Summary
Protokollen giver en metode til at opløse aerob kornet slam for at udvinde alginat-lignende ekstracellulære polymerer (ale).
Introduction
I de senere år den aerobe granuleret slam (AGS) proces er blevet en populær biologisk spildevandsrensning proces, anvendt med succes på flere fuldskala renseanlæg 1. I modsætning til den konventionelle aktiveret slam proces, i AGS behandle mikroorganismerne danner granuler stedet for flokke 2. Disse granuler har bedre sedimentationsevnen, er i stand til at modstå højere organiske ifyldningsgrader, og har højere tolerance over for toksicitet end aktiverede slam flokke 3.
I modsætning til biofilm, er AGS dannet spontant uden involvering af nogen bæremateriale 4. I AGS, ligesom i biofilm, mikroorganismer producerer en betydelig mængde af stærkt hydratiserede ekstracellulære polymere stoffer (EPS) 5 til dannelse af en hydrogel matrix, hvori de er selv-immobiliseret 4 - 6. EPS er en kompleks blanding, der består af polysaccharider, proteiner, nukleinsyrer, (phospho) lipider, humusstoffer og nogle intercellulære polymerer 5,7,8. Disse polymere stoffer interagerer med hinanden via elektrostatiske kræfter, hydrogenbindinger, attraktive ioniske kræfter og / eller biokemiske reaktioner osv 5, der danner en tæt og kompakt tertiær netstruktur. Polymererne i EPS som er i stand til at danne hydrogeler 4,9 og bidrager til dannelsen af den tertiære netværksstruktur er i denne henseende betragtes som strukturelle EPS, en delmængde af de samlede EPS.
EPS er ansvarlige for den kemiske struktur og fysiske egenskaber af granuler 5. Det er derfor afgørende at forstå funktionen af hver EPS sammensatte. Anvendes forskellige tilgange til at udtrække EPS 10 - 15. Men på grund af deres meget store kompleksitet, er det næsten umuligt at udtrække alle de EPS komponenter med en enkelt metode. Til dato er der ingen "one size fits all" metode til EPS udvinding. Valget af ekstraktionsmetode påvirker ikke kun det samlede beløb, men også sammensætningen af de udvundne polymerer 13,16 - 20. Afhængigt af typen af slam og EPS interesse forskellige metoder er nødvendige.
Udtræk geldannende polymerer, der karakteriserer deres egenskaber og undersøger deres samspil med hinanden og med ikke-geldannende EPS vil bidrage til at afsløre den rolle EPS i aerob granuleret slam dannelse. Endvidere er de geldannende polymerer er også egnede biopolymerer i industrielle applikationer. En mulig anvendelse er allerede vist ved hjælp af gel-dannende polymerer fra AGS som belægningsmateriale for at forøge vandtætheden af papir 21.
Derfor er der behov ekstraktionsmetoder, specifikke for geldannende EPS. Formålet med denne undersøgelse er at udvikle en metode til at udtrække geldannende EPS fra AGS. Seks ekstraktionsmetoder 10-15,22, som anvendes hyppigt i litteraturen, blev udvalgt til at udtrække EPS fra AGS. Det samlede beløb og det geldannende egenskab af de ekstraherede EPS blev sammenlignet for hver metode.
Protocol
BEMÆRK: AGS blev indsamlet fra Nereda pilot reaktor på renseanlægget Utrecht, Holland. Reaktoren blev tilført med kommunalt spildevand. Den granulerede slam havde en slam mængdeindeks (SVI 5min) på 59,5 ml / g VSS. Slammet blev samplet i april i slutningen af en aerob cyklus. Efter prøvetagning blev slammet straks transporteret til laboratoriet, sigtet og opbevaret ved -20 ° C indtil anvendelse.
1. EPS Extraction
BEMÆRK: Centrifuge granuleret slam ved 4000 x g og 4 ° C i 20 min, og dekanter supernatanten. Indsamle granuler i pelleten for ekstraktioner. Det totale tørstof (TS) og flygtige faststoffer (VS) af granulerne blev bestemt ved standardmetoderne 23. Omregningsfaktoren mellem granulat våd vægt - vægten af granulatet taget direkte fra pillen - og TS blev fastlagt forud for udvinding. Alle ekstraktioner blev udført i triplikater.
BEMÆRK: 3 g våd granules blev anvendt til hver ekstraktion metode. Deres TS og VS-værdier (0,39 g TS og 0,34 g VS), målt i tre eksemplarer, blev anvendt til at beregne ekstraktionsudbytte.
- Centrifugering udvinding 11
- Transfer 3 g (vådvægt) af granulat i et centrifugerør og fylde centrifugerør på 50 ml med demineraliseret vand.
- Lidt ryste centrifugerør med hånden.
- Centrifuger centrifugerør indeholdende blandingen ved 4000 x g og 4 ° C i 20 min.
- Saml supernatanten i et glas bægerglas, kasseres pellet og fortsætte med supernatanten som beskrevet i afsnit 1.7.
- Sonikering udvinding 10
- Transfer 3 g (vådvægt) af granulat i et centrifugerør og fylde centrifugerør på 50 ml med demineraliseret vand.
- Påfør pulseret sonikering på is i 2,5 minutter ved 40 W til blandingen.
- Centrifugeres centrifugeringenrør indeholdende blandingen ved 4000 x g og 4 ° C i 20 min.
- Saml supernatanten i et glas bægerglas, kasseres pellet og fortsætte med supernatanten som beskrevet i afsnit 1.7.
- Ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA) ekstraktion 11
- Transfer 3 g (vådvægt) af granuler i en 100 ml glasflaske og fylde flasken til 50 ml med 2% (w / v) EDTA-opløsning.
- Lidt ryste flasken med hånden og opbevar den i køleskab ved 4 ° C i 3 timer.
- Overfør blandingen i et 50 ml centrifugerør.
- Centrifuger centrifugerør indeholdende blandingen ved 4000 x g og 4 ° C i 20 min.
- Saml supernatanten i et glas bægerglas, kasseres pellet og fortsætte med supernatanten som beskrevet i afsnit 1.7.
- Formamid - natriumhydroxid ekstraktion (NaOH) 13
- Transfer 3 g (vådvægt) af granuler i en 100ml glasflaske og fylde flasken til 50 ml med demineraliseret vand.
- Tilføj 0,3 ml 99% formamid.
- Lidt ryste flasken med hånden og opbevar den i køleskab ved 4 ° C i 1 time.
- Tilsæt 20 ml 1 M NaOH til granulatet suspensionen.
- Lidt ryste flasken med hånden og opbevar den i køleskab ved 4 ° C i 3 timer.
- Overfør blandingen jævnt i to 50 ml centrifugerør.
- Centrifuger centrifugeringsrør indeholdende blandingen ved 4000 x g og 4 ° C i 20 min.
- Saml supernatanten i et glas bægerglas, kasseres pellet og fortsætte med supernatanten som beskrevet i afsnit 1.7.
- Formaldehyd - NaOH udvinding 11
- Transfer 3 g (vådvægt) af granuler i en 100 ml glasflaske og fylde flasken til 50 ml med demineraliseret vand.
- Tilføj 0,3 ml 37% formaldehyd.
- Lidt ryste flasken i hånden og butikden i køleskab ved 4 ° C i 1 time.
- Tilsæt 20 ml 1 M NaOH til granulatet suspensionen.
- Lidt ryste flasken med hånden og opbevar den i køleskab ved 4 ° C i 3 timer.
- Overfør blandingen jævnt i to 50 ml centrifugerør.
- Centrifuger centrifugeringsrør indeholdende blandingen ved 4000 x g og 4 ° C i 20 min.
- Saml supernatanten i et glas bægerglas, kasseres pellet og fortsætte med supernatanten som beskrevet i afsnit 1.7.
- Høj temperatur - natriumcarbonat ekstraktion (Na 2 CO 3) 9,22,24
- Forvarm 150 ml ledningsvand i en 1000 ml bægerglas på en magnetomrører til 80 ° C.
- Transfer 3 g (våd vægt) af granulat i en 250 ml forbløffet kolbe og fylde kolben til 50 ml med demineraliseret vand.
- Tilføj 0,25 g Na 2 CO 3 vandfri eller 0,67 g Na 2 CO 3 • 10H
- Sæt kolben indeholdende blandingen i vandbad. kolben og bægeret glas Cover separat med alufolie for at forhindre fordampning.
- Blandingen omrøres i 35 minutter ved 400 rpm og 80 ° C.
- Overfør blandingen i et 50 ml centrifugerør.
- Centrifuger centrifugerør indeholdende blandingen ved 4000 x g og 4 ° C i 20 min.
- Saml supernatanten og kassér pillen.
- TS og VS måling af alle ekstrakter efter de standardmetoder 23.
- Tag supernatanten og dialyseres det i 24 timer mod 1.000 ml ultrarent vand (dialysepose med 3.500 Da molekylvægt (MWCO)) 11,12. Skift dialyse vand efter 12 timer til at øge virkningen af dialyse.
- Overfør en rimelig del (ca. 1/3) af den dialyserede supernatant tilen aluminium skål for TS og VS måling 23.
BEMÆRK: Tør prøven natten over ved 105 ° C. Vægtforskellen af den tomme aluminium skålen og aluminium skål indeholdende den tørrede prøve er TS-indhold. Derefter brænde den samme aluminium skål indeholdende prøven ved 550 ° C i 2 timer. Vægtforskellen mellem det tomme aluminium skålen og aluminium skål indeholdende den brændte prøve er askeindholdet. Forskellen mellem TS og askeindhold er VS-indhold. - For hver ekstrakt, overføre den resterende del af den dialyserede supernatant til 10 ml glas bægre. Tykkere supernatanten i 2 dage ved 60 ° C til et endeligt volumen på 1-2 ml for at forøge polymerkoncentrationen i supernatanten.
2. Alginat-lignende Ekstracellulære Polymer (ALE) Ekstraktion
- Dialyse ekstraktet opnået i trin 1.6.8 ifølge trin 1.7.1.
- Overfør den dialyserede ekstrakt i et 250 ml glasbæger. Langsomly omrør ekstraktion ved 100 opm og stuetemperatur. Overvåger konstant pH-ændringer med en pH-elektrode, mens tilsætning af 1 M saltsyre (HCI) til en endelig pH på 2,2 ± 0,05 for at opnå ALE i den sure form.
- Efter indstilling af pH til 2,2, overføre ekstrakten i en 50 ml centrifugerør og centrifugeres ved 4000 x g og 4 ° C i 20 min.
- Supernatanten kasseres, og indsamle den gelagtige pellet. Den gelagtige pellet er ALE i den sure form.
- For at opnå den natrium (eller kalium) form af ALE, tilsæt langsomt 0,5 M NaOH (eller 0,5 M kaliumhydroxid) til gelen opnået i trin 2.4, under blanding gelen langsomt med en glas stick med hånden, indtil pH 8,5 er nået.
3. Ionic Hydrogel Formation Test
BEMÆRK: For at kontrollere, om de udpakkede EPS havde ioniske hydrogel dannelse egenskaber, en perle formation test med Ca 2 + ioner blev anvendt 25.
- Efter fortykkelse af ekstrakten i trin 1.7.3 tilet volumen på 1-2 ml, langsomt blandingen omrøres med en glas stick og justere dens pH til 8,5 med 0,5 M NaOH.
- Tag ekstrakten fra trin 3.1 eller natrium- ALE fra trin 2.5 og langsomt dryppe af ekstrakten med en Pasteur-pipette i en 2,5% (w / v) calciumchlorid (CaCl2) opløsning.
BEMÆRK: Hvis den udpakkede EPS har ioniske hydrogel geldannende egenskaber, dråbeformet (sfæriske) perler vil blive dannet. Hvis den ekstraherede EPS har nogen ionisk hydrogel geldannende egenskaber, vil ekstrakten dispergere i CaCl2-opløsning.
4. Stabilitet Test af den ioniske Hydrogel
BEMÆRK: For yderligere at forstå den rolle den ioniske EPS hydrogel i AGS struktur dannelse, blev stabilitetstests udført på de ioniske hydrogel perler af Na 2 CO 3 udvinding, indsamlet i trin 3.2.
- Hold hydrogelperler i 30 minutter i CaCl2-opløsning.
- Brug en ske til at tage ud hydrogel perler fra CaCl2
- Store fraktion 1 i 10 ml demineraliseret vand i 4 timer ved 4 ° C.
De følgende stabilitetstests blev udført på samme måde som beskrevet i de udvindingsmetoder 1.3 - 1.5. - Store fraktion 2 i 10 ml 2% (w / v) EDTA-opløsning i 3 timer ved 4 ° C.
- Store fraktion 3 i 7,15 ml demineraliseret vand med 60 pi 99% formamid i 1 time ved 4 ° C. Derpå tilsættes 2,85 ml 1 M NaOH og opbevare fraktion 3 i 3 timer ved 4 ° C.
- Store fraktion 4 i 7,15 ml demineraliseret vand med 60 pi 37% formaldehyd i 1 time ved 4 ° C. Derpå tilsættes 2,85 ml 1 M NaOH og opbevare fraktion 4 i 3 timer ved 4 ° C.
- Overvåge, om der er synlig desintegration af perlerne under opbevaring under betingelserne beskrevet i punkt 4.3 - 4,6 til vurdere, om perlerne modstå ekstraktionsbetingelserne.
Representative Results
udvinding EPS
Udseendet af granuler efter anvendelse forskellige EPS ekstraktionsprocedurer er vist i figur 1. Formen og gelstruktur af granuler var intakte efter centrifugering (figur 1a) og EDTA ekstraktion (figur 1c). Granula blev brudt i fragmenter af forskellige størrelser ved lydbehandling. Turbiditeten i væskefasen kunne skyldes suspension af små fragmenter (figur 1b) som turbiditeten stærkt formindsket efter centrifugering. Formamid og formaldehyd alene havde ikke nogen indvirkning på at ændre formen af granulatet og dens gelstruktur (data ikke vist). Efter tilsætning af NaOH, væskefasen slået gullig. Nogle fluffy materiale blev løsrevet fra overfladen af granulatet og dannede et lag oven på de afviklede granulat (figur 1d og 1e). Stadig, formen afgranuler blev ikke ændret. Tilsætningen af NaOH tilsyneladende forbedret EPS solubilisering, men kunne ikke skade gelmatrixen struktur. Til sammenligning granulat helt forsvundet efter Na 2CO 3 ekstraktion (figur 1f). I stedet en blanding af sol-lignende flydende og lille jelly-lignende partikler blev dannet, viser gelmatrixen af granuler blev faktisk solubiliseret.
Figur 1. Aerobe granuleret slam EPS ekstraktioner. For en bedre visualisering af virkningerne af hver ekstraktion metode på granulatet, blev udført eksperimenter i 25 ml glasflasker. Efter ekstraktionsproceduren blev ekstrakterne holdt i 1 time ved stuetemperatur for at tillade suspenderet materiale bundfælde. (A) Centrifugering ekstraktion, (b) sonikeringen ekstraktion, (c) EDTA ekstraktion, (d) formamid - NaOH ekstraktion, (e) Formaldehyd - NaOH udvinding, (f) Høj temperatur -. Na 2 CO 3 udvinding Klik her for at se en større version af dette tal.
EPS udbytte i henseende til VS fraktionen for hver metode er illustreret i figur 2. Udbyttet præsenteres i mg VS EPS pr g indledende VS granulat. Mængden af EPS opnået ved formaldehyd + NaOH, formamid + NaOH og Na 2 CO 3 + varme + blanding var højere end den for centrifugering, sonikering og EDTA ekstraktion. Lignende resultater for disse ekstraktionsteknikker blev også vist ved tidligere undersøgelser 11 - 13,15 indikerer, at alkaliske betingelser forbedre EPS opløselighed 26,27. Mængden af EPS inddrives af Na 2 CO 3 var det højeste, mere end 20 gange af den, der opnås kun ved centrifugering. Derudover kan den samlede EPS udbyttet af Na 2CO 3 ekstraktion forøges yderligere ved flere ekstraktioner. En anden ekstraktion under anvendelse pelleten kasseret i trin 1.6.8 (protokol afsnit) af den første ekstraktion øgede det totale udbytte med 28%, en firedobbelt ekstraktion endog forøget det totale udbytte med 46%.
Figur 2. Resultater af alle udvindingsmetoder med hensyn til VS udbytte og askeindhold. For hver ekstraktion første bar repræsenterer VS udbytte i mg VS EPS pr g indledende VS granulat. Den anden søjle repræsenterer vægtprocenten af aske i de ekstraherede TS. Fejlsøjlerne illustrerer standardafvigelsen af de tre ekstraktioner udført for hver ekstraktion teknik."_blank"> Klik her for at se en større version af dette tal.
Alginat-lignende ekstracellulære polymer (ALE) ekstraktion
Efter at pH af EPS ekstraheres af Na 2CO 3 ekstraktion blev indstillet til 2,2, blev 63% af den samlede VS udfældet. Bundfaldet er surt ALE 25. Restfraktionen var sandsynlige EPS, der kan solubiliseres under ekstraktionsbetingelserne, men kan ikke danne et bundfald ved pH 2,2.
Dannelse test Ionic hydrogel
Aerobic granulat er blevet beskrevet som værende ligner en hydrogel. Granuleringsprocessen er blevet betragtet som et geldannende fænomen med glycosider som geleringsmidlet 4,9,25,28. Normalt Ca2 + er en af de mest almindelige kationer i spildevand. Desuden er det let bindes med sure polysaccharider (f.eksalginater og poly-galacturonsyre), formentlig som en mod-ion at mægle gelering 29. Hvilket således resulterer i en ionisk tværbundet hydrogel. Det blev observeret, at tilsætning af Ca 2+ ioner kan accelerere aerob slam granulering 30. Derfor Ca 2 + -EPS (ionisk hydrogel) kunne spille en vigtig rolle i opbygningen af gelen matrix struktur i aerob kornet slam. I denne henseende, også de ekstraherede EPS danner en ionisk hydrogel med Ca2 + -ioner kan anvendes som en test for at se, om den ekstraherede EPS er et strukturelt polymer bidrager til dannelsen af gelmatrixen i aerob granuleret slam 9.
I denne forskning, for EPS ekstraheret fra AGS (figur 3a) ved forskellige fremgangsmåder, kun EPS ekstraheres af Na 2CO 3 havde form som en dråbe i 2,5% (w / v) CaCl2 opløsning og dannede stabile ioniske hydrogelperler .Desuden natrium ALE fra denne EPS ved yderligere trin (ALE polymer udvinding, figur 3b) viste den samme ejendom som godt. Farven og morfologi af Ca 2+ -ALE gel perler (figur 3c) ligner aerob granuleret slam (figur 3a). Tilsyneladende, EPS ekstraheres af Na 2CO 3 metode bidrager til dannelsen af gelmatrixen i aerob granuleret slam. ALE, som er en hovedbestanddel af denne EPS er strukturelle polymerer, i stand til at danne en ionisk hydrogel.
Stabilitetstest af den ioniske hydrogel
Det blev observeret, at i løbet af EPS ekstraktion, aerobe granuler holdt deres sfæriske form i EDTA, formaldehyd + NaOH og formamid + NaOH (figur 1). For at forstå, hvis de udtrukne strukturelle polymerer spiller en rolle i stabiliteten af granulatet, Ca var 2 + -ALE perlerbehandlet på nøjagtig samme måde som aerobe granuler under udtrækningen. Interessant, Ca 2 + -ALE perler viste lignende stabiliteter som den i AGS (Figur 3d - 3f), dvs, Ca 2 + -ALE perler var ekstremt stabil i EDTA. Der var lidt mængde ALE løsrevet fra overfladen af Ca2 + -ALE perler (lille brunlig fnug i figur 3e og 3f), når Ca2 + -ALE perler var blevet gennemvædet med formaldehyd + NaOH og formamid + NaOH i tre timer , henholdsvis. Denne lighed med hensyn til stabilitet mellem Ca 2+ -ALE perler og aerobe granulat indikerer, at ALE er en del af de vigtige strukturelle polymerer danner AGS-gel matrix.
Figur 3. Aerob granulater og ekstraheret ALE. (A) granulat i demineraliseret vand prior ekstraktion. (B) Sur ALE (ekstraheres efter punkterne 1.6 og 2) efter centrifugering ved 4.000 x g og 4 ° C i 20 min. Resultater af stabilitetstest af den ioniske hydrogel. (C) Ca2 + -ALE-perler opbevares i demineraliseret vand i 4 timer ved 4 ° C. (D) Ca2 + -ALE-beads opbevaret i 2% EDTA, i 3 timer ved 4 ° C. (E) Ca 2+ -ALE-beads lagret i formamid + NaOH i 4 timer ved 4 ° C. (F) Ca 2 + -ALE-perler gemt i formaldehyd + NaOH i 4 timer ved 4 ° C. Klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Bemærkninger til protokollen sektion
Ekstraktionen af EPS / ALE beskrives ved et volumen på 50 ml og 3 g granulat. Disse værdier er beregnet som retningslinjer. Ekstraktioner med højere koncentrationer granula kan mindske udbyttet af de ekstraherede EPS. Under udvinding af ALE skal holdes konstant temperaturen ved 80 ° C i 30 minutter. Den nødvendige tid til blandingen at varme op (ca. 5 min) er inkluderet i protokollen. Endvidere er udvinding effekt forøges ved anvendelse af en magnetisk omrører af samme størrelse som diameteren af kolben bund. Dette vil resultere i gode blandeegenskaber og formaling effekter, fremme udvinding af EPS.
Senere i protokollen afsnit er TS og VS udbytter af alle ekstraktioner (supernatant indsamlet i trin 1.1-1.6) bestemmes. Dialyse skal udføres før TS og VS måling for at mindske eventuelle fejl på grund af tilstedeværelsen af kemikalier, der anvendes til ekstraktion. ENMWCO på 3.500 Da anbefales at fjerne disse kemikalier samtidig bevare EPS makromolekyler i dialyseposen. Dialyseposen bør have et større volumen end volumenet af ekstrakten. Dette er nødvendigt, da lydstyrken af ekstrakten vil stige i løbet af dialyse (fx til EDTA udvinding op til 40% volumen stigning). Omfanget af den kemiske fjernelse ved dialyse kan bestemmes ved måling af pH i prøven før og efter dialyse. Alternativt ledningsevnemålinger af dialyse vand viser omfanget af ion fjernelse.
At opnå ALE fra de samlede ekstraheret EPS (trin 1.6 og 2) dialyse trin er valgfrit. Alligevel dialyse har tre fordele: det reducerer mængden af HCI nødvendig til udfældning, det forbedrer syren massetransport i ekstrakten og nedsætter askeindholdet af det opnåede ALE. Til udfældning af ALE anbefales det at anvende et bægerglas med et meget større volumen end ekstraktiont. Na 2CO 3 normalt overdosed i ekstraktionen. Den tilsatte HCI vil først reagere med Na 2 CO 3 har i ekstrakten, hvilket resulterer i kuldioxid dannelse og, hvis prøven ikke blev dialyseret før, i opskumning. Under tilsætningen af HCl, bør ekstrakten omrøres langsomt med en magnetisk omrører af samme størrelse som bunden af bægerglasset. En omrører af denne størrelse og langsom omrøring vil resultere i endnu blanding uden at bryde strukturen af bundfaldet. Hvis sure gel klumper dannes i ekstraktet, skal bægeret bevæges rundt svagt med hånden. Fældningen udføres med en syre koncentration på 1 M for at undgå et stort volumen forøgelse af ekstrakten mens der stadig opnås en homogen fordeling af syren i prøven. Højere syrekoncentrationer kan resultere i en regional pH fald og sure gel klumper formation. En pH lavere end 2,0 nedsætter mængden af ALE, der kan inddrives, sandsynligvis på grund af strukturelle ændringeraf polymererne ved lavere pH. Det er derfor vigtigt at holde den endelige pH ved 2,20 ± 0,05.
Begrænsninger
Den ALE ekstraktionsfremgangsmåde formål at udvinde strukturelle ekstracellulære polymerer af EPS fra AGS eller biofilm i almindelighed og er ikke beregnet til at udtrække alle nuværende EPS. For at udpakke alle EPS, er det nødvendigt med en kombination af mere end én ekstraktion metode. Som vist med stigningen i udbyttet VS EPS ved at anvende en dobbelt og firdobbelt udvinding, en enkelt ekstraktion vil ikke udpakke alle strukturelle EPS. ALE ekstraktion er en barsk EPS ekstraktionsmetode, der kombinerer konstant blanding med varme og alkaliske betingelser. Af denne grund er det muligt, at nogle intracellulære materiale ekstraheres sammen med EPS. Selvom cellelysis kan være forårsaget af fysiske og kemiske udvinding teknikker (lydbehandling 31,32, NaOH 31,32, EDTA 11,32, CER 32, varme 32 og høj forskydningshastigheder ved mixing 19), skal stadig verificeres tilstedeværelsen af intracellulært materiale i genvundne EPS. Den ioniske geldannende egenskab af de udtrukne EPS er det vigtigste fokus for denne forskning, uanset om den genvundne EPS indeholder intracellulært materiale blev ikke analyseret. Fremtidig forskning vil fokusere på at identificere intracellulært materiale i de udtrukne EPS.
Solubilisering hydrogelmatriksen af AGS er afgørende at udtrække strukturelle EPS
EPS danner en tæt og kompakt hydrogel matrix i AGS. Selvom EPS indeholder forskellige klasser af organiske makromolekyler, såsom polysaccharider, proteiner, nukleinsyrer, (phospho) lipider, humusstoffer og nogle intercellulære polymerer 7,5,8, ikke alle af dem danner en gel. Kun de geldannende polymerer her betragtes som strukturelle polymerer i EPS.
Formålet med EPS ekstraktioner er først at opløse EPS og derefter at samle de solubiliserede EPS. Hvis de strukturelle EPS (dvs. than EPS dannes en hydrogel) er målet for ekstraktionen, gelmatrixen af AGS skal solubiliseres først. Kun metoder, der kan solubilisere gelmatrixen er i stand til at ekstrahere strukturelle EPS. I denne forskning, nogle ofte anvendte EPS ekstraktionsmetoder såsom centrifugering 10 - 15 lydbehandling 10,14,15, EDTA 10 - 12,14,15, formaldehyd + NaOH 10 - 15 og formamid + NaOH 13 ikke effektivt kunne isolere den strukturelle EPS. Dette skyldes det faktum, at hydrogelmatriksen af de aerobe granuler ikke blev solubiliseret ved disse fremgangsmåder. Derfor blev stabilitetstest i afsnit 4 kun udføres med betingelser til stede i EDTA, formamid + NaOH og formaldehyd + NaOH udvinding. Disse tre ekstraktioner var ikke i stand til at isolere strukturelle EPS, men stadig opnås den højeste VS EPS udbytte udover Na 2CO 3 ekstraktion. betingelser of Na 2 CO 3 ekstraktion blev ikke anvendt, da denne ekstraktion metode klart opløst AGS matrix. Derfor de anvendte forhold under stabilitet testen blev anset for repræsentative.
Ekstraktion med kationbytterresin (CER), en anden hyppigt anvendt EPS ekstraktionsmetode, blev ikke anset for denne sammenligning, som tidligere undersøgelser om EPS ekstraktion med CER ikke gav bedre resultater end de kemiske ekstraktioner anvendt her.
Geldannende EPS i AGS
Geldannende EPS betragtes som de strukturelle EPS i hydrogelmatriksen af AGS. Det er værd at påpege, at der er forskellige former for hydrogeler såsom ioniske geler, temperatur-induceret geler og pH inducerede geler. Denne undersøgelse kun fokuserer på EPS, der danner ioniske geler. Med hensyn til den store del af strukturelt gel materiale udvundet, er dette sandsynligvis være den dominerende strukturelle EPS. Der er helt sikkert muligheder, andre former for EPSat danne andre former for hydrogeler (fx pH inducerede gel 28) findes i den samme eller en anden type aerobe granuler. Ikke desto mindre, uanset hvilken form for hydrogel er målrettet, opløseliggørelse EPS gel matrix er det vigtigste skridt til at udtrække geldannende EPS.
I øjeblikket har lidt forskning blevet udført på strukturelle EPS granulært slam. ALE-ekstraktion er beskrevet i denne protokol er i stand til at ekstrahere geldannende EPS fra AGS og vil blive anvendt i fremtidige undersøgelser til karakterisering strukturelle EPS. Mere forskning skal gøres på AGS, strukturelle EPS og ikke-strukturelle EPS til bedre at forstå processen og funktion af granulering og EPS. Især følgende tre punkter skal undersøges: Hvorfor mikroorganismer producerer sådan en stor mængde af EPS, hvad der er den præcise sammensætning af EPS og hvordan sammensætningen af EPS ændres ud miljøændringer. Afsløring og analysere alle involverede forbindelser og deres interactions vil hjælpe til at forstå biofilm og hvordan man bruger dem til vores fordel.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 250 ml baffled flask | Kimble | 25630-250 | |
| 1,000 ml glass beaker | VWR | 213-1128 | |
| RCT basic, magnetic stirrer with thermometer | IKA | 3810000 | |
| sodium carbonate decahydrate | Merck KGaA | 1063911000 | |
| 50 ml centrifugation tubes | greiner bio-one | 227261 | |
| Multifuge 1 S-R, centrifuge | Heraeus/Thermo Scientific | - | |
| hydrochloric acid, 37% | Sigma-Aldrich | 30721-1L-GL-D | |
| 250 ml glass beaker | VWR | 213-1124 | |
| calcium chloride dihydrate | Merck KGaA | 1023821000 | |
| 1 ml Pasteur Pipette | Copan | 201C |
References
- Pronk, M., de Kreuk, M. K., de Bruin, B., Kamminga, P., Kleerebezem, R., van Loosdrecht, M. C. M. Full scale performance of the aerobic granular sludge process for sewage treatment. Water Res. 84, 207-217 (2015).
- Kreuk, M. K., Kishida, N., van Loosdrecht, M. C. M. Aerobic granular sludge - state of the art. Water Sci. Technol. 55 (8-9), 75 (2007).
- Adav, S. S., Lee, D. J., Show, K. Y., Tay, J. H. Aerobic granular sludge: Recent advances. Biotechnol. Adv. 26, 411-423 (2008).
- Seviour, T., Pijuan, M., Nicholson, T., Keller, J., Yuan, Z. Understanding the properties of aerobic sludge granules as hydrogels. Biotechnol. Bioeng. 102 (5), 1483-1493 (2009).
- Flemming, H. -C., Wingender, J. The biofilm matrix. Nat. Rev. Microbiol. 8 (9), 623-633 (2010).
- Seviour, T., Yuan, Z., van Loosdrecht, M. C. M., Lin, Y. Aerobic sludge granulation: A tale of two polysaccharides? Water Res. 46 (15), 4803-4813 (2012).
- Wingender, J., Neu, T. R., Flemming, H. -C. What are Bacterial Extracellular Polymeric Substances. Microb. Extracell. Polym. Subst. Charact. Struct. Funct. , 27-53 (1999).
- Flemming, H. -C., Neu, T. R., Wozniak, D. J. The EPS Matrix: The "House of Biofilm Cells.". J. Bacteriol. 189 (22), 7945-7947 (2007).
- Lin, Y. M., Sharma, P. K., van Loosdrecht, M. C. M. The chemical and mechanical differences between alginate-like exopolysaccharides isolated from aerobic flocculent sludge and aerobic granular sludge. Water Res. 47 (1), 57-65 (2013).
- Fang, H. H. P., Jia, X. S. Extraction of extracellular polymer from anaerobic sludges. Biotechnol. Tech. 10 (11), 803-808 (1996).
- Liu, H., Fang, H. H. P. Extraction of extracellular polymeric substances (EPS) of sludges. J. Biotechnol. 95, 249-256 (2002).
- Comte, S., Guibaud, G., Baudu, M. Effect of extraction method on EPS from activated sludge: An HPSEC investigation. J. Hazard. Mater. 140 (1-2), 129-137 (2007).
- Adav, S. S., Lee, D. J. Extraction of extracellular polymeric substances from aerobic granule with compact interior structure. J. Hazard. Mater. 154, 1120-1126 (2008).
- Pan, X., Liu, J., Zhang, D., Chen, X. I., Li, L., Song, W., Yang, J. A comparison of five extraction methods for extracellular polymeric substances (EPS) from biofilm by using three-dimensional excitation-emission matrix (3DEEM) fluorescence spectroscopy. Water SA. 36 (1), 111-116 (2010).
- D'Abzac, P., Bordas, F., Van Hullebusch, E., Lens, P. N. L., Guibaud, G. Extraction of extracellular polymeric substances (EPS) from anaerobic granular sludges: Comparison of chemical and physical extraction protocols. Appl. Microbiol. Biotechnol. 85 (5), 1589-1599 (2010).
- Comte, S., Guibaud, G., Baudu, M. Relations between extraction protocols for activated sludge extracellular polymeric substances (EPS) and EPS complexation properties: Part I. Comparison of the efficiency of eight EPS extraction methods. Enzyme Microb. Technol. 38 (1-2), 237-245 (2006).
- Adav, S. S., Lee, D. J., Tay, J. H. Extracellular polymeric substances and structural stability of aerobic granule. Water Res. 42, 1644-1650 (2008).
- Caudan, C., Filali, A., Lefebvre, D., Spérandio, M., Girbal-Neuhauser, E. Extracellular polymeric substances (EPS) from aerobic granular sludges: Extraction, fractionation, and anionic properties. Appl. Biochem. Biotechnol. 166 (7), 1685-1702 (2012).
- Frølund, B., Palmgren, R., Keiding, K., Nielsen, P. H. Extraction of extracellular polymers from activated sludge using a cation exchange resin. Water Res. 30 (8), 1749-1758 (1996).
- Nielsen, P. H., Jahn, A. Extraction of EPS. Microb. Extracell. Polym. Subst. Charact. Struct. Funct. , 49-72 (1999).
- Lin, Y. M., Nierop, K. G. J., Girbal-Neuhauser, E., Adriaanse, M., van Loosdrecht, M. C. M. Sustainable polysaccharide-based biomaterial recovered from waste aerobic granular sludge as a surface coating material. Sustain. Mater. Technol. 4, 24-29 (2015).
- Lin, Y. M., Wang, L., Chi, Z. M., Liu, X. Y. Bacterial Alginate Role in Aerobic Granular Bio-particles Formation and Settleability Improvement. Sep. Sci. Technol. 43 (7), 1642-1652 (2008).
- Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater. , American Public Health Association. Washington DC. (1998).
- Mchugh, D. J. A guide to the seaweed industry. , FAO Fish. Tech. Pap. 441. Food and Agriculture Organization of the United Nations. Rome, Italy. (2003).
- Lin, Y., de Kreuk, M., van Loosdrecht, M. C. M., Adin, A. Characterization of alginate-like exopolysaccharides isolated from aerobic granular sludge in pilot-plant. Water Res. 44 (11), 3355-3364 (2010).
- Zorel, J. A., Aquino, S. F., Sanson, aL., Castro-Borges, W., Silva, S. Q. Evaluation of EPS extraction protocols from anaerobic sludge for gel-based proteomic studies. Water Sci. Technol. 72 (4), 535 (2015).
- Ruiz-Hernando, M., Cabanillas, E., Labanda, J., Llorens, J. Ultrasound, thermal and alkali treatments affect extracellular polymeric substances (EPSs) and improve waste activated sludge dewatering. Process Biochem. 50 (3), 438-446 (2015).
- Seviour, T., Pijuan, M., Nicholson, T., Keller, J., Yuan, Z. Gel-forming exopolysaccharides explain basic differences between structures of aerobic sludge granules and floccular sludges. Water Res. 43, 4469-4478 (2009).
- de Kerchove, A. J., Elimelech, M. Formation of polysaccharide gel layers in the presenceof Ca2+ and K+ ions: Measurements and mechanisms. Biomacromolecules. 8 (1), 113-121 (2007).
- Jiang, H. L., Tay, J. H., Liu, Y., Tay, S. T. L. Ca2+ augmentation for enhancement of aerobically grown microbial granules in sludge blanket reactors. Biotechnol. Lett. 25 (2), 95-99 (2003).
- Liang, Z., Li, W., Yang, S., Du, P. Extraction and structural characteristics of extracellular polymeric substances (EPS), pellets in autotrophic nitrifying biofilm and activated sludge. Chemosphere. 81 (5), 626-632 (2010).
- Guo, X., Liu, J., Xiao, B. Evaluation of the damage of cell wall and cell membrane for various extracellular polymeric substance extractions of activated sludge. J. Biotechnol. 188, 130-135 (2014).
