Introduction
Ewing-Sarkom (ES) ist eine aggressive Krebserkrankung Kindern und Jugendlichen zu beeinträchtigen. 1 Die Tumoren entwickeln sich in Weichgewebe und Knochen, die üblicherweise in den Gliedern. Während das Vorhandensein von Metastasen für ES Patienten die einzige stärksten negativen prognostischer Faktor ist, bleiben die zugrunde liegenden Mechanismen ihrer Entwicklung unklar. 2 Tumorhypoxie ist eines der wenigen Faktoren in ES Progression beteiligt ist . In ES-Patienten wird das Vorhandensein von nicht-durchbluteten Bereichen innerhalb des Tumorgewebes mit einer schlechten Prognose verbunden. 3 In vitro erhöht Hypoxie Invasivität von ES - Zellen und löst die Expression von pro-metastatischen Gene. 4-6 Doch trotz dieser Beweislinien, keinen direkten Beweis für Hypoxie-induzierte ES Progression und Verbreitung besteht. Darüber hinaus sind die Mechanismen, durch die Hypoxie solche Wirkungen ausübt, sind derzeit nicht bekannt. Daher haben wir ein in vivo - Modell zu füllen die Lücke zwischen den bestehenden In - vitro - Daten und der klinischen Obser erstelltvationen. Dieses Modellsystem ermöglicht die direkte Prüfung der Wirkungen von Hypoxie auf Tumoren in ihrer natürlichen Umgebung auftritt, Magnetresonanz - Bildgebung (MRI) der Tumorprogression und Metastasierung in vivo in Kombination mit ex vivo pathologischen und molekularen Analysen (Abbildung 1) zu folgen.
Da keine etablierte transgenes Modell ES derzeit verfügbar ist, die in vivo Studien an metastatischen Eigenschaften dieser Tumoren beruhen auf Injektionen von menschlichen Zellen in immungeschwächten Mäusen. Während die Verwendung von immunologisch beeinträchtigt Tiere auf dem Fortschreiten der Krankheit, die Auswirkungen des Immunsystems unterschätzen können, erhöht die Fähigkeit, menschliche Zellen zu verwenden Translatierbarkeit solcher Studien. Unter den verschiedenen Xenotransplantatmodellen, sind systemische Injektionen in die Schwanzvene am einfachsten zu führen, aber sie lassen Sie die ersten Schritte der Tumorzelle intravasation und die Flucht aus dem primären Standort des Wachstums. 12.07 Auf der anderen Seite, orthoto pic xenografting, die Injektionen von Tumorzellen in Knochen (Femur, Rippe) oder Muskeln betrifft, ist technisch anspruchsvoll, aber auch mehr biologisch relevanten menschlichen Krebs. 13-16 jedoch in der Vergangenheit die hohe Morbidität mit raschem Wachstum von primären Tumoren ist oft notwendig Einschläferung vor Metastasierung Entwicklung. In dieser Studie verwendeten wir ein zuvor etabliertes Modell von Zellinjektionen in den Gastrocnemius-Muskel durch Exzision des resultierenden primären Tumors gefolgt mit Längs Überwachung des metastasierten Progression durch MRT kombiniert. 17,18 Solche Injektionen in gastrocnemius Muskel in der Nähe der Tibia erlauben für das Tumorwachstum in zwei natürlichen ES Umgebungen - Muskeln und Knochen - und in Fernmetastasen zu Orten führen in der Regel bei Menschen betroffen. Dadurch 18, ist dieses Modell rekapituliert genau die metastatische Vorgänge im ES Patienten während der Progression der Erkrankung.
Zelt "> Die Lokalisierung von Primärtumoren in der unteren hindlimb erleichtert auch die präzise Steuerung der Blutversorgung der Tumorgewebe. A. femoralis Ligatur (FAL) eine gut etablierte Technik, die in Angiogenese Forschung verwendet wird, ist der Blutfluss zu den distalen Regionen zu Block von das Bein und Gewebedurchblutung in Reaktion auf Ischämie untersuchen. 19,20 Wichtig ist , dass der anfängliche Abfall des Blutfluss wird durch Sicherheiten Gefäßöffnung und Gewebe Reperfusion beobachtet ca. 3 Tage nach FAL gefolgt. 20 wenn also in einem tumortragenden Glied durchgeführt, dieses Modell erschafft Hypoxie / Reperfusion Ereignisse , die natürlich in schnell wachsenden Tumoren und ermöglicht das Entweichen von metastasierenden Tumorzellen aufgrund Wiederherstellung der Perfusion an der unteren hinteren Gliedmaßen über neu eröffneten Kollateralen auftreten. 21 ist wichtig, dass dieses Verfahren durchgeführt werden , wenn die Tumorgröße ist klein genug, um eine übermäßige Hypoxie in Kontrolltumoren (typischerweise bei dem tumortragenden calf vol zu verhindernume von 150 bis 250 mm 3), signifikante Unterschiede in der Höhe der Tumorhypoxie zwischen Kontrolle und FAL behandelten Gruppen zu gewährleisten.Zusätzlich zur Längs Überwachung der Auswirkung der Hypoxie auf ES-Latenz und der Häufigkeit von Metastasen dieses Modell ermöglicht auch die Sammlung von Geweben und die Entwicklung neuer Zelllinien von sowohl primären Tumoren und Metastasen. Wichtig ist, dass festgestellt früheren Arbeiten, dass Metastasen abgeleiteten Zelllinien bei Wiedereinführung an Tiere verbessert metastatischen Potential aufweisen, was darauf hinweist, dass die Tumorausbreitung mit dauerhaften Veränderungen in der Tumorzelle Phänotyp assoziiert ist, und dadurch die Verwendung dieser Zelllinien Validierung der metastatischen Prozessen zu dechiffrieren. Insgesamt 18 Diese Modelle können nun für die genetische und molekulare Analysen zur Identifizierung von Hypoxie-induzierte metastasierendem Wege erforderlich verwendet werden.
Da Hypoxie ist ein Pro-metastatischen Faktor die Bösartigkeit verschiedener t Verbesserungumors, unser Modell kann als Plattform genutzt werden, um die Rolle von Hypoxie in anderen Tumorarten zu untersuchen, die von Natur aus in den Gliedern, wie Osteosarkom und Rhabdomyosarkom entwickeln. 21-23 Darüber hinaus kann ein ähnlicher Ansatz zu Malignitäten mit einer gut definierten Weg der Blutversorgung wächst in anderen anatomischen Stellen aufgebracht werden. Letztlich kann das Modell modifiziert und ihre Nutzbarkeit weiter ausgebaut werden, je nach individuellen Forschungsbedarf.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle Verfahren wurden von der Georgetown University Institutional Animal Care und Use Committee genehmigt.
1. Zellpräparation für Orthotopische Injections
- Kultur humanen ES-Zellen unter Standardbedingungen. Verwenden Sie etwa eine 15-cm-Zellkulturplatte nicht mehr als 70% der Konfluenz von mehr als für die Injektion von 5 Mäusen.
HINWEIS: Für diese Studie wurden SK-ES1-Zellen wurden in McCoy 5A-Medium mit 15% fötalem Rinderserum (FBS) auf Kollagen beschichteten Platten und TC71-Zellen in RPMI kultiviert wurden mit 10% FBS und 1% 4- (2-hydroxyethyl ) -1-piperazinethansulfonsäure (HEPES). Penicillin (100 Einheiten / ml), Streptomycin (100 ug / ml) und Fungizon (1 ug / ml) - Beide Medien wurden mit Antibiotika ergänzt. - Waschen Sie die ES-Zellen mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) und trypsinize bei 70% Konfluenz mit 0,25% Trypsin / Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) für 5 min.
