Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biochemistry

Biyolojik Numune metabolik profil için Sheathless Kapiler Elektroforez-Kütle Spektrometre

doi: 10.3791/54535 Published: October 1, 2016

Summary

Bir sheathless gözenekli ucu arayüz tasarımı kullanılarak kapiler elektroforez-kütle spektrometrisi ile biyolojik numunelerin metabolik profil için bir protokol verilmektedir.

Abstract

metabolitler olarak, analitik teknikler, geniş bir dizi karmaşık örneklerde (endojen) metabolitlerin genel profili kullanılır. Bu yazıda, bir protokol kapiller elektroforez-kütle spektrometrisi (CE-MS) ile, biyolojik örneklerinde anyonik ve katyonik Metabolitlerin analiz edilmesi için sunulmuştur. bileşikler, yük-ebat oranı temelinde ayrılır CE yüksek kutupsal ve yüklü Metabolitlerin analiz edilmesi için çok uygundur. Son yıllarda geliştirilmiş olan sheathless arayüz tasarımı, yani, gözenekli ucu arayüzü, iyonizasyon (ESI) MS elektro CE bağlanması için kullanılır. Bu ara yüz yaklaşım, polar metabolit sınıfların geniş bir aralığı için nanomolar saptama limitleri sonuçlanan MS ile kombinasyon halinde CE içsel düşük akım özelliğinin etkili kullanımına izin verir. Burada sunulan protokol analizi için düşük pH ayırma koşullarında gözenekli ucu verici ile çıplak erimiş silika kapiller istihdam dayanmaktadırbiyolojik numunelerde metabolit sınıfların geniş bir dizisi. Aynı sheathless CE-MS metodu yalnızca MS algılama açma ve şeker fosfatlar, nükleotidler ve organik asitler de dahil olmak üzere amino asitler, nükleositler ve küçük peptid, veya anyonik metabolitler dahil olmak üzere, katyonik metabolitlerin, profil için kullanılabilir olduğu gösterilmiştir ayırma gerilim kutuplarının. idrar, beyin omurilik sıvısı ve gliyoblastoma hücre çizgisinin ekstreleri çeşitli biyolojik örneklerinde yüksek bilgi açısından zengin metabolik profil, CE-MS analizi az 1 saat, bu protokol ile elde edilebilir.

Introduction

Çağdaş metabolomik ise, yüksek son analitik ayırma teknikleri bir temsilci elde etmek için metabolit sınıfları geniş bir yelpazede analiz etmek için kullanılan bir organizmanın 1 fizyolojik durumunun-out okudum. Bir metabolomiks çalışmanın nihai hedefi, belirli bir biyolojik / klinik soruya bir cevap elde etmektir. Şu anda, İnsan Metabolome Veritabanı endojen ve eksojen hem bileşikleri (besin, Mikrobiyota, uyuşturucu ve diğer kaynaklardan ikinci menşeli) temsil eden 40.000 'den fazla metabolit girişlerinin oluşur 2.. Fiziko-kimyasal özellikler ve bu metabolitlerin konsantrasyon aralığında, çok büyük bir çeşitlilik göz önüne alındığında, farklı ayrıştırma mekanizmalarla çok sayıda analitik teknikler, belirli bir biyolojik numunede mümkün olduğu kadar çok metabolitleri profil için birlikte kullanılır. Örneğin, Psychogios ve ark. Metabolik prof beş analitik ayırma teknikleri bir arada kullanılmıştır4.000 'den fazla kimyasal çeşitli metabolitlerin 3 tespiti ile sonuçlanan insan serumu Yağlam.

Bu yazıda, dikkat biyolojik numunelerin 4,5 metabolik profil için yeni geliştirilen CE-MS stratejilerine ödenecektir. CE olarak, daha özel olarak kapilar bölge elektroforezi (CZE, normalde CE) uygun olarak, bileşikler, bu nedenle, bu analitik teknik, polar ve yüklü Metabolitlerin analiz edilmesi için son derece uygundur, bunların yük-ebat oranı temelinde ayrılmış ve. CE ayırma mekanizması dolayısıyla biyolojik örnekler 6-8 metabolik kompozisyonuna tamamlayıcı bir görünüm sağlayan, kromatografik tabanlı teknikler temelde farklıdır. Soga ve ortak çalışanlar biyolojik numunelerde 9,10 metabolitleri küresel profil CE-MS yararını göstermek için ilk idi. Şu ana kadar, metabolomiks CE-MS fizibilite ve faydası çok 11-15 gösterilmiştir.CE genel teknik 16,17 arabirim, bir kılıf-sıvı ile MS kuple edilir; Ancak nedeniyle kılıf-sıvı tarafından kılcal atık su seyreltme, algılama hassasiyeti kendinden tehlikeye düşer.

Son zamanlarda, bu, klasik bir kılıf-su ara-yüzünün 5,18,19 kullanılarak CE-MS ile karşılaştırıldığında sheathless arayüzü kullanımı önemli ölçüde değişik biyolojik örneklerde mevcut metabolitlerin tespiti kapsama iyileştirdiğini göstermektedir. Yaklaşık 300 moleküler özellikleri kılıf-Sıvı CE-MS 5 gözlendi ise örneğin 900 yaklaşık moleküler özellikleri sheathless CE-MS ile insan idrarında tespit edilmiştir. Kullanılan sheathless arayüzü nano-ESI-MS ile birlikte CE özünde düşük akımlı özelliğinin etkin kullanımına imkan veren, Moini 20 tarafından icat edilen bir gözenekli uç yayıcı, dayanıyordu.

metabolitler alanında sheathless CE-MS kullanımını teşvik etmek amacıyla,bir protokol gliyoblastoma hücre hattı elde edilen ekstrelerin analizi için örneklendiği gibi bu yaklaşım, biyolojik numunelerde yüksek kutupsal Metabolitlerin analiz edilmesi için kullanılabilir açıklayan sunulmuştur. Katyonik metabolitlerin profil için sheathless CE-MS metodu, aynı zamanda bu şekilde analiz süresini azaltmak ve küresel profil oluşturma için tek bir analitik platform sağlayan, aynı kapiler ve ayırma koşulları kullanılarak anyonik metabolitlerin profil için kullanılabilir gösterilmiştir ücret metabolitleri içerir. protokol aynı zamanda MS cihazı ile sheathless gözenekli ucu yayıcı etkin uyum için bir strateji açıklamaktadır.

Protocol

NOT: metabolik profil çalışmaları için sheathless CE-MS kullanımı için burada açıklanan protokol laboratuvar kullanımı içindir. Aşağıda belirtilen prosedürler son yayınlanan iş 4,5'ten dayanmaktadır. Ileri deneysel ayrıntılar bu kağıtlar bulunabilir. Bu protokol kullanmadan önce, tüm ilgili malzeme güvenlik bilgi formlarını (MSDS) bakın. Bu protokolde belirtilen deneyler yaparken, güvenlik gözlükleri, laboratuvar önlüğü ve eldiven dahil tüm uygun laboratuar güvenlik prosedürlerini kullanın.

Reaktifler Çözümleri ve Örneklerin hazırlanması 1.

  1. Arka plan elektrolit hazırlanması (BGE)
    1. Yeni BGE çözeltisi (% 10 (hac / hac) asetik asit, pH 2.2) her gün hazırlayın.
    2. 10 ml'lik bir cam şişe içine su 9.0 ml ilave edilir ve bir çeker ocak içinde, su, asetik asit, 1.0 ml. iyice bir girdap kullanarak çözüm karıştırın.
  2. Metabolit standar hazırlanmasıd karışımı
    1. su 50 ul içine 60 katyonik metabolitleri içeren 50 uM katyon standart karışımı 50 ul çözülür ve iyice çözüm karıştırmak. -80 ° C'de saklayın kullanılmadığı zaman.
    2. su 50 ul içine 30 anyonik metabolitleri içeren 50 mM anyon standart karışımı 50 ul çözülür ve iyice çözüm karıştırmak. Kullanılmadığı zaman -80 ° C 'de, aynı şekilde karışımın donma / çözülme devrelerine önlemek için parçalar halinde, bu çözüm saklayın.
      Not: -80 ° C'de saklandığı zaman, standart karışımları 3 ay boyunca stabildir metaboliti.
  3. Glioblastoma hücre çizgisinden ekstrelerinin hazırlanması
    1. 1 ml buz gibi soğuk% 0.9 sodyum klorür solüsyonu 21 yapışık insan U-87 mg, glioblastoma hücreleri üç kez yıkayın.
    2. Yapışık hücreler 2 ml buz soğukluğunda metanol / su çözeltisi (8/2, h / h) ilave edin ve bir lastik hücre kazıyıcı 21 uçlu kullanılarak kazıyın. 2 dakika için metanol / su tüp içinde çözelti ve ultrasonicate toplayın.
    3. 16.100 x g'de 4 ° C'de 10 dakika boyunca metanol / su fraksiyonu (nihai oranı 8/8/2 v / v / v) ve santrifüj örneği kloroform ekleyin.
    4. metanol / su tabakayı toplayın ve vakum konsantratör kullanılarak bu fraksiyonun buharlaştırılması. sheathless CE-MS ile analiz için 50 ul su içinde kurutuldu malzeme sulandırın. Kullanılmadığı zaman -80 ° C örneği saklamayın.

2. Sheathless CE-MS Sistemini Kurmak

  1. Gözenekli uç yayıcı ile çıplak erimiş silika kartuş montajı
    1. CE enstrümanda bir gözenekli ucu yayıcı (30 mikron iç çapı x 90 cm toplam uzunluk) ile yeni bir çıplak erimiş silika kartuşu yerleştirin.
    2. % 100 metanol kullanılarak CE cihazının kontrol yazılımı ile 15 dakika boyunca 50 psi'de bir ön durulama uygulanır ve görsel olarak, sıvı capil arasından akmasını kontrolBu durulama adımında lary çıkışı. Ayrıca görsel, sıvı ileten kılcalından gelen dışarı akan olup olmadığını incelemek için BGE çözeltisi kullanılarak 5 dakika boyunca 50 psi'de karşı yönde bir durulama gerçekleştirin.
    3. herhangi bir sıvı damlası oluşumu kılcal çıkışında görülmüştür durumunda 100 psi basınçta adımı yineleyin 2.1.2. herhangi bir sıvı damlası oluşumu, bu adımı sırasında gözlenmiştir, yeni bir çıplak erimiş silika kartuşu takın.
    4. 10 dakika boyunca 50 psi'de su ile, daha sonra 10 dakika boyunca 50 psi'de 0.1 M NaOH ve ardından 10 dakika boyunca 50 psi'de, su ile ayrıştırma kılcal, yıkayın ve 10 dakika boyunca son BGE ile 50 psi.
      NOT: 2.1.4 kadar 2.1.1 sadece yeni bir kılcal kartuşunun kurulumu için gerekli olan adımları.
  2. ESI-MS kılcal gözenekli ucu yayıcı birleştirilmesi
    NOT: MS cihazı kalibre ve CE sistemine bağlı olmuştur emin olun, MS CE kılcal Bağlantıdan önce. ESI voltajı ayarlama0. nano-sprey kaynağı ile MS aleti takın. Gaz 1 gaz 2 ve arayüz ısıtıcı sıcaklığı sadece 5 psi 1500 V. Set perde ayarlanmış iyon püskürtme voltaj uygulayarak oluşur çok düşük akış hızlarında ESI olarak uygulanmadı.
    1. su tüpten erimiş silika kartuş püskürtme ucunu çıkarın ve MS cihazına bağlamak için nano-sprey kaynak adaptörü takın. CE cihazında BGE şişeleri yüksekliği püskürtücü ucu yüksekliği maç emin olun.
    2. 5 dakika boyunca 50 psi'de BGE ile durulama iletken kılcal boyunca sıvının akış kontrol edin. Bu durulama esnasında ESI püskürtücü iğne dibinde bir damla oluşumu dikkat edilmelidir adım.
    3. ileri yönde, 10 dakika boyunca 50 psi'de BGE ayırma kılcal yıkayın. Damla oluşumu, bu adımı sırasında gözenekli ucu yayıcı (püskürtücü ucu) ucunda dikkat edilmelidir.
    4. C bir mesafede MS girişinin giriş gözenekli ucu verici yerleştirinirca 2 ile 3 mm.
    5. 1 dakikalık bir rampa süresini kullanarak 30 kV gerilim uygulayın ve 65 0 ilk ESI gerilim kullanılarak metabolik profil çalışmaları için 1.000 m / z m / z aralığında MS verilerini elde başlar.
      NOT: elektrosprey olması gerektiği gibi kütle spektrumu sinyalinin geçersiz olmalıdır.
    6. ölçüm verilerinin devam ederken 1000 V ESI voltajı ayarlayın. sabit bir arka plan sinyali gelene kadar 200 V artımlarla ESI voltajı artış en az 15 dakika boyunca gözlenmiştir.
    7. maksimal ve en istikrarlı MS sinyalini (toplam iyon Elektroferogram) sağlayan konum görmek için x, y veya z-yönünde hareket MS girişine merkezine göre gözenekli ucu yayıcı pozisyonunu optimize edin.
    8. gözenekli ucu yayıcı pozisyonunu optimize ve optimal ESI gerilimi belirlendikten sonra, 0 V ESI gerilimini ayarlamak ve 5 dakikalık bir rampa süresini kullanarak 1 kV 30 kV CE gerilimi azaltın.
    9. MS yöntemi usin oluşturmag optimum ESI gerilim ve metabolit standartları ve biyolojik numunelerin analizi için CE cihaz üzerinde CE yöntemi.

Metabolit Standartları ve Biyolojik örnekler 3. Analizi

  1. Sheathless CE-MS sisteminin performans değerlendirmesi
    1. Transfer CE şişenin içine sığar ve giriş örnek tepsisine bu şişeyi koymak boş 100 ul microvial (PCR flakon) içine anyonik metaboliti standart karışımı 20 ul.
      NOT: Güvenilir bir enjeksiyon için microvial gerekli minimum hacim 2 ml.
      1. Adım 2.2.9 sırasında oluşturulan MS edinimi negatif iyon modu yöntemi başlatın ve daha sonra CE araç kontrol yazılımı kullanarak CE dizisi başlar.
      2. 10 için 1.0 psi BGE enjeksiyon ile daha sonra 60 saniye boyunca 2.0 psi'de enjeksiyon, ardından 3 dakika süre ile 50 psi'de BGE ayırma kılcal durulayın (NL 20 kılcal hacminin% 3 uygun olarak) vesn.
        Not: Daha sonra, MS verileri elde etme tetiklenir.
      3. girişine 30 dakika boyunca 0.5 psi'lik bir basınç ile 1,0 dakikalık bir yükseliş süresi ile -30 kV bir voltaj uygulanır. Bir 30 dakika elektroforetik ayrılmasından sonra MS veri toplama durdurmak ve (elektroforetik ayırma gözenekli ucu kılcal yayıcı dayanıklılığını artırır sonra CE gerilimi kademeli düşüş) 5 dakikalık bir rampa süresi kullanarak -1 kV CE gerilimi azaltır.
    2. Örnek enjeksiyonları arasında, 3 dakika boyunca 30 psi'de su ile kılcal 0.1 M sodyum hidroksit, su ve BGE her durulama.
    3. göç süreleri ve analiz anyonik metaboliti karışımının sinyal yoğunluğu belirleyerek kaydedilen verileri analiz edin.
    4. anyonik metabolit standartları 10 ve 28 dakika arasında bölgede görünür olup olmadığını değerlendirmek.
    5. Üç yapısal olarak ilgili izomerleri, yani, D-Glukoz-1-fosfat, D-Glukoz-6-fosfat, D-fruktoz-6-fosfat olup olmadığını kontrol edinKısmen ayrılmış, yani, ilk iki tepe arasındaki çözünürlük 0.75 dolaylarında olup, son iki tepe (Şekil 1 e bakınız) 0.50 circa.
      NOT: 1.5 çözünürlük iki komşu doruklarına bir temel ayrılık gösterir.
    6. Tekrarlayın 3.1.1 ve katyonik metaboliti karışımı için 3.1.2 adımları. MS algılama pozitif iyon modunda şimdi ve CE gerilimi 30 kV olduğundan emin olun.
    7. göç süreleri ve analiz katyonik metaboliti karışımının sinyal yoğunluğu belirleyerek kaydedilen verileri analiz edin.
    8. katyonik metabolit standartlar 8 ve 22 dakika arasındaki bölgede görünür olup olmadığını değerlendirmek. izolösin ve lösin 15 ila 15.5 dk göç olup olmadığını kontrol edin ve çözünürlük 0.5 dolaylarında olup olmadığını belirlemek.
  2. Biyolojik numunelerin analizi
    1. Tekrarlayın 3.1.1 ve glioblastoma hücre hattının ekstresi anyonik metabolik profil için 3.1.2 adımları.
      NOT: Metabolik conÖrnek ön muameleden sonra elde edilen tert 20 hücre / nl circa bir hücre yoğunluğuna karşılık gelir, bu nedenle, 20 nl enjeksiyon analizi 400 hücre eşdeğerdir. .
    2. 5 MDA kütle doğruluğu kullanarak metaboliti laktik asit (m / z 89,0243) için bir çıkarılan iyon Elektroferogram oluşturun ve sinyal yoğunluğu 100.000 sayıları üzerinde olup olmadığını kontrol edin.
    3. Tekrarlayın 3.1.1 ve glioblastoma hücre hattının ekstresi katyonik metabolik profil için 3.1.2 adımları.
      NOT: Bir çok bilgi açısından zengin toplam iyon Elektroferogram bu modda 20 nl enjeksiyon için dikkat edilmelidir.
    4. analizleri veya kullanılmadığında sonra 15 dakika boyunca 50 psi'de, su ile yıkayın ve kılcal bir şişe içeren su ve su ihtiva eden bir tüp içinde, gözenekli bölümü (çıkış kısmı) kılcal giriş bölümünü depolamak.

