Ett protokoll för metaboliska profilering av biologiska prover genom kapillärelektrofores-masspektrometri med hjälp av en sheathless porös spets gränssnittsdesign presenteras.
I metabolomik, är ett brett spektrum av analytiska tekniker som används för den globala profilering av (endogena) metaboliter i komplexa prover. I detta papper, är ett protokoll som presenteras för analys av anjoniska och katjoniska metaboliter i biologiska prover genom kapillärelektrofores-masspektrometri (CE-MS). CE är väl lämpad för analys av mycket polära och laddade metaboliter som föreningar separeras på basis av deras laddning till storleksförhållande. En nyligen utvecklad sheathless gränssnitt design, det vill säga, en porös spets gränssnitt, används för att koppla CE att elektrosprayjonisering (ESI) MS. Detta gränssnitt metod möjliggör en effektiv användning av den egen lågt flöde egendom CE i kombination med MS, vilket resulterar i nanomolära gränser för ett brett spektrum av polära metabolit klasser upptäckt. Protokollet presenteras här bygger på att anställa en bar kvarts kapillär med en porös spets emitter vid lågt pH separationsbetingelser för analys av enbrett spektrum av metabolit klasser i biologiska prover. Det kan visas att samma sheathless CE-MS-metod kan användas för profilering av katjoniska metaboliter, inklusive aminosyror, nukleosider och små peptider, eller anjoniska metaboliter, inklusive sockerfosfater, nukleotider och organiska syror, genom att endast koppla om MS-detektion och separation spänning polaritet. Mycket informationsrika metaboliska profiler i olika biologiska prover, såsom urin, cerebrospinalvätska och extrakt av glioblastomcellinje, kan erhållas genom detta protokoll i mindre än en timme av CE-MS-analys.
I samtida metabolomics, är avancerade analytiska separationstekniker användas för att analysera ett brett spektrum av metabolit klasser för att erhålla ett representativt utläsning av den fysiologiska statusen hos en organism 1. Det slutgiltiga målet med en metabolomik studie är att få ett svar på ett givet biologiskt / klinisk fråga. För närvarande är den mänskliga Metabolome databas bestående av mer än 40.000 metabolit bidrag som representerar både endogena och exogena föreningar (den senare med ursprung från näringsämnen, mikroorganismer, läkemedel och andra källor) 2. Med tanke på den enorma mångfalden i fysikalisk-kemiska egenskaper och koncentrationsintervall av dessa metaboliter, bör flera analytiska tekniker med olika mekanismer separations användas tillsammans för att profilera så många metaboliter som möjligt i ett givet biologiskt prov. Till exempel använde Psychogios et al. En kombination av fem analytiska separationstekniker för metabolisk profiling av humant serumresulterar i detektionen av mer än 4000 kemiskt olika metaboliter 3.
I detta dokument, kommer uppmärksamhet att ägnas åt nyutvecklade CE-MS strategier för metabolisk profilering av biologiska prover 4,5. I CE, närmare bestämt kapillärzonelektrofores (CZE, normalt kallat CE), föreningar separeras på basis av deras laddning till storleksförhållande, och därför är mycket lämpad för analys av polära och laddade metaboliter denna analysteknik. Mekanismen för CE-separation är fundamentalt annorlunda från kromatografiska baserade tekniker, vilket ger en kompletterande syn på den metaboliska sammansättningen av biologiska prover 6-8. Soga och medarbetare var de första att visa användbarheten av CE-MS för den globala profilering av metaboliter i biologiska prover 9,10. Hittills har möjligheten och nyttan av CE-MS för metabolomik i stor utsträckning visat 11-15.CE är i allmänhet kopplad till MS via en mantel-vätskegränssnittstekniken 16,17; emellertid, på grund av utspädning av den kapillära utflödet genom mantel-vätska, detektionskänsligheten är intimt äventyras.
Nyligen visades det att användningen av en sheathless gränssnittet förbättrats avsevärt detekteringstäckning av metaboliter som förekommer i olika biologiska prover jämfört med CE-MS med användning av en klassisk mantel-vätskegränssnittet 5,18,19. Till exempel var circa 900 molekylära funktioner upptäcks i mänsklig urin genom sheathless CE-MS, medan cirka 300 molekylära egenskaper observerades med mantel-flytande CE-MS 5. Den sheathless gränssnitt som användes var baserad på en porös spets emitter, som uppfanns av Moini 20, vilket möjliggör en effektiv användning av den i sig låga flytegenskap av CE i kombination med nano-ESI-MS.
För att stimulera användningen av sheathless CE-MS inom metabolomik,ett protokoll presenteras som beskriver hur detta tillvägagångssätt kan användas för analys av mycket polära metaboliter i biologiska prover, såsom exemplifieras för analys av extrakt från den glioblastomcellinje. Det är visat att sheathless CE-MS-metod för profilering av katjoniska metaboliter också kan användas för profilering av anjoniska metaboliter som använder exakt samma kapillär och separationsförhållanden, och därigenom minska analystiden och ge en enda analytisk plattform för den globala profilering av laddade metaboliter. Protokollet beskriver också en strategi för en effektiv inriktning av sheathless porös spets emitter med MS instrument.
En sheathless CE-MS-metod som utnyttjar en porös spets emitter har presenterats för analys av mycket polära och laddade metaboliter. En unik egenskap hos denna metod är att anjoniska eller katjoniska metaboliter kan profileras genom att endast växla MS-detektion och CE spänning polaritet. Ett brett utbud av mycket polära och laddade metaboliter i biologiska prover kan analyseras med en hög avskiljningsgrad, vilket är avgörande för strukturellt liknande metaboliter, och med detektionsgräns på (låg) nanomolära området. Den presenterade protokollet fokuserats på användningen av sheathless CE-MS för metabolisk profilering av cellextrakt i syfte att exemplifiera användbarheten av metoden för metabolisk profilering av ett biologiskt prov. Tillvägagångssättet som beskrivs här kan också användas för metabolisk profilering av andra typer av biologiska prover, såsom humant urin 5, med tanke på att en ordentlig förbehandling av provet förfarande används.
Den sheathless CE-MS-metod är baserad på en porös spets emitter som medger användning av den i sig låga flytegenskap av CE. I detta sammanhang är en stabil ESI signal en förutsättning för reproducerbara metaboliska profileringsstudier. Således är det viktigt att sprutan spetsen är korrekt placerad framför den MS inlopp. I denna uppsättning, är ESI processen huvudsakligen beroende på vilken typ av BGE och därför är BGE optimering kritisk. Den sheathless konfigurationen är mindre mångsidig i jämförelse med mantel-flytande CE-MS-system, där alla typer av mantel-flytande kompositionerna kan tillsättas för att förbättra den joniseringseffektivitet. Den sheathless ESI spruta nålen måste vara helt fylld med ledande vätska (dvs BGE lösning). En instabil ESI signal kan bli följden av en partiell eller helt ansluten kapillär. Sköljning vid höga tryck med BGE kan lösa det här problemet. Annars separations kapillär behöver bytas ut. Före bedömningen av den analytiska prestanda, en stabil ESI bakgrundssignalbör genereras först som är konsekvent från en dag till en annan.
Den analytiska prestanda sheathless CE-MS-metod för metaboliska profilering studier måste kontrolleras dagligen med metabolit standardblandningar. Under samma försöksbetingelser, konsekventa migrations gånger, dvs variation under 3% för inom dag (n = 10) och mellan-dag (n = 5) med hjälp av en 20 nl injektion av en metabolit standardblandning (12,5 M), topp höjder / områden (variation under 15%) och plattnummer (som sträcker sig mellan 60.000 och 400.000) bör erhållas. Detektionsgränser bör vara i det nanomolära intervallet för de flesta metabolit standarder. Först när dessa kriterier är uppfyllda är metoden klar för metabolisk profil av biologiska prover. Om inte, behöver MS instrument som skall avstämmas och åter kalibrerad eller den porösa spets kapillär emitter behöver ändras.
En effektiv sköljningssteg mellan CE-MS-analyser är av stor betydelse, inte bara förförhindra potentiell överföring utan också för att bibehålla separationsprestanda. Potentiell överföring kan orsakas av BGE flaskor förorenade med provet, och därför lösas genom ersättning med nya BGE flaskor. När sheathless CE-MS-metoden inte används, är det viktigt att koppla bort separations kapillären och för att lagra inloppssidan av kapillären i vatten och utsidan nedsänkt med skyddshylsan i ett rör innehållande vatten för att förlänga kapillär livstid.
Sammanfattningsvis visar den föreslagna sheathless CE-MS-metoden en stark potential för metabolisk profilering av biologiska prover när de används i enlighet med de förfaranden som redovisas i detta protokoll. I detta skede är mellan laboratorier jämförelsedata definitivt behövs för sheathless CE-MS för att bedöma den (långsiktiga) reproducerbarhet och robusthet av denna strategi för metabolomik. Detta protokoll kan stimulera en sådan studie. Olika analytiska utmaningar måste fortfarande övervägas. För optimal performance bör CE strömmen hållas företrädesvis under 5 iA och i detta skede de kapillära porösa spets sändare tillhandahålls endast med en längd av 91 cm, som kan hämma utvecklingen av hög genomströmning analyser. Dessutom har en låg pH separation används för anjoniska metabolisk profilering som kanske inte är den mest optimala för att uppnå en baslinje separation av strukturellt besläktade fosfater socker. Också viktigt är att endast anjoniska metaboliter kan analyseras som (delvis) negativt laddad under använda separationsbetingelserna. Nästa steg är att bedöma användbarheten av sheathless CE-MS-metod för kliniska metabolisk profilering studier för närvarande, kan en enda porös spets kapillär emitter endast användas för analys av upp till 100 biologiska prover.
Totalt sett kommer en vidareutveckling i sheathless CE-MS metod öppnar en ny riktning inom metabolomik, dvs mot en djupare förståelse av biologiska funktioner i sriklig fritt fall.
The authors have nothing to disclose.
Dr. Rawi Ramautar would like to acknowledge the financial support of the Veni grant scheme of the Netherlands Organization of Scientific Research (NWO Veni 722.013.008).
CESI 8000 instrument | Sciex | A98089 | OptiMS adapter required to couple CESI to MS |
OptiMS Fused-Silica Cartridge, 30 μm ID x 90 cm total length | Sciex | B07367 | |
OptiMS Adapter for Sciex Nanospray III source | Sciex | B07363 | |
CESI vials | Sciex | B11648 | |
Micro vials | Sciex | 144709 | |
Glacial acetic acid | Sigma | A6283 | Use in fume hood |
Cationic metabolite mixture | Human Metabolome Technologies | H3304-3034 | |
Anionic metabolite mixture | Human Metabolome Technologies | H3304-1031 | |
Methanol (LC-MS Ultra Chromasolv) | Sigma | 14262 | Use in fume hood |
Sodium hydroxide solution | Sigma | 72079 | 0.1 M |
U-87 MG Glioblastoma cell line | Sigma | 89081402 | |
Chloroform | Sigma | 650498 | Toxic; use in fume hood |