30
الشكل 1. مخطط ES نقص الأكسجة النموذجي. تم حقن - (2 × 10 6 1) في gastrocn خلايا ESعضلات emius من SCID / الفئران البيج. مرة واحدة وصلت الأورام الأولية الناتجة عن حجم العجل من 250 مم 3، تم تقسيم الفئران إلى مجموعتين تجريبيتين. تم حقن الفئران من المجموعة الضابطة مع hypoxyprobe-1 (HP-1)، وتم رفعه الأورام الأولية من خلال بتر الأطراف. تم حقن الفئران من المجموعة ميتة مع hypoxyprobe-1 ثم تعرض لعملية ربط الشريان الفخذي (فال). وبعد يومين تم حقن الفئران مع hypoxyprobe-2 (HP-2)، ثم الأطراف الحاملة للورم تم بتر ثلاثة أيام بعد فال. تم رصد الحيوانات من كلا المجموعتين من الدوري التصوير بالرنين المغناطيسي (MRI). بمجرد أن تصبح الانبثاث واضحة تقوم على التصوير والعلامات السريرية، والموت الرحيم الفئران وأكدت وجود نقائل من قبل التشريح والتحاليل المرضية في الأنسجة. الوقت من نمو الورم والتصوير والقتل الرحيم وعلى أساس سعر خلية SK-ES1 من النمو والانبثاث. لاحظ أنه في حين كان hypoxyprobe-2 ضرورية لإنشاء الطريقة وVISUالتغييرات اليز في مستويات نقص الأكسجة خلال الفترة ما بين FAL وبتر الأطراف، واستخدامه ليست ضرورية للتجارب الفعلية. لذلك، لا يتم تضمين هذه الخطوة في البروتوكول. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. نمو الأورام الأولية. ألف صورة بالرنين المغناطيسي (MRI) لhindlimb سليمة. يشير السهم الأحمر الموقع والاتجاه للحقن مثلي الخلايا السرطانية. B. الورم الأولي في حجم العجل حوالي 250 مم 3 نموا في عضلة الساق (مخطط الحمراء). وتشير السهام الحمراء مواقع الدمار العظام. T - الساق. يرجى جلعق هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3. الموقع من فخذي الشريان ربط. وبعد الوفاة تمثيلية الأشعة السينية التصوير الشرياني على فأرة الحاسوب 129S1 / SVJ مع perfused كبريتات الباريوم مباشرة بعد ربط يظهر لتسليط الضوء على وجود أوعية الضمانات موجودة مسبقا. لاحظ أنه في حين أن صورة يصور اثنين من عملية ربط (XS)، القاصي واحدة إلى الشريان المنعطف الجانبي الفخذ (LCFA) (أحمر X) والقريبة أخرى إلى الشريان ركبة (أبيض X)، ونموذج الورم نقص الأكسجة تستخدم فقط في الربط الداني، قرب الرباط الإربي والبعيدة إلى LCFA (أحمر X). وأظهرت هذه المنطقة من تطوير سفينة جانبية كما هو موضح (السفن باهتة)، ويتم تحديدها من قبل على متعرج، شكل الفلين المسمار. الرجاء الضغط هوإعادة لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4. ورم نقص الأكسجة المستحث بواسطة فخذي الشريان من ربط (فال). أ ورم تحكم في حجم العجل من 250 مم 3 ملطخة الهيماتوكسيلين ويوزين (H & E) وimmunostained لhypoxyprobe-1 (البني). لوحظ Hypoxyprobe-1 المناعية فقط في مجالات نقص الأكسجة الورم الفسيولوجية، حيث يتم حرمان الخلايا