En protokol til metabolisk profilering af biologiske prøver ved kapillarelektroforese-massespektrometri ved hjælp af en sheathless porøs spids interface design præsenteres.
I metabolomics, er en bred vifte af analytiske teknikker, der anvendes til den globale profilering af (endogene) metabolitter i komplekse prøver. I dette papir, er en protokol præsenteres til analyse af anioniske og kationiske metabolitter i biologiske prøver ved kapillarelektroforese-massespektrometri (CE-MS). CE er velegnet til analyse af stærkt polære og ladede metabolitter som forbindelser adskilles på basis af deres ladning-til-størrelsesforhold. En nyligt udviklet sheathless grænseflade design, dvs. en porøs spids interface, anvendes til kobling CE til elektrosprayionisering (ESI) MS. Denne grænseflade tilgang giver en effektiv udnyttelse af den iboende lav flow ejendom af CE i kombination med MS, hvilket resulterer i nanomolære detektionsgrænser for en bred vifte af polære metabolit klasser. Protokollen præsenteres her, er baseret på at ansætte en ikke-byggemodnede kvartsglas kapillar med en porøs spids emitter ved lav-pH-separation betingelser for analyse af enbred vifte af metabolit klasser i biologiske prøver. Det påvises, at den samme sheathless CE-MS-metode kan anvendes til profilering af kationiske metabolitter, herunder aminosyrer, nucleosider og små peptider eller anioniske metabolitter, herunder sukker- phosphater, nukleotider og organiske syrer, ved kun at skifte MS detektion og adskillelse spænding polaritet. Meget informationsrige metaboliske profiler i forskellige biologiske prøver, såsom urin, cerebrospinalvæske og ekstrakter af glioblastom cellelinie, kan opnås ved denne protokol i mindre end 1 time af CE-MS-analyse.
I moderne metabolomics, er høje ende analytisk separationsteknikker anvendt til at analysere en lang række metabolit klasser for at opnå en repræsentativ udlæsning af den fysiologiske status af en organisme 1. Det endelige mål for en metabolomics undersøgelse er at få et svar på et givet biologisk / klinisk spørgsmål. På nuværende tidspunkt er den menneskelige metabolomet Database består af mere end 40.000 metabolit poster, der repræsenterer både endogene og eksogene forbindelser (sidstnævnte oprindelse fra næringsstoffer, mikrobiota, narkotika og andre kilder) 2. I betragtning af den betydelige diversitet fysisk-kemiske egenskaber og koncentrationsinterval af disse metabolitter, bør flere analyseteknikker med forskellige mekanismer separation anvendes sammen for at profilere så mange metabolitter som muligt i en given biologisk prøve. F.eks Psychogios et al. Anvendes en kombination af fem analytiske separationsteknikker for metabolisk profiling af human serum resulterer i detektion af mere end 4.000 kemisk forskellige metabolitter 3.
I dette papir vil der blive lagt vægt på nyligt udviklede CE-MS strategier for metabolisk profilering af biologiske prøver 4,5. I CE, mere specifikt kapillarzoneelektroforese (CZE; normalt omtales som CE) er forbindelser adskilles på basis af deres ladning-til-størrelsesforhold, og derfor er denne analyseteknik er særdeles velegnet til analyse af polære og ladede metabolitter. Adskillelsen mekanisme CE er fundamentalt forskellige fra kromatografiske teknikker, hvorved der tilvejebringes en komplementær visning på metaboliske sammensætning biologiske prøver 6-8. Soga og medarbejdere var de første til at vise nytten af CE-MS for den globale profilering af metabolitter i biologiske prøver 9,10. Indtil nu har muligheden og nytten af CE-MS for metabolomics blevet bredt demonstreret 11-15.CE er generelt koblet til MS via en kappe-væske grænseflade teknik 16,17; Men på grund af fortynding af det kapillære eluatet efter hylsteret-væske, detekteringsfølsomheden er uløseligt kompromitteret.
For nylig blev det påvist, at anvendelsen af en sheathless grænseflade væsentligt forbedret påvisning dækning af metabolitter er til stede i forskellige biologiske prøver sammenlignet med CE-MS ved anvendelse af en klassisk kappe-væske-grænsefladen 5,18,19. For eksempel blev detekteret circa 900 molekylære funktioner i human urin ved sheathless CE-MS henviser ca. 300 molekylære funktioner blev observeret med skede-væske CE-MS 5. Den sheathless anvendte brugerflade var baseret på en porøs spids emitter, som blev opfundet af Moini 20, hvilket tillader effektiv brug af iboende lave flow ejendom CE i kombination med nano-ESI-MS.
For at stimulere brugen af sheathless CE-MS på metabolomics,en protokol præsenteres beskriver, hvordan denne fremgangsmåde kan anvendes til analyse af stærkt polære metabolitter i biologiske prøver, som eksemplificeret for analyse af ekstrakter fra glioblastoma-cellelinien. Det vises, at også kan anvendes sheathless CE-MS-metode til profilering af kationiske metabolitter til profilering af anioniske metabolitter på nøjagtigt samme kapillære og separationsbetingelser, derved reducere analyse tid og tilvejebringe en enkelt analytisk platform for den globale profilering af ladede metabolitter. Protokollen beskriver også en strategi for en effektiv tilpasning af sheathless porøse spids emitter med MS instrument.
En sheathless CE-MS-metode anvender en porøs spids emitter er blevet præsenteret for analysen af stærkt polære og ladede metabolitter. En unik egenskab ved denne fremgangsmåde er, at anioniske eller kationiske metabolitter kan profileres ved kun at skifte MS detektion og CE spænding polaritet. En bred vifte af meget polære og ladede metabolitter i biologiske prøver kan analyseres med en høj adskillelse effektivitet, som er afgørende for lignende struktur metabolitter, og med detektionsgrænser i (lav) nanomolær rækkevidde. Den præsenterede protokol fokuseret på anvendelsen af sheathless CE-MS for metabolisk profilering af celleekstrakter for at eksemplificere anvendeligheden af fremgangsmåden til metabolisk profilering af en biologisk prøve. Kan også anvendes den her beskrevne fremgangsmåde til metabolisk profilering af andre typer af biologiske prøver, såsom humant urin 5, idet der anvendes en korrekt procedure prøve forbehandling.
Den sheathless CE-MS method er baseret på en porøs spids emitter, der tillader brugen af iboende lave flow egenskab af CE. I denne sammenhæng, en stabil ESI signal er en forudsætning for reproducerbare metaboliske profilering undersøgelser. Således er det vigtigt, at sprøjten spids er korrekt placeret foran MS indløb. I denne opsætning, ESI-processen er primært afhængig af karakteren af BGE og derfor BGE optimering er kritisk. Den sheathless konfiguration er mindre alsidige i forhold til kappe-flydende CE-MS systemer, hvor der kan tilsættes alle former for kappe-væske sammensætninger for at forbedre ionisering effektivitet. Den sheathless ESI sprøjten nål skal være helt fyldt med ledende væske (dvs. BGE opløsning). En ustabil ESI signal kan skyldes en delvis eller fuldt tilsluttet kapillær. Skylning ved høje tryk med BGE kan løse dette problem. Ellers skal udskiftes adskillelse kapillar. Forud for vurderingen af den analytiske ydeevne, et stabilt ESI baggrund signalbør genereres først som er konsistent fra den ene dag til den anden.
