使用鞘多孔提示界面设计的毛细管电泳 – 质谱联用生物样品的代谢谱的协议提出。
在代谢组学,广泛的分析技术被用于复杂样品中(内生)的代谢产物全球分析。在本文中,一个协议被提出用于通过毛细管电泳 – 质谱(CE-MS)的生物样品中的阴离子和阳离子的代谢物的分析。 CE是非常适合高极性带电代谢物的分析化合物的电荷 – 大小比率的基础上分离。最近开发的鞘接口设计, 即,多孔尖接口,用于连接CE电喷雾(ESI)MS。这种接口方法允许组合的有效使用的CE的固有的低流动性的与MS,导致对大范围的极性代谢物类纳摩尔检测限。这里介绍的协议是基于在低pH的分离条件采用裸熔融石英毛细管与多孔尖端发射极对的一个分析生物样品中的代谢物类宽阵列。它证明了相同的无鞘CE-MS法可以仅切换MS检测和可用于阳离子代谢物,包括氨基酸,核苷和小肽,或阴离子的代谢产物,包括糖磷酸盐,核苷酸和有机酸,的分析分离电压极性。各种生物样品中的高度信息丰富的代谢概况,如尿,脑脊髓液和胶质母细胞瘤细胞系的提取物,可通过该协议中的CE-MS分析的不到1小时来获得。
在当代代谢,高端分析分离技术被用来进行分析,以获得一个代表广泛代谢物类的读出的生物体1的生理状态。代谢组学研究的最终目标是获得一个答案,一个给定的生物/临床问题。目前,人类代谢组数据库包括代表内源性和外源性化合物(从营养物,微生物群,药物和其它来源后者始发)4万多代谢物的条目2。定在物理 – 化学性质和这些代谢物的浓度范围的巨大多样性,不同的分离机制的多个分析技术应结合以轮廓尽可能多的代谢物尽可能给定生物样品中的使用。例如,Psychogios 等人使用五个分析分离技术的组合为代谢教授导致检测4000多个不同的化学代谢物3的人血清iling。
在本文中,将注意力投放到最近开发的CE-MS策略生物样品4,5的代谢谱。在CE中,更具体地毛细管区带电泳(CZE;通常称为CE)化合物是分离的它们的电荷多尺寸比率的基础上,因此,此分析技术是非常适合于极性及带电代谢物的分析。 CE的分离机理是从基于色谱的技术根本不同的,由此提供对生物样品6-8的代谢组合物的互补视图。曾我和同事是第一个显示的CE-MS的效用为代谢物的生物样品9,10在全局分析。到现在为止,CE-MS的代谢组的可行性和效用已得到广泛证实11-15。CE经由鞘液接口技术16,17通常耦合到MS;然而,由于由鞘液的毛细管流出的稀释,检测灵敏度固有损害。
最近,证明的是,使用一个无鞘接口相比,CE-MS利用经典鞘-液界面5,18,19显著改善本多种生物样品中的代谢物的检测范围。例如,被人体尿液中鞘CE-MS检测到大约900分子特征,而与鞘液CE-MS 5中观察到约300分子特征。所使用的无鞘接口是基于多孔尖端发射极,其通过Moini 20发明,使得在组合的有效使用的CE的固有的低流动性的纳米ESI-MS。
为了刺激代谢组学领域的使用鞘CE-MS的,提出的协议描述该方法如何可用于生物样品中的高极性代谢物的分析,作为例示用于从成胶质细胞瘤细胞系提取物的分析。它表明,也可用于使用完全相同的毛细管和分离条件,从而减少分析时间和的全局分析提供一个单一的分析平台的阴离子代谢物的分析阳离子代谢物的分析的无鞘CE-MS法充电代谢物。该协议还介绍了与MS仪器鞘多孔尖端发射极的有效调整的策略。
采用多孔尖端发光体A鞘CE-MS法已经提出了高极性和电荷的代谢物的分析。这种方法的独特之处在于阴离子或阳离子代谢产物只能由切换MS检测和CE电压极性进行概要。广泛的生物样品中的高极性和电荷的代谢物能够以高的分离效率,这是结构上相似的代谢物是至关重要的,并与在(低)纳摩尔范围检测限进行分析。所提出的协议集中在使用鞘CE-MS的对于细胞提取物的代谢谱,以举例说明用于生物样品的代谢谱的方法的效用。此处所描述的方法也可以用于其它类型的生物样品的代谢谱,如人尿5,考虑到一个适当的样品预处理过程被使用。
该鞘CE-MS方法具d被基于一个多孔尖端发射极,它允许CE的固有的低流动性的用法。在这种情况下,稳定的ESI信号是一个先决条件可再现代谢谱的研究。因此,重要的是,喷雾器尖端被正确地定位在MS入口的前面。在此设置中,在ESI过程主要依赖于BGE的性质,因此,BGE优化是非常关键的。所述鞘结构相比,可加入各种鞘液体组合物以提高离子化效率鞘液的CE-MS系统少的通用性。所述鞘ESI喷雾器针需要完全填充导电液体( 即 ,BGE溶液)。不稳定ESI信号可能导致从部分或完全堵塞毛细管。在与BGE高压冲洗就可以解决这个问题。否则分离毛细管需要更换。在此之前的分析性能考核,稳定的ESI背景信号应产生的第一是从一天到另一相一致。
需要使用标准的代谢产物为混合物,每天检查鞘CE-MS方法进行代谢谱研究的分析性能。在相同的实验条件下,一致的迁移时间, 即低于3%的变化对于内天(N = 10)和日间(N = 5),使用的代谢物标准混合物(12.5μM)的20 NL注射,峰高度/地区(低于15%的变化)和车牌号码(60,000至400,000范围)应获得。检测限应该在纳摩尔范围对大多数代谢物标准。只有当这些条件都满足是准备用于生物样品的代谢谱的方法。如果不是,则MS仪器需要调整和重新校准或需要更改多孔尖端毛细管发射极。
CE-MS之间的一种有效的漂洗步骤的分析是非常重要,不仅是为了防止潜在的交叉污染也能保持分离性能。潜在交叉污染可通过污染与样品,因此通过置换新BGE小瓶解决BGE小瓶引起。当鞘CE-MS法是不使用时,它断开分离毛细管并存储在水中的毛细管,并与在含有水以延长毛细管寿命的管保护套筒浸没外侧的入口侧是重要的。
总之,所提出的无鞘CE-MS法示出了根据在此协议报告的过程中使用时,生物样品的代谢谱的巨大潜力。在这个阶段,实验室间比数据肯定,以评估这种做法对代谢的(长期)的重现性和稳健性需要鞘CE-MS。该协议可能会刺激这样的研究。各种分析挑战仍需要考虑。为了获得最佳的PERFormance,在CE电流应该优选低于5μA和在此阶段仅在91厘米的长度,有可能妨碍高通量测定法的发展提供的毛细多孔尖端发射器被保持。另外,用于阴离子代谢轮廓这可能不是最优化的用于实现结构相关的糖磷酸酯的基线分离低pH分离缓冲液。同样重要的是,只有阴离子代谢产物可以分析这些(部分)带负用过的分离条件下充电。下一步骤是为目前评估鞘CE-MS法用于临床代谢谱研究的效用,单一多孔尖端的毛细管发射器只能用于多达100生物样品的分析。
总体来看,在鞘CE-MS方法的进一步发展将在代谢组学, 即领域打开一个新的方向,朝中的生物功能有更深的了解充裕的限制情况。
The authors have nothing to disclose.
Dr. Rawi Ramautar would like to acknowledge the financial support of the Veni grant scheme of the Netherlands Organization of Scientific Research (NWO Veni 722.013.008).
CESI 8000 instrument | Sciex | A98089 | OptiMS adapter required to couple CESI to MS |
OptiMS Fused-Silica Cartridge, 30 μm ID x 90 cm total length | Sciex | B07367 | |
OptiMS Adapter for Sciex Nanospray III source | Sciex | B07363 | |
CESI vials | Sciex | B11648 | |
Micro vials | Sciex | 144709 | |
Glacial acetic acid | Sigma | A6283 | Use in fume hood |
Cationic metabolite mixture | Human Metabolome Technologies | H3304-3034 | |
Anionic metabolite mixture | Human Metabolome Technologies | H3304-1031 | |
Methanol (LC-MS Ultra Chromasolv) | Sigma | 14262 | Use in fume hood |
Sodium hydroxide solution | Sigma | 72079 | 0.1 M |
U-87 MG Glioblastoma cell line | Sigma | 89081402 | |
Chloroform | Sigma | 650498 | Toxic; use in fume hood |