Representative Results

Önerilen sheathless CE-MS metodu, yüksek verimli sağlayabilen, yani 60,000 ila 400,000 arasında değişen plaka sayıları, BGE olarak% 10 asetik asit (pH 2.2) kullanarak, nanomolar saptama limitleri, anyonik ve katyonik metabolitleri için profil. Yüksek kutupsal anyonik Metabolitlerin analiz edilmesi için bir yöntem ayrılması performansı üç yapısal olarak ilgili şeker fosfat izomerleri (Şekil 1) için gösterilmiştir. bir temel ayrım bu üç analitler için elde edilmese de, kısmi ayrılması, bu analitler, aynı tam kütle olduğu gibi MS ile seçici algılama sağlamak için yeterlidir. Hücrelerin sınırlı sayıda metabolik profil için sheathless CE-MS metodu potansiyel, yani, 20 nl enjeksiyonu 400 hücrelerine karşılık gelen (hücre yoğunluğu 20 hücre / nl circa), bir ekstrakt katyonik Metabolitlerin analiz edilmesi için gösterilmiştir glioblastoma hücre çizgisinin (300'den fazla molekül özellikleri S / N oranı ≥ 5, yukarıda tespit edildiği Şekil 2).

Şekil 1
Negatif iyon modunda sheathless CE-MS ile elde edilen üç şeker fosfat izomerleri (25 uM) için sheathless CE-MS. Çıkarılan iyon Elektroforegramda ile analiz şeker fosfat izomerleri Şekil 1.. Deney koşulları: BGE,% 10 asetik asit (pH 2.2); ayırma gerilimi, -30 kV (0,5 psi CE kılcal girişinde uygulanan); numune enjeksiyon, 60 saniye boyunca 2.0 psi. Izni 4 ile yeniden. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

şekil 2
Izolösin ve l Şekil 2. Analizpozitif iyon modunda sheathless CE-MS ile elde edilen iki amino asit izomerleri (25 uM) sheathless CE-MS. Çıkarılan iyon Elektroforegramda ile eucine. Deney koşulları: BGE,% 10 asetik asit (pH 2.2); Ayırma voltaj +30 kV; Örnek enjeksiyon, 60 saniye boyunca 2.0 psi. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 3,
Gibi bir hücre dizisi özü katyonik metabolitler profil için sheathless CE-MS Şekil 3. Potansiyel. Metabolik profil (toplam iyon elektroferogramıdır) pozitif iyon modunda sheathless CE-MS ile glioblastoma hücre çizgisinin bir özü gözlenen. Deney koşulları: BGE,% 10 asetik asit (pH 2.2); Ayırma voltaj +30 kV; numune enjeksiyon, 60 saniye boyunca 2.0 psi. Izni 4 ile yeniden Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Discussion

gözenekli ucu yayıcısı kullanan bir sheathless CE-MS metodu yüksek kutupsal ve yüklü Metabolitlerin analiz edilmesi için sunulmuştur. Bu yaklaşımın benzersiz bir özelliği, anyonik veya katyonik metabolitler, MS tespiti ve CE gerilim polaritesini geçiş profilli olmasıdır. Biyolojik örneklerde yüksek kutupsal ve yüklü metabolitlerin çeşitli yapısal olarak benzer metabolitler için çok önemlidir, ve (düşük) nanomolar aralıkta algılama sınırları ile yüksek ayırma verimliliği ile analiz edilebilir. Sunulan protokol, bir biyolojik numunenin metabolik profil yönteminin kullanımını örneklendirmek için hücre ekstrelerinin metabolik profil için sheathless CE-MS kullanımına odaklanmıştır. Burada tarif edilen yaklaşım, uygun bir numune ön-muamele yöntemi kullanılır verilen, insan idrar 5 biyolojik örneklerinde, diğer tip metabolik profil oluşturma için kullanılabilir.

sheathless CE-MS metoksid CE özünde düşük akımlı özelliğinin kullanımını sağlayan bir gözenekli ucu yayıcı dayanmaktadır. Bu bağlamda, istikrarlı bir ESI sinyali tekrarlanabilir metabolik profil çalışmaları için bir ön koşuldur. Nedenle, püskürtme ucu düzgün MS girişinin önüne yerleştirilmiş olması önemlidir. Bu düzenleme içinde, ESI işlemi BGE doğasına bağlıdır ve bu nedenle, BGE optimizasyonu önemlidir. sheathless yapılandırma kılıf-sıvı bileşimlerin her türlü iyonizasyon verimliliğini artırmak için ilave edilebilir kılıf-Sıvı CE-MS sistemlere kıyasla daha az çok yönlüdür. Sheathless ESI püskürtme iğne tam olarak iletken bir sıvı (yani, BGE çözelti) ile doldurulması gerekmektedir. Dengesiz ESI sinyali kısmi veya tam olarak takılı kılcal kaynaklanabilir. BGE yüksek basınçlarda durulama bu sorunu çözebilir. Aksi takdirde, ayırım kılcal değiştirilmesi gerekir. Önceki analitik performansın değerlendirilmesi, istikrarlı bir ESI arka plan sinyaliBir gün diğerine istikrarlı olan ilk oluşturulmalıdır.

metabolik profil çalışmaları için sheathless CE-MS yöntemi analitik performans metaboliti standart karışımlar kullanılarak günlük olarak kontrol edilmesi gerekmektedir. Aynı deneysel koşullar altında, tutarlı bir geçiş süreleri, yani,% 3 aşağıdaki sapma olan günlük (n = 10) arasında günlük (n = 5), bir metabolit, standart karışım (12.5 uM), 20 nl enjeksiyonu ile, pik yükseklikleri / alanları (% 15'in altında varyasyon) ve (60.000 ile 400.000 arasında değişen) plaka numaraları alınmalıdır. algılama sınırları çok metabolit standartları için nanomolar aralığında olmalıdır. Sadece bu kriterlerin karşılanması durumunda biyolojik örneklerin metabolik profil hazır yöntemdir. , MS cihazı ayarlanmış ve gereken değilse yeniden kalibre veya gözenekli ucu kılcal yayıcısı değiştirilmesi gerekiyor.

analizleri CE-MS arasında etkin bir durulama adımı değil sadece, yüksek önem taşımaktadırPotansiyel taşınmasını önlemek değil, aynı zamanda ayırma performansını korumak için. Fazlalıkları numune ile kirlenmiş ve bu nedenle yeni bir BGE şişeleri ile değiştirilmesi ile çözülebilir BGE şişeler neden olabilir. sheathless CE-MS metodu kullanımda olmadığı zaman, ayırma kılcal kesmek ve su içinde kılcal ve kapiler ömrünü uzatmak için su ihtiva eden bir tüp içinde koruyucu kılıf ile batık dış giriş tarafına depolamak için önemlidir.

