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Biochemistry

鞘毛细管电泳 - 质谱联用生物样品的代谢谱

doi: 10.3791/54535 Published: October 1, 2016

Summary

使用鞘多孔提示界面设计的毛细管电泳 - 质谱联用生物样品的代谢谱的协议提出。

Abstract

在代谢组学,广泛的分析技术被用于复杂样品中(内生)的代谢产物全球分析。在本文中,一个协议被提出用于通过毛细管电泳 - 质谱(CE-MS)的生物样品中的阴离子和阳离子的代谢物的分析。 CE是非常适合高极性带电代谢物的分析化合物的电荷 - 大小比率的基础上分离。最近开发的鞘接口设计, 即,多孔尖接口,用于连接CE电喷雾(ESI)MS。这种接口方法允许组合的有效使用的CE的固有的低流动性的与MS,导致对大范围的极性代谢物类纳摩尔检测限。这里介绍的协议是基于在低pH的分离条件采用裸熔融石英毛细管与多孔尖端发射极对的一个分析生物样品中的代谢物类宽阵列。它证明了相同的无鞘CE-MS法可以仅切换MS检测和可用于阳离子代谢物,包括氨基酸,核苷和小肽,或阴离子的代谢产物,包括糖磷酸盐,核苷酸和有机酸,的分析分离电压极性。各种生物样品中的高度信息丰富的代谢概况,如尿,脑脊髓液和胶质母细胞瘤细胞系的提取物,可通过该协议中的CE-MS分析的不到1小时来获得。

Introduction

在当代代谢,高端分析分离技术被用来进行分析,以获得一个代表广泛代谢物类的读出的生物体1的生理状态。代谢组学研究的最终目标是获得一个答案,一个给定的生物/临床问题。目前,人类代谢组数据库包括代表内源性和外源性化合物(从营养物,微生物群,药物和其它来源后者始发)4万多代谢物的条目2。定在物理 - 化学性质和这些代谢物的浓度范围的巨大多样性,不同的分离机制的多个分析技术应结合以轮廓尽可能多的代谢物尽可能给定生物样品中的使用。例如,Psychogios 等人使用五个分析分离技术的组合为代谢教授导致检测4000多个不同的化学代谢物3的人血清iling。

在本文中,将注意力投放到最近开发的CE-MS策略生物样品4,5的代谢谱。在CE中,更具体地毛细管区带电泳(CZE;通常称为CE)化合物是分离的它们的电荷多尺寸比率的基础上,因此,此分析技术是非常适合于极性及带电代谢物的分析。 CE的分离机理是从基于色谱的技术根本不同的,由此提供对生物样品6-8的代谢组合物的互补视图。曾我和同事是第一个显示的CE-MS的效用为代谢物的生物样品9,10在全局分析。到现在为止,CE-MS的代谢组的可行性和效用已得到广泛证实11-15。CE经由鞘液接口技术16,17通常耦合到MS;然而,由于由鞘液的毛细管流出的稀释,检测灵敏度固有损害。

最近,证明的是,使用一个无鞘接口相比,CE-MS利用经典鞘-液界面5,18,19显著改善本多种生物样品中的代谢物的检测范围。例如,被人体尿液中鞘CE-MS检测到大约900分子特征,而与鞘液CE-MS 5中观察到约300分子特征。所使用的无鞘接口是基于多孔尖端发射极,其通过Moini 20发明,使得在组合的有效使用的CE的固有的低流动性的纳米ESI-MS。

为了刺激代谢组学领域的使用鞘CE-MS的,提出的协议描述该方法如何可用于生物样品中的高极性代谢物的分析,作为例示用于从成胶质细胞瘤细胞系提取物的分析。它表明,也可用于使用完全相同的毛细管和分离条​​件,从而减少分析时间和的全局分析提供一个单一的分析平台的阴离子代谢物的分析阳离子代谢物的分析的无鞘CE-MS法充电代谢物。该协议还介绍了与MS仪器鞘多孔尖端发射极的有效调整的策略。

Protocol

注意:这里描述了使用鞘CE-MS的代谢谱研究该协议仅用于实验室使用。下面列出的程序是根据最近发表的作品4,5。进一步的实验细节,可以在这些文件中找到。此前使用此协议,请所有相关的材料安全数据表(MSDS)。请使用所有适当的实验室安全程序,包括安全眼镜,白大褂和手套,在开展该协议所列的实验时。

1.试剂溶液和样品的制备

  1. 背景电解质的制备(BGE)
    1. 准备新的BGE溶液(10%(V / V)乙酸,pH值2.2)的每一天。
    2. 加9.0毫升水到10ml玻璃小瓶中,并在通风橱中加入1.0毫升乙酸的水。调匀使用涡旋该溶液中。
  2. 代谢STANDAR的制备ð混合
    1. 溶解50微升含有60阳离子代谢成50微升水中的50μM的阳离子标准混合物中,将溶液充分混合。在-80°C储存在不使用时。
    2. 溶解50微升含有30阴离子代谢成50微升水中的50μM的阴离子标准混合物中,将溶液充分混合。存储此溶液,以等分试样,以防止相同的标准混合物的冷冻/解冻循环,在-80℃下,不使用时。
      注:当代谢产物在-80℃妥善保存标准混合物连续3个月保持稳定。
  3. 提取物对胶质母细胞瘤细胞系的制备
    1. 洗粘附人的U-87 MG成胶质细胞瘤细胞三次用1ml冰冷的0.9%氯化钠溶液21中
    2. 加入2毫升冰冷的甲醇/水的溶液(8/2,体积/体积),以贴壁细胞并用橡胶放倒细胞刮刀21刮除。 收集2分钟在管的甲醇/水的溶液和ultrasonicate。
    3. 在16100 xg离心4℃10分钟加氯仿至甲醇/水级分(最终比8/8/2,体积/体积/体积)并离心样本。
    4. 收集甲醇/水层,并用真空浓缩器蒸发该馏分。通过鞘CE-MS重组在50μl水中分析干燥的材料。在不使用时存放在-80℃的样品。

2.设置鞘CE-MS系统

  1. 裸石英墨盒安装与多孔尖端发射极
    1. 将新的裸石英墨盒在CE仪器的多孔尖端发射极(共30微米内径×90厘米长)。
    2. 在50psi施加向前漂洗用100%甲醇的软件15分钟控制CE仪器并进行目视检查液体是否从capil流出在此冲洗步骤毛细管出口。此外,在相反的方向上在50psi进行漂洗使用BGE溶液可视地检查液体是否从导电毛细管流出5分钟。
    3. 重复步骤2.1.2在万一没有液滴形成已在毛细管出口被观察到100磅的压力。如果在该步骤中没有观察到液滴形成安装一个新的裸石英盒。
    4. 在50psi 10分钟用水冲洗分离毛细管在50psi进行10分钟,随后用0.1 M氢氧化钠在50psi进行10分钟,然后用水,最后在50与BGE psi的10分钟。
      注意:步骤2.1.1至2.1.4只需要安装新的毛细管墨盒。
  2. 毛细多孔尖端发射极到ESI-MS耦合
    注:以耦合CE毛细管MS,确保MS仪器被校准并连接到CE系统之前。设置ESI电压0适合用纳米喷雾源的MS仪器。气体1,天然气2接口加热器温度在非常低的流量并没有用作ESI只把它运用离子喷雾电压设置为1500 V.设置窗帘在5 PSI发生。
    1. 从水管除去石英盒的喷雾器尖端和在纳米喷雾源适配器安装它用于耦合到MS仪器。确保在CE仪器的BGE小瓶的高度匹配喷雾器尖端的高度。
    2. 通过在50psi与BGE漂洗5分钟检查通过导电毛细管液流。在此冲洗步骤在ESI喷雾器针的基部的液滴形成应观察。
    3. 冲洗用BGE分离毛细管在50psi在向前方向10分钟。液滴形成应在多孔尖端发射极(喷雾器尖端)的前端在该步骤中被观察到。
    4. 在C的距离的多孔尖端发射极到MS入口的入口位置IRCA 2〜3毫米。
    5. 用1分钟的升温时间申请30千伏的电压,并开始在m / z范围获取MS数据从65至1000 米/ z计算使用0第一电喷雾电压代谢谱的研究。
      注:质谱应该是无效的信号,因为应该没有电。
    6. 设置ESI电压为1,000V,而测量数据的携带。加大与200伏增量ESI电压直到恒定背景信号观察至少15分钟。
    7. 通过在x,y或z方向,以查看哪个位置提供的最大的和最稳定的MS信号(总离子电泳)移动它优化相对于该MS入口中心的多孔尖端发射极的位置。
    8. 优化多孔尖端发射极的位置和确定最佳ESI电压后,设置ESI电压为0V,并使用了5分钟的升温时间为30千伏降低CE的电压为1千伏。
    9. 创建一个MS法全光照克最佳ESI电压在CE仪器的代谢物标准和生物样品分析的方法CE。

3.代谢物标准和生物样品分析

  1. 在鞘CE-MS系统的性能评价
    1. 转让20微升的阴离子代谢物的标准混合物成适合在CE小瓶中,并把这个小瓶在进口样品盘空100微升microvial(PCR瓶)。
      注:在microvial一个可靠的注射所需的最小体积为2微升。
      1. 启动STEP 2.2.9期间创建的MS采集负离子模式的方法,并随后开始使用软件控制CE仪器的CE序列。
      2. 在1.0磅10冲洗BGE分离毛细管在50psi 3分钟,然后注入在2.0磅60秒(对应于毛细管体积的3%20 NL),然后通过BGE注射秒。
        注意:此后,MS数据采集被触发。
      3. 适用-30千伏的电压为1.0分钟,0.5磅的用于在入口30分钟的压力的斜坡时间。 30分钟电泳分离后,停止MS数据采集和利用5分钟的升温时间(CE电压的逐渐减少电泳分离提高了多孔尖毛细管发射器的耐用性之后)降低CE电压为-1千伏。
    2. 样品进样之间,用清水冲洗毛细管,0.1M氢氧化钠,水和BGE各在30psi 3分钟。
    3. 通过确定迁移时间和所分析的阴离子代谢物的混合物的信号强度分析所记录的数据。
    4. 评估阴离子代谢物标准是否10和28分钟之间出现在该地区。
    5. 检查是否三种结构相关的异构体, ,D-葡萄糖-1-磷酸,D-葡萄糖-6-磷酸和D-果糖-6-磷酸是部分分离, ,前两个峰之间的分辨率为大约0.75和最后两个峰的是大约0.50( 见图1)。
      注:1.5的决议表明了两个相邻峰的基线分离。
    6. 重复步骤3.1.1和3.1.2阳离子代谢的混合物。确保MS检测现在处于正离子模式和CE电压为+30千伏。
    7. 通过确定迁移时间和所分析的阳离子代谢物的混合物的信号强度分析所记录的数据。
    8. 评估阳离子代谢物标准是否出现在8和22分钟之间的区域。检查异亮氨酸和亮氨酸是否迁移15和15.5分钟之间,并确定如果分辨率大约0.5。
  2. 生物样品的分析
    1. 重复步骤3.1.1和3.1.2的胶质母细胞瘤细胞系的提取物的阴离子代谢轮廓。
      注:代谢CON样品预处理之后获得10吨对应于大约20个细胞/ NL的细胞密度,因此,一个20 NL注射是每次分析400个细胞的等价物。 。
    2. 创建用于使用5 MDA质量精度的代谢产物乳酸(M / Z 89.0243)提取离子电泳,并检查该信号强度是否高于100,000计数。
    3. 重复步骤3.1.1和3.1.2的胶质母细胞瘤细胞系的提取物的阳离子代谢轮廓。
      注:一个高度信息丰富的总离子电泳应该在此模式下20 NL注射液被观察到。
    4. 的分析或在不使用时后,用水冲洗所述毛细管在50psi进行15分钟,并在毛细管的入口部分存储在一个含有小瓶水和多孔质部(出口部)中的管也含有水。

Representative Results

所提出的无鞘CE-MS法是能够提供高效率的,即,塔板数范围从60,000至400,000,在用10%乙酸(pH为2.2)作为BGE纳摩尔检测限阴离子和阳离子的代谢物分布。对于高极性阴离子代谢物的分析方法的分离性能是展示三个结构相关的糖磷酸异构体( 图1)。虽然这三个分析物不能获得基线分离,部分分离足以允许其被MS选择性检测这些分析物具有相同的精确质量。所述鞘CE-MS法的对数细胞的限制,代谢谱的电位 20 NL喷射对应于400个细胞(细胞密度为大约20个细胞/ NL)中,展示了阳离子代谢物中的提取物的分析在胶质母细胞瘤细胞系(图2),其中上述一个的S / N比≥5检测到超过300个分子的功能。

图1
图1.糖磷酸异构体的分析鞘CE-MS提取离子为负离子模式与鞘CE-MS得到的三种糖磷酸异构体(25μM)电泳。实验条件:BGE,10%乙酸(pH为2.2);分离电压,-30千伏(+0.5磅施加在CE毛细管入口);样品注射,2.0磅60秒。经许可后转载4。 请点击此处查看该图的放大版本。

图2
图2.异亮氨酸和L的分析通过鞘CE-MS提取离子的正离子模式与鞘CE-MS获得的两个氨基酸的异构体(25μM)电泳eucine。实验条件:BGE,10%乙酸(pH为2.2);分离电压,+ 30千伏;进样,2.0磅,持续60秒。 请点击此处查看该图的放大版本。

图3
图3. 鞘CE-MS的潜力在细胞系提取物分析阳离子的代谢物。代谢轮廓(总离子电泳)在正离子模式下与鞘CE-MS成胶质细胞瘤细胞系的提取物观察到的。实验条件:BGE,10%乙酸(pH为2.2);分离电压,+ 30千伏;样品注射,2.0磅60秒。经许可后转载4 请点击此处查看该图的放大版本。

Discussion

采用多孔尖端发光体A鞘CE-MS法已经提出了高极性和电荷的代谢物的分析。这种方法的独特之处在于阴离子或阳离子代谢产物只能由切换MS检测和CE电压极性进行概要。广泛的生物样品中的高极性和电荷的代谢物能够以高的分离效率,这是结构上相似的代谢物是至关重要的,并与在(低)纳摩尔范围检测限进行分析。所提出的协议集中在使用鞘CE-MS的对于细胞提取物的代谢谱,以举例说明用于生物样品的代谢谱的方法的效用。此处所描述的方法也可以用于其它类型的生物样品的代谢谱,如人尿5,考虑到一个适当的样品预处理过程被使用。

该鞘CE-MS方法具d被基于一个多孔尖端发射极,它允许CE的固有的低流动性的用法。在这种情况下,稳定的ESI信号是一个先决条件可再现代谢谱的研究。因此,重要的是,喷雾器尖端被正确地定位在MS入口的前面。在此设置中,在ESI过程主要依赖于BGE的性质,因此,BGE优化是非常关键的。所述鞘结构相比,可加入各种鞘液体组合物以提高离子化效率鞘液的CE-MS系统少的通用性。所述鞘ESI喷雾器针需要完全填充导电液体( ,BGE溶液)。不稳定ESI信号可能导致从部分或完全堵塞毛细管。在与BGE高压冲洗就可以解决这个问题。否则分离毛细管需要更换。在此之前的分析性能考核,稳定的ESI背景信号应产生的第一是从一天到另一相一致。

需要使用标准的代谢产物为混合物,每天检查鞘CE-MS方法进行代谢谱研究的分析性能。在相同的实验条件下,一致的迁移时间, 低于3%的变化对于内天(N = 10)和日间(N = 5),使用的代谢物标准混合物(12.5μM)的20 NL注射,峰高度/地区(低于15%的变化)和车牌号码(60,000至400,000范围)应获得。检测限应该在纳摩尔范围对大多数代谢物标准。只有当这些条件都满足是准备用于生物样品的代谢谱的方法。如果不是,则MS仪器需要调整和重新校准或需要更改多孔尖端毛细管发射极。

CE-MS之间的一种有效的漂洗步骤的分析是非常重要,不仅是为了防止潜在的交叉污染也能保持分离性能。潜在交叉污染可通过污染与样品,因此通过置换新BGE小瓶解决BGE小瓶引起。当鞘CE-MS法是不使用时,它断开分离毛细管并存储在水中的毛细管,并与在含有水以延长毛细管寿命的管保护套筒浸没外侧的入口侧是重要的。

总之,所提出的无鞘CE-MS法示出了根据在此协议报告的过程中使用时,生物样品的代谢谱的巨大潜力。在这个阶段,实验室间比数据肯定,以评估这种做法对代谢的(长期)的重现性和稳健性需要鞘CE-MS。该协议可能会刺激这样的研究。各种分析挑战仍需要考虑。为了获得最佳的PERFormance,在CE电流应该优选低于5μA和在此阶段仅在91厘米的长度,有可能妨碍高通量测定法的发展提供的毛细多孔尖端发射器被保持。另外,用于阴离子代谢轮廓这可能不是最优化的用于实现结构相关的糖磷酸酯的基线分离低pH分离缓冲液。同样重要的是,只有阴离子代谢产物可以分析这些(部分)带负用过的分离条件下充电。下一步骤是为目前评估鞘CE-MS法用于临床代谢谱研究的效用,单一多孔尖端的毛细管发射器只能用于多达100生物样品的分析。

总体来看,在鞘CE-MS方法的进一步发展将在代谢组学, 领域打开一个新的方向朝中的生物功能有更深的了解充裕的限制情况。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CESI 8000 instrument Sciex A98089 OptiMS adapter required to couple CESI to MS
OptiMS Fused-Silica Cartridge, 30 μm ID x 90 cm total length Sciex B07367
OptiMS Adapter for Sciex Nanospray III source Sciex B07363
CESI vials Sciex B11648
Micro vials Sciex 144709
Glacial acetic acid Sigma A6283 Use in fume hood
Cationic metabolite mixture Human Metabolome Technologies H3304-3034
Anionic metabolite mixture Human Metabolome Technologies H3304-1031
Methanol (LC-MS Ultra Chromasolv) Sigma 14262 Use in fume hood
Sodium hydroxide solution Sigma 72079 0.1 M
U-87 MG Glioblastoma cell line Sigma 89081402
Chloroform Sigma 650498 Toxic; use in fume hood

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References

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Zhang, W., Gulersonmez, M. C., Hankemeier, T., Ramautar, R. Sheathless Capillary Electrophoresis–Mass Spectrometry for Metabolic Profiling of Biological Samples. J. Vis. Exp. (116), e54535, doi:10.3791/54535 (2016).

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