- Entfernen Sie die ES-Zellen von der Platte mit Zellkultur media, dann für 5 min Zentrifugation bei 200 xg bei Raumtemperatur. Re-suspend die ES-Zellen in 10 ml kaltem PBS und dann die Anzahl der Zellen zu zählen.
- Zentrifuge ES Zellen 5 min bei 200 xg bei Raumtemperatur und dann erneut zu suspendieren bei 2 x 10 7 (SK-ES1) bzw. 10 7 (TC71) Zellen pro ml in kaltem PBS. Halten Sie die Zellsuspension auf Eis, während Injektionen durchgeführt wird.
2. Orthotopische Injektion von ES-Zellen in Gastrocnemius Muskel
- Verwenden Sie 4-6 Wochen alten weiblichen SCID / beige Mäuse.
- Um ES-Zellen injizieren, sanft die Maus halten und zu stabilisieren, seine linke Bein zwischen dem vierten und fünften Finger, die mediale Seite des unteren hinteren Gliedmaßen ausgesetzt wird.
- Unter Verwendung einer 28 G ½ Nadel injizieren 0,1 ml der zuvor hergestellten Zellsuspension , die entweder 2 × 10 6 (SK-ES1) oder 10 6 (TC71) ES - Zellen in den Gastrocnemius - Muskel enthält (Abbildung 2A).
Hinweis: Obwohl maximale Lautstärke für die intramuskuläre injexionen beträgt typischerweise 0,05 ml, für dieses bestimmte Verfahren auf 0,1 ml der Volumenzunahme aufgrund der hohen Anzahl von Zellen injiziert notwendig ist. Dieses Verfahren wurde von der Georgetown University Institutional Animal Care und Use Committee genehmigt.- Führen Sie die Nadel in die gastrocnemius Muskel nach vorn bei etwa eine 30 - 45-Grad-Winkel in Richtung des Tibiakante / Tuber.
- Etwas die Nadel zurückziehen, sobald sie die Tibiakante / Tuber berührt. Langsam injizieren Lösung die Zellsuspension, allmählich die Nadel herausgezogen Druck abzulassen.
- Überwachen Sie die injizierten Mäusen in den nächsten 24 Stunden für Anzeichen von Leiden.
HINWEIS: Die Ermittler mit weniger Erfahrung im Umgang mit Tieren sollte anesthetizing Mäuse für die Tumorzellinjektionen in Betracht ziehen. Einige Einrichtungen können Anästhesie aus Sicherheitsgründen erforderlich.
3. Überwachung der Primärtumorwachstum
- Überwachen Sie das Wachstum von Primärtumoren daily, bis die Tumorgröße erreicht das gewünschte Volumen.
HINWEIS: In der aktuellen Studie, ein Kalb Volumen von 250 mm 3 wurde als Startpunkt des Experiments verwendet wird (2B). Typischerweise dauert es ca. 1 - 2 Wochen für die Tumore dieser Größe zu erreichen.- Messen Sie die Wadengröße täglich mit digitalen Sätteln über seine medial-lateral und anterior-posterioren Längen.
- Bestimmen die calf Volumen durch die Formel (D xd 2/6) x 3,14, wobei D der längere Durchmesser und d der kürzere Durchmesser der Tumor-tragenden unteren hinteren Gliedmaßen.
HINWEIS: Die Größe des normalen erwachsenen Maus calf ist von etwa 40 - 50 mm 3. Sein Volumen wird aufgrund des Tumorwachstums zu erhöhen und bei den späteren Phasen das Kalb wird in erster Linie von Tumorgewebe bestehen.
4. Femoralarterie Ligatur (FAL) zum Induzieren Hypoxie in dem Tumor-tragenden hinteren Gliedmaßen
- Bereiten Sie die chirurgische Instrumente für diesen Vorgang benötigt: curved oder spitz feinen Pinzette, spitz Pinzetten, chirurgische Scheren und Nadelhalter. Sterilisieren Sie diese Tools vor der Operation einen Autoklaven oder einen Wärmetönungs Sterilisator verwenden. Zusätzlich haben, Wattestäbchen feine bereit für diese Operation.
HINWEIS: Es wird empfohlen, dass die Werkzeuge an den Spitzen erneut sterilisiert werden, da während des Verfahrens erforderlich ist. - Injizieren Analgetikum (Carprofen 5 mg / kg) subkutan (SQ). Zur Erkennung und Hypoxie bestätigen, injizieren hypoxyprobe-1 (pimonidazole, 60 mg / kg).
ANMERKUNG: Diese Dosis entspricht 1,5 mg pro Maus und wird erreicht, indem 0,1 ml einer 15-mg / ml-Lösung in PBS hypoxyprobe Injektion intraperitoneal (IP). Die hypoxyprobe ist dann nachweisbar Obduktion in tierischen Geweben durch Immunhistochemie. - Platzieren Sie die Maus in einer Anästhesieinduktionskammer enthält, 3 bis 5% Isofluran in 100% Sauerstoff bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 1 l / min.
- Lassen Sie die Maus in die Induktionskammer, bis er nicht mehr reagiert auf äußere Reize ist. Dann entfernen Sie das Tier aus dem induction Kammer. Legen Sie das Tier in Rückenlage auf einem sterilen Tuch auf einem wärmenden Pad auf der Arbeitsfläche platziert. Verwenden, um einen Nasenkonus an einen kontinuierlichen Fluss von 1 zu verbinden - 3% Isofluran in 100% Sauerstoff bei einer Flussrate von 0,8 L / min.
- Bewerben sterile nicht-medizinischen Augensalbe für jedes Auge Hornhaut Austrocknen zu verhindern. Um gründlich den OP-Bereich enthaaren, gelten Enthaarungscreme, es auf der Haut zu verlassen für nicht mehr als 10 Sekunden. die Enthaarungscreme mit einem Ethanoltupfer abwischen.
- Verlängern und sichern Sie den hinteren Gliedmaßen mit einem Stück Klebeband etwa 45 Grad von der Mittellinie der Maus. Sobald die hinteren Gliedmaßen sicher ist, wischen Sie die betroffene Hautpartien mit 10% Povidon / Iod-Tupfer / Lösung, gefolgt von Ethanol, je zwei weitere Male wiederholen. Für den Rest des chirurgischen Eingriffs, mit einem Stereomikroskop eine vergrößerte Ansicht des hinteren Gliedmaßen Region zu erhalten.
- Mit spitzen Pinzette und chirurgische Scheren, machen einen Einschnitt des skin ca. 1 cm lang, von der Mitte des Oberschenkels in Richtung der Leistengegend. Mit Kochsalzlösung befeuchtet feinen Wattestäbchen, Bürste sanft subkutanes Fett Gewebe um den Oberschenkelmuskel entfernt.
- Vorsichtig zeigen die darunter liegende Femoralarterie über stumpfe Präparation durch das subkutane Fettgewebe. Stabilisieren Sie die Wunde und OP-Feld das Gefäßsystem des mittleren oberen Schließmuskel zu belichten.
- Mit einer feinen Pinzette vorsichtig stechen durch die membranartige Oberschenkelscheide das Gefäßnervenbündel zu belichten. Mit einem sauberen Satz von feinen Pinzette, sezieren und die Oberschenkelarterie aus der Oberschenkelvene und Nerven in der Nähe der Leiste, distal des Leistenbandes am proximalen Stelle trennen. Seien Sie vorsichtig, Einstechen in die Oberschenkelvene Wand zu vermeiden.
- Nach Präparation, passieren einen Strang von 6-0 Seidennaht unterhalb der Femoralarterie und distal der Zweig der A. circumflexa femoris lateralis (LCFA). Verschließen Sie die Femoralarterie mit Doppelknoten (Abbildung 3). Schließen Sie den Schnitt mit 6-0 Polypropylen Nähten. Nach dem Schnitt zu schließen, SQ 0,5 ml warmem Salzlösung für den Flüssigkeitshaushalt Therapie injizieren. Legen Sie das Tier auf einem drapierten warmen Pad im Erholungskäfig und überwachen kontinuierlich bis wach.
- Überwachen Sie die Tiere während der ersten 6 Stunden nach der Operation und injizieren das Analgetikum (Carprofen 5 mg / kg, SQ) jeden Tag für 3 Tage. Entfernen Nähte 10 Tage nach der Operation mit einer sterilen Schere.
5. Primärtumor Exzision von Beinamputation
HINWEIS: amputieren die tumortragenden unteren hinteren Gliedmaßen , wenn das Kalb Größe 250 mm 3 für die Gruppensteuerung erreicht oder 3 Tage nach FAL für die hypoxische Gruppe.
- Shave Haar aus dem tumortragenden Glied aus der distalen Tibia auf den Beckenbereich mit Haarschneidemaschinen, während sanft um das Tier zu halten. Spritzen Sie das Analgetikum (Carprofen 5 mg / kg, SQ) vor dem Eingriff.
- Platzieren Sie die Maus in eine Narkoseeinleitung chamber enthaltend 3 bis 5% Isofluran in 100% Sauerstoff bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 1 l / min. Lassen Sie die Maus in die Induktionskammer, bis er nicht mehr reagiert auf äußere Reize ist. Dann entfernen Sie das Tier aus der Induktionskammer.
- Legen Sie das Tier in der rechten Seitenlage auf einem sterilen Tuch gelegt auf eine Erwärmung Pad auf der Bedienoberfläche. Verwenden, um einen Nasenkonus an einen kontinuierlichen Fluss von Isofluran zu verbinden, von 1 bis 3% in 100% Sauerstoff bei einer Flussrate von 0,8 L / min. Bewerben sterile nicht-medizinischen Augensalbe für jedes Auge Hornhaut Austrocknen zu verhindern
- Bereiten Sie die Operationsstelle mit 10% Povidon / Iod-Tupfer / Lösung, gefolgt von Ethanol, wiederholen 3 mal. Tragen Sie eine sterile Gaze (zB Operationstuch) über die Maus , um einen sterilen OP - Bereich zu erhalten.
- Machen Sie eine mittlere Oberschenkelumfangshautschnitt, gefolgt durch stumpfe Dissektion und Einfahren der proximal Haut. Setzen Sie die mediale Oberschenkelneurovaskuläre Pedikel auf der Mittelseite des Beines, und dann ligierenin der Nähe des Leistenbandes 4-0 beschichtet (Polyglactin 910) resorbierbares Nahtmaterial verwendet wird.
- Führen Sie eine Mitte Oberschenkeldurchtrennung von Muskelgruppen mit einer Schere, durch stumpfe Präparation von Weichgewebe an der Hüftgelenk gefolgt. Mit Hilfe eines Knochenschneider, führen Sie eine Mitte Femurosteotomie. Mit einem sterilen feinen Wattestäbchen oder eine resorbierbare Gelatineschwamm, drücken Sie sanft die Osteotomie zu minimieren und zu verhindern, Blutungen.
- Schließen Sie die darüber liegende Haut mit chirurgischen Wundklammern und injizieren 0,5 ml warmem Salz SQ für den Flüssigkeitshaushalt Therapie. Legen Sie das Tier auf einem drapierten warmen Pad im Erholungskäfig und überwachen kontinuierlich bis wach.
- Nach der Operation, Gewebeproben von primären Tumoren für RNA, DNA oder Proteinisolierung, Snap freeze in flüssigem Stickstoff und bei -80 ° C zu sammeln. Für das primäre Zellkultur, Gewebeproben bei diesem Schritt zu sammeln, wie in Abschnitt 9 unten beschrieben. Befestigen Sie die restlichen Gliedmaßen Gewebe in 10% neutral gepuffertem Formalin für die Histologie und immunochemisversuchen, einschließlich hypoxyprobe-1-Erkennung.
- Überwachen Sie die Tiere für die Fortbewegung, Schmerzen und Lebensmittelkonsum während der ersten 6 Stunden nach der Operation, dann jeden Tag für 3 Tage. Spritzen Sie das Analgetikum (Carprofen 5 mg / kg, SQ) täglich für 3 Tage. Entfernen Sie die Wundklammern 10 Tage nach der Amputation eines Wundklammer-Entferner.
6. Überwachung Mäuse für das Vorhandensein von Metastasen
- Beachten Sie die Mäuse täglich und werten sie für die klinische Anzeichen einer Metastasierung mindestens zweimal pro Woche.
- Beachten Sie die Tiere auf die Anwesenheit von Makrometastasen als Massen präsentiert, die an verschiedenen Standorten entwickeln, in der Regel Schultern, kontralateralen Beine und Kiefer. Zu diesem Zweck ertasten vorsichtig Kopf, Nacken und Achselbereiche und kontralateralen hindlimb. Überprüfen Sie für die interne Organmetastasen über Abdomens zusammen mit MRT-Untersuchung.
- Überprüfen Sie das Vorhandensein von Lungenmetastasen durch den Xyphoid Pressverfahren (das untere Ende des Brustbeins) mit index Finger. 24
HINWEIS: Dieser Druck vermindert die Zwerchfellatmung Kapazität. Mäuse, die mit fortgeschrittenen Lungenmetastasen zeigen Anzeichen von Atemnot durch mühsame Atmung manifestiert. - Beachten Sie die Tiere für neurologische Symptome, wie Beinlähmung und Ataxie Metastasen des zentralen Nervensystems hinweist.
- Überwachen Sie die Mäuse mindestens einmal pro Woche für Gewichtsverlust, als ein Hinweis auf einen möglichen Krankheitsprogression. Körpergewichtsverlust 15% der vorprozessualen Gewicht von mehr als eine humane Endpunkt betrachtet.
7. Magnetic Resonance Imaging (MRI) zur Erfassung Metastasierung
- Führen MRT Metastasen in gewünschten Zeitpunkten zu erfassen. 18
HINWEIS: In der aktuellen Studie, ein 7-Tesla horizontal Spektrometer verwendet wurde. MRT wurde an den Tagen 15 und 35 nach der Amputation für SK-ES1 Zellen und am Tag 15 für TC71-Zellen durchgeführt. - Platzieren Sie die Maus in eine Narkoseeinleitung chamber enthaltend von 1 bis 3% Isofluran in einem Gasgemisch aus 30% Sauerstoff und 70% Distickstoffoxid.
- Lassen Sie die Maus in die Induktionskammer, bis er nicht mehr reagiert auf äußere Reize ist. Dann entfernen Sie das Tier aus der Induktionskammer.
- Übertragen Sie die narkotisierten Maus auf einen stereotaktischen Halter mit der Atmung und Temperatur monitorization bei kontinuierlicher Gabe von 1,5% Isofluran und 30% Lachgas. Bewerben sterile nicht-medizinischen Augensalbe für jedes Auge Hornhauttrockenheit zu verhindern. Bild das Tier entweder in einem 40 oder 23 mm Bruker Maus Volumenspule für den ganzen Körper oder Gehirn-Bildgebung sind.
- Verwenden Sie einen zweidimensionalen, T2-gewichteten RARE - Sequenz: TR = 3000 ms, TE = 24 msec, Matrix = 256, FOV = 4,35 x 3,0 cm, Schichtdicke = 0,5 mm, RARE Faktor = 4 und mittelt = 4. 18
- Legen Sie das Tier in einem warmen Erholungskäfig und überwachen kontinuierlich bis wach.