Bu protokolde rapor edilen prosedürlere göre kullanıldığında Özetle, teklif edilen sheathless CE-MS metodu biyolojik örneklerin metabolik profil için güçlü bir potansiyel göstermektedir. Bu aşamada, laboratuarlar arası karşılaştırma verileri kesinlikle metabolitler için bu yaklaşımın (uzun süreli) tekrarlanabilirlik ve sağlamlığı değerlendirmek için sheathless CE-MS için ihtiyaç vardır. Bu protokol böyle bir çalışma teşvik edebilir. Çeşitli analitik zorluklar hala dikkate alınması gerekir. Optimal perf içinsergilemiş, CE akımı tercihen 5 uA altında ve kılcal gözenekli ucu yayıcılar sadece yüksek girdili tahliller gelişimini engelleyebilir 91 cm uzunluğunda sağlanmaktadır, bu aşamada tutulmalıdır. Üstelik, düşük pH ayırma tamponu yapısal olarak ilgili şeker fosfatları arasında bir temel ayrılmasını elde etmek için en uygun olmayabilir anyonik metabolik profil için kullanılmıştır. Ayrıca önemli sadece anyonik metabolitler (kısmen) olumsuz kullanılan ayırma koşulları altında ücret olan analiz edilebilir olmasıdır. Bir sonraki adım olarak, şu anda klinik metabolik profil çalışmaları için sheathless CE-MS metodu yararlarını değerlendirmek için olup, tek gözenekli bir ucu kılcal yayıcı olduğunda, en fazla 100, biyolojik numunelerin analizi için kullanılabilir.

Genel olarak, sheathless CE-MS yaklaşımında daha da geliştirilmesi s biyolojik fonksiyonların daha derin bir anlayış doğru yani metabolomik, alanında yeni bir yön açılacakbol kısıtlı durumda.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CESI 8000 instrument Sciex A98089 OptiMS adapter required to couple CESI to MS
OptiMS Fused-Silica Cartridge, 30 μm ID x 90 cm total length Sciex B07367
OptiMS Adapter for Sciex Nanospray III source Sciex B07363
CESI vials Sciex B11648
Micro vials Sciex 144709
Glacial acetic acid Sigma A6283 Use in fume hood
Cationic metabolite mixture Human Metabolome Technologies H3304-3034
Anionic metabolite mixture Human Metabolome Technologies H3304-1031
Methanol (LC-MS Ultra Chromasolv) Sigma 14262 Use in fume hood
Sodium hydroxide solution Sigma 72079 0.1 M
U-87 MG Glioblastoma cell line Sigma 89081402
Chloroform Sigma 650498 Toxic; use in fume hood

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ramautar, R., Berger, R., van der Greef, J., Hankemeier, T. Human metabolomics: strategies to understand biology. Curr Opin Chem Biol. 17, 841-846 (2013).
  2. Wishart, D. S., et al. HMDB 3.0--The Human Metabolome Database in 2013. Nucleic Acids Res. 41, D801-D807 (2013).
  3. Psychogios, N., et al. The human serum metabolome. PLoS One. 6, e16957 (2011).
  4. Gulersonmez, M. C., Lock, S., Hankemeier, T., Ramautar, R. Sheathless capillary electrophoresis-mass spectrometry for anionic metabolic profiling. Electrophoresis. 37, 1007-1014 (2016).
  5. Ramautar, R., Busnel, J. M., Deelder, A. M., Mayboroda, O. A. Enhancing the coverage of the urinary metabolome by sheathless capillary electrophoresis-mass spectrometry. Anal Chem. 84, 885-892 (2012).
  6. Ramautar, R., et al. Metabolic profiling of human urine by CE-MS using a positively charged capillary coating and comparison with UPLC-MS. Mol Biosyst. 7, 194-199 (2011).
  7. Naz, S., Garcia, A., Barbas, C. Multiplatform analytical methodology for metabolic fingerprinting of lung tissue. Anal Chem. 85, 10941-10948 (2013).
  8. Ibanez, C., et al. CE/LC-MS multiplatform for broad metabolomic analysis of dietary polyphenols effect on colon cancer cells proliferation. Electrophoresis. 33, 2328-2336 (2012).
  9. Soga, T., et al. Simultaneous determination of anionic intermediates for Bacillus subtilis metabolic pathways by capillary electrophoresis electrospray ionization mass spectrometry. Anal Chem. 74, 2233-2239 (2002).
  10. Soga, T., et al. Quantitative metabolome analysis using capillary electrophoresis mass spectrometry. J Proteome Res. 2, 488-494 (2003).
  11. Britz-McKibbin, P. Capillary electrophoresis-electrospray ionization-mass spectrometry (CE-ESI-MS)-based metabolomics. Methods Mol Biol. 708, 229-246 (2011).
  12. Ibanez, C., et al. A new metabolomic workflow for early detection of Alzheimer's disease. J Chromatogr A. 1302, 65-71 (2013).
  13. Kuehnbaum, N. L., Britz-McKibbin, P. New advances in separation science for metabolomics: resolving chemical diversity in a post-genomic era. Chem Rev. 113, 2437-2468 (2013).
  14. Nemes, P., Rubakhin, S. S., Aerts, J. T., Sweedler, J. V. Qualitative and quantitative metabolomic investigation of single neurons by capillary electrophoresis electrospray ionization mass spectrometry. Nat Protoc. 8, 783-799 (2013).
  15. Hirayama, A., Wakayama, M., Soga, T. Metabolome analysis based on capillary electrophoresis-mass spectrometry. Trac-Trend Anal Chem. 61, 215-222 (2014).
  16. Maxwell, E. J., Chen, D. D. Twenty years of interface development for capillary electrophoresis-electrospray ionization-mass spectrometry. Anal Chim Acta. 627, 25-33 (2008).
  17. Bonvin, G., Schappler, J., Rudaz, S. Capillary electrophoresis-electrospray ionization-mass spectrometry interfaces: fundamental concepts and technical developments. J Chromatogr A. 1267, 17-31 (2012).
  18. Hirayama, A., Tomita, M., Soga, T. Sheathless capillary electrophoresis-mass spectrometry with a high-sensitivity porous sprayer for cationic metabolome analysis. Analyst. 137, 5026-5033 (2012).
  19. Bonvin, G., Schappler, J., Rudaz, S. Non-aqueous capillary electrophoresis for the analysis of acidic compounds using negative electrospray ionization mass spectrometry. J Chromatogr A. 1323, 163-173 (2014).
  20. Moini, M. Simplifying CE-MS operation. 2. Interfacing low-flow separation techniques to mass spectrometry using a porous tip. Anal Chem. 79, 4241-4246 (2007).
  21. Dettmer, K., et al. Metabolite extraction from adherently growing mammalian cells for metabolomics studies: optimization of harvesting and extraction protocols. Anal Bioanal Chem. 399, 1127-1139 (2011).
Biyolojik Numune metabolik profil için Sheathless Kapiler Elektroforez-Kütle Spektrometre
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhang, W., Gulersonmez, M. C., Hankemeier, T., Ramautar, R. Sheathless Capillary Electrophoresis–Mass Spectrometry for Metabolic Profiling of Biological Samples. J. Vis. Exp. (116), e54535, doi:10.3791/54535 (2016).More

Zhang, W., Gulersonmez, M. C., Hankemeier, T., Ramautar, R. Sheathless Capillary Electrophoresis–Mass Spectrometry for Metabolic Profiling of Biological Samples. J. Vis. Exp. (116), e54535, doi:10.3791/54535 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter