Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biochemistry

Sheathless شعري الكهربائي-الطيف الكتلي لالاستقلابية من التنميط العينات البيولوجية

doi: 10.3791/54535 Published: October 1, 2016

Summary

ويرد بروتوكول لتحديد ملامح التمثيل الغذائي من العينات البيولوجية التي كتبها شعري قياس الطيف الكهربائي الشامل باستخدام sheathless التي يسهل اختراقها تصميم واجهة طرف.

Abstract

في الايض، يتم استخدام مجموعة واسعة من التقنيات التحليلية لالتنميط العالمي (الذاتية) الأيض في عينات معقدة. في هذه الورقة، ويقدم على بروتوكول لتحليل نواتج أنيوني والموجبة في العينات البيولوجية التي كتبها شعري قياس الطيف الكهربائي الشامل (CE-MS). ومناسبة تماما CE لتحليل نواتج القطبية للغاية ومشحونة كما يتم فصل المركبات على أساس نسبة الاتهام إلى حجمها. وضعت مؤخرا sheathless تفاعل تصميم، أي واجهة طرف يسهل اختراقها، ويستخدم لاقتران م إلى Electrospray التأين (ESI) MS. يسمح هذا النهج التواصل الاستخدام الفعال للممتلكات في جوهرها انخفاض تدفق من اوربا في تركيبة مع مرض التصلب العصبي المتعدد، مما أدى إلى حدود الكشف nanomolar لمجموعة واسعة من فئات الأيض القطبية. ويستند البروتوكول المقدمة هنا على توظيف عارية الشعرية تنصهر السيليكا مع باعث طرف يسهل اختراقها في ظروف فصل انخفاض الرقم الهيدروجيني لتحليل لمجموعة واسعة من الطبقات الأيض في العينات البيولوجية. وتبين أن نفس الأسلوب sheathless CE-MS يمكن استخدامها لتحديد ملامح الأيض الموجبة، بما في ذلك الأحماض الأمينية، نوكليوسدس والببتيدات الصغيرة، او نواتج الأيونية، بما في ذلك الفوسفات والسكر، والنيوكليوتيدات والأحماض العضوية، عن طريق التحول فقط الكشف عن مرض التصلب العصبي المتعدد و الفصل قطبية الجهد. ملامح التمثيل الغذائي للغاية غنية بالمعلومات في مختلف العينات البيولوجية، مثل البول، السائل المخي الشوكي ومقتطفات من خط خلية ورم أرومي، ويمكن الحصول على هذا البروتوكول في أقل من 1 ساعة من تحليل CE-MS.

Introduction

في الايض المعاصرة، وتستخدم الراقية تقنيات الفصل التحليلي لتحليل مجموعة واسعة من الطبقات الأيض من أجل الحصول على ممثل للقراءة للخروج من الحالة الفيزيولوجية للكائن الحي 1. الهدف النهائي للدراسة الايض هو الحصول على إجابة على سؤال البيولوجي / السريرية معين. في الوقت الحاضر، وتتألف قاعدة البيانات Metabolome الإنسان أكثر من 40،000 إدخالات الأيض تمثل المركبات على حد سواء الداخلية والخارجية (للمنشأ الأخير من المواد الغذائية، والجراثيم، والمخدرات، وغيرها من المصادر) 2. ونظرا لتنوع كبير في الخصائص الفيزيائية والكيميائية ومدى تركيز هذه المركبات، متعددة التقنيات التحليلية مع آليات الفصل مختلفة وينبغي أن تستخدم جنبا إلى جنب من أجل محة العديد من نواتج الأيض ممكن في عينة بيولوجية معينة. على سبيل المثال، Psychogios آخرون استخدام مزيج من خمس تقنيات الفصل تحليلية للأستاذ التمثيل الغذائيiling من المصل البشري مما أدى إلى الكشف عن أكثر من 4000 الأيض المختلفة كيميائيا 3.