Den analytiske ydeevne sheathless CE-MS metode til metaboliske profilering undersøgelser skal kontrolleres dagligt bruger metabolit standard blandinger. Under de samme eksperimentelle betingelser, konsistente migration gange, dvs., variation under 3% i inden-dag (n = 10) og mellem-dag (n = 5) under anvendelse af en 20 nl injektion af en metabolit standard blanding (12,5 uM), peak bør indhentes højder / områder (variation under 15%) og plade numre (på mellem 60.000 og 400.000). Detektionsgrænser skal være i det nanomolære område for de fleste metabolit standarder. Kun når disse kriterier er opfyldt, er fremgangsmåden klar til metabolisk profilering af biologiske prøver. Hvis ikke, skal tilpasses og MS instrument re-kalibreres eller det porøse spids kapillær emitter skal ændres.
En effektiv skylletrin mellem CE-MS-analyser er af stor betydning, ikke blot forforhindre potentiel overførsel men også for at opretholde adskillelsen ydeevne. Potentiel fremførsel kan skyldes BGE hætteglas forurenet med prøven, og derfor løses ved erstatning med nye BGE hætteglas. Når sheathless CE-MS-metoden ikke er i brug, er det vigtigt at frakoble adskillelse kapillar og lagre indgangssiden af kapillarrøret i vand og ydersiden neddykket med den beskyttende muffe i et rør indeholdende vand for at forlænge kapillær levetid.
Sammenfattende den foreslåede sheathless CE-MS-metode viser et stort potentiale for metabolisk profilering af biologiske prøver, når de anvendes i overensstemmelse med fremgangsmåderne rapporteret i denne protokol. På dette stadium, er absolut nødvendig mellem laboratorier sammenligning data for sheathless CE-MS for at vurdere den (lang sigt) reproducerbarhed og robusthed af denne tilgang til metabolomics. Denne protokol kan stimulere en sådan undersøgelse. Forskellige analytiske udfordringer skal stadig tages i betragtning. For optimal performance, bør CE-strøm holdes foretrukket under 5 pA og på dette tidspunkt de kapillære porøse tip udledere, kun udleveres ved en længde på 91 cm, som kan hæmme udviklingen af high-throughput analyser. Desuden var der en lav pH adskillelse puffer anvendt til anionisk stofskifteprofil der ikke kan være den mest optimale for at opnå en baseline separation af strukturelt beslægtede sukkeropløsninger fosfater. Også vigtigt er, at kun anioniske metabolitter kan analyseres som (delvis) negativt ladet under de anvendte separationsbetingelserne. Det næste skridt er at vurdere nytten af den sheathless CE-MS-metode til kliniske stofskifteprofil studier som i øjeblikket kan en enkelt porøs spids kapillar emitter kun anvendes til analyse af op til 100 biologiske prøver.
Samlet set vil yderligere udvikling i sheathless CE-MS metode åbne en ny retning inden for metabolomics, dvs, i retning af en dybere forståelse af biologiske funktioner i srigelig-begrænsede tilfælde.
The authors have nothing to disclose.
Dr. Rawi Ramautar would like to acknowledge the financial support of the Veni grant scheme of the Netherlands Organization of Scientific Research (NWO Veni 722.013.008).
CESI 8000 instrument | Sciex | A98089 | OptiMS adapter required to couple CESI to MS |
OptiMS Fused-Silica Cartridge, 30 μm ID x 90 cm total length | Sciex | B07367 | |
OptiMS Adapter for Sciex Nanospray III source | Sciex | B07363 | |
CESI vials | Sciex | B11648 | |
Micro vials | Sciex | 144709 | |
Glacial acetic acid | Sigma | A6283 | Use in fume hood |
Cationic metabolite mixture | Human Metabolome Technologies | H3304-3034 | |
Anionic metabolite mixture | Human Metabolome Technologies | H3304-1031 | |
Methanol (LC-MS Ultra Chromasolv) | Sigma | 14262 | Use in fume hood |
Sodium hydroxide solution | Sigma | 72079 | 0.1 M |
U-87 MG Glioblastoma cell line | Sigma | 89081402 | |
Chloroform | Sigma | 650498 | Toxic; use in fume hood |