Summary
De on-bead werkwijze voor het labelen van antilichamen met kleine moleculen maakt het kenmerken van een kleine hoeveelheid antilichamen rechtstreeks uit celmedium. Deze methode is geschikt amine en thiol chemie, en kan meerdere monsters tegelijkertijd, handmatig of met geautomatiseerde platforms.
Abstract
Antilichamen die zijn gemerkt met kleine moleculen zoals fluorescerende kleurstoffen, cytostatica en radioactieve tracers zijn essentiële instrumenten in het biomedisch onderzoek, immunodiagnostiek en meer recentelijk als therapeutische middelen. Traditionele methoden voor het labelen van antilichamen met kleine moleculen vereisen gezuiverde antilichamen bij relatief hoge concentratie, betrekking hebben op meerdere dialyse stappen en hebben beperkte verwerkingscapaciteit. Toch zijn er verschillende toepassingen, waaronder het gebied van antilichaam Drug Conjugaten (ADC), zullen profiteren van nieuwe methoden die de etikettering van antilichamen direct van cel media zal toestaan. Dergelijke werkwijzen kunnen toestaan antilichamen worden gescreend in biologisch relevante assays, bijvoorbeeld, de receptor-gemedieerde internalisatie antilichaam assay bij ADCs. Hier beschrijven we een werkwijze (on-bead methode) die kenmerken van kleine hoeveelheden antilichamen maakt rechtstreeks uit celmedium. Deze aanpak maakt gebruik van een hoge capaciteit magnetische proteïne A en proteïne G affiniteit kralen om antilichamen te vangenuit de cel media gevolgd door merken met kleine moleculen met behulp van amine of thiol chemie en daaropvolgende elutie van gelabelde antilichamen. Het nemen van fluorescerende kleurstoffen als surrogaat voor kleine moleculen, tonen we de on-bead etikettering van drie verschillende muis antilichamen direct van cel media met behulp van zowel amine en thiol etikettering chemie. De hoge bindingsaffiniteit van antilichamen aan Proteïne A en Proteïne G zorgt voor een hoge terugwinning en hoge zuiverheid van de gelabelde antilichamen. Bovendien, het gebruik van magnetische korrels kunnen meerdere monsters handmatig worden gehanteerd, waardoor een aanzienlijke verbetering labeling doorvoer.
Introduction
Antilichamen gelabeld met kleine moleculen zijn misschien de meest gebruikte reagentia in de biologie 1,2. Antilichamen gelabeld met fluorescente kleurstoffen en biotine worden veel gebruikt in de beeldvorming, immunoassays, flowcytometrie, Western blots, immuunprecipitatie en onder andere toepassingen 3-6. Radiogelabelde antilichamen 3,7 vinden veel toepassing bij beeldvorming en therapie, antilichamen gelabeld met cytotoxische geneesmiddelen (ADCs) bieden nieuwe mogelijkheden voor de behandeling van kanker, en twee ADCs zijn reeds goedgekeurd voor therapeutisch gebruik 8. Ondanks hun veelvuldig gebruik zijn de methoden voor het labelen van antilichamen verrassend ongewijzigd gebleven en meestal meerdere reacties te betrekken en ontzouting stappen 9-12. Oplossing methoden werken heel goed in gevallen waar slechts een paar antilichamen moeten worden geëtiketteerd en zijn verkrijgbaar in zeer gezuiverde vorm bij hoge concentratie en in voldoende volumes. Voor nieuwere toepassingen zoals ADC, is er eenmoeten antilichamen etiketteren vroeg stadium hybridoma zodat ze kunnen worden gescreend op biologisch relevante eigenschappen, bijvoorbeeld receptor-gemedieerde internalisatie antilichaam 13-16. Voor deze hybridoma stadium monstervolumes beperkt, antilichamen uitgedrukt bij lage concentraties en een aantal monsters zijn groot, dus oplossing gebaseerde labeling niet geschikt zijn.
Ter vereenvoudiging en verbetering van de doorvoer van de traditionele labeling antilichamen gebaseerde methoden, hebben een aantal alternatieve benaderingen voorgesteld 17,18. Een benadering is niet-magnetische proteïne A gebruikt affiniteitskorrels verpakt in kleine kolommen antilichamen gevolgd door de labelingsreactie en elutie van gelabelde en gezuiverd eiwit vangen. Deze methode kan worden gebruikt om antilichamen direct labelen van cel media, is het gebruik van kolommen moeizaam. Een magnetische korrel gebaseerde werkwijze is recentelijk gerapporteerd dat 19 het gebruik van kolommen elimineert en verbetert de doorvoer maar doorde beperkte antilichaambinding capaciteit van de korrels konden alleen lage nanogram tot microgram hoeveelheden van de antilichamen worden gelabeld.
