En protokoll for metabolsk profilering av biologiske prøver med kapillær elektroforese-massespektrometri ved anvendelse av en sheathless porøs spiss grensesnitt design er presentert.
I metabolomics, er et bredt utvalg av analytiske teknikker som brukes for den globale profileringen av (endogene) metabolitter i komplekse prøver. I dette papiret, er en protokoll presentert for analyse av anioniske og kationiske metabolitter i biologiske prøver ved kapillær elektroforese-massespektrometri (CE-MS). CE er godt egnet for analyse av svært polare metabolitter og ladede forbindelser som separeres på basis av deres ladning-til-størrelsesforhold. En nylig utviklet sheathless samvirking utforming, det vil si, en porøs spiss grensesnitt, blir brukt for å kople til CE elektrospray ionisering (ESI) MS. Dette grensesnitt tilnærmingen gjør effektiv bruk av den iboende lav-flow tilhører CE i kombinasjon med MS, noe som resulterer i nanomolare deteksjonsgrenser for et bredt spekter av polare metabolitten klasser. Protokollen presentert her, er basert på anvendelse av et nakent smeltet silisiumdioksyd-kapillær med en porøs spiss emitter ved lav-pH-separasjonsbetingelser for analyse av enbredt spekter av metabolitt klasser i biologiske prøver. Det er vist at det samme sheathless CE-MS-metoden kan anvendes for profilering av kationiske metabolittene, inkludert aminosyrer, nukleosider og små peptider, eller anioniske metabolitter, inkludert sukker fosfater, nukleotider og organiske syrer, ved bare å bytte MS deteksjon og separasjon spenning polaritet. Sterkt informasjonsrike metabolske profiler i forskjellige biologiske prøver, slik som urin, cerebrospinalvæske og ekstrakter av glioblastoma cellelinje, kan oppnås ved denne protokollen i mindre enn en time av CE-MS-analyse.
I moderne metabolomics, er high end analytisk separasjonsteknikker anvendes for å analysere et bredt spekter av metabolitten klasser for å oppnå en representativ avlesning av den fysiologiske statusen til en organisme 1. Det ultimate målet for en metabolomics studien er å få et svar på et gitt biologisk / klinisk spørsmål. I dag er den menneskelige metabolomet Database består av mer enn 40.000 metabolitt oppføringer som representerer både endogene og eksogene forbindelser (sistnevnte stammer fra næringsstoffer, bakterieflora, narkotika og andre kilder) 2. Gitt det store mangfold i fysisk-kjemiske egenskaper og konsentrasjonsområde av disse metabolittene, bør flere analytiske teknikker med forskjellige separasjonsmekanismer brukes i kombinasjon for å profilere så mange metabolitter som mulig i en gitt biologisk prøve. For eksempel Psychogios et al. Brukt en kombinasjon av fem analytiske separasjonsteknikker for metabolsk profiling av humant serum som resulterer i deteksjon av mer enn 4000 kjemiske ulike metabolitter 3.
I denne artikkelen skal tas hensyn til nylig utviklet CE-MS strategier for metabolsk profilering av biologiske prøver 4,5. I CE, nærmere bestemt kapillar sone-elektroforese (CZE, normalt omtalt som evt) blir forbindelser separert på basis av deres ladning-til-størrelse-forhold, og derfor er denne analyseteknikk særlig egnet for analyse av polare og ladede metabolitter. Separasjonen mekanismen for CE er fundamentalt forskjellig fra kromatografiske-baserte teknikker, for derved å tilveiebringe en komplementær syn på den metaboliske sammensetningen av biologiske prøver 6-8. Soga og medarbeidere var de første til å vise nytten av CE-MS for den globale profilering av metabolitter i biologiske prøver 9,10. Til nå har muligheten og nytten av CE-MS for metabolomics blitt mye påvist 11-15.CE er vanligvis koblet til MS via en tolle væske grensesnitt teknikk 16,17; imidlertid, på grunn av fortynning av den kapillære avløpet ved tolle væske, deteksjonsfølsomheten blir egen kompromittert.
