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Biochemistry

Sheathless electroforesis capilar-espectrometría de masas de perfiles metabólicos de muestras biológicas

doi: 10.3791/54535 Published: October 1, 2016

Summary

Se presenta un protocolo para perfiles metabólicos de muestras biológicas mediante electroforesis capilar de espectrometría de masas utilizando un diseño de interfaz de punta porosa sheathless.

Abstract

En la metabolómica, una amplia gama de técnicas de análisis se utiliza para el mundial de perfiles de metabolitos (endógenas) en muestras complejas. En este documento, un protocolo se presenta para el análisis de metabolitos aniónicos y catiónicos en muestras biológicas por espectrometría de capilar de electroforesis en masa (CE-MS). CE es muy adecuado para el análisis de metabolitos altamente polares y cargados como compuestos se separan sobre la base de su relación de carga a medida. Un sheathless interfaz de diseño de reciente desarrollo, es decir, una interfaz de punta porosa, se utiliza para acoplar CE para ionización por electrospray (ESI) MS. Este enfoque de interfaz permite el uso eficaz de la propiedad de flujo bajo intrínsecamente de CE en combinación con MS, lo que resulta en los límites de detección nanomolares para una amplia gama de clases de metabolitos polares. El protocolo que aquí se presenta se basa en el empleo de un capilar de sílice fundida desnudo con un emisor de punta porosa en condiciones de separación de pH bajo para el análisis de unaamplia gama de clases de metabolitos en muestras biológicas. Se demuestra que el mismo método sheathless CE-MS se puede utilizar para el perfilado de metabolitos catiónicos, incluyendo aminoácidos, nucleósidos y péptidos pequeños, o metabolitos aniónicos, incluyendo fosfatos de azúcares, nucleótidos y ácidos orgánicos, por solamente conmutar la detección de MS y polaridad de la tensión de separación. perfiles metabólicos altamente ricas en información en diferentes muestras biológicas, tales como orina, líquido cefalorraquídeo y los extractos de la línea celular de glioblastoma, se pueden obtener mediante este protocolo en menos de 1 h de análisis CE-MS.

Introduction

En la metabolómica contemporáneos, técnicas de separación analítica de gama alta se utilizan para analizar una amplia gama de clases de metabolitos con el fin de obtener un representante de lectura del estado fisiológico de un organismo 1. El objetivo final de un estudio de la metabolómica es la obtención de una respuesta a una cuestión biológica / clínica dada. En la actualidad, la base de datos Metaboloma humana está compuesta por más de 40.000 entradas de metabolitos representan compuestos tanto endógenos como exógenos (estos últimos procedentes de nutrientes, la microbiota, drogas y otras fuentes) 2. Dado el enorme diversidad en las propiedades físico-químicas y rango de concentración de estos metabolitos, múltiples técnicas de análisis con diferentes mecanismos de separación deben ser utilizados en conjunto con el fin de perfil como muchos metabolitos como sea posible en una muestra biológica dada. Por ejemplo, Psychogios et al. Utilizó una combinación de técnicas de separación cinco análisis para prof metabólicaIling de suero humano que resulta en la detección de más de 4.000 químicamente diversos metabolitos 3.

En este trabajo, se prestará atención a las estrategias de CE-MS recientemente desarrolladas para el perfil metabólico de muestras biológicas 4,5. En CE, electroforesis más específicamente capilar de zona (CZE, normalmente se hace referencia como CE), los compuestos se separan sobre la base de su relación de carga con el tamaño y, por lo tanto, esta técnica analítica es muy adecuado para el análisis de metabolitos polares y cargados. El mecanismo de separación de CE es fundamentalmente diferente de las técnicas basadas en cromatográficas, proporcionando de este modo una visión complementaria sobre la composición metabólica de muestras biológicas 6-8. Soga y colaboradores fueron los primeros en demostrar la utilidad de CE-MS para el mundial de perfiles de metabolitos en muestras biológicas 9,10. Hasta ahora, la viabilidad y la utilidad de CE-MS para la metabolómica ha sido ampliamente demostrada 11-15.CE está generalmente acoplado a MS a través de una funda-líquido interfaz técnica 16,17; sin embargo, debido a la dilución del efluente capilar por la funda-líquido, la sensibilidad de detección se ve comprometida intrínsecamente.