في هذه الورقة، سيتم دفع الانتباه إلى استراتيجيات CE-MS وضعت مؤخرا لتحديد ملامح التمثيل الغذائي من العينات البيولوجية 4،5. م، الكهربائي أكثر الشعرية تحديدا منطقة (تشيكيا؛ ويشار عادة باسم م)، يتم فصل المركبات على أساس نسبة الاتهام إلى حجمها، وبالتالي، فإن هذا الأسلوب التحليلية هي مناسبة للغاية لتحليل نواتج القطبية واتهم. آلية فصل CE تختلف اختلافا جوهريا عن التقنيات المعتمدة الكروماتوغرافي، وبالتالي تقديم وجهة نظر مكملة على تكوين الأيض من العينات البيولوجية 6-8. كانت سوجا وزملاء العمل الأولى التي تظهر فائدة CE-MS لالتنميط العالمي من الأيض في عينات بيولوجية 9،10. حتى الآن، وجدوى وفائدة CE-MS لالايض وقد ثبت على نطاق واسع 11-15.ويقترن CE عموما إلى MS عبر غمد السائل التواصل تقنية 16،17. ولكن نظرا لتخفيف من النفايات السائلة الشعرية التي كتبها غمد السائل، للخطر حساسية الكشف عن جوهرها.

في الآونة الأخيرة، وقد تبين أن استخدام واجهة sheathless تحسنت بشكل ملحوظ التغطية الكشف عن الأيض الموجودة في مختلف العينات البيولوجية بالمقارنة مع CE-MS استخدام الكلاسيكية واجهة غمد السائل 5،18،19. على سبيل المثال، تم الكشف عن حوالي 900 ميزات الجزيئية في البول البشري عن طريق sheathless CE-MS في حين لوحظت حوالي 300 ميزات الجزيئية مع غمد السائل CE-MS 5. واستند واجهة sheathless استخدامها على باعث طرف يسهل اختراقها، والتي اخترعها مويني 20، والسماح للاستخدام الفعال للممتلكات في جوهرها انخفاض تدفق من اوربا في تركيبة مع نانو ESI-MS.

من أجل تحفيز استخدام sheathless CE-MS في مجال الايض،ويرد بروتوكول يصف كيف أن هذا النهج يمكن استخدامها لتحليل نواتج القطبية عالية في العينات البيولوجية، كما يتضح لتحليل مقتطفات من خط خلية ورم أرومي. وتبين أن طريقة CE-MS sheathless لالتنميط الأيض الموجبة يمكن أن تستخدم أيضا لالتنميط من المركبات الأيونية باستخدام بالضبط نفس شعري والانفصال الظروف، وبالتالي تقليل الوقت اللازم تحليل وتوفير منصة تحليلية واحدة لالتنميط العالمي لل الأيض المشحونة. يصف البروتوكول أيضا استراتيجية لمحاذاة الفعالة للsheathless التي يسهل اختراقها باعث طرف مع أداة MS.

Protocol

ملاحظة: بروتوكول الموصوفة هنا لاستخدام sheathless CE-MS للدراسات التنميط التمثيل الغذائي للاستخدام المختبر فقط. وتستند الإجراءات المبينة أدناه على 4،5 العمل التي نشرت مؤخرا. تفاصيل تجريبية أخرى يمكن أن تكون موجودة في هذه الأوراق. قبل استخدام هذا البروتوكول، والتشاور مع جميع بيانات سلامة المواد ذات الصلة (MSDS). الرجاء استخدام جميع الإجراءات المناسبة سلامة المختبرات، بما في ذلك النظارات الواقية، معطف المختبر والقفازات، وعند إجراء التجارب الواردة في هذا البروتوكول.