Nylig ble det påvist at bruken av et sheathless grensesnitt signifikant forbedret deteksjon dekning av metabolitter som er tilstede i forskjellige biologiske prøver, sammenlignet med CE-MS anvendelse av en klassisk kappe-væske-grenseflate 5,18,19. For eksempel ble circa 900 molekylære egenskaper påvist i human urin ved sheathless CE-MS, mens omtrent 300 molekylære egenskaper ble observert med kappe-væske CE-MS 5. Den sheathless grensesnitt som ble brukt var basert på en porøs spiss emitter, som ble oppfunnet av Moini 20, slik at effektiv bruk av den iboende lav-flyt egenskap av CE i kombinasjon med nano-ESI-MS.
For å stimulere bruk av sheathless CE-MS innen metabolomics,en protokoll er presentert som beskriver hvordan denne tilnærmingen kan brukes for analyse av svært polare metabolitter i biologiske prøver, som er eksemplifisert for analyse av ekstrakter fra glioblastoma cellelinje. Det er vist at den sheathless CE-MS fremgangsmåte for profilering av kationiske metabolitter kan også benyttes for profilering av anioniske metabolitter ved hjelp av nøyaktig de samme kapillær og separasjonsbetingelser, og dermed redusere analysetiden og tilveiebringe en enkel analytisk plattform for den globale profilering av ladede metabolitter. Protokollen beskriver også en strategi for effektiv innretting av sheathless porøs spiss emitter med MS instrumentet.
En sheathless CE-MS-metode som anvender en porøs spiss emitter er blitt presentert for analyse av sterkt polare og ladede metabolitter. En unik funksjon i denne tilnærmingen er at anioniske eller kationiske metabolitter kan profilert ved bare å bytte MS deteksjon og CE spenning polaritet. Et bredt utvalg av høyt ladede polare og metabolitter i biologiske prøver kan analyseres med en høy separasjonseffektivitet, noe som er avgjørende for strukturelt lignende metabolitter, og med påvisningsgrenser i (lav) nanomolare området. Den presenterte protokollen fokusert på bruk av sheathless CE-MS for metabolske profilering av celle-ekstrakter for å eksemplifisere anvendeligheten av fremgangsmåten for metabolske profilering av en biologisk prøve. Den metode som er beskrevet her kan også anvendes for metabolske profilering av andre typer av biologiske prøver, slik som humant urin 5, gitt at en passende prøve forbehandling prosedyre benyttes.
Den sheathless CE-MS-metod er basert på en porøs spiss emitter som gjør bruk av den iboende lav-flyt egenskap av CE. I denne sammenheng, er en stabil ESI signal en forutsetning for reproduserbare metaboliske studier profilering. Det er derfor viktig at sprøytespissen er riktig plassert i front av MS innløpet. I dette oppsettet er det ESI prosessen i hovedsak avhengig av arten av BGE og derfor er kritisk BGE optimalisering. Den sheathless konfigurasjonen er mindre allsidig i forhold til sliren-væske CE-MS-systemer der mange forskjellige overtrekks-flytende preparater kan tilsettes for å forbedre ioniseringen effektivitet. Den sheathless ESI sprøyten nål må fylles helt med ledende væske (dvs. BGE løsning). En ustabil ESI signal kan resultere fra en delvis eller fullstendig plugget kapillær. Skylling ved høye trykk med BGE kan løse dette problemet. Ellers separasjons kapillær må skiftes. Før vurdering av analyse ytelse, en stabil ESI bakgrunnssignalskal genereres første som er konsistent fra en dag til en annen.