Recientemente, se demostró que el uso de una interfaz de sheathless mejoró significativamente la cobertura de detección de metabolitos presentes en diversas muestras biológicas en comparación con CE-MS que utiliza un interfaz de vaina-líquido clásico 5,18,19. Por ejemplo, se detectaron circa 900 características moleculares en la orina humana por sheathless CE-MS mientras que se observaron aproximadamente 300 características moleculares con la envoltura-líquido CE-MS 5. La interfaz sheathless utilizado se basó en un emisor de punta porosa, que fue inventado por Moini 20, lo que permite el uso eficaz de la propiedad de flujo bajo intrínsecamente de CE en combinación con nano-ESI-MS.

Con el fin de estimular el uso de sheathless CE-MS en el campo de la metabolómica,un protocolo se presenta la descripción de cómo este enfoque se puede utilizar para el análisis de metabolitos altamente polares en muestras biológicas, como se ejemplifica para el análisis de los extractos de la línea celular de glioblastoma. Se muestra que el método de CE-MS sheathless para el perfilado de metabolitos catiónicos también se puede utilizar para el perfilado de metabolitos aniónicos usando exactamente las mismas condiciones de capilares y de separación, lo que reduce el tiempo de análisis y proporcionar una sola plataforma analítica para el perfil global de la metabolitos cargadas. El protocolo también describe una estrategia para la alineación efectiva de la sheathless emisor punta porosa con el instrumento MS.

Protocol

NOTA: El protocolo descrito aquí por el uso de sheathless CE-MS para los perfiles de los estudios metabólicos es para uso de laboratorio. Los procedimientos descritos a continuación se basan en el trabajo publicado recientemente 4,5. Más detalles experimentales se pueden encontrar en estos documentos. Antes de utilizar este protocolo, consulte a todas las hojas de datos de seguridad de materiales (MSDS) correspondientes. Por favor, use todos los procedimientos de seguridad de laboratorio apropiadas, incluyendo gafas de seguridad, bata de laboratorio y guantes, al llevar a cabo los experimentos descritos en este protocolo.

1. Preparación de Reactivos y Soluciones muestras

  1. Preparación del electrolito de fondo (BGE)
    1. Preparar una nueva solución BGE (10% (v / v) de ácido acético, pH 2,2) cada día.
    2. Añadir 9,0 ml de agua en un vial de vidrio de 10 ml y añadir 1,0 ml de ácido acético al agua en una campana de humos. Mezclar la solución a fondo usando un vórtice.
  2. Preparación de standar metabolitomezcla d
    1. Disolver 50 l de una mezcla estándar de 50 mM de cationes contiene 60 metabolitos catiónicos en 50 l de agua y se mezcla bien la solución. Almacenar a -80 ° C cuando no esté en uso.
    2. Disolver 50 l de un anión mezcla estándar 50 mM que contiene 30 metabolitos aniónicos en 50 l de agua y se mezcla bien la solución. Almacenar esta solución, en alícuotas para evitar ciclos de congelación / descongelación de la misma mezcla estándar, a -80 ° C cuando no esté en uso.
      NOTA: El metabolito mezclas estándar son estables durante 3 meses si se almacena correctamente a -80 ° C.
  3. La preparación de extractos de la línea celular de glioblastoma
    1. Lavar las células U-87 MG de glioblastoma humano adherentes tres veces con solución de cloruro sódico 1 ml de hielo frío 0.9% 21.
    2. Añadir solución de metanol / agua 2 ml enfriado con hielo (, / v 8/2 v) a las células adherentes y raspar usando un caucho con punta de raspador de células 21. Recoger la solución de metanol / agua en un tubo y ultrasonicate por 2 min.
    3. Añadir cloroformo a la fracción de metanol / agua (relación final, v / v 8/8/2 v /) y se centrifuga la muestra durante 10 min a 16.100 xg y 4 ° C.
    4. Recoger la fase de metanol / agua y se evapora esta fracción utilizando un concentrador de vacío. Reconstituir el material seco en 50 l de agua para su análisis por sheathless CE-MS. Cuando no está en uso almacenar la muestra a -80 ° C.

2. Configuración de la CE-MS Sistema Sheathless

  1. Instalación del cartucho de sílice fundida desnudo con el emisor punta porosa
    1. Coloque un nuevo cartucho de sílice fundida desnudo con un emisor de punta porosa (longitud de 30 micras de diámetro interno x 90 cm en total) en el instrumento de la CE.
    2. Aplicar un enjuague hacia adelante a 50 psi durante 15 minutos con el software que controlan el instrumento CE utilizando metanol al 100% y comprobar visualmente si el líquido está fluyendo hacia fuera de la capilsalida Lary durante esta etapa de aclarado. También realizar un enjuague en la dirección opuesta a 50 psi durante 5 min usando la solución BGE para examinar visualmente si el líquido está fluyendo hacia fuera del capilar conductora.
    3. Repita el paso 2.1.2 a una presión de 100 psi en caso de no formación de gotas de líquido se ha observado en la salida del tubo capilar. Instalar un nuevo cartucho de sílice fundida desnuda si no se observó la formación de gotas de líquido durante este paso.
    4. Enjuague el capilar de separación con agua a 50 psi durante 10 min, seguido de NaOH 0,1 M a 50 psi durante 10 min, a continuación, por el agua a 50 psi durante 10 min y finalmente con BGE a 50 psi durante 10 min.
      NOTA: Los pasos 2.1.1 hasta 2.1.4 sólo son necesarios para la instalación de un nuevo cartucho capilar.
  2. El acoplamiento del capilar porosa emisor punta de ESI-MS
    NOTA: Antes de acoplar el capilar CE a MS, asegúrese de que el instrumento ha sido calibrado MS y conectado al sistema de CE. Ajuste la tensión de ESI0. Coloque el instrumento MS con una fuente de nanopulverización. Gas 1, gas 2 y la temperatura del calentador de interfaz no se aplicaron como ESI a velocidades de flujo muy bajas se produce por la simple aplicación de la tensión de pulverización iónica fijado en 1.500 V. Set la cortina a 5 psi.
    1. Retire la punta del rociador del cartucho de sílice fundida desde el tubo de agua e instalarlo en el adaptador de fuente de nanopulverización para acoplar al instrumento MS. Asegúrese de que la altura de los viales de BGE en el instrumento CE coincide con la altura de la punta del pulverizador.
    2. Compruebe para el flujo de líquido a través del capilar conductora enjuagando con BGE a 50 psi durante 5 min. Durante esta fase de aclarado una formación de gotas en la base de la aguja pulverizador ESI debe observarse.
    3. Enjuague el capilar de separación con BGE a 50 psi durante 10 min en la dirección de avance. formación de gotas debe observarse en la punta del emisor punta porosa (punta del pulverizador) durante este paso.
    4. Coloque el emisor punta porosa a la entrada de la entrada de MS a una distancia de cIRCA 2-3 mm.
    5. Aplicar un voltaje de 30 kV usando un tiempo de rampa de 1 min y comenzar a adquirir datos de MS en el intervalo m / z de 65 a 1000 m / z para los estudios de perfiles metabólicos utilizando primero una tensión de ESI de 0.
      NOTA: El espectro de masas debe ser vacío de señal como no debe haber electrospray.
    6. Ajuste la tensión de ESI a 1.000 V, mientras que llevar a cabo la medición de datos. Aumenta la tensión de ESI con incrementos de 200 V hasta que una señal de fondo constante se observa durante al menos 15 minutos.
    7. Optimizar la posición de emisor punta porosa con respecto al centro de la entrada MS moviéndolo en la x, y, o dirección z con el fin de ver qué posición proporciona la máxima y la señal de MS más estable (electroferograma de iones totales).
    8. Después de optimizar la posición del emisor de punta porosa y determinar el voltaje óptimo ESI, ajuste la tensión de ESI a 0 V y disminuir la tensión de CE a partir de 30 kV a 1 kV usando un tiempo de rampa de 5 min.
    9. Crear un método MS using la tensión óptima ESI y un método CE en el instrumento de CE para el análisis de las normas de metabolitos y muestras biológicas.

3. Análisis de metabolitos estándares y muestras biológicas

  1. La evaluación del desempeño del sistema sheathless CE-MS
    1. Transferencia de 20 l de la mezcla patrón de metabolito aniónico en un microvial vacío 100 l (vial PCR) que encaja en un vial CE y puso este vial en la bandeja de entrada de la muestra.
      NOTA: El volumen mínimo requerido en el microvial para una inyección fiable es de 2 l.
      1. Iniciar el método modo de iones negativos adquisición MS creada durante el paso 2.2.9 y posteriormente iniciar la secuencia de CE utilizando el software que controla el instrumento de la CE.
      2. Enjuague el capilar de separación con BGE a 50 psi durante 3 min, seguido de inyección en 2,0 psi durante 60 segundos (20 nl correspondiente al 3% del volumen capilar) y luego por inyección BGE a 1,0 psi para 10segundo.
        NOTA: Posteriormente, la adquisición de datos de MS se activa.
      3. Aplicar una tensión de -30 kV con un tiempo de rampa de 1,0 min con una presión de 0,5 psi durante 30 min en la entrada. Después de un 30 min separación electroforética, parada de adquisición de datos de MS y disminuir la tensión de CE a -1 kV usando un tiempo de rampa de 5 min (una disminución gradual de la tensión de CE después de la separación electroforética mejora la durabilidad del emisor capilar punta porosa).
    2. Entre inyecciones de muestra, aclare el capilar con agua, hidróxido de sodio 0,1 M, agua y BGE cada a 30 psi durante 3 min.
    3. Analizar los datos registrados por la determinación de los tiempos de migración y la intensidad de la señal de la mezcla de metabolito aniónico analizado.
    4. Evaluar si las normas de metabolitos aniónicos aparecen en la región entre 10 y 28 min.
    5. Comprobar si tres isómeros estructuralmente relacionados, es decir, D-glucosa-1-fosfato, D-glucosa-6-fosfato y D-fructosa-6-fosfato deshidrogenasa sonparcialmente separada, es decir, la resolución entre los dos primeros picos es alrededor de 0,75 y de los dos últimos picos es alrededor de 0,50 (véase la Figura 1).
      NOTA: Una resolución de 1,5 indica una separación inicial de dos picos adyacentes.
    6. Repita los pasos 3.1.1 y 3.1.2 de la mezcla metabolito catiónico. Asegúrese de que la detección MS se encuentra ahora en modo de iones positivos y la tensión CE es 30 kV.
    7. Analizar los datos registrados por la determinación de los tiempos de migración y la intensidad de la señal de la mezcla de metabolito catiónico analizado.
    8. Evaluar si las normas de metabolitos catiónicos aparecen en la región entre 8 y 22 min. Compruebe si isoleucina y leucina están migrando entre el 15 y el 15,5 min y determinar si la resolución es de alrededor de 0,5.
  2. Análisis de las muestras biológicas
    1. Repita los pasos 3.1.1 y 3.1.2 para los perfiles metabólicos aniónico del extracto de la línea celular de glioblastoma.
      NOTA: El aire metabólicatienda de campaña obtenido después de pretratamiento de la muestra corresponde a una densidad celular de alrededor de 20 células / nl, por lo tanto, una inyección de 20 nl es el equivalente de 400 células por análisis. .
    2. Crear un electroferograma de iones extraídos para el metabolito ácido láctico (m / z 89.0243) utilizando 5 exactitud de masa MDA y compruebe si la intensidad de la señal está por encima de 100.000 recuentos.
    3. Repita los pasos 3.1.1 y 3.1.2 para los perfiles metabólicos catiónico del extracto de la línea celular de glioblastoma.
      NOTA: Un electroferograma de iones totales altamente rico en información debe ser observado para una inyección de 20 nl en este modo.
    4. Después de los análisis o cuando no está en uso, enjuague el capilar con agua a 50 psi durante 15 min y almacenar la parte de entrada del capilar en un agua que contiene vial y la sección porosa (parte de salida) en un tubo que contiene también agua.

Representative Results

El método sheathless CE-MS propuesto es capaz de proporcionar alta eficiencia, es decir, números de placa que van de 60.000 a 400.000, los perfiles de metabolitos aniónicos y catiónicos en los límites de detección nanomolares utilizando ácido acético al 10% (pH 2,2) como BGE. El rendimiento de separación del método para el análisis de metabolitos aniónicos altamente polares se demuestra por tres isómeros de fosfato de azúcar relacionadas estructuralmente (Figura 1). Aunque no se obtuvo una separación de línea de base para estos tres analitos, una separación parcial es suficiente para permitir su detección selectiva por MS como estos analitos tienen exactamente la misma masa. El potencial del método de CE-MS sheathless para perfiles metabólicos de número limitado de células, es decir, una inyección nl 20 corresponde a 400 células (densidad celular es alrededor de 20 células / nl), se demuestra para el análisis de metabolitos catiónicos en un extracto de la línea celular de glioblastoma (La Figura 2), en el que se detectaron más de 300 características moleculares por encima de un / N-relación S ≥ 5.

Figura 1
Figura 1. Análisis de isómeros de fosfato de azúcar por sheathless CE-MS. Electroferograma de iones extraída para los tres isómeros de fosfato de azúcar (25 m) obtenidos con sheathless CE-MS en el modo de iones negativos. Condiciones experimentales: BGE, 10% de ácido acético (pH 2,2); voltaje de separación, -30 kV (psi 0.5 aplicado a la entrada del capilar CE); inyección de la muestra, 2,0 psi durante 60 seg. Reproducido con permiso 4. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2
Figura 2. Análisis de isoleucina y Leucine por CE-MS. electroferograma de iones Extraído sheathless de dos isómeros de aminoácidos (25 m) obtenidos con sheathless CE-MS en el modo de iones positivos. Condiciones experimentales: BGE, 10% de ácido acético (pH 2,2); voltaje de separación, 30 kV; inyección de la muestra, 2,0 psi durante 60 seg. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figura 3
Figura 3. Potencial de sheathless CE-MS para crear perfiles de metabolitos catiónicos en un extracto de línea celular. Perfil metabólico (electroferograma de iones totales) observado en un extracto de una línea celular de glioblastoma con sheathless CE-MS en el modo de iones positivos. Condiciones experimentales: BGE, 10% de ácido acético (pH 2,2); voltaje de separación, 30 kV; inyección de la muestra, 2,0 psi durante 60 seg. Reproducido con permiso 4 Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discussion

Un método de CE-MS sheathless empleando un emisor de punta porosa se ha presentado para el análisis de metabolitos altamente polares y cargados. Una característica única de este enfoque es que los metabolitos aniónicos o catiónicos se pueden perfilar sólo por conmutación de la detección y el voltaje de polaridad CE MS. Una amplia gama de metabolitos muy polares y cargados en muestras biológicas pueden ser analizados con una alta eficiencia de separación, que es crucial para los metabolitos estructuralmente similares, y con límites de detección en el (bajo) rango nanomolar. El protocolo presentado centra en el uso de sheathless CE-MS para el perfil metabólico de los extractos celulares con el fin de ejemplificar la utilidad del método para el perfil metabólico de una muestra biológica. El método descrito aquí también se puede utilizar para el perfil metabólico de otros tipos de muestras biológicas, tales como orina humana 5, dado que se utiliza un procedimiento adecuado de la muestra de pretratamiento.

La meto sheathless MS-CEd se basa en un emisor de punta porosa que permite el uso de la propiedad de flujo bajo intrínsecamente de la CE. En este contexto, una señal estable ESI es un pre-requisito para los estudios de perfiles metabólicos reproducibles. Por lo tanto, es importante que la punta de pulverizador está correctamente colocado en frente de la entrada MS. En esta configuración, el proceso de ESI depende principalmente de la naturaleza de la BGE y por lo tanto, BGE optimización es crítica. La configuración sheathless es menos versátil en comparación con los sistemas de CE-MS vaina-líquido en el que todos los tipos de composiciones de la vaina-líquido se pueden añadir para mejorar la eficiencia de ionización. La aguja sheathless pulverizador ESI debe estar completamente lleno de líquido conductor (es decir, solución BGE). Una señal ESI inestable puede resultar de un capilar parcial o totalmente enchufado. El enjuague a altas presiones con BGE puede resolver este problema. De lo contrario el capilar de separación tiene que ser reemplazado. Antes de la evaluación del rendimiento analítico, una señal de fondo estable ESIdebe ser generada primero lo que es consistente de un día para otro.

El rendimiento analítico del método de CE-MS sheathless para estudios de perfiles metabólicos necesita ser comprobado diariamente utilizando mezclas estándar metabolito. En las mismas condiciones experimentales, los tiempos de migración consistente, es decir, la variación por debajo de 3% en el plazo de días (n = 10) y entre-día (n = 5) usando una inyección de 20 nl de una mezcla estándar de metabolito (12,5 M), pico se deben obtener alturas / áreas (variación inferior al 15%) y números de placa (que oscilan entre 60.000 y 400.000). Los límites de detección deben estar en el rango nanomolar para la mayoría de las normas de metabolitos. Sólo cuando se cumplen estos criterios es el método listo para perfiles metabólicos de las muestras biológicas. Si no, el instrumento MS necesita ser sintonizado y re-calibrado o el emisor de punta capilar porosa necesita ser cambiado.

Una etapa de aclarado eficaz entre CE-MS análisis es de gran importancia, no sólo paraevitar el arrastre potencial sino también para mantener el rendimiento de la separación. arrastre potencial puede ser causada por viales BGE contaminados con la muestra y, por tanto, que resuelve sustitución por nuevos viales de BGE. Cuando el método de CE-MS sheathless no está en uso, es importante para desconectar el capilar de separación y para almacenar el lado de entrada del capilar en el agua y el exterior sumergido con el manguito protector en un tubo que contiene el agua para prolongar la vida útil capilar.

En resumen, el método de CE-MS sheathless propuesto muestra un fuerte potencial de perfiles metabólicos de las muestras biológicas cuando se usa de acuerdo con los procedimientos indicados en el presente protocolo. En esta etapa, los datos de comparación entre laboratorios son sin duda necesarios para sheathless CE-MS con el fin de evaluar la reproducibilidad (a largo plazo) y la solidez de este enfoque para la metabolómica. Este protocolo puede estimular un estudio de este tipo. Varios retos analíticos todavía tienen que ser considerados. Por Potencia óptimaormance, la corriente CE debe mantenerse preferentemente por debajo de 5 mu y en esta etapa los capilares emisores punta porosa únicamente se proporcionan en una longitud de 91 cm que puede obstaculizar el desarrollo de ensayos de alto rendimiento. Por otra parte, se utilizó un tampón de separación de pH bajo para perfiles metabólicos aniónico que puede no ser el más óptimo para lograr una separación de línea de base de fosfatos de azúcares relacionados estructuralmente. También es importante que sólo los metabolitos aniónicos pueden ser analizados que son (parcialmente) cargado negativamente en las condiciones de separación utilizada. El siguiente paso es evaluar la utilidad del método CE-MS sheathless para los estudios clínicos de perfiles metabólicos en la actualidad, un único emisor de punta capilar porosa sólo se puede utilizar para el análisis de hasta 100 muestras biológicas.

En general, un mayor desarrollo en el enfoque sheathless CE-MS se abrirá una nueva dirección en el campo de la metabolómica, es decir, hacia una comprensión más profunda de las funciones biológicas en s-Amplias restringida casos.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CESI 8000 instrument Sciex A98089 OptiMS adapter required to couple CESI to MS
OptiMS Fused-Silica Cartridge, 30 μm ID x 90 cm total length Sciex B07367
OptiMS Adapter for Sciex Nanospray III source Sciex B07363
CESI vials Sciex B11648
Micro vials Sciex 144709
Glacial acetic acid Sigma A6283 Use in fume hood
Cationic metabolite mixture Human Metabolome Technologies H3304-3034
Anionic metabolite mixture Human Metabolome Technologies H3304-1031
Methanol (LC-MS Ultra Chromasolv) Sigma 14262 Use in fume hood
Sodium hydroxide solution Sigma 72079 0.1 M
U-87 MG Glioblastoma cell line Sigma 89081402
Chloroform Sigma 650498 Toxic; use in fume hood

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References

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Zhang, W., Gulersonmez, M. C., Hankemeier, T., Ramautar, R. Sheathless Capillary Electrophoresis–Mass Spectrometry for Metabolic Profiling of Biological Samples. J. Vis. Exp. (116), e54535, doi:10.3791/54535 (2016).More

Zhang, W., Gulersonmez, M. C., Hankemeier, T., Ramautar, R. Sheathless Capillary Electrophoresis–Mass Spectrometry for Metabolic Profiling of Biological Samples. J. Vis. Exp. (116), e54535, doi:10.3791/54535 (2016).

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