HINWEIS: Die Mäuse erholen sich schnell, da eine flache Ebene der Anästhesie verwendet wird. Überwachen Sie die Tiere während der ersten 6 Stunden nach der Bebilderung, um sicherzustellen, dass es keine negativen Auswirkungen der Anästhesie.
8. Euthanasie und Necropsy
- Euthanize die Mäuse, sobald die Tiere vorhanden mit Metastasen nachweisbar durch MRI und / oder klinische Symptome der Krankheitsprogression.
HINWEIS: In der aktuellen Studie wurden die Mäuse an den Tagen 50 und 25 nach der Amputation für Tiere mit SK-ES1 und TC71 Xenotransplantate geopfert sind. In einigen Fällen notwendig war früher Euthanasie aufgrund einer hohen Belastung der Metastasierung. - Euthanize die Mäuse durch Exposition 2 bei 1,5 L / min zu CO (CO 2 bei 10 bis 30% der Euthanasie Kammer vol / min). Zervikaldislokation nach CO 2 Exposition gegenüber Tier Tod gewährleisten, führen.
- Sprühen Sie die gesamte Maus mit 70% Ethanol und legen Sie sie in die Laminarströmungsabzug. Sammeln Sie das Blut durch Herzpunktion eine 25 G ½ Nadel mit einer 1-ml-Spritze und die Übertragung auf eine Blutentnahme mit tumit 2 mg EDTA sein.
- Sammeln Sie die folgenden Gewebe: Milz, Nebennieren, Ovarien, Nieren, Leber, Lunge, Gehirn, rechtes Bein, das Knochenmark aus beiden humeri und der Wirbelsäule, sowie makroskopische vorhanden Metastasen an anderen Orten. 25,26
- Fix Hälfte jedes Gewebe in 10% neutral gepuffertem Formalin für die Histologie und Immun, einschließlich hypoxyprobe-1-Erkennung. Snap-einfrieren, die andere Hälfte in flüssigem Stickstoff, dann bei -80 ° C für RNA, DNA oder Protein Isolation. 25,26 Für die Primärzellkultur sammeln Gewebeproben , wie in Abschnitt 9 unten beschrieben.
9. Primärzellkultur
- Zur primären Zellkultur durchführen, sezieren Gewebe aus dem amputierten Extremität (Abschnitt 5) oder während der Obduktion (Abschnitt 8 oben) unter sterilen Bedingungen in einer Laminar-Flow-Haube.
- Bereiten Zellkulturmedien geeignet für die Zelllinie für die orthotope Injektionen verwendet, ergänzt mit Penicillin (200 Einheiten / ml),Streptomycin (200 ug / ml), Fungizon (1 ug / ml) und 0,2% Mycoplasma prophylaktische Antibiotikum. Platzieren 2,5 ml der primären Kulturmedium in eine 6 cm-Zellkulturplatte.
- Wählen Sie vitalen Tumorgewebebereiche aus primären Tumoren oder Metastasen, und dann isolieren zwei vor drei Segmente bei 2-3 mm jede sterile Schere.
HINWEIS: Lebensfähige Tumorgewebe in der Regel an den Rändern des Tumors gefunden wird und kann von Nekrose durch seine rosa oder rötliche Farbe, die wesentlichen Glanz und insgesamt nassen Aussehen unterschieden werden. Im Gegensatz dazu wird Nekrosen häufig im Zentrum des Tumors und präsentiert als weißlicher / Creme Farbmasse mit einem dumpfen, käsig Erscheinung gesehen. 27 - Übertragen Sie die isolierten Segmente zu einer 6-cm-Zellkulturplatte Primärkulturmedium in Schritt 9.2 beschrieben enthält.
- Kultur Zellen unter Standardbedingungen, wie in Abschnitt 1 (HINWEIS) und 9.2 beschrieben. 18,28 Prüfen Sie die Kultur für die zelluläre Auswuchs die sich aus den Gewebestücken, which sollte innerhalb weniger Tage beobachtet werden. Sobald Zellen Zusammenfluß erreichen, trypsinize und propagieren sie nach Standardzellkulturtechniken.
HINWEIS: Die primäre Zellkultur kann anschließend Wachstum und metastatischen Eigenschaften verwendet werden, der Zellen von Steuerung und hypoxischen Tumoren, sowie deren molekularen Eigenschaften, abgeleitet zu bewerten, wie zuvor beschrieben. 18
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Nach der Injektion von ES - Zellen in Gastrocnemius - Muskel, werden die primären Tumoren erlaubt einer Wadengröße von 250 mm 3 (1, 2) zu wachsen. 15 Tage für TC71 bis 20-25 Tage für SK-ES1 Xenotransplantate, bzw. - Die Zeit, die für die Tumoren dieses Volumen typischerweise im Bereich von 10 zu erreichen. Tumoren bei einem Kalb Volumen von 250 mm 3 einen relativ niedrigen Pegel von endogenen Hypoxie (ca. 3% des Tumorgewebes), bezogen auf hypoxybrobe-1 (pimonidazole) -Färbung (4A, C). Wichtig ist , dass in diesen Kontrolltumoren, die positive Färbung für hypoxyprobe-1 nur in den Bereichen der physiologischen Hypoxie, dh in Tumorzellen beobachtet , die aus dem Gefäßsystem entfernt sind und starten Zelltod (4A) zu unterziehen. Eine solche Färbung weist eine charakteristische "Luftpinsel" Muster, während der Großteil der gesunden Tumorgewebe für hypoxyprobe-1 negativ bleibt. <sup> 6 Im Gegensatz dazu FAL in diesem Stadium durchgeführt schafft tiefe Hypoxie, wie durch die positive Färbung für hypoxyprobe-1 beobachtet in der überwiegenden Mehrzahl der Tumorzellen bei 4 Stunden nach der FAL (4B) belegt. Bemerkenswerterweise sind die hypoxyprobe-1-positive Tumorzellen auch in der Nähe von Blutgefäßen und das charakteristische Muster von physiologischen Hypoxie verloren beobachtet. In diesen FAL-behandelten Tumoren, 73% von Gewebe besteht aus hypoxischen Tumorzellen (4C). Das Tumorgewebe zeigt auch die ersten Anzeichen von Hypoxie-induzierte Schäden, einschließlich Zellschrumpfung und lose Struktur (4B).
Die Wirksamkeit der FAL wurde durch die vollständige Inhibierung des Primärtumorwachstum unterstützt. Während der 3-Tage - Frist zwischen FAL und Amputation, die Größe von Primärtumoren nicht zu erhöhen (5A). Im Gegensatz dazu unterzogen Primärtumoren von Mäusen surger auf Scheiny weiter schnell zu wachsen, ein Volumen von etwa 650 mm 3 erreichte, wodurch die Wachstumsrate von Tumoren in Kontrollmäusen imitiert nicht unterworfen Operation (5A). 18 Im Einklang mit diesen Daten ergab die histopathologische Analyse umfangreiche Nekrosen in FAL behandelten primären 3 Tage nach der Operation (5B) geerntet Tumoren. Dennoch gab es Gruppen von lebensfähigen Tumorzellen im Tumorgewebe, in der Regel an den Rändern des Tumors, in der Nähe des Gefäßsystems (5B). die Oxygenierung Status dieser Zellen zu untersuchen wir hypoxyprobes verwendet, die in lebenden hypoxischen Zellen aktiviert werden, anschließend die Fähigkeit gewinnt kovalent innerhalb dieser Zellen an Proteine zu binden. 29 Als solche dienen diese Sonden als dauerhafte Markierung der Zellen , die Hypoxie an jedem beliebigen Punkt in der Zeit erlebt. Somit zur Ermittlung von Änderungen in den Sauerstoffgehalt der Tumorzellen während der gesamten Dauer des experiment verwendeten wir zwei verschiedene hypoxyprobes, die unabhängig voneinander durch Immunhistochemie nachgewiesen werden kann. Die Sonden wurden zu zwei Zeitpunkten verabreicht - unmittelbar vor der FAL (hypoxyprobe-1) und vor der Amputation (hypoxyprobe-2, CCI-103F) - und ihre Lokalisation wurde in Tumoren 3 Tage nachgewiesen geerntet post-FAL (Abbildung 1). Hypoxyprobe-1, die zum Zeitpunkt der FAL im System vorhanden war, war ein Großteil der Tumorzellen, da das Gewebe stark hypoxischen (5C) wurde. Diese Kennzeichnung ist auch offensichtlich , in Bereiche der Nekrose / Apoptose, da diese Zellen zum Zeitpunkt der FAL noch am Leben waren und daher in der Lage dauerhaft Bindungs hypoxyprobe-1, wie in 4B gezeigt. Im Gegensatz dazu hypoxyprobe-2 2 Tage nach der FAL nur gefärbten lebenden Zellen verabreicht werden , wie die Zellen in Nekrosen waren bereits tot und nicht in der Lage , die Sonde zum Zeitpunkt ihrer Verwaltung (5D) zu aktivieren. Interessanterweise OBSE wir auchrved lebensfähige Tumorgewebe angrenzend an das Gefäßsystem , die anfänglich hypoxischen (hypoxyprobe-1-positiv), aber ausreichend mit Sauerstoff angereichert zu dem späteren Zeitpunkt (hypoxyprobe-2-negativ) (5C, D) war. Dieser Befund ist in Übereinstimmung mit früheren Berichten darauf hinweist, dass Sicherheiten gefäßabhängige Gewebe Reperfusion des Blutflusses in den hinteren Gliedmaßen 3 Tage nach der FAL wieder her. 20 Die lebensfähigen Tumor verbleibenden Zellen in dem Tumorgewebe 3 Tage post-FAL waren sehr invasiv, wie durch ihren massiven intravasation auf vaskularisierten Rändern des Tumors (5E) belegt. Einige der Zellen innerhalb der Gefäßlumen waren positiv für hypoxyprobe-1, was darauf hinweist, dass sie auf FAL hypoxischen geworden war, noch lebensfähig blieben. Zusammengefasst legen diese Daten nahe, dass Reperfusion Gewebe schwere Hypoxie folgenden kann das Entweichen von Zellen aus den primären Tumoren erleichtern.
Auf der Grundlage der Pilotversuch, waren weit verbreitet Metastasennachweisbar durch MRI etwa 35 Tage nach der Amputation für SK-ES1 Xenotransplantate, während TC71-Zellen typischerweise innerhalb von 15 Tagen metastasiert. Folglich ist für vergleichende Analyse der Metastasierung Latenz und Frequenz wurde MRI am Tag durchgeführt 15 und 35 nach der Amputation für die Tiere SK-ES1 Tumore tragen, während einer Bildgebung am Tag 15 für Mäuse mit TC71 Tumoren ausreichend war. Euthanasie wurde am Tag 50 und Tag 25 für die Tiere mit SK-ES1 und TC71 Xenotransplantate ausgeführt sind. Wie bereits berichtet, enthalten die häufigsten Arten von Metastasen Weichteilmassen im Schulterbereich sowie Knochenmetastasen zu kontralateralen Beine, Kieferbereich und der Wirbelsäule für SK-ES1-Zellen und Lunge und Beckentumoren für TC71. 18 Darüber hinaus häufig Metastasen an inneren Organen, einschließlich Nebennieren, Lungen und Leber, Infiltration sowie Knochenmark, wurden in Mäusen mit FAL behandelten SK-ES1 Xenotransplantaten (Abbildung 6) beobachtet. Im allgemeinen Hypoxie signifikant erhöhtedie Gesamt (SK-ES1) oder ortsspezifische (TC71) Frequenz und Vielzahl von Metastasen in beiden Zelllinien. Jedoch auch TC71 Xenotransplantate entwickelt häufig wiederkehrenden Massen an der Stelle der Amputation (25% für die Kontrolle und 40% für FAL-behandelten Tumoren), wie zuvor für die großen TC71 Primärtumoren beschrieben. 18
Die Gewebe von der Kontrolle und FAL-behandelten primären Tumoren und Metastasen kann auch eine Quelle von Material für umfassenden molekularen Analysen bei der Identifizierung von durch Hypoxie aktiviert Wegen beteiligt in ES Verbreitung verbessert sein. Zum Beispiel haben wir beobachtet, signifikante Unterschiede in metabolomic Profilen von Steuer- und hypoxischen Primärtumoren (Daten nicht gezeigt). Wir waren auch in der Lage, erfolgreich mehrere Zelllinien aus allen oben genannten Gewebe zu isolieren. In vielen Fällen zeigten die Zellen, abgeleitet von FAL-behandelten Tumoren spürbare Veränderungen in der Morphologie, wie in den ursprünglichen Zellen verglichen, und diejenigen, die aus Steuer tu abgeleitetenmors (7A). Die Reinheit dieser Zellkulturen wurde durch positive Immunfärbung für das Ewing - Sarkom - Marker CD99 (7B) bestätigt. Außerdem hatten 100% der Zellen in den etablierten Zelllinien als ein positives Signal in der Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) mit humanem zentromerischen Sonden, oft mit erhöhten Chromosomenzahlen (8A) darstellt. Der menschliche Ursprung dieser Zellen wurde durch die Analyse der Chromosomen in der Metaphase (8B) bestätigt , dass beide Linie der ursprünglichen Zelle in zytogenetische Umlagerungen zuvor für SK-ES1 Zellen zeigten und von FAL-behandelten Tumoren (8B) abgeleiteten Zellen. 30
Abbildung 1. Überblick über die ES Hypoxie Modell. ES - Zellen (1 - 2 x 10 6) wurden in gastrocn injiziertenemius Muskeln von SCID / beige Mäuse. Nachdem die sich ergebende Primärtumoren ein Kalb Volumen von 250 mm 3 erreichten, wurden die Mäuse in zwei experimentelle Gruppen aufgeteilt. Mäuse aus der Kontrollgruppe wurden mit hypoxyprobe-1 (HP-1) injiziert, und die primären Tumoren wurden durch Amputation exzidiert. Mäuse aus der hypoxischen Gruppe wurden mit hypoxyprobe-1 injiziert und dann auf Femoralarterie Bindung unterworfen (FAL). Zwei Tage später wurden die Mäuse mit hypoxyprobe-2 (HP-2) injiziert, und dann wurden die Tumor-tragenden Glieder wurden amputiert 3 Tage post-FAL. Tiere aus beiden Gruppen wurden durch periodische Kernspintomographie (MRI) überwacht. Sobald Metastasen basierend auf Bildgebung und klinische Symptome offensichtlich wurde, wurden die Mäuse euthanasiert und die Anwesenheit von Metastasen wurde durch Nekropsie und histopathologische Analysen bestätigt. Die Zeit des Tumorwachstums, Bildgebung und Euthanasie basiert auf der SK-ES1 Zellwachstumsrate und Metastasierung. Beachten Sie, dass während hypoxyprobe-2 war notwendig, um die Verfahren zu etablieren und visualize ändert sich in Hypoxie während des Zeitraums zwischen FAL und Amputation von Gliedmaßen, ist seine Verwendung für die eigentlichen Experimente nicht wesentlich. Daher wird dieser Schritt nicht in das Protokoll aufgenommen. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. Primärtumorwachstum. A. Magnet - Resonanz - Bild (MRT) eines intakten hinteren Gliedmaßen. Der rote Pfeil zeigt den Standort und die Richtung der Tumorzelle orthotoper Injektion. B. Primärtumor bei einem Kalb Volumen von ca. 250 mm 3 in M. gastrocnemius (rot umrandet) wächst. Rote Pfeile zeigen an Stellen von Knochenzerstörung. T - Tibia. Bitte Clecken hier eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3. Die Website der Femoralarterie Ligatur. Eine repräsentative Obduktion Röntgen Arteriogramm eines 129S1 / SVJ-Maus mit Bariumsulfat durchbluteten unmittelbar nach Ligatur wird gezeigt, dass die Anwesenheit eines vorbestehenden Kollateralen zu markieren. Man beachte, dass, während das Bild zwei Ligationen (Xs) zeigt, einer distal zu dem seitlichen circumflex Femoralarterie (LCFA) (rot X) und einem anderen proximal zur genu Arterie (white X), wird nur der Tumorhypoxie Modell die proximal Ligation verwendet, nahe das Leistenband und distal der LCFA (rotes X). Die Region von Sicherheiten Gefäßentwicklung wird wie beschrieben (schwache Gefäße) gezeigt, und sie werden von ihren gewundenen, Korkenzieherform identifiziert. Bitte klicken erwieder eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4. Tumorhypoxie induziert durch Femoralarterie Ligatur (FAL). A. Eine Steuer Tumor bei einem Kalb Volumen von 250 mm 3 gefärbt durch Hematoxylin & Eosin (H & E) und immunhistochemisch für hypoxyprobe-1 (braun). Hypoxyprobe-1-Immunfärbung ist in den Bereichen der physiologischen Tumorhypoxie, wobei die Tumorzellen entfernt von Gefäßen sind aus Sauerstoff entzogen und beginnen zu unterziehen Zelltod allein beobachtet. B. Primärtumor bei einer ähnlichen Größe geerntet 4 Stunden nach der Ligatur FAL-behandelt und gefärbt mit H & E und immunhistochemisch für hypoxyprobe-1. Die Mehrheit der Tumorzellen sind stark positiv für hypoxyprobe-1, einschließlich der in der Nähe des Gefäßsystems. V - Blutgefäß. C. Der Bereich der positive Färbung für hypoxyprobe-1 war quantified in Kontrolle und FAL-behandelten Tumoren ImageJ-Software. Die Fehlerbalken stellen SEM. *** - P <0,001 Bitte klicken Sie hier eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 5. Wirkung der Femoralarterie Ligatur (FAL) auf dem Primärtumorwachstum. A. Primärtumorwachstum während der 3-Tages - Frist zwischen Chirurgie und Amputation in FAL- (n = 4) und Scheinoperation behandelt (n = 4) Tiere im Vergleich zu intakten Kontrolltumoren (n = 6). Fehlerbalken stellen SD. *** - P <0,001 im Vergleich zu beiden Kontroll und Scheinoperation behandelten Tumoren. B. Hämatoxylin und Eosin (H & E) Färbung eines FAL-behandelten Tumor geerntet 3 Tage nach der Ligation zeigt verbreitet Nekrose innerhalb Tumors. Die rote Umrandung zeigt einen Bereich von lebensfähigen Tumor cells in unmittelbarer Nähe zu einem stark vaskularisierten Bereich perfundiert 3 Tage post-FAL. C. FAL behandelten Tumorgewebe 3 Tage nach der Operation für hypoxyprobe-1 immunhistochemisch geerntet. Hypoxyprobe-1 wurde vor FAL injiziert. Daher zeigt die positive Immunofärbung die Existenz von umfangreichen Gewebehypoxie unmittelbar nach der Operation. D. Hypoxyprobe-2 wurde 2 Tage nach der FAL injiziert, und das Gewebe gesammelt 24h später bei Amputationen. Positive hypoxyprobe-2-Färbung identifiziert Gewebshypoxie zum Zeitpunkt der Amputation. Der rote Pfeil zeigt Gewebe, das hypoxische zu beiden Zeitpunkten ist, während der gelbe Pfeil einen Bereich neben dem Gefäßsystem zeigt an, dass hypoxische unmittelbar nach FAL (hypoxyprobe-1-positiv), aber negativ für hypoxyprobe-2 zum Zeitpunkt der Exzision war, die ist von Gewebe Reperfusion indikativ. Der Mangel an hypoxyprobe-2-Färbung in nekrotischen Bereichen legt nahe, dass die Zellen in dieser Region zum Zeitpunkt ihrer Verabreichung nicht lebensfähig waren und deshalbnicht in der Lage, die Sonde aktiv zu binden. Die Färbung in Platten BD präsentiert wurde auf serielle Gewebeschnitten durchgeführt. E. Intravasation in FAL-behandelten Tumor 3 Tage nach der FAL. Die Immunfärbung identifiziert lebenden Zellen positiv für hypoxyprobe-1 in das Gefäßlumen (roter Pfeil). Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 6. Beispiele für Metastasen in Mäusen mit FAL behandelten SK-ES1 Tumoren. Die Metastasen wurden durch Magnetresonanz-Bildgebung (MRI) nachgewiesen und durch Nekropsie und histopathologische Analysen (Hämatoxylin und Eosin-Färbung, H & E) bestätigt. M - Metastasierung. Bitte klicken Sie hier einen größeren vers zu sehen Ion dieser Figur.
Abbildung 7. Eigenschaften von Zellen , die aus FAL behandelten primären Tumoren abgeleitet. A. führbare Zellkulturen wurden aus dem Gewebe von der Kontrolle und hypoxischen Primärtumoren und deren Morphologie wurde auf den ursprünglichen Zelllinien für die anfängliche orthotoper Injektionen im Vergleich geerntet etabliert. Die Zellen stammen aus FAL behandelten Primärtumoren zeigen dramatische Veränderungen in ihrer Größe und Morphologie. Repräsentative Bilder der ursprünglichen und Primärtumor stamm SK-ES1 Zellen gezeigt. B. Repräsentative Bilder von FAL-behandelten Tumoren abgeleiteten Zellen immunhistochemisch für die ES Marker CD99 und gegengefärbt mit dem DNA-bindenden Farbstoff DAPI. Alle Zellen sind CD99-positive, einschließlich hypertrophen Zellen enthält vergrößerte Kerne (weißer Pfeil). OAD / 54532 / 54532fig7large.jpg "target =" _ blank "> Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 8. Die chromosomale Analyse der Zellen von FAL-behandelten Tumoren abgeleitet. A. Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) -Analyse in Interphase - Zellen mit zwei Kernen mit Signalen für den menschlichen zentromerischen 4 - Sonde. Die großen Kern mit vier Signale zeigt einen tetraploid (4n) Zelle (weißer Pfeil). B. FISH - Analyse in repräsentativen Metaphasen des SK-ES1 ursprünglichen Zelllinie und der Zelle , abgeleitet von FAL behandelten Primärtumor. Rote Pfeile zeigen inv (1) (p13.1q21), eine nicht-zufällige zytogenetische Umlagerung Charakteristik der SK-ES1 Zellen. Rote Signale: menschliche zentromerischen 4 Sonde; Grüne Signale in den ursprünglichen SK-ES1 Zellen: NPY5R Sonde auf dem Chromosom 4q32.2.e.com/files/ftp_upload/54532/54532fig8large.jpg "target =" _ blank "> Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Unser Modell beinhaltet den Vergleich von Metastasen in beiden Versuchsgruppen - eine Kontrollgruppe, wo Tumoren erlaubt sind in der hinteren Gliedmaßen durch Amputation bei Erreichen eines Kalbes Volumen von 250 mm 3 und eine Hypoxie-exponierten Gruppe gefolgt zu entwickeln, in dem die Tumor- Lager hindlimb wird bei gleichem Volumen zu FAL unterworfen, die später von Amputations 3 Tage gefolgt. Auch wenn die FAL-behandelten Tumoren in diesen Experimenten mit einer leichten Verzögerung amputiert werden, zu den Kontrolltumoren verglichen, deren Größe nicht erhöht während der 3-Tages-Frist zwischen Ligatur und Amputation. Daher ermöglicht dieser Ansatz den Vergleich von metastatischem Potential zwischen Tumoren vergleichbarer Größe, aber mit drastisch unterschiedlichen Ebenen der Hypoxie. Im Gegensatz dazu Scheinoperation verwenden, eine häufig verwendete Steuerung für operative Eingriffe, von 3 Tagen nach der Tumorwachstum gefolgt würde erhebliche Unterschiede in der Tumorgröße zwischen den Versuchsgruppen zur Folge haben, mit der Scheinoperation-treated primären Tumoren signifikante Mengen an endogenen Hypoxie zu besitzen. Basierend auf den Pilotversuchen, nicht Scheinoperation nicht signifikant das Tumorwachstum oder seine Hypoxie Spiegel beeinflussen und somit aus dem experimentellen Design eliminiert werden. Stattdessen wird die Strategie von Tumoren ähnlicher Größen und verschiedenen Hypoxie Ebenen ist ein sehr wichtiges Modell für die Klärung der Auswirkungen von Hypoxie auf die Verbreitung der Krankheit zu vergleichen. Wichtig ist , dass im Gegensatz zu früheren in vitro - Studien, ermöglicht dieser Ansatz für eine umfassende Bewertung der pro-metastatischen Wirkungen von Hypoxie in einem natürlichen Tumor - Mikroumgebung. 4-6
Das Ziel der Versuchsanordnung war eine niedrige Grundniveau von Metastasen zu erreichen, die für die Detektion einer Hypoxie-induzierten stimulierende Wirkung auf die Bildung ermöglichen. Wir haben festgestellt , dass ein Kalb Größe von 250 mm 3 bei FAL und Amputation für SK-ES1 Primärtumoren optimal war. Allerdings müssen diese Parameter für ea optimiert werden ch-Zelllinie, abhängig von ihrem metastatischen Potential und lokale Invasivität. Bei Tumoren mit höherem metastatische Potential der Primärtumorgröße bei Amputationen kann verringert werden müssen. Beispielsweise zeigen TC71 Tumoren eine hohe durch häufige Bildung manifestiert lokale Invasivität von rezidivierenden Tumoren an der Stelle der Amputation. 18 Sobald eine solche Massen zu entwickeln, haben die Tiere aus den Analysen ausgeschlossen werden, da es nicht klar wäre , wenn nachfolgende Fernmetastasen von den primären Tumoren oder von rezidivierenden Tumoren entstanden , die oft schnell wachsen und hohe Konzentrationen von endogenem Hypoxie aufweisen. Aus früheren Erfahrungen, unabhängig von der Zelllinie verwendet wird , 150 mm 3 ist die minimal tumortragenden Wadengröße , die zuverlässig und normalisiert gemessen werden kann. Wenn Abnahme nicht die Tumorgröße bei FAL und Amputation nicht rezidivierenden Tumoren zu beseitigen oder die basale Metastasierungsrate ausreichend zu verringern, die bestimmte Zelllinie in Frage für diese Versuche nicht geeignet sein.
ve_content "> Ebenso ist es wichtig, die Zeitleiste von MRI und Euthanasie für jede einzelne Zelllinie zu etablieren, in Abhängigkeit von der Latenz ihrer Metastasierung. Insbesondere die chirurgischen Wundklammern, die mit MRT stören kann als 10 Tage nicht früher entfernt werden post- Chirurgie und dieser Zeit muß manchmal aufgrund von Komplikationen bei der Heilung verlängert werden. Somit wird in dieser Studie haben wir Tag 15 als die Zeit der ersten MRI etabliert.Ein weiterer wichtiger Aspekt in diesem Modell ist die Aufrechterhaltung einer Ebene von Hypoxie Lage von metastasierendem Prozesse induzieren ohne vollständige Tumor-Nekrose verursacht, die Tumorzelldissemination verhindern würde. Obwohl wir dieses Problem in dieser Studie nicht aufgetreten ist, falls erforderlich, kann die Schwere der Hypoxie durch Änderung an den Zweigen der Arteria femoralis, wie die LCFA und genu artery die genaue Lage und die Anzahl der Ligationen in Beziehung geregelt werden. 20 eine Ligatur proximal der LCFA schwerer Ischämie in der Hallo So wird erstellenndlimb Zirkulation, wodurch die hypoxischen Bedingungen im distalen Bein. Im Gegensatz dazu wird Ligieren distal nachfolgenden Zweige der Arteria femoralis verringern die resultierende Hypoxie in dem unteren hinteren Gliedmaßen.
Wichtig ist, gab es keine schweren unerwünschten Wirkungen einer kombinierten FAL und Amputation Verfahren und keine der Operationen Todesfälle im Zusammenhang mit, wie zuvor für diese Techniken getrennt durchgeführt berichtet. 18-20 Somit wird der Erfolg des Verfahrens in erster Linie durch die Geschwindigkeit des Tumor nehmen an der primären Stelle und die Frequenz von wiederkehrenden Tumoren beschränkt, die beide Zellinie abhängig sind.
Wie Hypoxie hat als pro-metastatic Faktor in vielen Tumorarten verwickelt worden ist, kann dieser Ansatz auch geeignet sein, direkt ihre Wirkungen zu testen und ihre Wirkungsmechanismen in anderen Sarkome definieren, die in den Gliedern zu entwickeln. Zudem 23 kann eine ähnliche Strategie zu anderen bösartigen Erkrankungen angewendet werden , bei orthotope Umgebungen wachsen wit einem gut definierten Blutversorgung Route. Somit kann mit entsprechenden Modifikationen kann dieses Modell über den Bereich der ES Biologie ein nützliches Werkzeug in der Forschung sein.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SK-ES1 Human Ewing sarcoma (ES) cells | ATCC | ||
| TC71 Human ES cells | Kindly provided from Dr. Toretsky | ||
| McCoy's 5A (modified) Medium | Gibco by Life Technologies | 12330-031 | |
| RPMI-1640 | ATCC | 30-2001 | |
| PBS | Corning Cellgro | 21-040-CV | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442-500mL | |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1x) | Gibco by Life Technologies | 25200-056 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco by Life Technologies | 15140-122 | |
| Fungizone® Antimycotic | Gibco by Life Technologies | 15290-018 | |
| MycoZap™ Prophylactic | Lonza | VZA-2032 | |
| Collagen Type I Rat tail high concetration | BD Biosciences | 354249 | |
| SCID/beige mice | Harlan or Charles River | 250 (Charles River) or 18602F (Harlan) | |
| 1 ml Insulin syringes with permanently attached 28 G ½ needle | BD | 329424 | |
| Saline (0.9% Sodium Chloride Injection, USP) | Hospira, INC | NDC 0409-7984-37 | |
| Digital calipers | World Precision Instruments, Inc | 501601 | |
| Surgical Tools | Fine Science Tools | ||
| Rimadyl (Carprofen) Injectable | Zoetis | ||
| Hypoxyprobe-1 (Pimonidazole Hydrochloride solid) | HPI, Inc | HP-100mg | |
| hypoxyprobe-2 (CCI-103F-250 mg) | HPI, Inc | CCI-103F-250mg | |
| Povidone-iodine Swabstick | PDI | S41350 | |
| Sterile alcohol prep pad | Fisher HealthCare | 22-363-750 | |
| LubriFresh P.M. (eye lubricant ointment) | Major Pharaceuticals | NDC 0904-5168-38 | |
| VWR Absorbent Underpads with Waterproof Moisture Barrier | VWR | 56617-014 | |
| Oster Golden A5 Single Speed Vet Clipper with size 50 blade | Oster | 078005-050-002 (clipper), 078919-006-005 (blade) | |
| Nair Lotion with baby oil | Church & Dwight Co., Inc. | ||
| Silk 6-0 | Surgical Specialties Corp | 752B | |
| Prolene (polypropylene) suture 6-0 | Ethicon | 8680G | |
| Vicryl (Polyglactin 910) suture 4-0 | Ethicon | J386H | |
| Fisherbrand Applicators (Purified cotton) | Fisher Scientific | 23-400-115 | |
| GelFoam Absorbable Dental Sponges - Size 4 | Pfizer Pharmaceutical | 9039605 | |
| Autoclip Wound Clip Applier | BD | 427630 | |
| Stereo Microscope | Olympus | SZ61 | |
| Autoclip remover | BD | 427637 | |
| Aound clip | BD | 427631 | |
| MRI 7 Tesla | Bruker Corporation | ||
| Paravision 5.0 software | Bruker Corporation | ||
| CO2 Euthanasia system | VetEquip | ||
| 25 G 5/8 Needle (for heart-puncture) | BD | 305122 | |
| 0.1 ml syringe (for heart-puncture) | Terumo | SS-01T | |
| K3-EDTA Micro tube 1.3 ml | Sarstedt | 41.1395.105 | |
| 10% Neutral Buttered Formalin | Fisher Scientific | SF100-4 |
References
- Lessnick, S. L., Ladanyi, M. Molecular pathogenesis of Ewing sarcoma: new therapeutic and transcriptional targets. Annu Rev Pathol. 7, 145-159 (2012).
- Ladenstein, R. Primary disseminated multifocal Ewing sarcoma: results of the Euro-EWING 99 trial. J Clin Oncol. 28, 3284-3291 (2010).
- Dunst, J., Ahrens, S., Paulussen, M., Burdach, S., Jurgens, H. Prognostic impact of tumor perfusion in MR-imaging studies in Ewing tumors. Strahlenther Onkol. 177, 153-159 (2001).
- Aryee, D. N. Hypoxia modulates EWS-FLI1 transcriptional signature and enhances the malignant properties of Ewing's sarcoma cells in vitro. Cancer Research. 70, 4015-4023 (2010).
- Knowles, H. J., Schaefer, K. L., Dirksen, U., Athanasou, N. A. Hypoxia and hypoglycaemia in Ewing's sarcoma and osteosarcoma: regulation and phenotypic effects of Hypoxia-Inducible Factor. BMC cancer. 10, 372 (2010).
- Tilan, J. U. Hypoxia shifts activity of neuropeptide Y in Ewing sarcoma from growth-inhibitory to growth-promoting effects. Oncotarget. 4, 2487-2501 (2013).
- Franzius, C. Successful high-resolution animal positron emission tomography of human Ewing tumours and their metastases in a murine xenograft model. Eur J Nucl Med Mol Imaging. 33, 1432-1441 (2006).
- Hauer, K. DKK2 mediates osteolysis, invasiveness, and metastatic spread in Ewing sarcoma. Cancer Research. 73, 967-977 (2012).
- Manara, M. C. Preclinical in vivo study of new insulin-like growth factor-I receptor--specific inhibitor in Ewing's sarcoma. Clin Cancer Res. 13, 1322-1330 (2007).
- Scotlandi, K. Murine model for skeletal metastases of Ewing's sarcoma. J Orthop Res. 18, 959-966 (2000).
- Vormoor, J. Establishment of an in vivo model for pediatric Ewing tumors by transplantation into NOD/scid mice. Pediatr Res. 49, 332-341 (2001).
- Picarda, G. Preclinical evidence that use of TRAIL in Ewing's sarcoma and osteosarcoma therapy inhibits tumor growth, prevents osteolysis, and increases animal survival. Clin Cancer Res. 16, 2363-2374 (2010).
- Vormoor, B. Development of a preclinical orthotopic xenograft model of ewing sarcoma and other human malignant bone disease using advanced in vivo imaging. PLoS One. 9, e85128 (2014).
- Wang, Y. Platelet-derived growth factor receptor beta inhibition increases tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL) sensitivity: imatinib and TRAIL dual therapy. Cancer. 116, 3892-3902 (2010).
- Wang, Y. X. Inhibiting platelet-derived growth factor beta reduces Ewing's sarcoma growth and metastasis in a novel orthotopic human xenograft model. In Vivo. 23, 903-909 (2009).
- Odri, G. A. Zoledronic acid as a new adjuvant therapeutic strategy for Ewing's sarcoma patients. Cancer Research. 70, 7610-7619 (2010).
- Merchant, M. S. Interferon gamma enhances the effectiveness of tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand receptor agonists in a xenograft model of Ewing's sarcoma. Cancer Research. 64, 8349-8356 (2004).
- Hong, S. H. High neuropeptide Y release associates with Ewing sarcoma bone dissemination - in vivo model of site-specific metastases. Oncotarget. 6, 7151-7165 (2015).
- Lee, E. W. Neuropeptide Y induces ischemic angiogenesis and restores function of ischemic skeletal muscles. J Clin Invest. 111, 1853-1862 (2003).
- Tilan, J. U. Platelet neuropeptide Y is critical for ischemic revascularization in mice. FASEB J. , (2013).
- Toffoli, S., Michiels, C. Intermittent hypoxia is a key regulator of cancer cell and endothelial cell interplay in tumours. The FEBS journal. 275, 2991-3002 (2008).
- Das, B. Hypoxia enhances tumor stemness by increasing the invasive and tumorigenic side population fraction. Stem cells (Dayton, Ohio). 26, 1818-1830 (2008).
- Arndt, C. A., Rose, P. S., Folpe, A. L., Laack, N. N. Common musculoskeletal tumors of childhood and adolescence. Mayo Clin Proc. 87, 475-487 (2012).
- Mendoza, A. A novel noninvasive method for evaluating experimental lung metastasis in mice. J Am Assoc Lab Anim Sci. 52, 584-589 (2013).
- Feldman, D. B., Seely, J. C. Necropsy Guide: Rodents and the Rabbit. , CRC Press. (1988).
- Parkinson, C. M. Diagnostic necropsy and selected tissue and sample collection in rats and mice. J Vis Exp. , (2011).
- Raymond, A. K., Lazar, A. J. Bone Sarcoma. PP, L. in, S, P. atel , Springer. (2013).
- Dietel, M., Arps, H., Gerding, D., Trapp, M., Niendorf, A. Establishment of primary cell cultures: experiences with 155 cell strains. Klin Wochenschr. 65, 507-512 (1987).
- Varghese, A. J., Gulyas, S., Mohindra, J. K. Hypoxia-dependent reduction of 1-(2-nitro-1-imidazolyl)-3-methoxy-2-propanol by Chinese hamster ovary cells and KHT tumor cells in vitro and in vivo. Cancer Research. 36, 3761-3765 (1976).
- ATCC. , http://www.atcc.org/products/all/HTB-86.aspx#characteristics (2014).