السرطانية بعيدة من الأوعية الدموية من الأكسجين والبدء في الخضوع لموت الخلايا. B. FAL المعالجة الورم الرئيسي في حجم مماثل تحصد 4 ساعات بعد ربط وملطخة H & E وimmunostained لhypoxyprobe-1. غالبية الخلايا السرطانية إيجابية للغاية لhypoxyprobe-1، بما في ذلك على مقربة من الأوعية الدموية. V - الأوعية الدموية. جيم مجال تلطيخ إيجابية لكان hypoxyprobe-1 quantifالعبوات الناسفة في السيطرة والمعالجة FAL-الأورام باستخدام برنامج ImageJ. أشرطة الخطأ تمثل SEM. *** - ع <0.001 الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 5. تأثير فخذي الشريان من ربط (فال) على نمو الورم الرئيسي. ألف نمو الورم الأولي خلال الفترة التي استمرت 3 أيام بين الجراحة والبتر في FAL- (ن = 4) وصورية المعالجة جراحة (ن = 4) الحيوانات، بالمقارنة مع الأورام سيطرة سليمة (ن = 6). تمثل أشرطة الخطأ SD. *** - ع <0.001، بالمقارنة مع كل من السيطرة وصورية الأورام المعالجة جراحة. B. الهيماتوكسيلين ويوزين (H & E) تلطيخ وجود ورم تعامل FAL-تحصد 3 أيام بعد ربط يكشف نخر على نطاق واسع داخل الورم. الخطوط العريضة الأحمر يدل على وجود مجال م الورم قابلا للتطبيقLLS على مقربة من منطقة أوعية دموية للغاية perfused 3 أيام بعد فال. تعامل FAL-جيم أنسجة الورم تحصد 3 أيام بعد الجراحة immunostained لhypoxyprobe-1. تم حقن Hypoxyprobe-1 قبل FAL. ولذلك، فإن المناعية إيجابي يدل على وجود نقص الأكسجة الأنسجة واسعة النطاق على الفور بعد الجراحة. تم حقن D. Hypoxyprobe-2 2 يوما بعد FAL، وبعد الأنسجة التي تم جمعها 24H، في بتر. ويحدد إيجابي hypoxyprobe-2 تلطيخ نقص الأكسجة الأنسجة في وقت البتر. يشير السهم الأحمر الأنسجة التي هي ميتة في كل نقطة زمنية في حين يشير السهم الأصفر في المنطقة المتاخمة للالأوعية الدموية التي كانت ميتة على الفور بعد فال (hypoxyprobe-1-إيجابية)، ولكن سلبية لhypoxyprobe-2 في وقت الختان، الذي يدل على ضخه الأنسجة. عدم وجود hypoxyprobe-2 تلطيخ في المناطق الميتة تشير إلى أن الخلايا في هذه المنطقة لم تكن قابلة للتطبيق في الوقت إدارتها، وبالتاليغير قادر على ربط بنشاط التحقيق. تم إجراء تلطيخ قدمت في لوحات دينار بحريني على أقسام الأنسجة التسلسلي. E. دخول الوعاء في FAL المعالجة ورم 3 أيام بعد فال. يحدد المناعية خلايا قابلة للحياة إيجابية لhypoxyprobe-1 داخل التجويف سفينة (السهم الأحمر). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6. أمثلة من الانبثاث في الفئران وإذ تعامل FAL-SK-ES1 الأورام. تم الكشف عن النقائل بواسطة التصوير بالرنين المغناطيسي (MRI)، وأكد من قبل التشريح والتحاليل المرضية في الأنسجة (تلطيخ الهيماتوكسيلين ويوزين، H & E). M - ورم خبيث. الرجاء انقر هنا لعرض أكبر فرس أيون من هذا الرقم.
الرقم 7. خصائص الخلايا المشتقة من الأورام الابتدائية تعامل فال. أنشئت ألف مزارع الخلايا قابلة للحياة من الأنسجة التي تحصد من السيطرة والأورام الأولية ميتة ومقارنة التشكل على خطوط الخلايا الأصلية المستخدمة للحقن مثلي الأولية. الخلايا المشتقة من الأورام الأولية تعامل FAL-يحمل تغييرات جذرية في أحجامها والتشكل. وتظهر الصور ممثل الخلايا SK-ES1 الأصلية والأولية المستمدة من الورم. صور B. ممثل الخلايا المشتقة من الأورام تعامل FAL-immunostained للعلامة ES، CD99، و counterstained مع صبغة الحمض النووي ملزم، دابي. كل الخلايا-CD99 إيجابي، بما في ذلك الخلايا الضخامي تحتوي على نواة الموسع (السهم الأبيض). OAD / 54532 / 54532fig7large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 8. تحليل الكروموسومات من الخلايا المشتقة من الأورام تعامل فال. A. الإسفار في الموقع التهجين (FISH) تحليل في الخلايا البيني تظهر نواتين مع إشارات لالقسيم المركزي البشري 4 التحقيق. نواة كبيرة مع أربع إشارات تشير إلى رباعي الصيغة الصبغية (4N) الخلية (السهم الأبيض). B. تحليل FISH في طور متوسط تمثيلية من خط الخلية الأصلية SK-ES1 والخلية المستمدة من الورم الرئيسي تعامل فال. وتشير السهام الحمراء الجرد (1) (p13.1q21)، وغير عشوائية الوراثية الخلوية خاصية إعادة ترتيب الخلايا SK-ES1. إشارات حمراء: القسيم المركزي البشري 4 التحقيق. الإشارات الخضراء في الخلايا SK-ES1 الأصلي: NPY5R التحقيق في 4q32.2 كروموسوم.e.com/files/ftp_upload/54532/54532fig8large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ويشمل نموذجنا مقارنة ورم خبيث في مجموعتين تجريبيتين - مجموعة مراقبة، حيث يسمح للأورام لتطوير في hindlimb تليها البتر عند بلوغ حجم العجل 250 ملم 3، ومجموعة المعرضة للنقص الأكسجين، والذي tumor- يخضع تحمل hindlimb لفال في نفس الحجم، تليها بتر بعد 3 أيام. على الرغم من أن في هذه التجارب وبتر الأورام تعامل FAL مع تأخير بسيط، بالمقارنة مع الأورام السيطرة، لا يزيد حجمها خلال فترة 3 ايام بين ربط وبتر الأطراف. لذلك، هذا النهج يمكن المقارنة بين إمكانيات المنتشر بين أورام أحجام مماثلة لكن مع مستويات مختلفة بشكل كبير من نقص الأكسجة. في المقابل، وذلك باستخدام جراحة صورية، عنصر تحكم يستخدم عادة للتدخلات الجراحية، تليها 3 أيام من نمو الورم من شأنه أن يؤدي إلى اختلافات كبيرة في حجم الورم بين المجموعات التجريبية، مع صورية جراحة علاجالأورام الأولية إد تمتلك مستويات عالية من نقص الأكسجة الذاتية. وبناء على التجارب الرائدة، جراحة صورية لا يؤثر على نمو الورم بدرجة كبيرة أو مستويات نقص الأكسجين، وبالتالي يمكن التخلص من التصميم التجريبي. بدلا من ذلك، فإن استراتيجية مقارنة أورام أحجام مماثلة، ومستويات نقص الأكسجة مختلفة هي نموذج ذات أهمية كبيرة لتوضيح آثار نقص الأكسجين على انتشار المرض. الأهم من ذلك، على عكس سابقة في الدراسات المختبرية، ويسمح هذا النهج لتقييم شامل من الإجراءات الموالية للالنقيلي من نقص الأكسجين في المكروية ورم الطبيعية. 4-6
وكان الهدف من التصميم التجريبي لتحقيق مستوى منخفض القاعدية الانبثاث التي من شأنها أن تسمح للكشف عن تأثير الناجم عن نقص الأكسجة تنشيطية على تشكيلها. أنشأنا أن حجم العجل من 250 مم 3 في FAL وبتر الأطراف والأمثل لعلاج الأورام الأولية SK-ES1. ومع ذلك، سوف تحتاج هذه المعلمة إلى أن يكون الأمثل لعصام خط الخلية الفصل، اعتمادا على غزو محتمل والمحلية المنتشر بها. للأورام مع إمكانية المنتشر أعلى، قد تحتاج إلى خفض حجم الورم الرئيسي في بتر. على سبيل المثال، وأورام TC71 تبدي الغازية المحلية عالية تتجلى في تشكيل المتكرر للأورام المتكررة في موقع البتر. 18 مرة واحدة تتطور هذه الجماهير، والحيوانات يجب أن تستبعد من التحليلات، كما أنه لن يكون واضحا ما إذا نشأت الانبثاث البعيدة لاحقة من الأورام الأولية أو من الأورام المتكررة التي غالبا ما تنمو بسرعة وتظهر مستويات عالية من نقص الأكسجة الذاتية. من التجربة السابقة، بغض النظر عن خط الخلية المستخدمة، 150 مم 3 هو الحد الأدنى من الورم الحاملة حجم العجل التي يمكن قياسها بشكل موثوق وتطبيع. إذا تقليل حجم الورم في FAL وبتر الأطراف لا يلغي الأورام المتكررة أو خفض معدل ورم خبيث القاعدية بما فيه الكفاية، خط خلية معينة في مسألة قد لا تكون مناسبة لهذه التجارب.
ve_content "> وبالمثل، فمن المهم وضع جدول زمني التصوير بالرنين المغناطيسي والقتل الرحيم لكل خط الخلية الفردية، وهذا يتوقف على الكمون ورم خبيث لها. والجدير بالذكر أن مقاطع الجرح الجراحية التي تتداخل مع التصوير بالرنين المغناطيسي يمكن إزالة أي في وقت سابق من 10 يوما مرحلة ما بعد يجب أحيانا أن تمتد عملية جراحية، وهذه الفترة بسبب مضاعفات والشفاء. وهكذا، في هذه الدراسة أنشأنا يوم 15 مرة من حيث التصوير بالرنين المغناطيسي الأول.اعتبار آخر مهم في هذا النموذج هو الحفاظ على مستوى من نقص الأكسجين قادرة على إحداث عمليات المنتشر دون أن تسبب نخر كامل الورم، والتي من شأنها أن تمنع نشر الخلايا السرطانية. على الرغم من أننا لم تواجه هذه المشكلة في هذه الدراسة، إذا لزم الأمر، من شدة نقص الأكسجة قد ينظم عن طريق تغيير الموقع المحدد وعدد من عملية ربط فيما يتعلق فروع الشريان الفخذي، مثل LCFA والشريان ركبة. 20 وهكذا، فإن الأقرب إلى ربط LCFA خلق نقص التروية أكثر شدة في مرحباتداول ndlimb، مما يزيد من ظروف نقص الأوكسجين في الساق البعيدة. في المقابل، ligating البعيدة إلى فروع لاحقة من الشريان الفخذي سيقلل من نقص الأكسجين مما يؤدي إلى hindlimb أقل.
الأهم من ذلك، لم تكن هناك آثار سلبية شديدة من الإجراءات فال وبتر الأطراف مجتمعة وليس الوفيات المرتبطة العمليات الجراحية، كما ذكرت سابقا لهذه التقنيات يؤديها بشكل منفصل. 18-20 وهكذا، فإن نجاح الأسلوب يقتصر أساسا من معدل تأخذ ورم في الموقع الأساسي وتردد الأورام المتكررة، وكلاهما خط التي تعتمد على الخلايا.
كما تورطت نقص الأكسجين كعامل الموالية للالمنتشر في العديد من أنواع الأورام، وهذا النهج يمكن أيضا أن تكون مناسبة لاختبار مباشرة آثاره وتحديد آليات عملها في الأورام اللحمية الأخرى التي تتطور في أطرافه. 23 وعلاوة على ذلك، يمكن تطبيق استراتيجية مماثلة إلى الأورام الخبيثة الأخرى نموا في بيئات مثلي ثإيث طريق إمدادات الدم واضحة المعالم. وهكذا، مع بعض التعديلات المناسبة، وهذا النموذج يمكن أن تكون أداة مفيدة في البحث خارج مجال البيولوجيا ES.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SK-ES1 Human Ewing sarcoma (ES) cells | ATCC | ||
| TC71 Human ES cells | Kindly provided from Dr. Toretsky | ||
| McCoy's 5A (modified) Medium | Gibco by Life Technologies | 12330-031 | |
| RPMI-1640 | ATCC | 30-2001 | |
| PBS | Corning Cellgro | 21-040-CV | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442-500mL | |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1x) | Gibco by Life Technologies | 25200-056 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco by Life Technologies | 15140-122 | |
| Fungizone® Antimycotic | Gibco by Life Technologies | 15290-018 | |
| MycoZap™ Prophylactic | Lonza | VZA-2032 | |
| Collagen Type I Rat tail high concetration | BD Biosciences | 354249 | |
| SCID/beige mice | Harlan or Charles River | 250 (Charles River) or 18602F (Harlan) | |
| 1 ml Insulin syringes with permanently attached 28 G ½ needle | BD | 329424 | |
| Saline (0.9% Sodium Chloride Injection, USP) | Hospira, INC | NDC 0409-7984-37 | |
| Digital calipers | World Precision Instruments, Inc | 501601 | |
| Surgical Tools | Fine Science Tools | ||
| Rimadyl (Carprofen) Injectable | Zoetis | ||
| Hypoxyprobe-1 (Pimonidazole Hydrochloride solid) | HPI, Inc | HP-100mg | |
| hypoxyprobe-2 (CCI-103F-250 mg) | HPI, Inc | CCI-103F-250mg | |
| Povidone-iodine Swabstick | PDI | S41350 | |
| Sterile alcohol prep pad | Fisher HealthCare | 22-363-750 | |
| LubriFresh P.M. (eye lubricant ointment) | Major Pharaceuticals | NDC 0904-5168-38 | |
| VWR Absorbent Underpads with Waterproof Moisture Barrier | VWR | 56617-014 | |
| Oster Golden A5 Single Speed Vet Clipper with size 50 blade | Oster | 078005-050-002 (clipper), 078919-006-005 (blade) | |
| Nair Lotion with baby oil | Church & Dwight Co., Inc. | ||
| Silk 6-0 | Surgical Specialties Corp | 752B | |
| Prolene (polypropylene) suture 6-0 | Ethicon | 8680G | |
| Vicryl (Polyglactin 910) suture 4-0 | Ethicon | J386H | |
| Fisherbrand Applicators (Purified cotton) | Fisher Scientific | 23-400-115 | |
| GelFoam Absorbable Dental Sponges - Size 4 | Pfizer Pharmaceutical | 9039605 | |
| Autoclip Wound Clip Applier | BD | 427630 | |
| Stereo Microscope | Olympus | SZ61 | |
| Autoclip remover | BD | 427637 | |
| Aound clip | BD | 427631 | |
| MRI 7 Tesla | Bruker Corporation | ||
| Paravision 5.0 software | Bruker Corporation | ||
| CO2 Euthanasia system | VetEquip | ||
| 25 G 5/8 Needle (for heart-puncture) | BD | 305122 | |
| 0.1 ml syringe (for heart-puncture) | Terumo | SS-01T | |
| K3-EDTA Micro tube 1.3 ml | Sarstedt | 41.1395.105 | |
| 10% Neutral Buttered Formalin | Fisher Scientific | SF100-4 |
References
- Lessnick, S. L., Ladanyi, M. Molecular pathogenesis of Ewing sarcoma: new therapeutic and transcriptional targets. Annu Rev Pathol. 7, 145-159 (2012).
- Ladenstein, R. Primary disseminated multifocal Ewing sarcoma: results of the Euro-EWING 99 trial. J Clin Oncol. 28, 3284-3291 (2010).
- Dunst, J., Ahrens, S., Paulussen, M., Burdach, S., Jurgens, H. Prognostic impact of tumor perfusion in MR-imaging studies in Ewing tumors. Strahlenther Onkol. 177, 153-159 (2001).
- Aryee, D. N. Hypoxia modulates EWS-FLI1 transcriptional signature and enhances the malignant properties of Ewing's sarcoma cells in vitro. Cancer Research. 70, 4015-4023 (2010).
- Knowles, H. J., Schaefer, K. L., Dirksen, U., Athanasou, N. A. Hypoxia and hypoglycaemia in Ewing's sarcoma and osteosarcoma: regulation and phenotypic effects of Hypoxia-Inducible Factor. BMC cancer. 10, 372 (2010).
- Tilan, J. U. Hypoxia shifts activity of neuropeptide Y in Ewing sarcoma from growth-inhibitory to growth-promoting effects. Oncotarget. 4, 2487-2501 (2013).
- Franzius, C. Successful high-resolution animal positron emission tomography of human Ewing tumours and their metastases in a murine xenograft model. Eur J Nucl Med Mol Imaging. 33, 1432-1441 (2006).
- Hauer, K. DKK2 mediates osteolysis, invasiveness, and metastatic spread in Ewing sarcoma. Cancer Research. 73, 967-977 (2012).
- Manara, M. C. Preclinical in vivo study of new insulin-like growth factor-I receptor--specific inhibitor in Ewing's sarcoma. Clin Cancer Res. 13, 1322-1330 (2007).
- Scotlandi, K. Murine model for skeletal metastases of Ewing's sarcoma. J Orthop Res. 18, 959-966 (2000).
- Vormoor, J. Establishment of an in vivo model for pediatric Ewing tumors by transplantation into NOD/scid mice. Pediatr Res. 49, 332-341 (2001).
- Picarda, G. Preclinical evidence that use of TRAIL in Ewing's sarcoma and osteosarcoma therapy inhibits tumor growth, prevents osteolysis, and increases animal survival. Clin Cancer Res. 16, 2363-2374 (2010).
- Vormoor, B. Development of a preclinical orthotopic xenograft model of ewing sarcoma and other human malignant bone disease using advanced in vivo imaging. PLoS One. 9, e85128 (2014).
- Wang, Y. Platelet-derived growth factor receptor beta inhibition increases tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL) sensitivity: imatinib and TRAIL dual therapy. Cancer. 116, 3892-3902 (2010).
- Wang, Y. X. Inhibiting platelet-derived growth factor beta reduces Ewing's sarcoma growth and metastasis in a novel orthotopic human xenograft model. In Vivo. 23, 903-909 (2009).
- Odri, G. A. Zoledronic acid as a new adjuvant therapeutic strategy for Ewing's sarcoma patients. Cancer Research. 70, 7610-7619 (2010).
- Merchant, M. S. Interferon gamma enhances the effectiveness of tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand receptor agonists in a xenograft model of Ewing's sarcoma. Cancer Research. 64, 8349-8356 (2004).
- Hong, S. H. High neuropeptide Y release associates with Ewing sarcoma bone dissemination - in vivo model of site-specific metastases. Oncotarget. 6, 7151-7165 (2015).
- Lee, E. W. Neuropeptide Y induces ischemic angiogenesis and restores function of ischemic skeletal muscles. J Clin Invest. 111, 1853-1862 (2003).
- Tilan, J. U. Platelet neuropeptide Y is critical for ischemic revascularization in mice. FASEB J. , (2013).
- Toffoli, S., Michiels, C. Intermittent hypoxia is a key regulator of cancer cell and endothelial cell interplay in tumours. The FEBS journal. 275, 2991-3002 (2008).
- Das, B. Hypoxia enhances tumor stemness by increasing the invasive and tumorigenic side population fraction. Stem cells (Dayton, Ohio). 26, 1818-1830 (2008).
- Arndt, C. A., Rose, P. S., Folpe, A. L., Laack, N. N. Common musculoskeletal tumors of childhood and adolescence. Mayo Clin Proc. 87, 475-487 (2012).
- Mendoza, A. A novel noninvasive method for evaluating experimental lung metastasis in mice. J Am Assoc Lab Anim Sci. 52, 584-589 (2013).
- Feldman, D. B., Seely, J. C. Necropsy Guide: Rodents and the Rabbit. , CRC Press. (1988).
- Parkinson, C. M. Diagnostic necropsy and selected tissue and sample collection in rats and mice. J Vis Exp. , (2011).
- Raymond, A. K., Lazar, A. J. Bone Sarcoma. PP, L. in, S, P. atel , Springer. (2013).
- Dietel, M., Arps, H., Gerding, D., Trapp, M., Niendorf, A. Establishment of primary cell cultures: experiences with 155 cell strains. Klin Wochenschr. 65, 507-512 (1987).
- Varghese, A. J., Gulyas, S., Mohindra, J. K. Hypoxia-dependent reduction of 1-(2-nitro-1-imidazolyl)-3-methoxy-2-propanol by Chinese hamster ovary cells and KHT tumor cells in vitro and in vivo. Cancer Research. 36, 3761-3765 (1976).
- ATCC. , http://www.atcc.org/products/all/HTB-86.aspx#characteristics (2014).