We hebben onlangs ontwikkeld en gebruikt hoge capaciteit magnetische Proteïne A en Proteïne G parels (> 20 mg humaan IgG / ml vaste korrels) antilichamen aanwezig in celmedium met 20 kleine moleculen te labelen. De hoge capaciteit van de korrels maakt tientallen tot honderden microgram antilichaam gemakkelijk worden gemerkt en de snelle respons van de magnetische kralen vereenvoudigt behandeling en verwerking van een groot aantal monsters in parallel. Het gebruik van fluorescerende kleurstoffen als surrogaat voor kleine moleculen, laten we zien dat de methode is compatibel met de etikettering chemie amine en thiol en biedt een hoge terugvorderingen van gemerkt en zeer zuiver antilichamen.
Dit protocol en de bijbehorende video beschrijven on-bead etikettering van muizenantilichamen in de cel media met magnetische Proteïne A en Proteïne G parels. Het protocol isverdeeld in vier delen: Deel 1 beschrijft de verovering van antilichamen op de hiel van biologische monsters. Naar aanleiding van capture, wordt de etikettering van antilichamen met een fluorescerende kleurstof met behulp van amine chemie of met behulp van thiol chemie beschreven in rubriek 2 en deel 3, respectievelijk. Tenslotte worden in hoofdstuk 4 beschrijft de werkwijze voor de berekening van de antilichaamconcentratie en de kleurstof antilichaam verhouding.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Antibody Capture naar High Capacity Magnetic Proteïne A of magnetische proteïne G Beads
- Gelijkmatig opnieuw te schorten magnetische korrels door zacht schudden. Houd de schorsing uniform wanneer aliquoting kralen.
- Voeg 50 ul kraal slurry naar een 1,5 ml microcentrifugebuis. Plaats de magnetische standaard voor 10 sec. Verwijder de opslag buffer voorzichtig.
- Voeg 250 gl antilichaam bindingsbuffer.
- Mengen en in de magnetische standaard voor 10 sec. Verwijder de binding buffer voorzichtig.
- Voeg 1,0 ml van het monster met 50-100 ug antilichaam aan de beads. De monsters kunnen worden gezuiverd antilichamen of antilichamen in celmedium.
- Meng monster gedurende 60 minuten bij kamertemperatuur met behulp van een vortex mixer of end-over-end mixer.
- Plaats de buis in de magnetische stand gedurende 10 seconden en verwijder het supernatant.
- Voeg 250 ul antilichaam binding / wasbuffer en meng. Plaats in de magnetische stand gedurende 10 seconden en verwijder binding / wasbuffer. Herhaal dit sTep voor een totaal van twee wassen.
- Ga verder naar deel 2 te label antilichamen met behulp van amine chemie of hoofdstuk 3 tot en met label antilichamen met behulp van thiol chemie.
2. Antibody Labeling Met behulp van Amine Chemie
- conjugaat Antibody
- Voeg 100 gl buffer amine conjugatie aan de korrels.
- Los het amine-reactieve fluorescerende kleurstoffen (AlexaFluor 532-SE) en 10 mg / ml door toevoeging van 100 gl dimethylsulfoxide (DMSO) om 1,0 mg kleurstof. Meng door vortexen. Maak deze oplossing vlak voor gebruik.
- Voeg 2,5 ul van amine-reactieve kleurstof van 100 ug antilichaam.
Noot: Typisch een 5-20 molaire overmaat reactieve kleurstof wordt aanbevolen. Echter hoeveelheid reactieve kleurstof toegevoegd aan het reactiemengsel moet empirisch worden geoptimaliseerd afhankelijk van de gewenste kleurstof antilichaam verhouding en intrinsieke eigenschappen antilichaam. - Meng monster gedurende 60 minuten bij kamertemperatuur met behulp van een vortex mixer of end-over-end mixer. Zorg ervoor dat de kralen in suspensio blijvenn.
- Plaats de buis in de magnetische stand gedurende 10 seconden en verwijder het supernatant.
