Introduction
El sarcoma de Ewing (ES) es una neoplasia agresiva que afecta a niños y adolescentes. 1 Los tumores se desarrollan en los tejidos blandos y huesos, comúnmente en las extremidades. Mientras que la presencia de metástasis es el factor pronóstico adverso más poderosa para los pacientes ES, los mecanismos subyacentes a su desarrollo siguen sin estar claros. 2 Tumor hipoxia es uno de los pocos factores implicados en la progresión de la ES. En pacientes ES, la presencia de áreas no perfundido dentro del tejido tumoral está asociada con mal pronóstico. 3 In vitro, la hipoxia aumenta la invasividad de las células madre embrionarias y desencadena la expresión de genes pro-metastásicos. 4-6 Sin embargo, a pesar de estas líneas de evidencia, no existe una prueba directa para ES hipoxia inducida por la progresión y diseminación. Por otra parte, los mecanismos por los que la hipoxia ejerce tales efectos son, en la actualidad, desconocidos. Por lo tanto, hemos creado un modelo in vivo para llenar la brecha entre los existentes en datos in vitro y obser clínicavaciones. Este sistema modelo permite la prueba directa de los efectos de la hipoxia en tumores que se producen en su entorno natural, el uso de imágenes de resonancia magnética (MRI) para seguir la progresión tumoral y la metástasis in vivo en combinación con ex vivo análisis patológicos y moleculares (Figura 1).
Puesto que ningún modelo transgénico establecida de ES está disponible actualmente, los estudios in vivo en las propiedades metastásicas de estos tumores dependen de inyecciones de células humanas en ratones inmunocomprometidos. Mientras que el uso de animales inmunológicamente con discapacidad puede subestimar el impacto del sistema inmune en la progresión de la enfermedad, la capacidad de utilizar células humanas aumenta traducibilidad de tales estudios. Entre los diferentes modelos de xenoinjertos, inyecciones sistémicas en vena de la cola son los más fáciles de realizar, sin embargo, que omiten los pasos iniciales de intravasación de células tumorales y se escapan del sitio primario de crecimiento. 7-12 Por otro lado, orthoto xenoinjertos pic, que implica la inyección de células tumorales en los huesos (fémur, las costillas o los músculos), es más difícil técnicamente, pero también más biológicamente relevante para el cáncer humano. 13-16 Sin embargo, en el pasado, la alta morbilidad asociada con el rápido crecimiento de los tumores primarios se ha hecho necesario a menudo la eutanasia de los animales antes del desarrollo de metástasis. En este estudio, hemos empleado un modelo previamente establecido de inyecciones de células en el músculo gastrocnemio, seguido de la escisión del tumor primario resultante combinada con la monitorización longitudinal de la progresión metastásica por MRI. 17,18 Tales inyecciones en el músculo gastrocnemio en las proximidades de la tibia permiten el crecimiento del tumor en dos entornos naturales ES - músculos y huesos - y dan lugar a metástasis distantes a lugares típicamente afectadas en los seres humanos. 18 De este modo, este modelo recapitula con precisión los procesos que ocurren en pacientes metastásicos ES durante la progresión de la enfermedad.
tienda "> La localización de los tumores primarios en el miembro posterior inferior también facilita el control preciso del suministro de sangre al tejido tumoral. ligadura de la arteria femoral (FAL) es una técnica bien establecida utilizado en la investigación de la angiogénesis para bloquear el flujo de sangre a las regiones distales de la pierna e investigar la vascularización del tejido en respuesta a la isquemia. 19,20 importante destacar que la caída inicial en el flujo sanguíneo es seguido por la apertura de los vasos colaterales y la reperfusión del tejido observado aproximadamente 3 días después de FAL. 20 por lo tanto, cuando se realiza en un miembro portador de un tumor, este modelo recrea eventos hipoxia / reperfusión que se producen de forma natural en los tumores que crecen rápidamente y permite el escape de las células tumorales metastásicas debido a la restauración de la perfusión de la extremidad posterior inferior a través de los vasos colaterales de reciente apertura. 21 es importante destacar que este procedimiento debe realizarse cuando el tamaño del tumor es lo suficientemente pequeño para evitar la hipoxia excesivo en los tumores de control (típicamente en el portador de un tumor de ternera volUME: 150 - 250 mm 3), asegurando diferencias significativas en los niveles de hipoxia tumoral entre el control y los grupos tratados con el FAL.Además de la monitorización longitudinal de los efectos de la hipoxia en es la latencia y la frecuencia de metástasis, este modelo también permite la recogida de tejidos y el desarrollo de nuevas líneas de células de los tumores primarios y metástasis. Es importante destacar que, el trabajo previo estableció que las líneas celulares metástasis derivados exhiben una mayor potencial metastásico a reintroducción a los animales, lo que indica que la difusión de tumores se asocia con cambios permanentes en el fenotipo de las células tumorales, y la validación de este modo el uso de estas líneas celulares de descifrar los procesos metastásicos. 18 En conjunto, estos modelos se pueden utilizar ahora para los análisis genéticos y moleculares requeridos para la identificación de vías metastásicas hipoxia inducida.
A medida que la hipoxia es un factor pro-metastásico mejora de la malignidad de diversos tumors, nuestro modelo puede ser utilizado como una plataforma para investigar el papel de la hipoxia en otros tipos de tumores que se desarrollan de forma natural en las extremidades, tales como osteosarcoma y rabdomiosarcoma. 21-23 Además, un enfoque similar se puede aplicar a tumores malignos que crecen en otras localizaciones anatómicas con una ruta bien definida de suministro de sangre. En última instancia, el modelo puede ser modificado y su utilidad extiende más lejos, dependiendo de las necesidades individuales de investigación.
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Protocol
Todos los procedimientos fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Georgetown.
1. Preparación de células para ortotópico Inyecciones
- células madre embrionarias humanas Cultura en condiciones estándar. Use aproximadamente una placa de cultivo celular de 15 cm que no exceda el 70% de confluencia para la inyección de 5 ratones.
NOTA: Para este estudio, las células SK-ES1 se cultivaron en medio 5A de McCoy con suero bovino fetal al 15% (FBS) en placas recubiertas de colágeno y las células TC71 se cultivaron en RPMI con 10% de FBS y 1% 4- (2-hidroxietil ) -1-piperazinetanosulfónico (HEPES). Ambos medios se suplementaron con antibióticos - penicilina (100 unidades / ml), estreptomicina (100 mg / ml) y Fungizone (1 mg / ml). - Lavar las células ES con solución salina tamponada con fosfato (PBS) y trypsinize a 70% de confluencia con ácido 0,25% de tripsina / etilendiaminotetraacético (EDTA) durante 5 min.
- Retire las células madre embrionarias a partir de la placa de cultivo celular con media, centrifugar durante 5 min a 200 xg a temperatura ambiente. Vuelva a suspender las células ES en 10 ml de PBS frío y luego contar el número de células.
- Las células madre embrionarias centrífuga durante 5 minutos a 200 x g a temperatura ambiente, y luego volver a suspender las células en 10 7 (TC71) por ml en PBS frío 2 x 10 7 (SK-ES1) o. Mantener la suspensión celular final en el hielo en el desempeño de las inyecciones.
2. La inyección ortotópico de células ES en músculo gastrocnemio
- Utilice 4-6 semanas de edad SCID hembra / ratones de color beige.
- Para inyectar células madre embrionarias, coloque un lado del ratón y estabilizar su pierna izquierda entre los dedos cuarto y quinto, dejando al descubierto el lado medial de la extremidad posterior inferior.
- Usando una aguja 28 G ½, inyectar 0,1 ml de la suspensión celular previamente preparada que contiene o bien 2 x 10 6 (SK-ES1) o 10 6 células (TC71) ES en el músculo gastrocnemio (Figura 2A).
NOTA: Aunque el volumen máximo para inj intramuscularreflexiones es típicamente 0,05 ml, para este procedimiento particular, el aumento de volumen de 0,1 ml es necesaria debido al número de células de alta inyectada. Este procedimiento ha sido aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Georgetown.- Insertar la aguja en el músculo gemelo anterior en aproximadamente un 30 - ángulo de 45 grados en la dirección de la cresta tibial / tuberosidad.
- Ligeramente retirar la aguja una vez que toca la cresta tibial / tuberosidad. inyectar lentamente la solución de suspensión celular, retirando poco a poco la aguja para liberar la presión.
- Monitorear los ratones inyectados durante las próximas 24 horas para detectar signos de angustia.
NOTA: Los investigadores con menos experiencia en el manejo animal debe considerar los ratones para inyecciones de células tumorales que anestesia. Algunas instituciones pueden requerir anestesia por razones de seguridad.
3. Monitoreo de crecimiento del tumor primario
- Controlar el crecimiento de los tumores primarios daily hasta que el tamaño del tumor alcanza el volumen deseado.
NOTA: En el estudio actual, se utilizó un volumen de ternera de 250 mm 3 como punto de partida del experimento (Figura 2B). Normalmente, se tarda aproximadamente 1 - 2 semanas para que los tumores para llegar a este tamaño.- Medir el tamaño de ternera al día con calibradores digitales a través de sus longitudes-medial lateral y anterior-posterior.
- Determinar el volumen de ternero por la fórmula (D xd 2/6) x 3,14, en donde D es el diámetro más largo y d es el diámetro más corto de la extremidad posterior inferior portadores de tumores.
NOTA: El tamaño de la pantorrilla normal de ratón adulto es de aproximadamente 40 - 50 mm 3. Su volumen se incrementará debido al crecimiento del tumor y en las etapas posteriores de la pantorrilla se compone principalmente de tejido tumoral.
4. La ligadura de la arteria femoral (FAL) para inducir la hipoxia en el miembro posterior portadores del tumor
- Preparar los instrumentos quirúrgicos necesarios para esta operación: curVed o unas pinzas finas puntas, señalaron fórceps, tijeras quirúrgicas y un soporte de aguja. Esterilizar estas herramientas antes de la cirugía utilizando un autoclave o esterilizador-grano caliente. Además, tienen hisopos de algodón finos listos para esta cirugía.
NOTA: Se recomienda que las herramientas pueden volver a esterilizarse en las puntas, según sea necesario durante el procedimiento. - Inyectar agente analgésico (carprofeno 5 mg / kg) por vía subcutánea (SQ). Para detectar y confirmar la hipoxia, inyectar hypoxyprobe-1 (pimonidazole, 60 mg / kg).
NOTA: Esta dosis equivale a 1,5 mg por ratón y se consigue mediante la inyección de 0,1 ml de solución hypoxyprobe ml / 15 mg en PBS por vía intraperitoneal (IP). El hypoxyprobe es entonces postmortem detectable en los tejidos animales por inmunohistoquímica. - Coloque el ratón en una cámara de inducción de anestesia que contiene 3-5% de isoflurano en oxígeno al 100% a una velocidad de flujo de 1 L / min.
- Deje el ratón en la cámara de inducción hasta que no responde a los estímulos externos. A continuación, retire al animal de la induction cámara. Colocar el animal en posición supina sobre un campo estéril colocada sobre una almohadilla de calentamiento en la superficie de funcionamiento. Use un cono de la nariz para conectarlo a un flujo continuo de 1-3% de isoflurano en oxígeno al 100% a un caudal de 0,8 L / min.
- Aplique una pomada oftálmica no medicado estéril para cada ojo para evitar el secado de la córnea. Para depilar completamente el área quirúrgica, aplique crema de eliminación de cabello, dejándolo sobre la piel durante no más de 10 segundos. A continuación, limpie la crema de depilación utilizando una almohadilla de etanol de preparación.
- Extender y asegurar la extremidad posterior con un trozo de cinta de aproximadamente 45 grados con respecto a la línea media del ratón. Una vez que el miembro posterior es seguro, limpie la piel expuesta con 10% hisopo de povidona / yodo / solución, seguido de etanol, repitiendo dos veces más cada uno. Para el resto del procedimiento quirúrgico, usar un microscopio estéreo para obtener una vista ampliada de la región de las extremidades posteriores.
- Con unas pinzas de punta y tijeras quirúrgicas, hacer una incisión de la sken, aproximadamente 1 cm de longitud, desde la mitad del muslo hacia la región inguinal. El uso de hisopos de algodón fino humedecido con solución salina, cepille suavemente distancia tejido graso subcutáneo que rodea el músculo del muslo.
- Con cuidado revelar la arteria femoral subyacente mediante disección roma a través del tejido graso subcutáneo. Estabilizar la herida y campo quirúrgico para exponer la vasculatura de media-superior del músculo aductor.
- Con unas pinzas finas, suavemente perforar a través de la vaina femoral membranosa para exponer el paquete neurovascular. El uso de un conjunto limpio de unas pinzas finas, diseccionar y separar la arteria femoral de la vena femoral y el nervio en la posición proximal cerca de la ingle, distal al ligamento inguinal. Tenga cuidado para evitar la perforación de la pared de la vena femoral.
- Después de la disección, pasar un hilo de sutura de seda 6-0 por debajo de la arteria femoral y distal a la rama de la arteria circunfleja femoral lateral (LCFA). Ocluir la arteria femoral utilizando los nudos dobles (Figura 3). Cerrar la incisión mediante suturas de polipropileno 6-0. Después de cerrar la incisión, SQ inyectar 0,5 ml de solución salina tibia para la terapia de equilibrio de líquidos. Colocar el animal en la parte superior de una almohadilla caliente envuelto en la jaula de recuperación y supervisar continuamente hasta que despierta.
- Monitorear los animales durante los primeros 6 horas después de la cirugía e inyectar el agente analgésico (carprofeno 5 mg / kg, SQ) cada día durante 3 días. Retirar las suturas 10 días después de la cirugía con unas tijeras estériles.
5. primaria de extirpación de tumores por amputación de pierna
NOTA: amputar la extremidad posterior inferior portadores de tumor cuando el tamaño de la pantorrilla alcanza 250 mm 3 para el grupo de control o 3 días después de FAL para el grupo hipóxica.
- Afeitado pelo de la extremidad portador de un tumor de la tibia distal a la región pélvica con cortar el pelo mientras sostiene suavemente el animal. Inyectar el agente analgésico (carprofeno 5 mg / kg, SQ) antes del procedimiento.
- Coloque el ratón en un ch inducción de la anestesiaámbar que contiene 3-5% de isoflurano en oxígeno al 100% a una velocidad de flujo de 1 L / min. Deje el ratón en la cámara de inducción hasta que no responde a los estímulos externos. A continuación, retire al animal de la cámara de inducción.
- Colocar el animal en decúbito lateral derecho en un campo estéril se coloca sobre una almohadilla de calentamiento en la superficie de trabajo. Use un cono de la nariz para conectarlo a un flujo continuo de isoflurano 1-3% en 100% de oxígeno a una velocidad de flujo de 0,8 L / min. Aplique una pomada oftálmica no medicado estéril para cada ojo para evitar el secado de la córnea
- Preparar el sitio quirúrgico usando 10% hisopo / solución de povidona / yodo, seguido de etanol, repetir 3 veces. Aplicar una gasa estéril (por ejemplo, paño quirúrgico) sobre el ratón para obtener un campo quirúrgico estéril.
- Haga una incisión circunferencial femoral media de la piel, seguido de disección roma y retracción de la piel proximal. Exponer el pedículo neurovascular femoral medial en el lado medio de la pierna, y luego ligarcerca del ligamento inguinal usando 4-0 (poliglactina 910) material de sutura absorbible recubierto.
- Realizar una transección mediados de femoral de grupos musculares con tijeras, seguido de disección roma de los tejidos blandos de la articulación coxofemoral. El uso de un cortador de hueso, realizar una osteotomía mid-femoral. El uso de un hisopo de algodón fino estéril o una esponja de gelatina absorbible, presione suavemente el lugar de la osteotomía para minimizar y prevenir el sangrado.
- Cierre la piel que lo recubre con clips de la herida quirúrgica e inyectar 0,5 ml de solución salina tibia SQ para la terapia del balance de fluidos. Colocar el animal en la parte superior de una almohadilla caliente envuelto en la jaula de recuperación y supervisar continuamente hasta que despierta.
- Tras la cirugía, recoger muestras de tejidos de tumores primarios de ARN, ADN o proteína aislada, congelamiento rápido en nitrógeno líquido y se almacena a -80 ° C. Para el cultivo de células primarias, recolectar muestras de tejido en esta etapa, como se describe en la sección 9 a continuación. Fijar el tejido de la extremidad que queda en el 10% de formalina tamponada neutra para la histología y immunochemistratar, incluyendo la detección hypoxyprobe-1.
- Monitorear los animales para la locomoción, el dolor y el consumo de alimentos durante las primeras 6 horas después de la cirugía, a continuación, todos los días durante 3 días. Inyectar el agente analgésico (carprofeno 5 mg / kg, SQ) al día durante 3 días. Retire las grapas para heridas 10 días después de la amputación con un extractor de clip de la herida.
6. Los ratones control de la presencia de metástasis
- Observar los ratones diariamente y evaluar si presentan signos clínicos de la metástasis al menos dos veces a la semana.
- Observar a los animales para detectar la presencia de macrometástasis presentan como masas que se desarrollan en varios lugares, por lo general hombros, piernas contralateral y las mandíbulas. Con este fin, se palpa cuidadosamente cabeza, el cuello y las regiones axilares, y miembro posterior contralateral. Compruebe si hay metástasis de órganos internos a través de la distensión abdominal, junto con la RM.
- Verificar la presencia de metástasis pulmonares pulsando el proceso xifoides (el extremo inferior del esternón) con index dedo. 24
NOTA: Esta presión disminuye la capacidad de la respiración diafragmática. Los ratones con metástasis pulmonares avanzadas muestran signos de dificultad respiratoria que se manifiesta por la respiración laboriosa. - Observar a los animales para los síntomas neurológicos, como la parálisis de las piernas y la ataxia sugiriendo metástasis en el sistema nervioso central.
- Monitorear los ratones al menos una vez por semana para la pérdida de peso, como una indicación del potencial de progresión de la enfermedad. pérdida de peso corporal superior a 15% del peso de pre-procedimiento se considera un criterio de valoración humana.
7. Imagen de Resonancia Magnética (MRI) para la detección de metástasis
- Realizar la IRM para detectar metástasis en puntos de tiempo deseados. 18
NOTA: En el presente estudio, se utilizó un espectrómetro horizontal 7-Tesla. La RM se realizó en los días 15 y 35 después de la amputación de las células SK-ES1 y el día 15 para TC71 células. - Coloque el ratón en un chambe inducción de la anestesiar que contiene 1-3% de isoflurano en una mezcla gaseosa de 30% de oxígeno y óxido nitroso 70%.
- Deje el ratón en la cámara de inducción hasta que no responde a los estímulos externos. A continuación, retire al animal de la cámara de inducción.
- Transferir el ratón anestesiado en un soporte estereotáxico con la respiración y la monitorización de la temperatura con la administración continua de 1,5% de isoflurano y óxido nitroso 30%. Aplique una pomada oftálmica no medicado estéril a cada ojo para prevenir la sequedad de la córnea. La imagen del animal, ya sea en un Bruker volumen bobina del ratón 40 o 23 mm para el cuerpo entero o de imágenes del cerebro, respectivamente.
- Utilice una de dos dimensiones, la secuencia ponderada en T2 RARE: TR = 3000 ms, TE = 24 ms, matriz = 256, FOV = 4,35 x 3,0 cm, grosor de corte = 0,5 mm, el factor de RARE = 4 y promedios = 4. 18
- Colocar el animal en una jaula de recuperación de calor y controlar continuamente hasta que despierta.
NOTA: Los ratones se recuperará rápidamente desde que se utiliza un plano superficial de la anestesia. Monitorear los animales durante las primeras 6 horas después de la impresión para asegurarse de que no hay efectos adversos de la anestesia.
8. La eutanasia y necropsia
- La eutanasia a los ratones una vez que los animales se presentan con metástasis detectables por resonancia magnética y / o síntomas clínicos de la progresión de la enfermedad.
NOTA: En el presente estudio, los ratones fueron sacrificados a los 50 días y 25 después de la amputación de animales portadores de SK-ES1 y TC71 xenoinjertos, respectivamente. En algunos casos, la eutanasia anterior era necesario debido a una alta carga metástasis. - La eutanasia a los ratones por exposición a CO 2 en 1,5 L / min (CO 2 al 10 a 30% de la cámara de eutanasia vol / min). Para asegurar la muerte del animal, realice dislocación cervical después de la exposición al CO 2.
- Pulverizar todo el ratón con un 70% de etanol y colocarlo en la campana de flujo laminar. Recoger la sangre por punción en el corazón usando una aguja de 25 G ½ con una jeringa de 1 ml y la transferencia a una colección de sangre tuser que contiene 2 mg de EDTA.
- Recoge los siguientes tejidos: bazo, las glándulas suprarrenales, los ovarios, los riñones, el hígado, los pulmones, el cerebro, la pierna derecha, la médula ósea de ambos húmeros y la columna vertebral, así como metástasis macroscópicas presentes en otros lugares. 25,26
- Fijar medio de cada tejido en 10% de formalina tamponada neutra para histología e inmunoquímica, incluyendo la detección hypoxyprobe-1. Snap congelar la otra mitad en nitrógeno líquido, a continuación, almacenar a -80 ° C para el ARN, ADN o proteína aislada. 25,26 Para el cultivo de células primarias, recolectar muestras de tejido como se describe en la sección 9 a continuación.
9. cultivo de células primarias
- Para llevar a cabo el cultivo primario, diseccionar los tejidos de la extremidad amputada (apartado 5 anterior) o durante la necropsia (sección 8 supra) en condiciones estériles en una campana de flujo laminar.
- Preparar los medios de cultivo celular apropiado para la línea celular utilizada para inyecciones ortotópico, complementado con penicilina (200 unidades / ml),estreptomicina (200 mg / ml), Fungizone (1 mg / ml), y 0,2% micoplasma antibiótico profiláctico. Colocar 2,5 ml del medio de cultivo principal en una placa de cultivo celular de 6 cm.
- Seleccionar las áreas de tejido tumoral viable a partir de tumores primarios o metástasis, y luego aislar dos o tres segmentos de 2-3 mm cada uno con unas tijeras estériles.
NOTA: tejido tumoral viable se encuentra generalmente en los bordes del tumor y puede ser discriminado de necrosis por su color rosáceo o rojizo, lustre significativo y apariencia húmeda general. En contraste, el tejido necrótico se ve comúnmente en el centro del tumor y presenta como una masa color blanquecino / crema con una apariencia opaca, caseoso. 27 - La transferencia de los segmentos aislados a una placa de cultivo celular de 6 cm que contiene medio de cultivo primario descrito en el paso 9.2.
- células de cultivo bajo condiciones estándar, como se describe en la sección 1 (NOTA) y 9.2. 18,28 Comprobar la cultura de excrecencia celular derivada de las piezas de tejido, WHICH debe observarse dentro de unos pocos días. Una vez que las células alcanzan la confluencia, trypsinize y propagar de acuerdo con técnicas de cultivo celular estándar.
NOTA: El cultivo de células primarias se puede utilizar posteriormente para evaluar el crecimiento y las propiedades metastásicas de las células derivadas de los tumores de control y de hipoxia, así como de sus características moleculares, como se describe anteriormente. 18
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Representative Results
Después de la inyección de las células ES en el músculo gastrocnemio, los tumores primarios se les permite crecer a un tamaño de ternera de 250 mm 3 (Figura 1, 2). El tiempo necesario para que los tumores para alcanzar este volumen varía típicamente de 10 - 15 días para TC71 a 20-25 días para xenoinjertos SK-ES1, respectivamente. Los tumores en un volumen de ternera de 250 mm 3 exhiben un nivel relativamente bajo de la hipoxia endógeno (aproximadamente 3% de tejido tumoral), basado en hypoxybrobe-1 (pimonidazole) tinción (Figura 4A, C). Es importante destacar que, en estos tumores de control, se observó la tinción positiva para hypoxyprobe-1 únicamente en las áreas de la hipoxia fisiológica, es decir, en células tumorales que son distantes de la vasculatura y comienzan a someterse a la muerte celular (Figura 4A). Tal tinción exhibe un patrón característico "aerógrafo", mientras que el grueso del tejido tumoral sano sigue siendo negativo para hypoxyprobe-1. <sup> 6 En contraste, FAL realiza en esta etapa crea profunda hipoxia, como se evidencia por la tinción positiva para hypoxyprobe-1 observado en la gran mayoría de las células tumorales a las 4 horas después de la FAL (Figura 4B). En particular, también se observan las células tumorales hypoxyprobe-1-positivas en las proximidades de los vasos sanguíneos y se pierde el patrón característico de la hipoxia fisiológica. En estos tumores tratados con FAL, 73% del tejido consta de células tumorales hipóxicas (Figura 4C). El tejido tumoral también muestra los primeros signos de daño inducido por hipoxia, incluyendo la contracción celular y la estructura suelta (Figura 4B).
La eficacia de FAL fue apoyada además por la inhibición completa del crecimiento del tumor primario. Durante el período de 3 días entre FAL y la amputación, el tamaño de los tumores primarios no aumentó (Figura 5A). Por el contrario, los tumores primarios de los ratones sometidos a tratamiento simulado surgery continuó creciendo rápidamente, alcanzando un volumen de aproximadamente 650 mm 3, imitando así la tasa de crecimiento de los tumores en ratones de control no sometidos a cirugía (Figura 5A). 18 De acuerdo con estos datos, el análisis histopatológico reveló extensas áreas de necrosis en los tumores primarios tratados con FAL cosechados 3 días después de la cirugía (Figura 5B). Sin embargo, había grupos de células tumorales viables presentes en el tejido tumoral, por lo general situados en los bordes del tumor, cerca de la vasculatura (Figura 5B). Para investigar el estado de oxigenación de estas células que utilizamos hypoxyprobes, que se activan en las células hipóxicas en vivo, posteriormente obtener la capacidad de unirse covalentemente a proteínas dentro de estas células. 29 Como tal, estas sondas sirven como un marcador permanente de las células que experimentaron la hipoxia en cualquier punto en el tiempo. Por lo tanto, para detectar cambios en los niveles de oxígeno de las células del tumor a lo largo de la duración de la experiment, utilizamos dos hypoxyprobes diferentes que se pueden detectar de forma independiente por inmunohistoquímica. Las sondas se administraron a dos puntos de tiempo - inmediatamente antes de FAL (, hypoxyprobe 2-CCI-103F) (hypoxyprobe-1) y antes de la amputación - Se ha detectado y su localización en tumores recogidos 3 días después de la FAL (Figura 1). Hypoxyprobe-1, que estaba presente en el sistema en el momento de FAL, marcó una mayoría de las células tumorales, ya que el tejido se convirtió severamente hipóxico (Figura 5C). Este etiquetado es también evidente en las áreas de necrosis / apoptosis, ya que estas células estaban todavía vivos en el momento de FAL y por lo tanto capaz de unirse de forma permanente hypoxyprobe-1, como se muestra en la Figura 4B. Por el contrario, hypoxyprobe-2 administraron 2 días post-FAL solamente manchado células viables, como las células en áreas necróticas ya estaban muertos y no puede activar la sonda en el momento de su administración (Figura 5D). Curiosamente, también OBSErved tejido tumoral viable adyacente a la vasculatura que fue inicialmente hipóxica (hypoxyprobe-1-positivo), pero oxigenada adecuadamente en el punto de tiempo más tarde (hypoxyprobe-2-negativo) (Figura 5C, D). Esta conclusión está de acuerdo con informes anteriores que indican que la reperfusión tejido de vasos colaterales que dependen restablece el flujo sanguíneo en el miembro posterior 3 días después de la FAL. 20 Las células tumorales viables restantes en el tejido tumoral de 3 días post-FAL fueron altamente invasivo, como lo demuestra su intravasación masiva en los bordes vascularizados del tumor (Figura 5E). Algunas de las células dentro de la luz del vaso fueron positivos para hypoxyprobe-1, lo que indica que se habían convertido en hipóxica FAL, sin embargo, permanecieron viables. En conjunto, estos datos sugieren que la reperfusión de tejidos después de la hipoxia severa puede facilitar el escape de células de los tumores primarios.
Sobre la base de la experiencia piloto, metástasis diseminadas fueron:detectable por MRI aproximadamente 35 días después de la amputación de xenoinjertos SK-ES1, mientras que las células TC71 normalmente metástasis dentro de los 15 días. En consecuencia, para el análisis comparativo de la latencia de la metástasis y la frecuencia, la resonancia magnética se realizó en el día 15 y 35 después de la amputación de los animales portadores de tumores SK-ES1, mientras que una imagen en el día 15 fue suficiente para que los ratones con tumores TC71. La eutanasia se realizó en el día 50 y el día 25 para los animales con SK-ES1 y TC71 xenoinjertos, respectivamente. Como se informó anteriormente, los tipos más comunes de metástasis incluyen masas de tejido blando en la zona de los hombros, así como las metástasis óseas en las piernas contralateral, zona maxilar y la columna vertebral de las células SK-ES1 y de pulmón y tumores pélvicos para TC71. 18 Además, las metástasis frecuentes a los órganos internos, incluyendo las glándulas adrenales, los pulmones y el hígado, así como la infiltración de la médula ósea, se observaron en ratones portadores tratados con FAL xenoinjertos SK-ES1 (Figura 6). En general, la hipoxia aumenta significativamenteel (SK-ES1) o específica de sitio de frecuencia total (TC71) y la multiplicidad de las metástasis en ambas líneas celulares. Sin embargo, los xenoinjertos TC71 también desarrollaron masas recurrentes frecuentes en el sitio de amputación (25% para el control y 40% para los tumores tratados con FAL), como se describe anteriormente para los tumores primarios grandes TC71. 18
Los tejidos de control y los tumores primarios y las metástasis tratadas con FAL también pueden ser una fuente de material para análisis moleculares globales encaminadas a la identificación de las vías hipoxia activado involucrados en la difusión ES. Por ejemplo, se observaron diferencias significativas en los perfiles metabolómicos de control y de los tumores primarios de hipoxia (datos no mostrados). También hemos sido capaces de aislar con éxito varias líneas celulares de todos los tejidos anteriores. En muchos casos, las células derivadas de tumores tratados con FAL mostraron cambios notables en la morfología, en comparación con las células originales y los derivados de control de tumors (Figura 7A). La pureza de estos cultivos celulares se confirmó mediante inmunotinción positiva para el marcador de sarcoma de Ewing, CD99 (Figura 7B). Además, 100% de las células en las líneas celulares establecidas tenía una señal positiva en la hibridación fluorescente in situ (FISH) con sondas centroméricas humanos, a menudo se presenta con el aumento del número de cromosomas (Figura 8A). El origen humano de estas células se confirmó además por análisis de los cromosomas en metafase (Figura 8B) que exhibieron reordenamientos citogenéticas descritos anteriormente para las células SK-ES1 tanto en la línea de células original y las células derivadas de tumores tratados-FAL (Figura 8B). 30
Figura 1. Esquema de la hipoxia Modelo ES. Las células ES (1 - 2 x 10 6) se inyectaron en gastrocnmúsculos emius de ratones SCID de color beige /. Una vez que los tumores primarios resultantes alcanzaron un volumen de ternera de 250 mm 3, los ratones se dividieron en dos grupos experimentales. Los ratones del grupo de control fueron inyectados con hypoxyprobe-1 (HP-1), y los tumores primarios se extirparon mediante la amputación de extremidades. Los ratones del grupo de hipoxia se inyectaron con hypoxyprobe-1 y después se sometió a ligadura de la arteria femoral (FAL). Dos días más tarde los ratones fueron inyectados con hypoxyprobe-2 (HP-2), y luego los miembros portadores de tumores fueron amputadas tres días post-FAL. Los animales de ambos grupos fueron monitoreadas por imagen de resonancia magnética periódica (MRI). Una vez que las metástasis se hicieron aparentes sobre la base de formación de imágenes y de los signos clínicos, los ratones fueron sacrificados y la presencia de metástasis se confirmó mediante necropsia y análisis histopatológico. El tiempo de crecimiento tumoral, formación de imágenes y la eutanasia se basa en la velocidad de células SK-ES1 de crecimiento y la metástasis. Tenga en cuenta que, si bien hypoxyprobe-2 era necesario establecer el método y visuAlize cambios en los niveles de hipoxia durante el período comprendido entre el FAL y amputación de miembros, su uso no es esencial para los experimentos reales. Por lo tanto, este paso no está incluido en el protocolo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. crecimiento del tumor primario. A. imagen por resonancia magnética (IRM) de una extremidad posterior intacta. La flecha roja indica el sitio y la dirección de la inyección ortotópico de células tumorales. B. El tumor primario a un volumen de ternera de aproximadamente 250 mm3 crecimiento en el músculo gemelo (línea roja). puntas de flechas rojas indican los sitios de destrucción ósea. T - tibia. Por favor Clamer aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. El Sitio de la arteria femoral Ligadura. Un representante de la autopsia arteriografía radiografía de un ratón 129S1 / SvJ perfundido con sulfato de bario inmediatamente después de la ligadura se muestra para destacar la presencia de vasos colaterales preexistentes. Tenga en cuenta que mientras que la imagen representa dos ligaduras (XS), uno distal a la arteria circunfleja lateral femoral (LCFA) (rojo X) y otro proximal a la arteria genu (blanco X), el modelo de hipoxia tumoral utilizado la ligación proximal, cerca el ligamento inguinal y distal a la LCFA (rojo X). La región del desarrollo de vasos colaterales se muestra como (vasos débiles) descritos, y que se identifican por su tortuosa, forma de sacacorchos. Por favor, haga clic en élvolver a ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. Tumor de hipoxia inducida por la arteria femoral Ligadura (FAL). A. Un tumor de control en un volumen de ternera de 250 mm 3 manchado por la hematoxilina y eosina (H & E) y immunostained para hypoxyprobe-1 (marrón). Hypoxyprobe-1 inmunotinción se observa únicamente en las áreas de la hipoxia tumoral fisiológico, donde las células tumorales alejadas de la vasculatura son privadas de oxígeno y comienzan a someterse a la muerte celular. B. FAL-tratada del tumor primario a un tamaño similar cosechado 4 horas después de la ligadura y teñidas con H & E y immunostained para hypoxyprobe-1. La mayoría de las células tumorales son altamente positivo para hypoxyprobe-1, incluyendo los que están en las proximidades de la vasculatura. V - vaso sanguíneo. C. El área de tinción positiva para hypoxyprobe-1 fue quantifIED de los tumores de control y tratados con FAL utilizando el software ImageJ. Las barras de error representan SEM. *** - P <0,001 Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5. Efecto de la arteria femoral Ligadura (FAL) en el crecimiento del tumor primario. Crecimiento del tumor primario A. durante el período de 3 días entre la cirugía y la amputación en barbecho (n = 4) y cirugía simulada tratados (n = 4) los animales, en comparación con los tumores de control intactos (n = 6). Las barras de error representan SD. *** - P <0,001, en comparación con los tumores tratados con cirugía de control y simuladas. B. hematoxilina y eosina (H & E) tinción de un tumor tratado-FAL cosechó 3 días después de la ligadura revela necrosis generalizada dentro del tumor. La línea roja indica un área de ce tumor viableLLS en las proximidades de una región altamente vascularizado perfundidos 3 días después de la FAL. Tejido tumoral tratada-FAL C. cosechó 3 días después de la cirugía a inmunotinción para hypoxyprobe-1. Hypoxyprobe-1 se inyecta antes FAL. Por lo tanto, la inmunotinción positiva indica la existencia de hipoxia tisular extensa inmediatamente después de la cirugía. D. Hypoxyprobe-2 se inyectó 2 días después de la FAL, y el tejido recogido 24 horas después, a la amputación. Positivo hypoxyprobe-2 tinción identifica hipoxia tisular en el momento de la amputación. La flecha roja indica tejido que es hipóxico en ambos puntos temporales mientras que la flecha amarilla indica un área adyacente a la vasculatura que era hipóxico inmediatamente después de FAL (hypoxyprobe-1-positivo), pero negativo para hypoxyprobe-2 en el momento de la escisión, que es indicativo de la reperfusión del tejido. La falta de hypoxyprobe-2 tinción en las zonas necróticas sugiere que las células en esta región no eran viables en el momento de su administración y, por lo tantoincapaz de unirse activamente la sonda. La tinción se presenta en los paneles de BD se realizó en secciones de tejido de serie. E. intravasación en el tumor de 3 días después de la FAL FAL-tratada. La inmunotinción identifica células viables positivos para hypoxyprobe-1 dentro de la luz del vaso (flecha roja). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6. Ejemplos de metástasis en ratones con tumores SK-ES1-FAL tratados. Las metástasis fueron detectados por resonancia magnética (MRI) y confirmado por la autopsia y los análisis histopatológicos (tinción de hematoxilina y eosina, H & E). M - metástasis. Haga clic aquí para conocer el vers más grandes ión de esta figura.
Figura 7. Características de las células derivadas de tumores primarios tratados con FAL. Se establecieron cultivos de células de A. viables a partir de tejidos recogidos de control y tumores primarios de hipoxia y su morfología se comparó con las líneas celulares originales utilizados para inyecciones ortotópico iniciales. Las células derivadas de tumores primarios tratados con FAL exhiben cambios dramáticos en sus tamaños y morfología. se muestran imágenes representativas de las células SK-ES1 derivadas de tumores originales y primarios. Imágenes B. representativos de células derivadas de tumores tratados-FAL inmunoteñidas para el marcador ES, CD99, y contrastados con el colorante de unión a ADN, DAPI. Todas las células son CD99-positivas, incluyendo las células hipertróficas contienen núcleos grandes (flecha blanca). OAD / 54532 / 54532fig7large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 8. Análisis cromosómico de las células derivadas de tumores tratados con FAL. A. La hibridación fluorescente in situ (FISH) El análisis de las células en interfase que muestran dos núcleos con señales de la sonda centromérica 4 humano. El núcleo grande con cuatro señales indica una célula tetraploide (4n) (flecha blanca). B. análisis FISH en las metafases representativos de la línea celular original SK-ES1 y de la célula derivada de tumor primario tratado con FAL. Las flechas rojas indican inv (1) (p13.1q21), una característica no aleatoria reordenamiento citogenético de las células SK-ES1. señales rojas: 4 centromérica humana sonda; Señales verdes en las células originales SK-ES1: sonda NPY5R en 4q32.2 del cromosoma.e.com/files/ftp_upload/54532/54532fig8large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Nuestro modelo implica la comparación de la metástasis en dos grupos experimentales - un grupo de control, donde se permite a los tumores a desarrollar en el miembro posterior seguida de amputación al llegar a un volumen de ternera de 250 mm 3, y un grupo hipoxia expuesto, en el que el tumor- teniendo los miembros posteriores se somete a FAL en el mismo volumen, seguido de la amputación 3 días más tarde. A pesar de que en estos experimentos, los tumores tratados con FAL se amputan con un ligero retraso, en comparación con los tumores de control, su tamaño no aumenta durante el período de 3 días entre la ligadura y la amputación. Por lo tanto, este enfoque permite la comparación de potencial metastásico entre los tumores de tamaños comparables pero con dramáticamente diferentes niveles de hipoxia. En contraste, el uso de cirugía simulada, un control comúnmente utilizado para las intervenciones quirúrgicas, seguido de 3 días de crecimiento del tumor daría lugar a diferencias significativas en el tamaño del tumor entre los grupos experimentales, con la cirugía simulada de tratartumores primarios ed que poseen niveles significativos de hipoxia endógeno. Con base en los experimentos piloto, cirugía simulada no afecta significativamente el crecimiento del tumor o de sus niveles de hipoxia y por lo tanto puede ser eliminado desde el diseño experimental. En cambio, la estrategia de comparar los tumores de tamaños similares y diferentes niveles de hipoxia es un modelo de gran relevancia para la aclaración de los efectos de la hipoxia sobre la difusión de la enfermedad. Es importante destacar que, a diferencia de anteriores estudios in vitro, este enfoque permite una evaluación completa de las acciones pro-metastásicos de la hipoxia en un microambiente tumoral natural. 4-6
El objetivo del diseño experimental era lograr un bajo nivel basal de las metástasis que permitan la detección de un efecto estimulador inducido por hipoxia en su formación. Hemos establecido que un tamaño de ternera de 250 mm3 en el FAL y la amputación era óptima para tumores primarios SK-ES1. Sin embargo, tendrá que ser optimizada para este parámetro ea línea celular ch, en función de su potencial de invasión local y metástasis. Para tumores con mayor potencial metastásico, puede ser necesario disminuir el tamaño del tumor primario en la amputación. Por ejemplo, los tumores TC71 exhiben un alto invasión local se manifiesta por la formación frecuente de los tumores recurrentes en el sitio de amputación. 18 Una vez que tales masas se desarrollan, los animales tienen que ser excluidos de los análisis, ya que no sería claro si las metástasis distantes posteriores se originaron a partir de los tumores primarios o de tumores recurrentes que a menudo crecen rápidamente y exhiben altos niveles de hipoxia endógeno. De la experiencia anterior, independiente de la línea celular utilizada, 150 mm 3 es el tamaño de la pantorrilla portador de un tumor mínimo que se puede medir de forma fiable y normalizada. Si una disminución en el tamaño del tumor en el FAL y la amputación no elimina los tumores recurrentes o disminuir la tasa de metástasis basal suficientemente, la línea celular particular en cuestión puede no ser adecuado para estos experimentos.
ve_content "> Así mismo, es importante establecer la línea de tiempo de la RM y la eutanasia para cada línea celular individual, dependiendo de la latencia de sus metástasis. En particular, los clips de la herida quirúrgica que interfieren con la RM pueden ser removidos no antes de 10 días posteriores a la cirugía, y este período a veces deben extenderse debido a complicaciones con la curación. por lo tanto, en este estudio se estableció día 15 como el tiempo de la primera resonancia magnética.Otra consideración importante en este modelo es el mantenimiento de un nivel de hipoxia capaz de inducir procesos metastásicos sin causar necrosis completa del tumor, lo que impediría la difusión de células tumorales. Aunque no hemos encontrado este problema en este estudio, si es necesario, la gravedad de la hipoxia puede ser regulada mediante la alteración del sitio exacto y el número de ligaduras en relación con las ramas de la arteria femoral, como el LCFA y la arteria genu. 20 Por lo tanto, una ligadura proximal a la LCFA creará isquemia más severa en la hicirculación ndlimb, lo que aumenta las condiciones de hipoxia en la pierna distal. Por el contrario, la ligación distal de las ramas posteriores de la arteria femoral disminuirá la hipoxia que resulta en la extremidad posterior inferior.
Es importante destacar que no hubo efectos adversos graves de los procedimientos de FAL y amputación combinados y no hubo muertes relacionadas con las cirugías, como se informó anteriormente para estas técnicas se realizan por separado. 18-20 Por lo tanto, el éxito del método está limitada principalmente por la tasa de toma de tumor en el sitio primario y la frecuencia de los tumores recurrentes, ambos de los cuales son dependientes de la línea celular.
Como hipoxia ha sido implicado como un factor pro-metastásico en muchos tipos de tumores, este enfoque también puede ser adecuado para probar directamente sus efectos y definir sus mecanismos de acción en otros sarcomas que se desarrollan en las extremidades. 23 Por otra parte, una estrategia similar se puede aplicar a otros tumores malignos que crecen en entornos ortotópico wITH una ruta de suministro de sangre bien definido. Por lo tanto, con las modificaciones apropiadas, este modelo puede ser una herramienta útil en la investigación más allá del campo de la biología ES.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SK-ES1 Human Ewing sarcoma (ES) cells | ATCC | ||
| TC71 Human ES cells | Kindly provided from Dr. Toretsky | ||
| McCoy's 5A (modified) Medium | Gibco by Life Technologies | 12330-031 | |
| RPMI-1640 | ATCC | 30-2001 | |
| PBS | Corning Cellgro | 21-040-CV | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442-500mL | |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1x) | Gibco by Life Technologies | 25200-056 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco by Life Technologies | 15140-122 | |
| Fungizone® Antimycotic | Gibco by Life Technologies | 15290-018 | |
| MycoZap™ Prophylactic | Lonza | VZA-2032 | |
| Collagen Type I Rat tail high concetration | BD Biosciences | 354249 | |
| SCID/beige mice | Harlan or Charles River | 250 (Charles River) or 18602F (Harlan) | |
| 1 ml Insulin syringes with permanently attached 28 G ½ needle | BD | 329424 | |
| Saline (0.9% Sodium Chloride Injection, USP) | Hospira, INC | NDC 0409-7984-37 | |
| Digital calipers | World Precision Instruments, Inc | 501601 | |
| Surgical Tools | Fine Science Tools | ||
| Rimadyl (Carprofen) Injectable | Zoetis | ||
| Hypoxyprobe-1 (Pimonidazole Hydrochloride solid) | HPI, Inc | HP-100mg | |
| hypoxyprobe-2 (CCI-103F-250 mg) | HPI, Inc | CCI-103F-250mg | |
| Povidone-iodine Swabstick | PDI | S41350 | |
| Sterile alcohol prep pad | Fisher HealthCare | 22-363-750 | |
| LubriFresh P.M. (eye lubricant ointment) | Major Pharaceuticals | NDC 0904-5168-38 | |
| VWR Absorbent Underpads with Waterproof Moisture Barrier | VWR | 56617-014 | |
| Oster Golden A5 Single Speed Vet Clipper with size 50 blade | Oster | 078005-050-002 (clipper), 078919-006-005 (blade) | |
| Nair Lotion with baby oil | Church & Dwight Co., Inc. | ||
| Silk 6-0 | Surgical Specialties Corp | 752B | |
| Prolene (polypropylene) suture 6-0 | Ethicon | 8680G | |
| Vicryl (Polyglactin 910) suture 4-0 | Ethicon | J386H | |
| Fisherbrand Applicators (Purified cotton) | Fisher Scientific | 23-400-115 | |
| GelFoam Absorbable Dental Sponges - Size 4 | Pfizer Pharmaceutical | 9039605 | |
| Autoclip Wound Clip Applier | BD | 427630 | |
| Stereo Microscope | Olympus | SZ61 | |
| Autoclip remover | BD | 427637 | |
| Aound clip | BD | 427631 | |
| MRI 7 Tesla | Bruker Corporation | ||
| Paravision 5.0 software | Bruker Corporation | ||
| CO2 Euthanasia system | VetEquip | ||
| 25 G 5/8 Needle (for heart-puncture) | BD | 305122 | |
| 0.1 ml syringe (for heart-puncture) | Terumo | SS-01T | |
| K3-EDTA Micro tube 1.3 ml | Sarstedt | 41.1395.105 | |
| 10% Neutral Buttered Formalin | Fisher Scientific | SF100-4 |
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