Introduction
Le sarcome d'Ewing (ES) est une tumeur maligne agressive affectant les enfants et les adolescents. 1 Les tumeurs se développent dans les tissus mous et les os, généralement dans les membres. Alors que la présence de métastases est le plus puissant facteur pronostique défavorable pour les patients ES, les mécanismes sous-jacents à leur développement restent floues. 2 est une tumeur hypoxie des quelques facteurs impliqués dans la progression ES. ES chez les patients, la présence de zones non perfusé dans le tissu de la tumeur est associée à un mauvais pronostic. 3 In vitro, l' hypoxie augmente invasivité des cellules ES et déclenche l' expression de gènes pro-métastatiques. 4-6 Cependant, malgré ces éléments de preuve, aucune preuve directe pour ES induite par l' hypoxie progression et la propagation existe. En outre, les mécanismes par lesquels l'hypoxie exerce de tels effets sont, à l'heure actuelle, inconnus. Par conséquent, nous avons créé un modèle in vivo pour combler l'écart entre les existants des données in vitro et obser cliniquevations. Ce système modèle permet de tester directement les effets de l' hypoxie sur les tumeurs qui se produisent dans leur environnement naturel, en utilisant l' imagerie par résonance magnétique (IRM) pour suivre la progression tumorale et les métastases in vivo en combinaison avec ex vivo analyses pathologiques et moléculaires (figure 1).
Comme aucun modèle transgénique établi des ES est actuellement disponible, les études in vivo sur les propriétés métastatiques de ces tumeurs reposent sur des injections de cellules humaines dans des souris immunodéprimées. Bien que l'utilisation d'animaux déficients immunologiquement peut sous-estimer l'impact du système immunitaire sur la progression de la maladie, la capacité d'utiliser des cellules humaines augmente traductibilité de ces études. Parmi les modèles de xénogreffes différents, les injections systémiques dans la veine caudale sont les plus faciles à réaliser, mais ils omettent les étapes initiales de cellules tumorales intravasation et d'échapper à partir du site principal de la croissance. 12/07 D'autre part, orthoto pic xénogreffe, qui implique des injections de cellules tumorales dans les os (fémur, côtes) ou les muscles, est techniquement plus difficile, mais aussi biologiquement plus pertinentes pour le cancer humain. 13-16 Cependant, dans le passé, le taux élevé de morbidité associée à la croissance rapide des tumeurs primaires a souvent nécessité l' euthanasie des animaux avant le développement de métastases. Dans cette étude, nous avons utilisé un modèle préalablement établi des injections de cellules dans le muscle gastrocnémien, suivie par l'excision de la tumeur primaire résultante combinée avec un suivi longitudinal de la progression métastatique par IRM. 17,18 Ces injections dans le muscle gastrocnémien à proximité du tibia permettent la croissance tumorale dans deux ES naturelles environnements - les muscles et les os - et entraîner des métastases à distance à des endroits généralement affectés chez les humains. 18 Ainsi, ce modèle récapitule avec précision les processus métastatiques qui se produisent chez les patients ES lors de la progression de la maladie.
tente "> La localisation des tumeurs primaires dans le hindlimb inférieur facilite également le contrôle précis de l'approvisionnement en sang dans le tissu tumoral. artère fémorale ligature (FAL) est une technique bien établie utilisée dans la recherche de l'angiogenèse pour bloquer le flux sanguin vers les régions distales la jambe et étudier vascularisation des tissus en réponse à une ischémie. 19,20 importante, la chute initiale dans le flux sanguin est suivi par une sûreté ouverture du vaisseau et la reperfusion tissulaire observée à environ 3 jours après la FAL. 20 Ainsi, lorsqu'il est effectué dans un membre porteur d'une tumeur, ce modèle recrée les événements hypoxie / reperfusion qui se produisent naturellement dans les tumeurs à croissance rapide et permet l'échappement des cellules tumorales métastatiques dues à la restauration de la perfusion du hindlimb inférieure via les vaisseaux collatéraux nouvellement ouverts. 21 Fait important, cette procédure doit être effectuée lorsque la taille de la tumeur est suffisamment faible pour prévenir l'hypoxie excessive dans les tumeurs témoins (typiquement au porteur d'une tumeur veau volume de 150-250 mm 3), assurant des différences significatives dans les niveaux de l' hypoxie tumorale entre les groupes témoins et FAL-traités.Outre le suivi longitudinal de l'effet de l'hypoxie sur ES latence et la fréquence des métastases, ce modèle permet également la collecte des tissus et le développement de nouvelles lignées cellulaires à partir des tumeurs primaires et des métastases. Surtout, les travaux antérieurs établi que des lignées de cellules de métastases dérivées présentent un potentiel métastatique accrue sur la réintroduction d'animaux, ce qui indique que la diffusion de la tumeur est associée à des changements permanents dans le phénotype de cellules tumorales et validant ainsi l'utilisation de ces lignées de cellules pour déchiffrer les processus métastatiques. 18 Collectivement, ces modèles peuvent maintenant être utilisés pour les analyses génétiques et moléculaires nécessaires à l' identification des voies métastatiques induite par l' hypoxie.
Comme l'hypoxie est un facteur pro-métastatique améliorant la malignité de divers tumors, notre modèle peut être utilisé comme une plate-forme pour étudier le rôle de l'hypoxie dans d'autres types de tumeurs qui se développent naturellement dans les membres, comme l'ostéosarcome et le rhabdomyosarcome. 21-23 En outre, une approche similaire peut être appliquée à des tumeurs malignes en croissance dans d' autres localisations anatomiques avec une voie d'approvisionnement en sang bien défini. En fin de compte, le modèle peut être modifié et son utilité en outre étendu, en fonction des besoins individuels de recherche.
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Protocol
Toutes les procédures ont été approuvées par le Comité institutionnel de protection et de l'utilisation des animaux de l'Université de Georgetown.
1. Préparation des cellules pour orthotopiques Injections
- Les cellules ES humaines Culture dans des conditions normales. Consommerait environ 15 cm, une plaque de culture cellulaire ne dépassant pas 70% de confluence pour l'injection de 5 souris.
NOTE: Pour cette étude, des cellules SK-ES1 ont été cultivées dans du milieu de McCoy 5A avec 15% de sérum bovin fœtal (FBS), sur des plaques revêtues de collagène et les cellules TC71 ont été cultivées dans du RPMI avec 10% de FBS et 1% de 4- (2-hydroxyethyl ) -1-piperazineethanesulfonic (HEPES). Les deux milieux ont été supplémentés avec des antibiotiques - la pénicilline (100 unités / ml), streptomycine (100 pg / ml) et de Fungizone (1 pg / ml). - Laver les cellules ES avec du tampon phosphate salin (PBS) et trypsiniser à 70% de confluence avec de la trypsine à 0,25% d'acide / éthylènediaminetétraacétique (EDTA) pendant 5 min.
- Retirez les cellules ES de la plaque avec la culture cellulaire media, puis centrifuger pendant 5 min à 200 x g à température ambiante. Re-suspendre les cellules ES dans 10 ml de PBS froid puis compter le nombre de cellules.
- Centrifugeuse cellules ES pour 5 min à 200 xg à la température ambiante, puis remettre en suspension à 2 x 10 7 (SK-ES1) ou 10 7 (TC71) cellules par ml dans du PBS froid. Gardez la suspension cellulaire finale sur la glace tout en effectuant des injections.
2. Injection orthotopique de cellules ES dans Gastrocnemius Muscle
- Utilisez 4-6 semaine vieux SCID femelle / souris beige.
- Pour injecter des cellules ES, tenir doucement la souris et stabiliser sa jambe gauche entre les quatrième et cinquième doigts, exposant le côté médial de la patte arrière inférieure.
- En utilisant une aiguille de 28 G ½, injecter 0,1 ml de la suspension de cellules préalablement préparée qui contient soit 2 x 10 6 (SK-ES1) ou 10 6 cellules (TC71) ES dans le muscle gastrocnémien (figure 2A).
NOTE: Bien que le volume maximum pour inj intramusculaireexions est généralement 0,05 ml, pour cette procédure particulière l'augmentation du volume à 0,1 ml est nécessaire en raison du nombre de cellules haute injecté. Cette procédure a été approuvée par le Comité institutionnel de protection et de l'utilisation des animaux de l'Université de Georgetown.- Insérez l'aiguille dans le muscle gastrocnémien à environ 30 en avant - angle de 45 degrés dans la direction de la crête tibiale / tubérosité.
- Légèrement retirer l'aiguille une fois qu'il touche la crête tibiale / tubérosité. Injecter lentement la solution de suspension cellulaire, retirant progressivement l'aiguille pour relâcher la pression.
- Surveiller les souris injectées au cours des 24 heures suivant les signes de détresse.
NOTE: Les chercheurs ayant moins d'expérience dans la manipulation des animaux devrait envisager anesthésier les souris pour les injections de cellules tumorales. Certaines institutions peuvent nécessiter une anesthésie pour des raisons de sécurité.
3. Suivi de la croissance tumorale primaire
- Surveiller la croissance des tumeurs primaires daily jusqu'à ce que la taille de la tumeur atteint le volume souhaité.
Remarque: Dans l'étude actuelle, un volume de veau de 250 mm 3 a été utilisé comme point de l'expérience (figure 2B) de départ. En règle générale, il faut environ 1 - 2 semaines pour que les tumeurs atteignent cette taille.- Mesurer la taille de veau quotidien avec étriers numériques via ses longueurs médio-latérale et antérieure-postérieure.
- Déterminer le volume du mollet par la formule (D xd 6/2) x 3,14 où D est le diamètre plus long et d est le diamètre plus court de la patte arrière inférieure portant une tumeur.
REMARQUE: La taille du mollet normale de la souris adulte est d'environ 40 - 50 mm 3. Son volume augmentera en raison de la croissance tumorale et aux stades ultérieurs du veau sera principalement composé de tissu tumoral.
4. Artère fémorale Ligation (FAL) pour Induire hypoxie dans la tumeur de membres postérieurs portant
- Préparer les outils chirurgicaux nécessaires à cette opération: CURved ou pinces fines pointues, pointues des pinces, des ciseaux chirurgicaux et un porte-aiguille. Stériliser ces outils avant l'intervention chirurgicale en utilisant un autoclave ou un stérilisateur à chaud perle. En outre, avoir des cotons-tiges fines prêtes pour cette chirurgie.
NOTE: Il est recommandé que les outils soient re-stérilisées aux conseils, au besoin au cours de la procédure. - Injecter agent analgésique (carprofène 5 mg / kg) par voie sous cutanée (SQ). Pour détecter et confirmer l'hypoxie, injecter hypoxyprobe-1 (pimonidazole, 60 mg / kg).
Remarque: cette dose équivaut à 1,5 mg par souris et est obtenue en injectant 0,1 ml d'une solution hypoxyprobe 15 mg / ml dans du PBS par voie intraperitoneale (IP). Le hypoxyprobe est ensuite post-mortem détectable dans les tissus animaux par immunohistochimie. - Placer la souris dans une chambre d'induction d'anesthésie contenant de 3 à 5% d'isoflurane dans 100% d'oxygène à un débit de 1 L / min.
- Laisser la souris dans la chambre d'aspiration jusqu'à ce qu'il soit insensible à des stimuli externes. Ensuite, retirer l'animal du ichambre nduction. Placer l'animal dans la position couchée sur un champ stérile placé au sommet d'un coussin chauffant sur la surface de fonctionnement. Utiliser un cône d'entrée pour le relier à un flux continu de 1-3% d'isoflurane dans 100% d'oxygène à un débit de 0,8 L / min.
- Appliquer une pommade ophtalmique non-médicamenteux stérile pour chaque œil pour éviter le dessèchement de la cornée. Pour épiler soigneusement la zone chirurgicale, appliquez une crème d'épilation, laissant sur la peau pendant plus de 10 sec. Ensuite, essuyez la crème d'épilation à l'aide d'un tampon éthanol de préparation.
- Étendre et sécuriser le hindlimb avec un morceau de ruban adhésif d'environ 45 degrés par rapport à la ligne médiane de la souris. Une fois que le hindlimb est sécurisé, essuyez la peau exposée avec 10% de povidone / iode tampon / solution, suivie par l'éthanol, en répétant deux fois plus chacune. Pour la suite de l'intervention chirurgicale, en utilisant un microscope stéréo pour obtenir une vue agrandie de la région de la patte arrière.