- Voeg 250 ul antilichaam binding / wasbuffer en meng. Plaats de magnetische standaard voor 10 sec. Verwijder en gooi binding / wasbuffer. Herhaal deze stap voor een totaal van twee wassen.
- antilichaam Recovery
- Voeg 50 ul elutiebuffer aan de korrels.
- Meng gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur met behulp van een vortex mixer of end-over-end mixer. Zorg ervoor dat de parels in suspensie blijven.
- Plaats buis in de magnetische stand voor 10 sec. Verwijder geëlueerde monster en overdracht naar een nieuwe micro-centrifugebuis met 5 pl neutralisatie buffer.
- Herhaal dit proces nog een keer en het zwembad het geëlueerde monsters.
- Kwantificeren het antilichaam concentratie en kleurstof-to-antilichaam-verhouding, zoals beschreven in hoofdstuk 4.
3. Antibody Labeling Met behulp van thiol chemie
- antilichaam Reduction
- Voeg 250 ulvan thiol vervoeging buffer en mix. Plaats de buis in de magnetische stand voor 10 sec. Verwijder de buffer. Herhaal deze stap twee keer.
- Voeg 100 ul van thiol vervoeging buffer.
- Voeg dithiothreitol (DTT) tot een uiteindelijke concentratie van 2,5 mM.
- Meng monster gedurende 60 minuten bij kamertemperatuur met behulp van een vortex mixer of end-over-end mixer. Zorg ervoor dat de parels in suspensie blijven.
- Plaats de buis in de magnetische stand voor 10 sec en gooi de buffer.
- Voeg 250 gl thiol conjugatie buffer en meng. Plaats de buis in de magnetische stand voor 10 sec. Verwijder de buffer. Herhaal deze stap voor een totaal van twee wassen.
- Voeg 100 ul van thiol vervoeging buffer.
- conjugaat Antibody
- Los het thiol-reactieve kleurstof bij 10 mg / ml door toevoeging van 100 ul DMSO 1,0 mg kleurstof. Meng door vortexen. Maak deze oplossing vlak voor gebruik.
- Voeg 2,5 pl thiol-reactieve kleurstof van 100 ug antilichaam.
Noot: Typisch een 5-20 molaire overmaat reactieve kleurstof wordt aanbevolen. Echter hoeveelheid reactieve kleurstof toegevoegd aan het reactiemengsel moet empirisch worden geoptimaliseerd afhankelijk van de gewenste kleurstof antilichaam verhouding en intrinsieke eigenschappen antilichaam. - Meng monster gedurende 60 minuten bij kamertemperatuur met behulp van een vortex mixer of end-over-end mixer. Zorg ervoor dat de parels in suspensie blijven.
- Plaats de buis in de magnetische stand voor 10 sec en verwijder supernatant.
- Voeg 250 gl thiol conjugatie buffer en meng. Plaats de magnetische standaard voor 10 sec en verwijder de buffer. Herhaal deze stap voor een totaal van twee wassen.
- Elueer Antibody
- Voeg 50 ul elutiebuffer aan de korrels.
- Meng gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur met behulp van een vortex mixer of end-over-end mixer. Zorg ervoor dat de parels in suspensie blijven.
- Plaats buis in de magnetische stand voor 10 sec. Verwijder geëlueerde monster en overdracht naar een nieuwe micro-centrifugebuis bevattende 5 ui neutralization buffer.
- Herhaal dit proces nog een keer en het zwembad het geëlueerde monsters.
- Kwantificeren het antilichaam concentratie en kleurstof-to-antilichaam-verhouding, zoals beschreven in hoofdstuk 4.
4. Bereken Dye-to-Antibody Ratio
- Meet de absorptie van het antilichaam-conjugaat kleurstof bij 280 nm (A280) en bij de Amax van de kleurstof (Amax).