1. إعداد الكواشف حلول والعينات

  1. إعداد بالكهرباء الخلفية (BGE)
    1. يعد حل جديد BGE (10٪ (ت / ت) وحامض الخليك، ودرجة الحموضة 2.2) كل يوم.
    2. إضافة 9.0 مل من الماء في قارورة زجاجية 10 مل وإضافة 1.0 مل من حمض الخليك إلى الماء في غطاء الدخان. مزيج الحل بدقة باستخدام الدوامة.
  2. إعداد القياسيه الأيضد الخليط
    1. حل 50 ميكرولتر من خليط القياسي 50 ميكرومتر الموجبة التي تحتوي على 60 الأيض الموجبة إلى 50 ميكرولتر من الماء وتخلط الحل بدقة. مخزن في -80 درجة مئوية عندما لا تكون قيد الاستعمال.
    2. حل 50 ميكرولتر من 50 ميكرومتر أنيون خليط القياسية تحتوي على 30 الأيض الأيونية إلى 50 ميكرولتر من الماء وتخلط الحل بدقة. تخزين هذا الحل، في قسامات لمنع تجميد / الذوبان دورات من نفس خليط القياسية، في -80 درجة مئوية عندما لا تكون قيد الاستعمال.
      ملاحظة: الأيض خليط القياسية مستقرة لمدة 3 أشهر عند تخزينها بشكل صحيح في -80 درجة مئوية.
  3. إعداد مقتطفات من خط خلية ورم أرومي
    1. غسل ملتصقة خلايا U-87 MG ورم أرومي الإنسان ثلاث مرات مع 1 مل الجليد الباردة 0.9٪ محلول كلوريد الصوديوم 21.
    2. إضافة 2 مل من محلول الميثانول / الماء المثلج (8/2، ت / ت) لخلايا ملتصقة وكشط باستخدام المطاط يميل مكشطة خلية 21. جمع الحل الميثانول / الماء في أنبوب وultrasonicate لمدة 2 دقيقة.
    3. إضافة الكلوروفورم إلى جزء الميثانول / الماء (نسبة النهائية 8/8/2، ت / ت / ت) وأجهزة الطرد المركزي العينة لمدة 10 دقيقة في 16100 x ج و 4 درجات مئوية.
    4. جمع الميثانول / طبقة المياه وتتبخر هذا الكسر باستخدام مكثف فراغ. إعادة تشكيل المواد المجففة في 50 ميكرولتر المياه لتحليلها من قبل sheathless CE-MS. عندما لا تكون قيد الاستعمال تخزين العينة عند -80 درجة مئوية.

2. إعداد CE-MS النظام Sheathless

  1. تركيب العارية خرطوشة تنصهر السيليكا مع باعث طرف يسهل اختراقها
    1. وضع العارية خرطوشة تنصهر السيليكا جديدة مع باعث طرف يسهل اختراقها (30 ميكرون الداخلية قطر × 90 سم الطول الإجمالي) في الصك م.
    2. تطبيق شطف إلى الأمام في 50 رطل لمدة 15 دقيقة مع برنامج السيطرة على الصك CE باستخدام الميثانول بنسبة 100٪ وتحقق بصريا سواء كانت سائلة تتدفق خارجا من capilمخرج لاري خلال هذه الخطوة الشطف. أيضا إجراء الشطف في الاتجاه المعاكس في 50 رطل لمدة 5 دقائق باستخدام حل BGE لفحص البصر سواء كانت سائلة تتدفق خارجا من الشعرية موصل.
    3. كرر الخطوة 2.1.2 عند ضغط 100 رطل في حال لوحظ أي تشكيل قطرة السائل عند مخرج الشعرية. تثبيت العارية خرطوشة تنصهر السيليكا جديدة إذا لم يلاحظ أي تشكيل قطرة السائل خلال هذه الخطوة.
    4. شطف الشعرية فصل مع الماء في 50 رطل لمدة 10 دقيقة، تليها 0.1 M هيدروكسيد الصوديوم في 50 رطل لمدة 10 دقيقة، ثم عن طريق المياه في 50 رطل لمدة 10 دقيقة، وأخيرا مع BGE في 50 رطل لمدة 10 دقيقة.
      ملاحظة: الخطوات 2.1.1 حتى 2.1.4 مطلوبة فقط لتركيب خرطوشة الشعرية الجديدة.
  2. اقتران الشعرية التي يسهل اختراقها باعث تلميح إلى ESI-MS
    ملاحظة: قبل اقتران الشعرية CE لمرض التصلب العصبي المتعدد، تأكد من أن أداة MS تم معايرة وتوصيلها إلى نظام CE. تعيين الجهد ESI ل0. تناسب أداة MS مع مصدر nanospray. لم تطبق غاز 1، 2 الغاز ودرجة الحرارة سخان واجهة كما ESI في معدلات تدفق منخفضة جدا يحدث فقط عن طريق تطبيق الجهد رذاذ أيون التي وضعت في 1500 خامسا مجموعة الستار في 5 رطل.
    1. إزالة غيض بخاخ خرطوشة تنصهر السيليكا من أنبوب المياه وتثبيته في محول مصدر nanospray لاقتران إلى أداة MS. تأكد من أن ارتفاع قارورة BGE في الصك CE تتطابق مع ارتفاع الحافة البخاخ.
    2. تحقق من وجود تدفق السائل من خلال الشعيرات الدموية الموصلة قبل الشطف مع BGE في 50 رطل لمدة 5 دقائق. خلال هذه الشطف خطوة تشكيل انخفاض في قاعدة البخاخ إبرة ESI ينبغي مراعاتها.
    3. تدفق شعري الفصل مع BGE في 50 رطل لمدة 10 دقيقة في الاتجاه إلى الأمام. ينبغي مراعاة تشكيل انخفاض في غيض من طرف باعث التي يسهل اختراقها (بخاخ طرف) خلال هذه الخطوة.
    4. ضع باعث طرف يسهل اختراقها إلى مدخل مدخل MS على مسافة جIRCA 2-3 ملم.
    5. تطبيق الجهد 30 كيلو فولت باستخدام الوقت منحدر من 1 دقيقة والبدء في الحصول على البيانات MS في مجموعة م / ض من 65 إلى 1000 م / ض للدراسات التنميط الأيضية باستخدام أولا الجهد ESI 0.
      ملاحظة: يجب أن يكون الطيف الكتلي باطل إشارة كما ينبغي أن يكون هناك أي electrospray.
    6. تعيين الجهد ESI إلى 1000 V في حين حمل على قياس البيانات. زيادة الجهد ESI مع الزيادات من 200 V حتى إشارة خلفية ثابتة لوحظ لمدة 15 دقيقة على الأقل.
    7. تحسين يسهل اختراقها طرف موقف باعث فيما يتعلق وسط مدخل MS بوضعها في س، ص، ض أو اتجاه، من أجل معرفة أي موقف توفر القصوى والأكثر استقرارا إشارة MS (مجموع أيون رحلاني).
    8. بعد تحقيق الاستفادة المثلى من موقف باعث طرف يسهل اختراقها وتحديد الأمثل ESI الجهد، وتعيين الجهد ESI 0 V وتقليل الجهد CE من 30 كيلو فولت إلى 1 كيلو فولت باستخدام الوقت منحدر من 5 دقائق.
    9. إنشاء أسلوب النقيب MSز الأمثل ESI الجهد وطريقة CE على الصك CE لتحليل معايير الأيض والعينات البيولوجية.