- En utilisant des pinces pointues et des ciseaux chirurgicaux, faire une incision de la skdans, environ 1 cm de long, de la mi-cuisse vers la région inguinale. En utilisant des tampons de coton fin salins-humidifié, brosser doucement le tissu adipeux sous-cutané entourant le muscle de la cuisse.
- révéler soigneusement l'artère fémorale sous-jacente par l'intermédiaire de dissection à travers le tissu adipeux sous-cutané. Stabiliser la plaie et champ chirurgical pour exposer la vascularisation du milieu du haut du muscle adducteur.
- En utilisant une pince fine, délicatement percer à travers la gaine fémorale membraneuse pour exposer le faisceau neurovasculaire. L'utilisation d'un ensemble propre de pinces fines, disséquer et séparer l'artère fémorale de la veine fémorale et du nerf à l'emplacement proximal près de l'aine, distale du ligament inguinal. Faites preuve de prudence pour éviter de percer la paroi de la veine fémorale.
- Après dissection, passer un brin de 6-0 suture de soie sous l'artère fémorale et distale par rapport à la branche de l'artère fémorale circonflexe latérale (LCFA). Obturer l'artère fémorale à l' aide doubles noeuds (figure 3). Fermer l'incision en utilisant 6-0 sutures en polypropylène. Après la fermeture de l'incision, injecter SQ 0,5 ml de solution saline chaude pour la thérapie de l'équilibre des fluides. Placez l'animal sur le dessus d'un tampon chaud drapé dans la cage de récupération et de surveiller en continu jusqu'à éveillé.
- Surveiller les animaux pendant 6 premières heures après la chirurgie et injecter l'agent analgésique (carprofène 5 mg / kg, SQ) chaque jour pendant 3 jours. Retirer les sutures 10 jours post-opératoires à l'aide de ciseaux stériles.
5. primaire Excision de la tumeur par Leg Amputation
REMARQUE: amputer la patte arrière inférieure portant une tumeur lorsque la taille de veau atteint 250 mm3 pour le groupe témoin ou 3 jours après la FAL du groupe hypoxique.
- Raser les poils de la branche portant la tumeur du tibia distal par rapport à la région pelvienne avec une tondeuse à cheveux tout en maintenant doucement l'animal. Injecter l'agent analgésique (carprofène 5 mg / kg, SQ) avant la procédure.
- Placez la souris dans une induction de l'anesthésie chambre contenant de 3 à 5% d'isoflurane dans 100% d'oxygène à un débit de 1 L / min. Laisser la souris dans la chambre d'aspiration jusqu'à ce qu'il soit insensible à des stimuli externes. Ensuite, retirer l'animal de la chambre d'induction.
- Placez l'animal dans la position couchée sur le côté droit sur un champ stérile placé sur un coussin chauffant sur la surface de travail. Utiliser un cône d'entrée pour le relier à un flux continu de l'isoflurane: 1 - 3% dans 100% d'oxygène à un débit de 0,8 L / min. Appliquer une pommade ophtalmique non-médicamenteux stérile pour chaque œil pour éviter le dessèchement de la cornée
- Préparer le site chirurgical en utilisant 10% de povidone / iode tampon / solution, puis de l'éthanol, en répétant 3 fois. Appliquer une gaze stérile (par exemple drap chirurgical) sur la souris pour obtenir un champ chirurgical stérile.
- Faire une incision cutanée médiane fémorale circonférentielle, suivie par dissection et la rétraction de la peau proximalement. Exposer le pédicule neurovasculaire médial du fémur sur le côté médian de la jambe, puis ligaturerprès du ligament inguinal en utilisant 4-0 enduit (polyglactine 910) du matériel de suture absorbable.
- Effectuer une transection de mi-fémoral de groupes musculaires avec des ciseaux, suivi par dissection des tissus mous de l'articulation coxofémorale. L'utilisation d'un coupe-os, effectuer une ostéotomie mi-fémorale. En utilisant un coton-tige bien stérile ou une éponge de gélatine absorbable, appuyez doucement sur le site de l'ostéotomie pour minimiser et prévenir les saignements.
- Fermez la peau sus-jacente en utilisant des agrafes chirurgicales et injecter 0,5 ml de solution saline chaude SQ pour la thérapie de l'équilibre des fluides. Placez l'animal sur le dessus d'un tampon chaud drapé dans la cage de récupération et de surveiller en continu jusqu'à éveillé.
- Après la chirurgie, prélever des échantillons de tissus provenant de tumeurs primaires pour l'ARN, l'ADN ou l'isolement des protéines, snap gel dans de l'azote liquide et conserver à -80 ° C. Pour la culture de cellules primaires, prélever des échantillons de tissus à cette étape, comme décrit dans la section 9 ci-dessous. Fixer le tissu du membre restant dans 10% de formaline neutre tamponnée pour histologie et immunochemisessayer, y compris hypoxyprobe-1 détection.
- Surveiller les animaux pour la locomotion, la douleur et la consommation alimentaire au cours des 6 premières heures après la chirurgie, puis tous les jours pendant 3 jours. Injecter l'agent analgésique (carprofène 5 mg / kg, SQ) par jour pendant 3 jours. Retirez les clips de la plaie 10 jours après l'amputation à l'aide d'un clip décapant blessure.
6. Les souris de surveillance pour la présence de métastases
- Observer les souris tous les jours et les évaluer pour les signes cliniques de métastases au moins deux fois par semaine.
- Observer les animaux pour la présence de macrométastases présentant comme des masses qui se développent dans divers endroits, typiquement les épaules, les jambes et les mâchoires controlatéral. À cette fin, palper soigneusement la tête, le cou et les régions axillaires et hindlimb controlatéral. Vérifiez les métastases des organes internes par distension abdominale ainsi que l'IRM.
- Vérifier la présence de métastases pulmonaires en appuyant sur le processus xiphoïde (l'extrémité inférieure du sternum) avec indépenx doigt. 24
NOTE: Cette pression diminue la capacité de respiration diaphragmatique. Les souris présentant des métastases pulmonaires avancés montrent des signes de détresse respiratoire qui se manifeste par une respiration laborieuse. - Observer les animaux pour des symptômes neurologiques, tels que la paralysie de la jambe et l'ataxie suggérant des métastases du système nerveux central.
- Surveiller les souris au moins une fois par semaine pour la perte de poids, comme une indication de la progression de la maladie potentielle. perte de poids corporel supérieur à 15% du poids avant la procédure est considérée comme un critère humain.
7. Imagerie par résonance magnétique (IRM) pour détecter les métastases
- Effectuer une IRM pour détecter les métastases à des points temporels souhaités. 18
NOTE: Dans l'étude actuelle, un spectromètre horizontal 7-Tesla a été utilisé. L'IRM a été réalisée à 15 jours et 35 post-amputation pour les cellules SK-ES1 et au jour 15 pour TC71 cellules. - Placez la souris dans une induction chambe d'anesthésier contenant 1 à 3% d'isoflurane dans un mélange gazeux de 30% d'oxygène et 70% d'oxyde d'azote.
- Laisser la souris dans la chambre d'aspiration jusqu'à ce qu'il soit insensible à des stimuli externes. Ensuite, retirer l'animal de la chambre d'induction.
- Transférer la souris anesthésiés sur un support stéréotaxique avec la respiration et de contrôle On température avec l'administration continue de 1,5% d'isoflurane et 30% d'oxyde nitreux. Appliquer une pommade ophtalmique non-médicamenteux stérile pour chaque œil pour prévenir la sécheresse de la cornée. L'image que l'animal soit dans une bobine de volume de souris 40 ou 23 mm Bruker pour le corps entier ou l'imagerie du cerveau, respectivement.
- Utilisez un, T2-séquence pondérée en deux dimensions RARE: TR = 3,000 msec, TE = 24 msec, matrice = 256, FOV = 4,35 x 3,0 cm, épaisseur de coupe = 0,5 mm, le facteur RARE = 4 et moyennes = 4. 18
- Placez l'animal dans une cage de récupération à chaud et de surveiller en continu jusqu'à éveillé.
REMARQUE: La souris va récupérer rapidement depuis un plan peu profond de l'anesthésie est utilisé. Surveiller les animaux pendant les 6 premières heures après l'imagerie pour vous assurer qu'il n'y a pas d'effets indésirables de l'anesthésie.
8. Euthanasie et Necropsy
- Euthanize les souris une fois que les animaux présentent des métastases détectables par IRM et / ou les symptômes cliniques de la progression de la maladie.
NOTE: Dans l'étude actuelle, les souris ont été sacrifiées aux jours 50 et 25 post-amputation pour les animaux portant SK-ES1 et TC71 xénogreffes, respectivement. Dans certains cas, l'euthanasie antérieure était nécessaire en raison d'une charge élevée de métastases. - Euthanize les souris par exposition au CO 2 à 1,5 L / min (CO 2 à 10 - 30% de la chambre d'euthanasie vol / min). Pour assurer la mort des animaux, effectuer la dislocation cervicale après CO 2 exposition.
- Vaporiser la totalité de la souris avec 70% d'éthanol et le placer dans la hotte à flux laminaire. Recueillir le sang par ponction cardiaque en utilisant une aiguille 25 G ½ avec une seringue de 1 ml et le transfert à une collecte de sang tuêtre contenant 2 mg d'EDTA.
- Collecter les tissus suivants: la rate, les glandes surrénales, les ovaires, les reins, le foie, les poumons, le cerveau, la jambe droite, la moelle osseuse à la fois humérus et la colonne vertébrale, ainsi que des métastases macroscopiques présentes dans d'autres endroits. 25,26
- Fixer la moitié de chaque tissu dans 10% de formaline neutre tamponnée pour l'histologie et de l'immunochimie, y compris hypoxyprobe-1 détection. Snap geler l'autre moitié dans de l'azote liquide, puis stocker à -80 ° C pour l'ARN, l'ADN ou l'isolement des protéines. 25,26 Pour la culture de cellules primaires, recueillir des échantillons de tissus comme décrit au paragraphe 9 ci - dessous.
9. Culture cellulaire primaire
- Pour effectuer la culture de cellules primaires, disséquer les tissus du membre amputé (section 5 ci-dessus) ou lors de la nécropsie (article 8 ci-dessus) dans des conditions stériles dans une hotte à flux laminaire.
- Préparer la culture cellulaire support approprié pour la lignée cellulaire utilisée pour les injections orthotopique, complété avec de la pénicilline (200 unités / ml),la streptomycine (200 ug / ml), fungizone (1 pg / ml) et 0,2% mycoplasmes antibiotique prophylactique. Placer 2,5 ml du milieu de culture primaire dans une plaque de culture cellulaire de 6 cm.
- Sélectionner des zones de tissu tumoral viable à partir de tumeurs primaires ou des métastases, puis isoler deux ou trois segments de 2-3 mm en utilisant chacun des ciseaux stériles.
NOTE: le tissu tumoral Viable se trouve généralement sur les bords de la tumeur et peut être discriminé de la nécrose par sa couleur rose ou rougeâtre, lustre significative et l'apparence générale humide. En revanche, les tissus nécrosés est souvent observée dans le centre de la tumeur et présente comme une crème masse blanchâtre / couleur avec une apparence de fromage terne. 27 - Transférer les segments isolés sur une plaque de culture cellulaire de 6 cm contenant un milieu de culture primaire décrite à l'étape 9.2.
- les cellules de culture dans des conditions standard, telles que décrites dans la section 1 (NOTE) et 9.2. 18,28 Vérifiez la culture pour l' excroissance cellulaire résultant des morceaux de tissu, which devrait être observé dans quelques jours. Une fois que les cellules atteignent la confluence, trypsiniser et les propager selon des techniques de culture cellulaire standard.
REMARQUE: La culture cellulaire primaire peut ensuite être utilisé pour évaluer la croissance et les propriétés métastatiques des cellules dérivées de contrôle et hypoxiques de tumeurs, ainsi que leurs caractéristiques moléculaires, comme décrit précédemment. 18
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Representative Results
Suite à l' injection de cellules ES dans le muscle gastrocnémien, les tumeurs primaires sont autorisées à croître à une taille de veau de 250 mm 3 (figure 1, 2). Le temps nécessaire pour que les tumeurs pour atteindre ce volume est généralement compris entre 10 - 15 jours pour TC71 à 20-25 jours de xénogreffes SK-ES1, respectivement. Les tumeurs à un volume de veau de 250 mm 3 présentent un degré d'hypoxie endogène relativement faible (environ 3% du tissu tumoral), sur la base hypoxybrobe-1 (pimonidazole) coloration (figure 4A, C). Fait important, dans ces tumeurs témoins, la coloration positive pour hypoxyprobe-1 a été observée uniquement dans les zones d'hypoxie physiologique, soit dans des cellules tumorales qui sont éloignées de la vasculature et commencent à subir une mort cellulaire (figure 4A). Cette coloration présente un motif "air-brush" caractéristique, tandis que la majeure partie du tissu tumoral sain reste négatif pour hypoxyprobe-1. <sup> 6 En revanche, FAL effectuée à ce stade crée une hypoxie profonde, comme en témoigne la coloration positive pour hypoxyprobe-1 observée dans la grande majorité des cellules tumorales à 4 heures post-FAL (figure 4B). En particulier, les cellules tumorales hypoxyprobe-1-positifs sont également observés à proximité de vaisseaux sanguins et le motif caractéristique de l'hypoxie physiologique est perdue. Dans ces tumeurs traitées par FAL, 73% du tissu est constituée de cellules tumorales hypoxiques (Figure 4C). Le tissu tumoral présente également les premiers signes de dommages induits par l' hypoxie, y compris le retrait de la cellule et de la structure lâche (figure 4B).
L'efficacité de la FAL est en outre étayée par l'inhibition complète de la croissance tumorale primaire. Au cours de la période de 3 jours entre FAL et l' amputation, la taille des tumeurs primaires n'a pas augmenté (figure 5A). En revanche, les tumeurs primaires de souris soumises à sham surgery a continué de croître rapidement, pour atteindre un volume d'environ 650 mm 3, imitant ainsi le taux de tumeurs chez les souris témoins non soumis à une intervention chirurgicale (figure 5A) de croissance. 18 Conformément à ces données, l' analyse histopathologique a révélé de vastes zones de nécrose dans les tumeurs primaires FAL traitées récoltées 3 jours après la chirurgie (figure 5B). Néanmoins, il y a des groupes de cellules tumorales viables présentes dans le tissu tumoral, généralement situés au niveau des bords de la tumeur, à proximité de la vasculature (figure 5B). Afin d'étudier l'état d'oxygénation de ces cellules, nous avons utilisé hypoxyprobes, qui sont activés dans les cellules hypoxiques vivantes, obtenant ensuite la capacité de se lier de manière covalente aux protéines à l'intérieur de ces cellules. 29 En tant que tels, ces sondes servent de marqueur permanent des cellules qui ont connu une hypoxie à tout moment. Ainsi, pour détecter des changements dans les niveaux de cellules tumorales d'oxygène pendant toute la durée de la expériment, nous avons utilisé deux hypoxyprobes différents qui peuvent être détectés indépendamment par immunohistochimie. Les sondes ont été administrées à deux points de temps - immédiatement avant FAL (hypoxyprobe-1) et avant l'amputation (hypoxyprobe-2, CCI-103F) - et leur localisation a été détectée dans les tumeurs récoltées 3 jours post-FAL (Figure 1). Hypoxyprobe-1, qui était présent dans le système au moment de la FAL, marqué à la majorité des cellules tumorales, car le tissu est devenu gravement hypoxiques (Figure 5C). Cet étiquetage est également évidente dans les zones de nécrose / apoptose, puisque ces cellules étaient encore en vie au moment de la FAL et donc capable de hypoxyprobe-1 liaison permanente, comme le montre la figure 4B. En revanche, hypoxyprobe-2 administré 2 jours post-FAL ne tachée cellules viables, comme les cellules dans les zones nécrotiques étaient déjà morts et incapables d'activer la sonde au moment de son administration (Figure 5D). Fait intéressant, nous OBSE aussirved tissu tumoral viable adjacent au système vasculaire qui était initialement hypoxique (hypoxyprobe-1-positives), mais suffisamment oxygéné au moment ultérieur (hypoxyprobe-2-négatif) (Figure 5C, D). Cette conclusion est en accord avec les rapports précédents indiquant que la garantie reperfusion tissulaire navire dépendant restaure le flux sanguin dans le hindlimb 3 jours post-FAL. 20 Les cellules tumorales viables restant dans le tissu de la tumeur 3 jours après FAL étaient très invasifs, comme le montre leur intravasculaire massive sur les bords de la tumeur vascularisée (figure 5E). Certaines des cellules au sein de la lumière du vaisseau étaient positifs pour hypoxyprobe-1, ce qui indique qu'ils étaient devenus hypoxique sur FAL, restait encore viable. Collectivement, ces données suggèrent que la reperfusion tissulaire suite à une hypoxie sévère peut faciliter l'échappement des cellules des tumeurs primaires.
Sur la base de l'expérience pilote, les métastases étaient généraliséesdétectable par IRM environ 35 jours après l'amputation pour xénogreffes SK-ES1, tandis que les cellules TC71 typiquement métastasés dans les 15 jours. Par conséquent, pour l'analyse comparative des métastases de latence et de la fréquence, l'IRM a été réalisée au jour 15 et 35 post-amputation pour les animaux porteurs de tumeurs SK-ES1, tandis qu'une imagerie au jour 15 était suffisant pour les souris présentant des tumeurs TC71. Euthanasie a été réalisée au jour 50 et le jour 25 pour les animaux avec SK-ES1 et TC71 xénogreffes, respectivement. Comme indiqué précédemment, les types les plus communs de métastases comprenaient des masses de tissus mous dans la région de l'épaule, ainsi que les métastases osseuses à jambes controlatéral, zone maxillaires et la colonne vertébrale pour les cellules SK-ES1, et du poumon et les tumeurs pelviennes pour TC71. 18 En outre, les métastases fréquentes aux organes internes, y compris les glandes surrénales, les poumons et le foie, ainsi que l' infiltration de la moelle osseuse, ont été observés chez des souris porteuses de xénogreffes traitées FAL-SK-ES1 (figure 6). D'une manière générale, l'hypoxie a augmenté significativementle (SK-ES1) ou d'un site spécifique (TC71) la fréquence globale et la multiplicité des métastases dans les deux lignées cellulaires. Cependant, les xénogreffes TC71 ont également développé des masses fréquentes récurrentes sur le site de l'amputation (25% pour le contrôle et 40% pour les tumeurs traitées FAL), comme décrit précédemment pour les grandes tumeurs primaires TC71. 18
Les tissus de contrôle et les tumeurs et les métastases primaires FAL-traitées peuvent aussi être une source de matériel pour les analyses moléculaires globales visant à l'identification des voies d'hypoxie activées impliquées dans la diffusion ES. Par exemple, nous avons observé des différences significatives dans les profils métabolomiques de contrôle et hypoxiques de tumeurs primaires (données non présentées). Nous avons également été en mesure d'isoler avec succès plusieurs lignées de cellules de tous les tissus ci-dessus. Dans de nombreux cas, les cellules dérivées de tumeurs traitées présentaient FAL des changements notables dans la morphologie, en comparaison avec les cellules d'origine et ceux dérivés de contrôle tuMors (figure 7A). La pureté de ces cultures cellulaires a été confirmée par immunocoloration positive pour le marqueur de sarcome d' Ewing, CD99 (Figure 7B). De plus, 100% des cellules dans les lignées cellulaires établies a un signal positif en hybridation fluorescente in situ (FISH) avec des sondes centromériques humaines, présentant souvent des nombres de chromosomes augmenté (figure 8A). L'origine humaine de ces cellules a été confirmée par l' analyse des chromosomes métaphasiques (figure 8B) qui présentaient des réarrangements cytogénétiques décrites précédemment pour les cellules SK-ES1 à la fois la ligne et les cellules de la cellule d' origine provenant de tumeurs FAL-traitées (figure 8B). 30
Figure 1. Présentation de l'ES Hypoxie Modèle. Les cellules ES (1 - 2 x 10 6) ont été injectés dans gastrocnemius les muscles des souris beiges SCID /. Une fois que les tumeurs primaires résultantes ont atteint un volume de veau de 250 mm3, les souris ont été divisées en deux groupes expérimentaux. Les souris du groupe témoin ont reçu une injection hypoxyprobe-1 (HP-1) et les tumeurs primaires ont été excisées par amputation d'un membre. Les souris du groupe hypoxique ont été injectés avec hypoxyprobe-1, puis soumis à une ligature de l'artère fémorale (FAL). Deux jours plus tard, les souris ont été injectées avec hypoxyprobe-2 (HP-2), puis les branches porteuses de tumeurs ont été amputées trois jours après l'AFA. Les animaux des deux groupes ont été suivis par une imagerie par résonance magnétique périodique (IRM). Une fois que les métastases sont devenus apparents sur la base de l'imagerie et les signes cliniques, les souris ont été euthanasiées et la présence de métastases a été confirmée par l'autopsie et des analyses histopathologiques. Le temps de la croissance tumorale, l'imagerie et l'euthanasie est basée sur le débit de cellules SK-ES1 de la croissance et des métastases. Notez que tout était nécessaire hypoxyprobe-2 pour établir la méthode et Visualize changements dans les niveaux d'hypoxie au cours de la période comprise entre le FAL et l'amputation des membres, son utilisation ne soit pas essentiel pour les expériences réelles. Par conséquent, cette étape ne sont pas inclus dans le protocole. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. Croissance de la tumeur primaire. A. l' image par résonance magnétique (IRM) d'un hindlimb intact. La flèche rouge indique l'emplacement et l'orientation de l'injection orthotopique de cellules tumorales. B. La tumeur primitive à un volume de veau d'environ 250 mm 3 de plus en plus dans le muscle gastrocnémien (contour rouge). flèches rouges indiquent les sites de destruction osseuse. T - tibia. S'il te plait Clécher ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3. Le site de l' artère fémorale Ligation. Un post-mortem représentant artériographie x-ray d'une souris 129S1 / SvJ perfusé avec du sulfate de baryum immédiatement après la ligature est montré pour mettre en évidence la présence de vaisseaux collatéraux pré-existants. Notez que bien que l'image représente deux ligatures (Xs), une distal par rapport à l'artère circonflexe latérale fémorale (LCFA) (rouge X) et un autre en amont de l'artère genu (blanc X), le modèle d'hypoxie tumorale seulement utilisé la ligature proximale, à proximité le ligament inguinal et distal du LCFA (X rouge). La région de développement des vaisseaux collatéraux est représenté comme décrit (navires faibles), et ils sont identifiés par leur, forme tortueuse en tire-bouchon. S'il vous plaît cliquez sur ilre pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4. Tumeur hypoxie induite par l' artère fémorale Ligation (FAL). A. Une tumeur de contrôle à un volume de veau de 250 mm 3 colorées par hématoxyline et éosine (H & E) et immunocoloration pour hypoxyprobe-1 (marron). Hypoxyprobe-1 immunocoloration est observée uniquement dans les zones d'hypoxie tumorale physiologique, où les cellules tumorales éloignées du système vasculaire sont privées d'oxygène et commencent à subir une mort cellulaire. B. FAL-traité la tumeur primaire à une taille similaire récolté 4 heures post-ligature et colorées avec H & E et immunocolorée pour hypoxyprobe-1. La majorité des cellules tumorales sont hautement positives pour hypoxyprobe-1, y compris celles à proximité de la vasculature. V - vaisseau sanguin. C. La zone de coloration positive pour hypoxyprobe-1 était QUANTIFied dans les tumeurs de contrôle et FAL-traitées en utilisant le logiciel ImageJ. Les barres d'erreur représentent SEM. *** - P <0,001 S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 5. Effet de l' artère fémorale Ligation (FAL) sur la croissance de la tumeur primaire. La croissance de la tumeur primaire A. au cours de la période de 3 jours entre la chirurgie et l' amputation dans FAL- (n = 4) et la chirurgie fictive traités (n = 4) les animaux, comparativement aux tumeurs témoins intacts (n = 6). Les barres d'erreur représentent SD. *** - P <0,001, par comparaison avec les tumeurs traitées en chirurgie et de contrôle factice. B. hématoxyline et éosine (H & E) coloration d'une tumeur traitée FAL récolté 3 jours post-ligature révèle une nécrose généralisée au sein de la tumeur. Le contour rouge indique une zone de cen tumeur viablells à proximité d'une région hautement vascularisé perfusés 3 jours post-FAL. Tissu tumoral C. FAL traité récolté 3 jours post-chirurgie immunocoloration pour hypoxyprobe-1. Hypoxyprobe-1 a été injecté avant FAL. Par conséquent, l'immunomarquage positif indique l'existence d'une vaste hypoxie tissulaire immédiatement après la chirurgie. D. Hypoxyprobe-2 a été injecté 2 jours post-FAL, et le tissu recueilli 24h plus tard, à l' amputation. Positive hypoxyprobe-2 coloration identifie une hypoxie tissulaire au moment de l'amputation. La flèche rouge indique le tissu qui est hypoxique aux deux points de temps tandis que la flèche jaune indique une zone adjacente à la vascularisation qui était hypoxique immédiatement après FAL (hypoxyprobe-1-positif), mais négatif pour hypoxyprobe-2 au moment de l'excision, qui est indicative d'une reperfusion tissulaire. L'absence de coloration hypoxyprobe-2 dans les zones nécrotiques suggère que les cellules dans cette région, ne sont pas viables au moment de son administration et, par conséquentincapable de se lier activement la sonde. La coloration présenté dans les panneaux BD a été réalisée sur des coupes en série de tissus. E. intravasculaire dans la tumeur 3 jours post-fal fal-traitée. L'immunocoloration identifie les cellules viables positives pour hypoxyprobe-1 au sein de la lumière du vaisseau (flèche rouge). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 6. Exemples de métastases chez des souris porteuses FAL-traités Tumeurs SK-ES1. Les métastases ont été détectées par l'imagerie par résonance magnétique (IRM) et confirmés par l'autopsie et des analyses histopathologiques (hématoxyline et éosine, H & E). M - métastases. S'il vous plaît cliquer ici pour voir un plus grand vers ion de ce chiffre.
Figure 7. Caractéristiques des cellules dérivées de tumeurs primaires FAL-traités. A. cultures de cellules viables ont été établies à partir de tissus prélevés sur des tumeurs primaires et de contrôle hypoxiques et leur morphologie ont été comparées aux lignées de cellules d' origine utilisées pour les injections initiales orthotopique. Les cellules dérivées de tumeurs primaires traitées présentent FAL-changements spectaculaires dans leur taille et leur morphologie. Des images représentatives des cellules originales et primaires dérivées de tumeurs SK-ES1 sont présentés. B. images représentatives des cellules dérivées de tumeurs traitées par FAL immunocolorées pour le marqueur ES, CD99 et contre -colorées avec le colorant de liaison à l' ADN, DAPI. Toutes les cellules sont CD99-positives, y compris les cellules hypertrophiques contenant des noyaux élargie (flèche blanche). oad / 54532 / 54532fig7large.jpg "target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 8. Analyse chromosomique des cellules dérivées de tumeurs traitées par FAL. A. Fluorescence hybridation in situ (FISH) analyse dans les cellules interphase montrant deux noyaux avec des signaux pour centromérique humain 4 sonde. Le gros noyau avec quatre signaux indique une (4n) cellule tétraploïde (flèche blanche). B. Analyse FISH en métaphase représentatifs de la lignée cellulaire d' origine SK-ES1 et de la cellule dérivée d' une tumeur primaire FAL-traitée. Les flèches rouges indiquent inv (1) (p13.1q21), un réarrangement cytogénétique non aléatoire caractéristique des cellules SK-ES1. signaux rouges: centromérique humaine 4 de la sonde; Signaux verts dans les cellules SK-ES1 originales: sonde NPY5R sur le chromosome 4q32.2.e.com/files/ftp_upload/54532/54532fig8large.jpg "target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Notre modèle implique la comparaison des métastases dans les deux groupes expérimentaux - un groupe de contrôle, où on laisse les tumeurs se développer dans la patte arrière suivie d' une amputation après avoir atteint un volume de veau de 250 mm 3, et un groupe hypoxie exposée, dans laquelle l' une tumeur hindlimb roulement est soumise à un FAL au même volume, suivie par une amputation 3 jours plus tard. Bien que, dans ces expériences, les tumeurs traitées par FAL sont amputés avec un léger retard par rapport aux tumeurs témoins, leur taille ne pas augmenter au cours de la période de 3 jours entre la ligature et l'amputation. Par conséquent, cette approche permet de comparer le potentiel métastatique entre les tumeurs de tailles comparables, mais avec considérablement différents niveaux de l'hypoxie. En revanche, en utilisant une intervention chirurgicale fictive, un contrôle couramment utilisé pour des interventions chirurgicales, suivi de 3 jours de croissance de la tumeur entraînerait des différences significatives dans la taille de la tumeur entre les groupes expérimentaux, avec le simulacre de chirurgie traitertumeurs primaires ed possédant des niveaux significatifs de l'hypoxie endogène. Sur la base des expériences pilotes, une intervention chirurgicale fictive ne modifie pas significativement la croissance tumorale ou les niveaux d'hypoxie et peut donc être éliminé de la conception expérimentale. Au lieu de cela, la stratégie consistant à comparer des tumeurs de tailles similaires et différents niveaux d'hypoxie est un modèle très pertinent pour élucider les effets de l'hypoxie sur la diffusion de la maladie. Il est important, à la différence précédente dans les études in vitro, cette approche permet une évaluation globale des actions pro-métastatiques de l' hypoxie dans un microenvironnement tumoral naturel. 4-6
L'objectif de la conception expérimentale était d'atteindre un faible niveau de base de métastases qui permettraient la détection d'un effet de stimulation induite par l'hypoxie sur leur formation. Nous avons établi que la taille de veau de 250 mm 3 au FAL et l' amputation était optimale pour les tumeurs primaires SK-ES1. Cependant, ce paramètre doit être optimisé pour ea lignée cellulaire ch, en fonction de leur potentiel invasif et métastatique locale. Pour les tumeurs ayant un potentiel métastatique plus élevée, la taille de la tumeur primaire à une amputation peut devoir être réduite. Par exemple, les tumeurs TC71 présentent une invasivité locale élevée manifestée par la formation fréquente de tumeurs récurrentes sur le site de l'amputation. 18 Une fois que ces masses se développent, les animaux doivent être exclus des analyses, car il ne serait pas clair si des métastases à distance ultérieures provenaient des tumeurs primaires ou de tumeurs récurrentes qui se développent souvent rapidement et présentent des niveaux élevés de l' hypoxie endogène. De l' expérience précédente, indépendamment de la lignée cellulaire utilisée, 150 mm 3 est la tumeur portant la taille de veau minimal qui peut être mesurée de manière fiable et normalisée. Si la diminution de la taille de la tumeur au FAL et l'amputation ne supprime pas les tumeurs récurrentes ou diminuer le taux de métastases basale suffisamment, la lignée cellulaire en question peut ne pas convenir à ces expériences.
ve_content "> De même, il est important d'établir la chronologie de l'IRM et de l'euthanasie pour chaque ligne de cellule individuelle, en fonction de la latence de ses métastases. Notamment, les clips de plaies chirurgicales qui interfèrent avec l'IRM peuvent être retirées au plus tôt 10 jours post la chirurgie, et cette période doivent parfois être prolongés en raison de complications avec la guérison. ainsi, dans cette étude, nous avons établi 15 jours comme le temps de la première IRM.Une autre considération importante dans ce modèle est de maintenir un niveau d'hypoxie capable d'induire des processus métastasiques sans provoquer de nécrose tumorale complète, ce qui permettrait d'éviter la dissémination des cellules tumorales. Bien que nous ayons pas rencontré ce problème dans cette étude, le cas échéant, de la gravité de l'hypoxie peut être régulée en modifiant l'emplacement exact et le nombre de ligatures par rapport aux branches de l'artère fémorale, comme le LCFA et genu artère. 20 Ainsi, une extrémité proximale de ligature à l'LCFA va créer une ischémie plus sévère dans le salutla circulation ndlimb, augmentant ainsi les conditions hypoxiques dans la jambe distale. En revanche, la ligature distale par rapport à des branches suivantes de l'artère fémorale diminue l'hypoxie entraîne la patte arrière inférieure.
Surtout, il n'y avait pas d'effets indésirables graves des procédures de FAL et amputation combinées et aucun décès liés aux interventions chirurgicales, comme indiqué précédemment pour ces techniques effectuées séparément. 18-20 Ainsi, le succès de cette méthode est limitée principalement par le taux d' utilisation de la tumeur au niveau du site primaire et la fréquence des tumeurs récurrentes, qui sont toutes deux dépendantes ligne cellulaire.
Hypoxie a été impliquée en tant que facteur pro-métastatique nombreux types de tumeurs, cette approche peut également être adapté pour tester directement les effets et la définition de ses mécanismes d'action dans d'autres sarcomes qui se développent dans les membres. 23 Par ailleurs, une stratégie similaire peut être appliquée à d' autres tumeurs malignes dans des environnements de plus en plus orthotopique wvec un itinéraire d'approvisionnement en sang bien défini. Ainsi, avec les modifications appropriées, ce modèle peut être un outil utile dans la recherche au-delà du domaine de la biologie ES.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SK-ES1 Human Ewing sarcoma (ES) cells | ATCC | ||
| TC71 Human ES cells | Kindly provided from Dr. Toretsky | ||
| McCoy's 5A (modified) Medium | Gibco by Life Technologies | 12330-031 | |
| RPMI-1640 | ATCC | 30-2001 | |
| PBS | Corning Cellgro | 21-040-CV | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442-500mL | |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1x) | Gibco by Life Technologies | 25200-056 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco by Life Technologies | 15140-122 | |
| Fungizone® Antimycotic | Gibco by Life Technologies | 15290-018 | |
| MycoZap™ Prophylactic | Lonza | VZA-2032 | |
| Collagen Type I Rat tail high concetration | BD Biosciences | 354249 | |
| SCID/beige mice | Harlan or Charles River | 250 (Charles River) or 18602F (Harlan) | |
| 1 ml Insulin syringes with permanently attached 28 G ½ needle | BD | 329424 | |
| Saline (0.9% Sodium Chloride Injection, USP) | Hospira, INC | NDC 0409-7984-37 | |
| Digital calipers | World Precision Instruments, Inc | 501601 | |
| Surgical Tools | Fine Science Tools | ||
| Rimadyl (Carprofen) Injectable | Zoetis | ||
| Hypoxyprobe-1 (Pimonidazole Hydrochloride solid) | HPI, Inc | HP-100mg | |
| hypoxyprobe-2 (CCI-103F-250 mg) | HPI, Inc | CCI-103F-250mg | |
| Povidone-iodine Swabstick | PDI | S41350 | |
| Sterile alcohol prep pad | Fisher HealthCare | 22-363-750 | |
| LubriFresh P.M. (eye lubricant ointment) | Major Pharaceuticals | NDC 0904-5168-38 | |
| VWR Absorbent Underpads with Waterproof Moisture Barrier | VWR | 56617-014 | |
| Oster Golden A5 Single Speed Vet Clipper with size 50 blade | Oster | 078005-050-002 (clipper), 078919-006-005 (blade) | |
| Nair Lotion with baby oil | Church & Dwight Co., Inc. | ||
| Silk 6-0 | Surgical Specialties Corp | 752B | |
| Prolene (polypropylene) suture 6-0 | Ethicon | 8680G | |
| Vicryl (Polyglactin 910) suture 4-0 | Ethicon | J386H | |
| Fisherbrand Applicators (Purified cotton) | Fisher Scientific | 23-400-115 | |
| GelFoam Absorbable Dental Sponges - Size 4 | Pfizer Pharmaceutical | 9039605 | |
| Autoclip Wound Clip Applier | BD | 427630 | |
| Stereo Microscope | Olympus | SZ61 | |
| Autoclip remover | BD | 427637 | |
| Aound clip | BD | 427631 | |
| MRI 7 Tesla | Bruker Corporation | ||
| Paravision 5.0 software | Bruker Corporation | ||
| CO2 Euthanasia system | VetEquip | ||
| 25 G 5/8 Needle (for heart-puncture) | BD | 305122 | |
| 0.1 ml syringe (for heart-puncture) | Terumo | SS-01T | |
| K3-EDTA Micro tube 1.3 ml | Sarstedt | 41.1395.105 | |
| 10% Neutral Buttered Formalin | Fisher Scientific | SF100-4 |
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