- Bereken het antilichaam concentratie:
Antilichaam Concentratie (mg / ml) = A280 - (Amax x CF) / 1,4
waarbij CF = correctiefactor van de kleurstof (verstrekt door de fabrikant). - Bereken de kleurstof tot antilichaam verhouding:
Dye-to-antilichaam verhouding (DAR) = (A max x 150.000) / Ab Concentratie (mg / ml) x ε kleurstof
wanneer kleurstof ε = de extinctiecoëfficiënt van de kleurstof op zijn maximale absorptie en molecuulgewicht van antilichaam = 150.000 Da.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Een schema voor het labelen van antilichamen met kleine moleculen met behulp van hoge capaciteit magnetische Proteïne A en Proteïne G parels wordt getoond in figuur 1. Antilichamen gevangen op de magnetische proteïne G kralen kunnen met kleine moleculen worden gelabeld, bijvoorbeeld fluorescente kleurstoffen, met behulp van aminechemie welke labels primaire aminen met de lysine aminozuren of middels thiolchemie welke labels aan de gereduceerde thiolen in het scharniergebied van de antilichamen. Affiniteit tussen antilichamen en Proteïne G is sterk 21 en resulteert in een minimaal verlies van antilichaam tijdens de labelingsreactie. Dit wordt weerspiegeld in de efficiënte terugwinning (50-90%) van drie verschillende muizen antilichaam isotypen (Tabel 1) na labeling met fluorescerende kleurstoffen in vergelijking met eenvoudige zuivering. Efficiënte invordering (vergelijkbaar met dat gemeld vóór 19) is ook duidelijk in de Coomassie gels (figuur 2) waar de band intensiveringbanden van de zware en lichte ketens van de gezuiverde antilichamen en gemerkte antilichamen weerspiegelen de in tabel 1 resultaat. Magnetische Proteïne G parels hebben lage niet-specifieke binding eigenschappen resulteert in sterk gezuiverde antilichamen zoals in de Coomassie gel (figuur 2) en beide de zware en lichte ketens worden fluorescent gelabelde (figuur 2). On-bead labeling kan ook worden uitgevoerd op magnetische Proteïne A kralen en is compatibel met verschillende fluorescente kleurstoffen resulteert in een hoge terugwinning en goede kleurstof antilichaam verhoudingen (Tabel 2).
Figuur 1. Schematische voorstelling van on-bead labeling van antilichamen met fluorescerende moleculen. (A) antilichaam labeling gebruikt thiol chemie. Antilichamen worden vastgelegd op een hoge capaciteit magnetische proteïne A of magnetische proteïne G beads gevolgd door reductie van de inter-keten disulfidebindingen middels reductiemiddelen zoals DTT of tris (2-carboxyethyl) fosfine (TCEP). Thiol-reactieve maleïmide bevattende fluorescerende kleurstoffen worden toegevoegd label antilichamen. Gelabelde antilichamen worden teruggewonnen door een lage pH elutie en direct geneutraliseerd. (B) antilichaam labeling gebruikt aminechemie. Antilichamen vastgelegd op hoge capaciteit magnetische Proteïne A en Proteïne G parels reageren met amine-reactieve fluorescente kleurstoffen antilichamen etiketteren de primaire aminen met lysines. Gelabelde antilichamen worden geëlueerd bij lage pH elutie en direct geneutraliseerd. Aangepast van Nath, N. et al. 20 Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Denaturing SDS-PAGE gel beelden van drie muizen IgG isotypen gezuiverd en gelabeld met AlexaFluor 532, via on-bead methode. (A) aminereactieproduct (B) thiol reactie. Gelbeelden van antilichamen gemerkt met thiol-reactieve kleurstof. Lanen 1-6 overeen met de in Tabel 1 monsters. Gels werden eerst afgebeeld met fluorescerende scanner en tonen slechts AlexaFluor 532 gemerkt antilichaam zware en lichte ketens. Monsters waarbij antilichamen alleen werden gezuiverd zijn niet zichtbaar. Gels werden vervolgens gekleurd met Coomassie kleuring zware en lichte ketens van antilichamen die in kaart waren gezuiverd zoals antilichamen die gelabeld tonen. Aangepast van Nath, N. et al. 20 Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| aminereactieproduct | thiol Reaction | |||||
| Goed | isotype | Antilichaam Recovery (ug) | Dye naar Antibody Ratio | Antilichaam Recovery (ug) | Dye naar Antibody Ratio | |
| 1 | muis IgG1 | Zuivering | 54,8 ± 1,8 | 0 | 49,2 ± 2,0 | 0 |
| 2 | Conjugatie | 27,4 ± 3,2 | 4.2 ± 0.2 | 46,2 ± 3,5 | 1.6 ± 0.2 | |
| 3 | muizen IgG2a | Zuivering | 85,9 ± 6,4 | 0 | 75,3 ± 8,0 | 0 |
| 4 | Conjugatie | 60,7 ± 3,2 | 4,4 ± 0,1 | 61,5 ± 7,4 | 5,5 ± 0,4 | |
| 5 | muis IgG2b | Zuivering | 79,9 ± 6,9 | 0 | 73,3 ± 1,4 | 0 |
| 6 | Conjugatie | 66,7 ± 0,5 | 5.6 ± 0.1 | 55,7 ± 0,9 | 5.2 ± 0.5 | |
Tabel 1:. On-bead labeling van drie muizen IgG isotypen direct van cel media met amine en thiol chemie Per monster een aliquot van 1,0 ml celmedium werd gebruikt voor zuivering van antilichamen onder gebruikmaking van magnetische Proteïne G parels (50 pl suspensie) en tweede hoeveelheid werd gebruikt voor on-bead labeling met amine-reactieve AlexaFluor 532 kleurstof. Antilichaam herstel in beide gevallen berekend (zoals beschreven in de tekst) eenD in vergelijking met antilichaam verliezen tijdens labeling reactie te bepalen. Kleurstof antilichaam verhouding werd ook berekend voor alle drie de antilichamen. Alle reacties werden uitgevoerd in drievoud. Aangepast van Nath, N. et al. 20
| Magnetic Protein G Beads | Magnetische Proteïne A kralen | ||||
| Antilichaam Recovery (ug) | Dye antilichaam Ratio | Antilichaam Recovery (ug) | Dye antilichaam Ratio | ||
| 1 | Zuivering | 263,7 ± 10,4 | 0 | 269,4 ± 5.1 | 0 |
| 2 | AlexaFluor532 | 182,9 ± 15,3 | 5.377; 0.04 | 189,1 ± 6,9 | 6,9 ± 0,2 |
| 3 | AlexaFluor647 | 192,5 ± 2.9 | 3.3 ± 0.1 | 112,3 ± 11,4 | 3.6 ± 0.2 |
| 4 | fluoresceïne | 179,5 ± 5.3 | 6,8 ± 0,1 | 201,5 ± 6.5 | 6,8 ± 0,1 |
Tabel 2:. On-bead etikettering van muizen IgG2a met drie verschillende thiol-reactieve fluorescerende kleurstoffen Geconcentreerde celmedium monsters werden in dit experiment om deze methode tonen ook voor verschillende hoeveelheid antilichaam worden vastgesteld. Daarnaast werden conjugatiereacties uitgevoerd gebruikmakend van magnetische proteïne G en magnetische Proteïne A. Een portie van 1,0 ml geconcentreerde celmedium werd gebruikt voor antilichaamzuivering middels magnetische Proteïne G parels (100 pl suspensie). Drie andere 1,0 ml aliquots werden gelabeld en gezuiverd met thiol-reactieve AlexaFluor 532, AlexaFluor 647 en Fluoresceïne. Antilichaam herstel werd berekend (zoals beschreven in de tekst) en vergeleken voor verschillende labelingsreacties. Kleurstof antilichaam verhouding werd ook berekend voor alle drie fluorescente kleurstoffen. Vergelijkbare zuivering en labeling werd gedaan met behulp van Magnetic Proteïne A kralen. Alle reacties werden uitgevoerd in drievoud. Aangepast van Nath, N. et al. "20
| Buffer | Opmerkingen / Omschrijving |
| Amine conjugatie buffer (10 mM natriumbicarbonaat buffer, pH 8,5) | 1. 0,084 g natriumbicarbonaat 2. Los in gedemineraliseerd water. Op pH 8,5. 3. Stel het uiteindelijke volume op 100 ml met gedeïoniseerd water. |
| Thiol conjugatie buffer (10 mM fosfaat buffer met 1 mM EDTA, pH 7.0) | 1. 0,0378 g natriumfosfaat, monobasisch monohydraat 2. 0,195 g natriumfosfaat, dibasisch, heptahydraat 3. Los op in gedemineraliseerd water. 4. Voeg EDTA tot een eindconcentratie van 1,0 mM. 5. Stel tot pH 7. 6. Stel het uiteindelijke volume op 100 ml met gedeïoniseerd water. |
| Antilichaam binding / wasbuffer (10 mM fosfaatbuffer, pH 7,0) | 1. 0,0378 g natriumfosfaat, monobasisch monohydraat 2. 0,195 g natriumfosfaat, dibasisch, heptahydraat 3. Los op in gedemineraliseerd water. Op pH 7. 4. Stel het uiteindelijke volume op 100 ml met gedeïoniseerd water. |
| Elutiebuffer (50 mM glycinebuffer, pH 2,7) | 1. 0,188 g glycine 2. Los in gedemineraliseerd water. Stel de pH tot 2,7 met HCl. 3. Stel het uiteindelijke volume op 50 ml met gedeïoniseerd water. |
| Neutralisatie buffer (2 M Tris buffer, pH 7,5) | 1. 0,472 gTrizma base 2. 2,54 g trizma hydrochloride 3. Los op in gedemineraliseerd water. Op pH 7,5. 4. Stel het uiteindelijke volume op 10 ml met gedeïoniseerd water. |
Tabel 3: Buffer samenstellingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het doel van deze studie was om een methode om antilichamen aanwezig in het celmedium bij lage concentraties label, met een verscheidenheid aan kleine moleculen te ontwikkelen. Een dergelijke werkwijze zal een groot aantal antilichamen, tijdens de vroege stadia van antilichaam ontdekking mogelijk, te voorzien van kleine moleculen en gezeefd onder toepassing van een biologisch relevante assay. Een dergelijke test is de receptor-gemedieerde internalisatie antilichaam assay waarbij internalisatie kan variëren tussen antilichamen ook met gelijke bindingsaffiniteiten. Daarom is het belangrijk dat antilichamen die specifiek screenen op hun internalisatie eigenschappen naast de traditionele Enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) screening. De belangrijkste eisen voor de methode om antilichamen te labelen in het antilichaam ontwikkelingsfase vroeg zijn: a) het vermogen om antilichamen direct van cel media bestempelen; b) het vermogen om antilichamen aanwezig in lage concentraties label, bijvoorbeeld wanneer de antilichaamconcentratie in celmedium is 50 ug / ml; c)zuiverheid van het gemerkte antilichaam en antilichaamconcentratie moeten verenigbaar zijn met stroomafwaartse toepassingen; d) de methode moet compatibel met zowel amine en thiol gebaseerd vervoeging chemie; e) de methode moet compatibel zijn met gelijktijdig verwerken van meerdere monsters.
Gezien deze eisen, ontwikkelden we een on-bead antilichaam labeling en zuiveringswerkwijze met behulp van hoge capaciteit magnetische Proteïne A en Proteïne G parels. Deze kralen zijn gebaseerd op hydrofiele cellulose met lage niet-specifieke bindingseigenschappen en resulteren in zeer zuivere antilichaampreparaat zoals getoond in figuur 2. De hoge capaciteit van de kralen betekent dat een kleine hoeveelheid korrels efficiënt antilichamen vastleggen van de media en antilichamen kunnen worden geëlueerd in een klein volume geconcentreerd waardoor de antilichamen. In Tabel 1, alleen 10 gl vaste parels werden gebruikt om antilichamen uit 1,0 ml monsters (verwachten concentraties 50-100 ug / ml) een vastleggend gemerkte antilichamen werden geëlueerd in 120 ul volume concentraties van 200-500 ug / ml. Deze concentraties zijn compatibel met celgebaseerde internalisatie experimenten waarbij typische antilichaamconcentraties variëren van 1,0 ug / ml tot 10 ng / ml 15,16. De labeling methode on-kraal is compatibel met zowel amine en thiol chemie en uiteenlopende kleurstof-to-antilichaam verhoudingen kunnen worden bereikt met een efficiënte terugwinning van de gemerkte antilichamen (tabel 1). Experimenten werden uitgevoerd in drievoud en maximaal 12 monsters gelijktijdig handmatig verwerkt, aanzienlijk te verminderen verwerkingstijd. De overslag van de etikettering kan verder worden verhoogd door het gebruik van robotachtige platforms zoals het in andere toepassingen met behulp van magnetische bolletjes 19,22 aangetoond.
Monsters met een grotere hoeveelheid antilichaam kan gemakkelijk worden opgevangen door de hoeveelheid kralen gebruikt voor het vangen terwijl de antilichaam herstel en etikettering EFFICIËncy (Tabel 2). De werkwijze is ook geschikt voor meerdere kleurstoffen zodat verschillende kleurstof antilichaam conjugaten kunnen worden gemaakt, echter kleurstof-to-antilichaam verhoudingen moeten worden geoptimaliseerd. Kleurstof antilichaam verhouding van 2-4 is bepaalde optimale 11,12 zijn en bij erkende ADCs gemiddeld 3,5 geneesmiddelen per antilichaam is gerapporteerd 23. Met on-bead conjugatiechemie, is het relatief eenvoudig te stemmen een optimaal aantal kleine moleculen per antilichaam afhankelijk van de eisen van de stroomafwaartse toepassing. Bovendien kunnen zowel het thiol en amine chemie voor etikettering worden getest om de beste chemie optie die essentieel is voor ADCs omdat is aangetoond dat antigeen en receptorbinding, in vivo stabiliteit te bepalen en therapeutische activiteit van antilichaam afhankelijk van de conjugatiechemie 24 , 25.
Er zijn een aantal belangrijke factoren om een goede antilichaam etikettering en herstel te bereiken. Eigenschappen van de kleine moleculen eenopnieuw de kritische driver voor zowel het antilichaam herstel en kleurstof antilichaam ratio. Een hydrofoob klein molecuul, zal hoog kleurstof antilichaam verhouding aspecifieke kleven van het gemerkte antilichaam aan de hiel en een aanzienlijk verlaagde antilichaam herstel veroorzaken. Soms, afhankelijk van de kleurstof en antilichaam kenmerken, vonden we dat een kraal beter dan de andere daarmee kan werken, kan het testen van zowel de korrels tijdens optimalisering nuttig. Proteïne A en proteïne G hebben verschillende affiniteiten voor 21 antilichamen van verschillende soorten en verschillende subtypes, die moet worden overwogen bij het kiezen van de juiste parels. Bijvoorbeeld proteïne A heeft een lage affiniteit voor muizen IgG1 dus Proteïne G parels wordt sterk aanbevolen. Voor thiol chemie, DTT en TCEP reductiemiddelen werken even goed. DTT zal echter interfereren met de maleimide reactiemengsel derhalve moet volledig worden verwijderd door wassen. Lage pH van 2,7 wordt aanbevolen voor elutie, maar lagere pH van 2,2 kan nodig zijn voor efficiënte recOvery in sommige gevallen. Voor gemerkte antilichamen die denatureren bij lage pH een evenwicht tussen efficiënte terugwinning en functionaliteit antilichaam moet empirisch worden bepaald. Het is bekend dat de chemie etikettering antilichaam-antigen bindingsactiviteit 11,23 kunnen beïnvloeden, dus is het absoluut noodzakelijk om te testen op functionaliteit antilichaam na labelen met behulp gewenste stroomafwaartse toepassing.
Samengevat beschrijven we een werkwijze om antilichamen met fluorescerende kleurstoffen rechtstreeks van de celmedium labelen zonder voorafgaande zuiveringsstappen. Deze methode maakt gebruik van hoge capaciteit magnetische Proteïne A en Proteïne G parels en is een aanzienlijke verbetering ten opzichte oplossing gebaseerd labelmethode en die zeer gezuiverde antilichamen bij hoge concentraties 10,11. Het gebruik van magnetische korrels maakt handmatige en automatische monsterbehandeling, wat een voordeel is ten opzichte van niet-magnetische korrels gebaseerde labeltechnieken 17,18. Tenslotte, het gebruik van hoge capaciteit beads laten opschaling van etikettering antilichaam reactie van lage microgram niveaus om honderden microgram gebruik van kleine hoeveelheden kralen en onderscheidt deze methode van andere magnetische bolletje gebaseerd etikettering methoden 19. De hier gepresenteerde protocol beschrijft labeling van antilichamen met fluorescente kleurstoffen, maar de werkwijze kan worden uitgebreid tot andere labels zoals biotine, cytostatica en eventueel enzymen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Magne Protein A Beads | Promega Corporation | G8781 | |
| Magne Protein G Beads | Promega Corporation | G7471 | |
| AlexaFluor 532-SE (Succinimidyl Ester) | Life Technologies | A20001 | |
| AlexaFluor 532-ME (Malemide) | Life Technologies | A10255 | |
| AlexaFluor 647-ME (Maleimide) | Life Technologies | A20347 | |
| Fluorescein-ME (Maleimide) | Life Technologies | F-150 | |
| Magnetic Stand | Promega | Z5332 |
References
- Colwill, K., Graslund, S. Renewable Binder Working Group. A roadmap to generate renewable protein binders to the human proteome. Nat Methods. 8 (7), 551-558 (2011).
- Silverstein, A. M. Labeled antigens and antibodies: the evolution of magic markers and magic bullets. Nat Immunol. 5 (12), 1211-1217 (2004).
- Day, J. J., et al. Chemically modified antibodies as diagnostic imaging agents. Curr Opin Chem Biol. 14 (6), 803-809 (2010).
- Cunningham, R. E. Overview of flow cytometry and fluorescent probes for flow cytometry. Methods Mol Biol. 588, 319-326 (2010).
- Eaton, S. L., et al. A guide to modern quantitative fluorescent western blotting with troubleshooting strategies. J Vis Exp. (93), e52099 (2014).
- Dundas, C. M., Demonte, D., Park, S. Streptavidin-biotin technology: improvements and innovations in chemical and biological applications. Appl Microbiol Biotechnol. 97 (21), 9343-9353 (2013).
- Kraeber-Bodere, F., et al.
- Leal, M., et al. Antibody-drug conjugates: an emerging modality for the treatment of cancer. Ann N Y Acad Sci. 1321, 41-54 (2014).
- Drachman, J. G., Senter, P. D. Antibody-drug conjugates: the chemistry behind empowering antibodies to fight cancer. Hematology Am Soc Hematol Educ Program. 2013, 306-310 (2013).
- Hermanson, G. T. Bioconjugate Techniques. , Academic Press. 380-382 (1996).
- Shrestha, D., Bagosi, A., Szollosi, J., Jenei, A. Comparative study of the three different fluorophore antibody conjugation strategies. Anal Bioanal Chem. 404 (5), 1449-1463 (2012).
- Vira, S., Mekhedov, E., Humphrey, G., Blank, P. S. Fluorescent-labeled antibodies: Balancing functionality and degree of labeling. Anal Biochem. 402 (2), 146-150 (2010).
- Isa, M., et al. High-throughput screening system to identify small molecules that induce internalization and degradation of HER2. ACS Chem Biol. 9 (10), 2237-2241 (2014).
- Liao-Chan, S., et al. Quantitative assessment of antibody internalization with novel monoclonal antibodies against Alexa fluorophores. PLoS One. 10 (4), e0124708 (2015).
- Riedl, T., van Boxtel, E., Bosch, M., Parren, P. W., Gerritsen, A. F. High-Throughput Screening for Internalizing Antibodies by Homogeneous Fluorescence Imaging of a pH-Activated Probe. J Biomol Screen. 21 (1), 12-23 (2016).
- Nath, N., et al. Homogeneous plate based antibody internalization assay using pH sensor fluorescent dye. J Immunol Methods. 431, 11-21 (2016).
- Lundberg, E., Sundberg, M., Graslund, T., Uhlen, M., Svahn, H. A. A novel method for reproducible fluorescent labeling of small amounts of antibodies on solid phase. J Immunol Methods. 322 (1-2), 40-49 (2007).
- Strachan, E., et al.
- Dezfouli, M., et al. Magnetic bead assisted labeling of antibodies at nanogram scale. Proteomics. 14 (1), 14-18 (2014).
- Nath, N., Godat, B., Benink, H., Urh, M. On-bead antibody-small molecule conjugation using high-capacity magnetic beads. J Immunol Methods. 426, 95-103 (2015).
- Lund, L. N., et al. Exploring variation in binding of Protein A and Protein G to immunoglobulin type G by isothermal titration calorimetry. J Mol Recognit. 24 (6), 945-952 (2011).
- Safarik, I., Safarikova, M. Magnetic techniques for the isolation and purification of proteins and peptides. Biomagn Res Technol. 2 (1), 7 (2004).
- Flygare, J. A., Pillow, T. H., Aristoff, P. Antibody-drug conjugates for the treatment of cancer. Chem Biol Drug Des. 81 (1), 113-121 (2013).
- Shen, B. Q., et al. Conjugation site modulates the in vivo stability and therapeutic activity of antibody-drug conjugates. Nat Biotechnol. 30 (2), 184-189 (2012).
- Acchione, M., Kwon, H., Jochheim, C. M., Atkins, W. M. Impact of linker and conjugation chemistry on antigen binding, Fc receptor binding and thermal stability of model antibody-drug conjugates. MAbs. 4 (3), 362-372 (2012).