Den analytiske ytelsen til sheathless CE-MS metode for metabolske profilering studier må sjekkes daglig bruker metabolitt standardblandinger. Under de samme forsøksbetingelser, konsekvent migrasjonstider, dvs. variasjon under 3% for i løpet av dag (n = 10) og mellom-dag (n = 5) under anvendelse av en 20 nl injeksjon av en metabolitt standard blanding (12,5 pM), topp høyder / områder (variasjon under 15%) og plate nummer (som varierer mellom 60 000 og 400 000) skal innhentes. Deteksjonsgrenser bør være i nanomolar rekkevidde for de fleste metabolitt standarder. Først når disse kriteriene er oppfylt er metoden klar for metabolske profilering av biologiske prøver. Hvis ikke, må MS-instrumentet som skal avstemmes, og re-kalibreres eller den porøse spissen kapillær emitter må endres.
En effektiv rensetrinnet mellom CE-MS-analyser er av stor betydning, ikke bare for åforhindre potensiell overføring, men også for å opprettholde separasjonsytelse. Potensiell overføring kan være forårsaket av BGE ampuller forurenset med prøven, og derfor løses ved erstatning med nye BGE ampuller. Når sheathless CE-MS-metoden ikke er i bruk, er det viktig å koble separasjon kapillær og for å lagre innløpssiden av kapillaren i vannet, og på utsiden neddykket med den beskyttende hylsen i et rør inneholdende vann for å forlenge levetiden kapillar.
Oppsummert viser foreslått sheathless CE-MS-metoden et stort potensial for metabolske profilering av biologiske prøver når det brukes i henhold til prosedyrene som er rapportert i denne protokollen. På dette stadiet er sammenlignende laboratorieprøver data definitivt behov for sheathless CE-MS for å vurdere (langsiktig) reproduserbarhet og robusthet av denne tilnærmingen for metabolomics. Denne protokollen kan stimulere en slik studie. Ulike analytiske utfordringene må likevel tas i betraktning. For optimal performance bør CE nåværende holdes fortrinnsvis under 5 uA og på dette stadiet kapillær porøse tips emittere er bare gitt til en lengde på 91 cm som kan hemme utviklingen av high-throughput analyser. Dessuten ble en lav pH separasjonsbuffer anvendt for anionisk metabolsk profilering som kanskje ikke er den mest optimale for å oppnå en grunnlinje-separasjon av strukturelt beslektede sukker fosfater. Også viktig er at bare anioniske metabolitter kan analyseres som (delvis) negativt ladet under de brukte separasjonsbetingelser. Det neste trinnet er å vurdere nytten av sheathless CE-MS metode for kliniske metabolsk profilering studier som i dag, kan en enkelt porøs tips kapillær emitter bare brukes for analyse av opptil 100 biologiske prøver.
Samlet sett vil videre utvikling i sheathless CE-MS tilnærming åpner en ny retning innen metabolomics, dvs. mot en dypere forståelse av biologiske funksjoner i srikelig begrensede saker.
The authors have nothing to disclose.
Dr. Rawi Ramautar would like to acknowledge the financial support of the Veni grant scheme of the Netherlands Organization of Scientific Research (NWO Veni 722.013.008).
CESI 8000 instrument | Sciex | A98089 | OptiMS adapter required to couple CESI to MS |
OptiMS Fused-Silica Cartridge, 30 μm ID x 90 cm total length | Sciex | B07367 | |
OptiMS Adapter for Sciex Nanospray III source | Sciex | B07363 | |
CESI vials | Sciex | B11648 | |
Micro vials | Sciex | 144709 | |
Glacial acetic acid | Sigma | A6283 | Use in fume hood |
Cationic metabolite mixture | Human Metabolome Technologies | H3304-3034 | |
Anionic metabolite mixture | Human Metabolome Technologies | H3304-1031 | |
Methanol (LC-MS Ultra Chromasolv) | Sigma | 14262 | Use in fume hood |
Sodium hydroxide solution | Sigma | 72079 | 0.1 M |
U-87 MG Glioblastoma cell line | Sigma | 89081402 | |
Chloroform | Sigma | 650498 | Toxic; use in fume hood |