3. تحليل المستقلب المعايير والعينات البيولوجية

  1. تقييم أداء CE-MS نظام sheathless
    1. نقل 20 ميكرولتر من انيوني الأيض خليط القياسية في فارغة 100 microvial ميكرولتر (PCR القارورة) التي تناسبها في قارورة م، ووضع هذه القارورة في علبة عينة مدخل.
      ملاحظة: الحد الأدنى للحجم المطلوب في microvial لحقن موثوق بها و2 ميكرولتر.
      1. بدء اكتساب MS طريقة وضع الأيونات السالبة التي تم إنشاؤها خلال خطوة 2.2.9 وبعد ذلك يبدأ تسلسل CE باستخدام برنامج السيطرة على الصك م.
      2. شطف الشعرية الفصل مع BGE في 50 رطل لمدة 3 دقائق تليها حقن في 2.0 رطل لمدة 60 ثانية (20 نيكولا لانغ الموافق 3٪ من حجم الشعرية) ثم عن طريق الحقن BGE عند 1.0 رطل لمدة 10ثانية.
        ملاحظة: بعد ذلك، يتم تشغيل الحصول على البيانات MS.
      3. تطبيق الجهد من -30 كيلو فولت مع الوقت منحدر من 1.0 دقيقة مع ضغط 0.5 رطل لمدة 30 دقيقة في المدخل. بعد 30 دقيقة الفصل الكهربي، والتوقف عن الحصول على البيانات MS وتقليل الجهد CE إلى -1 كيلو فولت باستخدام الوقت منحدر من 5 دقيقة (انخفاض تدريجي من الجهد CE بعد الفصل الكهربي يحسن متانة من طرف يسهل اختراقها الشعرية باعث).
    2. بين حقن عينة، وشطف الشعرية بالماء، 0.1 M هيدروكسيد الصوديوم والماء وBGE كل في 30 رطل لمدة 3 دقائق.
    3. تحليل البيانات المسجلة عن طريق تحديد الأوقات الهجرة وقوة إشارة الخليط الأيض انيوني تحليلها.
    4. تقييم ما إذا كانت المعايير الأيض الأيونية تظهر في المنطقة بين 10 و 28 دقيقة.
    5. تحقق ما إذا كان ثلاثة ايزومرات المرتبطة هيكليا، أي مد الجلوكوز-1-فوسفات، مد الجلوكوز 6 فوسفات وD-الفركتوز-6-فوسفات همجزئيا فصل، أي القرار بين القمم الأولين هو حوالي 0.75 والقمم الماضيين هو حوالي 0.50 (انظر الشكل 1).
      ملاحظة: قرار من 1.5 يشير إلى الفصل الأساسي من اثنين من القمم المجاورة.
    6. كرر الخطوات من 3.1.1 و 3.1.2 لخليط الأيض الموجبة. تأكد من أن الكشف عن مرض التصلب العصبي المتعدد هو الآن في وضع ايون ايجابية وCE الجهد +30 كيلو فولت.
    7. تحليل البيانات المسجلة عن طريق تحديد الأوقات الهجرة وقوة إشارة الخليط الأيض الموجبة تحليلها.
    8. تقييم ما إذا كانت المعايير الأيض الموجبة تظهر في المنطقة بين 8 و 22 دقيقة. تحقق ما إذا كان يسوليوكيني ويسين وتهاجر بين 15 و 15.5 دقيقة، وتحديد ما إذا كان القرار هو حوالي 0.5.
  2. تحليل العينات البيولوجية
    1. كرر الخطوات من 3.1.1 و 3.1.2 لتحديد ملامح التمثيل الغذائي انيوني للاستخراج من خط خلية ورم أرومي.
      ملاحظة: الاشتراكات الأيضخيمة تم الحصول عليها بعد عينة المعالجة يتوافق مع كثافة خلية من حوالي 20 خلية / NL، بالتالي، 20 حقن نيكولا لانغ هو ما يعادل 400 خلية لكل تحليل. .
    2. إنشاء رحلاني أيون المستخرجة للحمض اللبنيك الأيض (م / ض 89.0243) باستخدام 5 نجمة داود الحمراء دقة كتلة وتحقق ما إذا كانت كثافة إشارة فوق 100،000 التهم الموجهة إليه.
    3. كرر الخطوات من 3.1.1 و 3.1.2 لتحديد ملامح التمثيل الغذائي الموجبة للاستخراج من خط خلية ورم أرومي.
      ملاحظة: يجب أن يلاحظ وجود الكلي رحلاني أيون عالية الغنية المعلومات ل20 حقن نيكولا لانغ في هذا الوضع.
    4. بعد التحليلات أو عندما لا تكون قيد الاستعمال، وشطف الشعرية مع الماء في 50 رطل لمدة 15 دقيقة وتخزين جزء من مدخل الشعرية في الماء قارورة تحتوي على والقسم يسهل اختراقها (منفذ جزئيا) في أنبوب أيضا تحتوي على الماء.

Representative Results

طريقة sheathless CE-MS المقترح هو قادرة على توفير كفاءة عالية، أي لوحة أرقام تتراوح بين 60،000 إلى 400،000، لمحات عن الأيض أنيوني والموجبة في حدود الكشف nanomolar باستخدام حمض الخليك 10٪ (الرقم الهيدروجيني 2.2) كما BGE. ويتجلى أداء فصل طريقة لتحليل نواتج الأيونية القطبية شديدة لمدة ثلاثة ايزومرات السكر الفوسفات المرتبطة هيكليا (الشكل 1). على الرغم من عدم الحصول على فصل خط الأساس لهذه التحاليل الثلاثة، الفصل الجزئي كافية للسماح للكشف انتقائي من قبل MS لأن هذه التحاليل لها نفس الكتلة بالضبط. إمكانات طريقة CE-MS sheathless لتحديد ملامح التمثيل الغذائي من عدد محدود من الخلايا، أي 20 حقن نيكولا لانغ يتوافق مع 400 الخلايا (كثافة الخلية حوالي 20 خلية / NL)، ويظهر لتحليل نواتج الموجبة في مقتطف خط خلية ورم أرومي (الشكل 2)، والتي تم الكشف عن أكثر من 300 الميزات الجزيئية فوق S / N-نسبة ≥ 5.

شكل 1
الشكل 1. تحليل أيزومرات السكر الفوسفات من قبل sheathless CE-MS. رحلاني أيون المستخلصة لمدة ثلاثة ايزومرات فوسفات السكر (25 ميكرومتر) التي تم الحصول عليها مع sheathless CE-MS في وضع الأيونات السالبة. الظروف التجريبية: BGE، وحامض الخليك 10٪ (الرقم الهيدروجيني 2.2)؛ الجهد الانفصال، -30 كيلو فولت (+0.5 رطل تطبيقها على مدخل الشعرية م)؛ حقن عينة، 2.0 رطل لمدة 60 ثانية. مستنسخة بإذن 4. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2. تحليل يسوليوكيني ولeucine بواسطة CE-MS sheathless. رحلاني أيون المستخلصة من أيزومرين الأحماض الأمينية (25 ميكرومتر) التي تم الحصول عليها مع sheathless CE-MS في وضع ايون ايجابية. الظروف التجريبية: BGE، وحامض الخليك 10٪ (الرقم الهيدروجيني 2.2)؛ الجهد الانفصال، +30 كيلو فولت. حقن عينة، 2.0 رطل لمدة 60 ثانية. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الشكل 3. إمكانات sheathless CE-MS لتحديد ملامح الأيض الموجبة في استخراج خط الخلية. الشخصي التمثيل الغذائي (مجموع أيون رحلاني) لوحظ في مقتطف من خط خلية ورم أرومي مع sheathless CE-MS في وضع ايون ايجابية. الظروف التجريبية: BGE، وحامض الخليك 10٪ (الرقم الهيدروجيني 2.2)؛ الجهد الانفصال، +30 كيلو فولت. حقن عينة، 2.0 رطل لمدة 60 ثانية. مستنسخة بإذن 4 الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

وقد تم توضيح طريقة CE-MS sheathless توظيف باعث طرف يسهل اختراقها لتحليل نواتج القطبية للغاية ومشحونة. ومن المزايا الفريدة لهذا النهج هو أن الأيض أنيوني أو الموجبة يمكن لمحة عن طريق التحول فقط MS كشف وCE الجهد القطبية. ويمكن تحليل مجموعة واسعة من المركبات القطبية العالية واتهم في العينات البيولوجية مع كفاءة فصل عالية، وهو أمر حاسم بالنسبة الأيض مماثلة من الناحية الهيكلية، ومع حدود الكشف في (منخفض) مجموعة nanomolar. ركز بروتوكول المعروضة على استخدام sheathless CE-MS لتحديد ملامح التمثيل الغذائي للخلية مقتطفات من أجل تجسد فائدة من طريقة لتحديد ملامح التمثيل الغذائي لعينة بيولوجية. ويمكن أيضا أن النهج الموصوف هنا أن تستخدم لتحديد ملامح التمثيل الغذائي من أنواع أخرى من العينات البيولوجية، مثل البول البشري بالنظر إلى أن يستخدم إجراء نموذج المعالجة المناسبة.

وsheathless CE-MS methoويستند د على باعث طرف المسامية التي تسمح للاستخدام العقار في جوهرها انخفاض تدفق من CE. في هذا السياق، إشارة ESI المستقرة هي شرط مسبق للدراسات التنميط التمثيل الغذائي استنساخه. وبالتالي، فمن المهم أن الطرف الرش بشكل سليم أمام مدخل MS. في هذا الإعداد، عملية ESI تعتمد بشكل رئيسي على طبيعة BGE وبالتالي، BGE الأمثل أمر بالغ الأهمية. تكوين sheathless أقل تنوعا بالمقارنة مع غمد السائل أنظمة CE-MS حيث يمكن إضافة جميع أنواع التراكيب غمد سائل لتحسين كفاءة التأين. تحتاج sheathless ESI البخاخ إبرة المراد شغلها تماما مع السائل موصل (أي حل BGE). قد يؤدي إشارة ESI غير مستقرة من الشعرية الجزئي أو توصيله بشكل كامل. الشطف في الضغوط العالية مع BGE قد حل هذه المسألة. خلاف ذلك يحتاج إلى استبداله الشعرية الانفصال. قبل تقييم الأداء التحليلي، مستقر إشارة الخلفية ESIيجب أن تتولد لأول مرة وهو ما يتسق من يوم واحد إلى آخر.

أداء التحليلي للsheathless طريقة CE-MS للدراسات التنميط التمثيل الغذائي يحتاج إلى أن يتم التحقق يوميا باستخدام خليط الأيض القياسية. في ظل الظروف التجريبية نفسها، وأوقات الهجرة متسقة، أي تباين أقل من 3٪ لفي غضون يوم (ن = 10)، وبين يوم و(ن = 5) باستخدام 20 حقن نيكولا لانغ من خليط القياسية الأيض (12.5 ميكرون)، الذروة وينبغي الحصول على المرتفعات / المناطق (تباين أقل من 15٪) وأرقام لوحة (تتراوح بين 60،000 و 400،000). يجب أن تكون حدود الكشف في نطاق nanomolar لمعظم المعايير الأيض. فقط عندما يتم استيفاء هذه المعايير هو الأسلوب جاهزة لتحديد ملامح التمثيل الغذائي من العينات البيولوجية. إذا لم يكن كذلك، يحتاج أداة MS لضبطها وإعادة معايرة أو يحتاج يسهل اختراقها طرف الشعرية باعث على تغييرها.

خطوة الشطف فعالة بين CE-MS تحليلات ذات أهمية عالية، ليس فقط لمنع ترحيل محتمل ولكن أيضا للحفاظ على أداء الانفصال. قد يكون سبب ترحيل محتمل من قبل قارورة BGE الملوثة مع العينة وحلها عن طريق استبدال مع قارورة BGE الجديدة ول. عندما sheathless طريقة CE-MS لا تكون قيد الاستعمال، فإنه من المهم لقطع شعري فصل وتخزين الجانب مدخل الشعرية في الماء وخارج المغمورة مع الأكمام واقية في أنبوب يحتوي على الماء لإطالة شعري مدى الحياة.

وخلاصة القول، يبين sheathless طريقة CE-MS اقترح إمكانية قوية لتحديد ملامح التمثيل الغذائي من العينات البيولوجية عندما تستخدم وفقا للإجراءات الواردة في هذا البروتوكول. في هذه المرحلة، هناك حاجة إلى بيانات المقارنة بين المختبرات بالتأكيد لsheathless CE-MS من أجل تقييم (على المدى الطويل) استنساخ ومتانة هذا النهج لالايض. قد يحفز هذا البروتوكول مثل هذه الدراسة. التحديات التحليلية المختلفة لا تزال بحاجة إلى النظر فيها. لالأداء الإقتصادي الأداء الأمثلormance، يجب أن تحفظ CE الحالية ويفضل أقل من 5 أمبير وفي هذه المرحلة يتم توفير الشعرية بواعث طرف مسامية فقط بطول 91 سم والتي قد تعوق تطوير فحوصات عالية الإنتاجية. وعلاوة على ذلك، تم استخدام منطقة عازلة فصل انخفاض الرقم الهيدروجيني لتحديد ملامح التمثيل الغذائي انيوني التي قد لا تكون الأكثر الأمثل لتحقيق الفصل الأساسي من الفوسفات والسكر المرتبطة هيكليا. ومن المهم أيضا هو أن الأيض الأيونية الوحيدة التي يمكن أن تحلل والتي (جزئيا) سالبة الشحنة وفقا للشروط الفصل المستخدمة. والخطوة التالية هي لتقييم جدوى طريقة CE-MS sheathless للدراسات التنميط الأيض السريرية كما في الوقت الراهن، واحد يسهل اختراقها طرف الشعرية باعث لا يمكن إلا أن تستخدم لتحليل ما يصل إلى 100 عينات بيولوجية.

عموما، سوف مزيد من التطوير في نهج sheathless CE-MS فتح اتجاه جديد في مجال الايض، أي نحو فهم أعمق من الوظائف البيولوجية في الصورةحالات وافرة المقيدة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CESI 8000 instrument Sciex A98089 OptiMS adapter required to couple CESI to MS
OptiMS Fused-Silica Cartridge, 30 μm ID x 90 cm total length Sciex B07367
OptiMS Adapter for Sciex Nanospray III source Sciex B07363
CESI vials Sciex B11648
Micro vials Sciex 144709
Glacial acetic acid Sigma A6283 Use in fume hood
Cationic metabolite mixture Human Metabolome Technologies H3304-3034
Anionic metabolite mixture Human Metabolome Technologies H3304-1031
Methanol (LC-MS Ultra Chromasolv) Sigma 14262 Use in fume hood
Sodium hydroxide solution Sigma 72079 0.1 M
U-87 MG Glioblastoma cell line Sigma 89081402
Chloroform Sigma 650498 Toxic; use in fume hood

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ramautar, R., Berger, R., van der Greef, J., Hankemeier, T. Human metabolomics: strategies to understand biology. Curr Opin Chem Biol. 17, 841-846 (2013).
  2. Wishart, D. S., et al. HMDB 3.0--The Human Metabolome Database in 2013. Nucleic Acids Res. 41, D801-D807 (2013).
  3. Psychogios, N., et al. The human serum metabolome. PLoS One. 6, e16957 (2011).
  4. Gulersonmez, M. C., Lock, S., Hankemeier, T., Ramautar, R. Sheathless capillary electrophoresis-mass spectrometry for anionic metabolic profiling. Electrophoresis. 37, 1007-1014 (2016).
  5. Ramautar, R., Busnel, J. M., Deelder, A. M., Mayboroda, O. A. Enhancing the coverage of the urinary metabolome by sheathless capillary electrophoresis-mass spectrometry. Anal Chem. 84, 885-892 (2012).
  6. Ramautar, R., et al. Metabolic profiling of human urine by CE-MS using a positively charged capillary coating and comparison with UPLC-MS. Mol Biosyst. 7, 194-199 (2011).
  7. Naz, S., Garcia, A., Barbas, C. Multiplatform analytical methodology for metabolic fingerprinting of lung tissue. Anal Chem. 85, 10941-10948 (2013).
  8. Ibanez, C., et al. CE/LC-MS multiplatform for broad metabolomic analysis of dietary polyphenols effect on colon cancer cells proliferation. Electrophoresis. 33, 2328-2336 (2012).
  9. Soga, T., et al. Simultaneous determination of anionic intermediates for Bacillus subtilis metabolic pathways by capillary electrophoresis electrospray ionization mass spectrometry. Anal Chem. 74, 2233-2239 (2002).
  10. Soga, T., et al. Quantitative metabolome analysis using capillary electrophoresis mass spectrometry. J Proteome Res. 2, 488-494 (2003).
  11. Britz-McKibbin, P. Capillary electrophoresis-electrospray ionization-mass spectrometry (CE-ESI-MS)-based metabolomics. Methods Mol Biol. 708, 229-246 (2011).
  12. Ibanez, C., et al. A new metabolomic workflow for early detection of Alzheimer's disease. J Chromatogr A. 1302, 65-71 (2013).
  13. Kuehnbaum, N. L., Britz-McKibbin, P. New advances in separation science for metabolomics: resolving chemical diversity in a post-genomic era. Chem Rev. 113, 2437-2468 (2013).
  14. Nemes, P., Rubakhin, S. S., Aerts, J. T., Sweedler, J. V. Qualitative and quantitative metabolomic investigation of single neurons by capillary electrophoresis electrospray ionization mass spectrometry. Nat Protoc. 8, 783-799 (2013).
  15. Hirayama, A., Wakayama, M., Soga, T. Metabolome analysis based on capillary electrophoresis-mass spectrometry. Trac-Trend Anal Chem. 61, 215-222 (2014).
  16. Maxwell, E. J., Chen, D. D. Twenty years of interface development for capillary electrophoresis-electrospray ionization-mass spectrometry. Anal Chim Acta. 627, 25-33 (2008).
  17. Bonvin, G., Schappler, J., Rudaz, S. Capillary electrophoresis-electrospray ionization-mass spectrometry interfaces: fundamental concepts and technical developments. J Chromatogr A. 1267, 17-31 (2012).
  18. Hirayama, A., Tomita, M., Soga, T. Sheathless capillary electrophoresis-mass spectrometry with a high-sensitivity porous sprayer for cationic metabolome analysis. Analyst. 137, 5026-5033 (2012).
  19. Bonvin, G., Schappler, J., Rudaz, S. Non-aqueous capillary electrophoresis for the analysis of acidic compounds using negative electrospray ionization mass spectrometry. J Chromatogr A. 1323, 163-173 (2014).
  20. Moini, M. Simplifying CE-MS operation. 2. Interfacing low-flow separation techniques to mass spectrometry using a porous tip. Anal Chem. 79, 4241-4246 (2007).
  21. Dettmer, K., et al. Metabolite extraction from adherently growing mammalian cells for metabolomics studies: optimization of harvesting and extraction protocols. Anal Bioanal Chem. 399, 1127-1139 (2011).
Sheathless شعري الكهربائي-الطيف الكتلي لالاستقلابية من التنميط العينات البيولوجية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhang, W., Gulersonmez, M. C., Hankemeier, T., Ramautar, R. Sheathless Capillary Electrophoresis–Mass Spectrometry for Metabolic Profiling of Biological Samples. J. Vis. Exp. (116), e54535, doi:10.3791/54535 (2016).More

Zhang, W., Gulersonmez, M. C., Hankemeier, T., Ramautar, R. Sheathless Capillary Electrophoresis–Mass Spectrometry for Metabolic Profiling of Biological Samples. J. Vis. Exp. (116), e54535, doi:10.3791/54535 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter