Summary
küçük moleküller ile antikorlar için etiketleme üzerine boncuk yöntem doğrudan hücre ortamından antikorlar, az miktarda etiketleme sağlar. Bu yöntem amin ve tiyol kimyası ile uyumlu ve paralel olarak çoklu örnekleri, elle veya otomatik platformları kullanarak işleyebilir.
Abstract
Floresan boyalar, sitotoksik ilaçlar ve radyoaktif iz gibi küçük moleküller ile işaretlenmiş olan antikorlar, esas biyomedikal araştırmalarda araçları, bağışıklıkla ilgili tanı ve daha yakın olarak terapötik maddelerdir. küçük moleküller ile markalama antikorlar için geleneksel yöntemler, nispeten yüksek bir konsantrasyonda antikor saflaştınldı birden diyaliz adımları içerir ve veri akışını sınırlı gerektirir. Ancak, Antikor İlaç Eşlenikleri (ADC) alanında olmak üzere çeşitli uygulamalar, hücre ortamından doğrudan antikorların etiketleme sağlayacak yeni yöntemler yararlanacaktır. Bu tür yöntemler antikorlar örneğin, biyolojik olarak uygun deneylerde taranabilir izin verebilir, ADC'ler halinde reseptör aracılı antikor, geliştirilmiş içselleştirme deneyi. Burada, doğrudan hücre ortamından antikorlar küçük miktarlarda etiketleme sağlayan bir yöntem olup (on-boncuk yöntemi) tarif eder. Bu yaklaşım antikorları yakalamak için yüksek kapasiteli manyetik Protein A ve Protein G afinite boncuklar kullanıramin veya tiyol kimya ve etiketlenmiş antikorlar daha sonra elüsyon kullanılarak küçük moleküller ile etiketleme ve ardından hücre ortamından. küçük moleküller için suretler olarak floresan boyalar alırsak, biz doğrudan amin ve tiyol etiketleme kimyası her ikisini de kullanarak hücre medyadan üç farklı fare antikorları on-boncuk etiketleme göstermektedir. Protein A ve Protein G antikorların yüksek bağlanma afinitesi, yüksek geri kazanımlar olarak etiketlenmiş antikorların yüksek saflıkta sağlar. Buna ek olarak, manyetik boncuk kullanımı çoklu numuneler önemli oranda markalama verimliliği arttırır, elle kullanılmasına izin verir.
Introduction
Küçük moleküller ile etiketli antikorlar, belki de biyoloji 1,2 en yaygın olarak kullanılan reaktiflerdir. Floresan boyalar ve biyotin ile etiketlenmiş antikorlar yoğun diğer uygulamalar 3-6 arasında sitometrisi Western blot ve immüno-çökeltme, akış görüntüleme, bağışıklık kullanılır. Radyoaktif işaretli antikorlar 3,7 kanserlerin tedavisi için yeni seçenekler sunuyoruz, ve iki ADC zaten terapötik kullanım 8 için onaylanmıştır görüntüleme ve tedavi, sitotoksik ilaçlar (ADK) ile etiketlenmiş antikorlar yaygın kullanım bulmaktadır. Bunların yaygın kullanımı olmasına rağmen, etiketleme antikorlar için yöntemler şaşırtıcı değişmemiş ve tipik olarak çok sayıda reaksiyonlar içerir ve tuz giderme 9-12 aşama vardır. Çözüm yöntemleri sadece birkaç antikorlar etiketlenmesi gerekir ve yüksek konsantrasyonda yüksek arıtılmış formda mevcut olduğu durumlarda ve yeterli hacimlerde çok iyi çalışmaz. Ancak, ADK gibi yeni uygulamalar için, orada birBunlar, örneğin, reseptör aracılı antikor, geliştirilmiş içselleştirme 13-16 için, biyolojik olarak uygun özellikler için taranabilir erken böylece hibridom aşamasında antikorlar etiket gerekir. hibridom aşamada, numune hacimleri antikorlar düşük konsantrasyonlarda ifade numune sayısı dolayısıyla çözelti bazlı etiketleme yöntemleri uygun değildir, büyük olan, sınırlıdır.
Basitleştirmek ve geleneksel antikor etiketleme yöntemleri verimini artırmak için, birkaç alternatif yaklaşımlar 17,18 önerilmiştir. Bir yaklaşım, etiketleme reaksiyonu ve etiketlenmiş, saflaştırılmış protein tasfiye edilir antikorları yakalamak için manyetik olmayan Proteini küçük sütunlarda paketlenmiş bir afinite taneleri kullanmaktır. Bu yöntem, hücre ortamı şirketinden antikorları etiketlemek için kullanılabilir, ancak sütun kullanımı zahmetli olabilir. Bir manyetik boncuk tabanlı bir yöntem son zamanlarda sütun kullanımını ortadan kaldırır ve hacmini fakat geliştirir 19 rapor edilmiştirboncuk bağlama kapasitesi, sınırlı antikora, alçak antikor mikrogram düzeylerindeki miktarlarda sadece nanogram etiketlenmiş olabilir.
Biz son zamanlarda geliştirilen ve yüksek kapasitesi manyetik Protein A ve Protein G boncuk (> İnsan IgG / yerleşik boncuk ml 20 mg) küçük moleküller 20 hücre medyada mevcut antikorları etiketlemek için kullanılır. tanelerin yüksek kapasiteli antikorun mikrogram On ila yüzlerce uygun etiketlenmesine izin verir ve boncuk hızlı bir manyetik müdahale paralel örneklerin çok sayıda taşıma ve işleme kolaylaştırır. Küçük moleküller için belirteç gibi floresan boyalar kullanarak, yöntem, bir amin ve tiyol markalama kimya ile uyumlu ve etiketlenmiş ve çok saf antikorların yüksek geri kazanımlar sahip olduğunu gösteriyor.
Bu protokol ve beraberindeki bir video Manyetik Protein A ve Protein G boncuklar kullanılarak hücre medyada mevcut fare antikorları üzerinde boncuk etiketleme açıklar. protokoldürdört bölüme ayrılır: Bölüm 1 biyolojik örneklerden boncuk üzerine antikorların fethini şöyle anlatır. yakalanmasını takiben, amin kimyası kullanılarak veya tiyol kimya kullanılarak floresan boya ile antikor etiketleme sırasıyla 2 ve 3. bölümde tarif edilmektedir. Son olarak, bölüm 4 antikoru konsantrasyonu hesaplamalar ve antikor oranı boya için bir yöntem açıklanır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Yüksek Kapasiteli Manyetik Protein A veya Manyetik Protein G Boncuk üzerine 1. Antikor Yakalama
- Düzgün nazik sallayarak manyetik boncuk yeniden askıya. boncuk aliquoting Süspansiyon üniforma tutun.
- 1.5 ml mikrosantrifüj tüpüne boncuk çamuru 50 ul ekle. 10 saniye boyunca manyetik stand koyun. Dikkatle depolama tamponu çıkarın.
- Antikor bağlama tamponu, 250 ul ekleyin.
- Mix ve 10 saniye manyetik stand koyun. Dikkatle bağlayıcı tampon kaldırmak.
- tanelerine antikorun 50-100 ug ihtiva eden numune 1.0 ml ilave edilir. Numuneler, hücre ortamında antikorlar ya da antikor arıtılabilir.
- vorteksli bir mikserde veya son aşırı uç mikser kullanılarak, oda sıcaklığında 60 dakika boyunca örnek karıştırın.
- 10 saniye boyunca manyetik stand tüp yerleştirin ve süpernatant kaldırmak.
- antikor bağlama / yıkama tamponu 250 ul ilave et ve karıştır. 10 saniye boyunca manyetik stand koyun ve bağlayıcı / yıkama tamponu çıkarın. Bu s tekrarlayınİki yıkar toplam TEP.
- amin kimyası veya Bölüm 3 tiol kimyası kullanılarak etiketli antikorlar kullanılarak etiket antikorlara Bölüm 2'ye geçin.
Amin kimyası kullanılarak 2. Antikor etiketleme
- Konjuge Antikor
- Boncuklar amin konjugasyon tampon 100 ul ekle.
- boyanın 1.0 mg dimetil sülfoksit (DMSO), 100 ul ekleyerek, 10 mg / ml'de bir amin-reaktif floresan boyalar (AlexaFluor 532-K) içinde çözülür. vorteks ile karıştırın. Kullanımdan hemen önce bu çözüm olun.
- antikorun, 100 ug amin-reaktif boya 2.5 ul ekle.
Not: Genellikle reaktif boyanın 5-20 mol fazlası önerilir. Bununla birlikte, reaktif boyanın miktarı, reaksiyon ampirik antikor oranı ve içsel antikor özellikleri arzu edilen boya bağlı olarak optimize edilmesi gerekmektedir ilave edildi. - vorteksli bir mikserde veya son aşırı uç mikser kullanılarak, oda sıcaklığında 60 dakika boyunca örnek karıştırın. boncuk suspensio kalır emin olunn.
- 10 saniye boyunca manyetik stand tüp yerleştirin ve süpernatant kaldırmak.
- antikor bağlama / yıkama tamponu 250 ul ilave et ve karıştır. 10 saniye boyunca manyetik stand koyun. Çıkarın ve bağlayıcı / yıkama tamponu atın. İki yıkar toplam için bu adımı tekrarlayın.
- antikor Kurtarma
- tanelerine elüsyon tamponu 50 ul ekle.
- vorteksli bir mikserde veya son aşırı uç mikser kullanılarak oda sıcaklığında 5 dakika boyunca karıştırın. boncuk süspansiyon kalır emin olun.
- 10 saniye boyunca manyetik stand tüp yerleştirin. nötralizasyon tamponu 5 ul içeren yeni bir mikro-santrifüj tüpüne yıkandı örnek ve transfer çıkarın.
- sürecini bir kez daha tekrarlayın ve yıkandı, örnekleri havuz.
- antikor konsantrasyonunu ölçmek ve boya için antikor oranı Bölüm 4'te tarif edildiği gibi.
Tiol kimyası kullanılarak 3. Antikor etiketleme
- antikor Azaltma
- 250 ul ekleyintiyol konjugasyon tampon ve karışımı. 10 saniye boyunca manyetik stand tüp yerleştirin. Çıkarın ve tampon atın. İki kez bu adımı yineleyin.
- tiyol konjugasyon tampon 100 ul ekleyin.
- 2.5 mM'lik bir son konsantrasyona ditiyotreitol (DTT) ilave edilir.
- vorteksli bir mikserde veya son aşırı uç mikser kullanılarak, oda sıcaklığında 60 dakika boyunca örnek karıştırın. boncuk süspansiyon kalır emin olun.
- 10 saniye boyunca manyetik stand tüp yerleştirin ve tampon atın.
- tiyol konjugasyon tampon 250 ul ekleyin ve karıştırın. 10 saniye boyunca manyetik stand tüp yerleştirin. Çıkarın ve tampon atın. İki yıkar toplam için bu adımı tekrarlayın.
- tiyol konjugasyon tampon 100 ul ekleyin.
- Konjuge Antikor
- boyanın 1.0 mg DMSO, 100 ul ekleyerek / ml 10 mg tiol-reaktif boya çözülür. vorteks ile karıştırın. Kullanımdan hemen önce bu çözüm olun.
- anti 100 ug için tiol-reaktif boya 2.5 ul eklevücut.
Not: Genellikle reaktif boyanın 5-20 mol fazlası önerilir. Bununla birlikte, reaktif boyanın miktarı, reaksiyon ampirik antikor oranı ve içsel antikor özellikleri arzu edilen boya bağlı olarak optimize edilmesi gerekmektedir ilave edildi. - vorteksli bir mikserde veya son aşırı uç mikser kullanılarak, oda sıcaklığında 60 dakika boyunca örnek karıştırın. boncuk süspansiyon kalır emin olun.
- 10 saniye boyunca manyetik stand tüp yerleştirin ve süpernatant kaldırmak.
- tiyol konjugasyon tampon 250 ul ekleyin ve karıştırın. 10 saniye boyunca manyetik stand koyun ve tampon kaldırmak. İki yıkar toplam için bu adımı tekrarlayın.
- Zehir Antikor
- tanelerine elüsyon tamponu 50 ul ekle.
- vorteksli bir mikserde veya son aşırı uç mikser kullanılarak oda sıcaklığında 5 dakika boyunca karıştırın. boncuk süspansiyon kalır emin olun.
- 10 saniye boyunca manyetik stand tüp yerleştirin. neut 5 ul içeren yeni bir mikro-santrifüj tüpüne yıkandı örnek ve transfer çıkarınralization tamponu.
- sürecini bir kez daha tekrarlayın ve yıkandı, örnekleri havuz.
- antikor konsantrasyonunu ölçmek ve boya için antikor oranı Bölüm 4'te tarif edildiği gibi.
4. Hesapla Dye-to-Antikor Oranı
- 280 nm (A280) de ve boya (Amak) için Xmaks antikor boya birleşimine absorbansı ölçülür.
- antikor konsantrasyonunu hesaplayın:
Antikor konsantrasyonu (mg / ml) = A280 - (CF x A max) / 1.4
nerede CF (üretici tarafından sağlanan) boya = düzeltme faktörü. - boya-to-antikora oranı hesaplanır:
Boya-to-antikor oranı (DAR) = (150,000 x A max) / Ab konsantrasyonu (mg / ml) x ε boyası
burada, ε boya = sönüm absorbansı en fazla boyanın katsayısı ve antikorun molekül ağırlığı = 150.000 Da.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Yüksek kapasiteli manyetik Protein A ve Protein G boncuklar kullanılarak küçük moleküller ile antikor etiketleme için bir şeması, Şekil 1 'de gösterilmiştir. Antikorlar etiketler amin kimyası kullanılarak, örneğin flüoresan boyalar, G boncuklar küçük moleküller ile etiketlenebilir manyetik Protein çekilen lizin amino asitler ya da antikor menteşe bölgesindeki düşük tiyoller etiketler, tiol kimya kullanılarak birincil aminlerdir. Antikorlar ve Protein G arasındaki bağlantılı etiketleme reaksiyonu sırasında antikorun minimum kayba yol 21 ve sonuçlar güçlüdür. Basit bir saflaştırma işlemine göre, bu floresan boyalar ile işaretlendikten sonra, üç farklı fare antikoru izotipleri (Tablo 1) etkin kurtarma (% 50-90) yansıtılır. (19 önce bildirilen benzer) etkin kurtarma Coomassie jeller de açıktır (Şekil 2) bant intensiSaflaştırılmış antikorların ağır ve hafif zincirlerinin bağları ve etiketli antikorlar Coomassie jel (Şekil 2) görüldüğü gibi, manyetik Protein G boncuk yüksek oranda saflaştırılmış antikorlar ile sonuçlanan düşük spesifik olmayan bağlanma özelliklerine sahiptir. Tablo 1 'de verilen sonuçlar, yansıtır ve her iki ağır ve hafif zincirlerinin floresan (Şekil 2) olarak etiketlenmiştir. On-boncuk markalama manyetik Protein A boncuk yapılır ve antikor oranları (Tablo 2), yüksek geri kazanım ve iyi boya ile sonuçlanan çok sayıda floresan boyalar ile uyumlu olabilir.
Floresan moleküller ile antikorların üzerinde boncuk etiketleme Şekil 1. şematik. (A) Antikor etiketleme tiol kimyası kullanılarak. Antikorlar yüksek kapasiteli manyetik Protein A veya manyetik Protein G b yakalanırEADS DTT veya tris (2-karboksietil) fosfin (TCEP) gibi bir indirgeme maddeleri kullanılarak arası zincirli disülfit bağlarının indirgenmesiyle indirgenebilir. Floresan boyalar içeren tiol-reaktif maleimid etiketi antikorlar eklenir. Etiketli antikorlar düşük pH elüsyon ile geri kazanılmaktadır hemen nötralize edilir. (B) Antikor etiketleme amin kimyası kullanılarak. Yüksek kapasiteli manyetik Protein A ve Protein G Boncuk çekilen antikorlar lizinlerin birincil aminler de antikor etiket amin reaktif floresan boyalar ile birlikte reaksiyona sokulur. Etiketli antikorlar düşük pH yıkamayla yıkanır ve hemen nötralize edilir. Nath, N. ve ark. 20 uyarlanan bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2. denatüre SÜç fare IgG DS-PAGE jeli görüntülerin-boncuk yöntemi kullanılarak saflaştırılmış ve AlexaFluor 532 ile etiketlenir izotipleri (A). Amin reaksiyonu (b) Tiyol reaksiyonu. tiol-reaktif boya ile işaretlenmiş antikorların jel ve görüntüler. Kuşak 1-6 Tablo 1 'de gösterilen örneklere karşılık gelmektedir. Jeller ilk fluoresan tarayıcı kullanarak görüntülü ve tek AlexaFluor 532 etiketli antikor ağır ve hafif zincirlerine edildi. antikorlar sadece arıtılmış Numuneler görünmez. Jeller daha sonra etiketli antikorlar gibi saflaştırıldı antikorlardan ağır ve hafif zincirlerini gösteren Coomassie boyası ile boyandı. Nath, N. ve ark. 20 uyarlanan bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
| Amin reaksiyon | tiyol Reaksiyon | |||||
| İyi | izotip | Antikor Kurtarma (mikrogram) | Antikor oranı Boya | Antikor Kurtarma (mikrogram) | Antikor oranı Boya | |
| 1 | fare IgG1 | arıtma | 54.8 ± 1.8 | 0 | 49.2 ± 2.0 | 0 |
| 2 | birleşme | 27.4 ± 3.2 | 4.2 ± 0.2 | 46.2 ± 3.5 | 1.6 ± 0.2 | |
| 3 | fare IgG2a | arıtma | 85.9 ± 6.4 | 0 | 75.3 ± 8.0 | 0 |
| 4 | Conjugtirme | 60.7 ± 3.2 | 4.4 ± 0.1 | 61.5 ± 7.4 | 5.5 ± 0.4 | |
| 5 | fare IgG2b | arıtma | 79.9 ± 6.9 | 0 | 73.3 ± 1.4 | 0 |
| 6 | birleşme | 66.7 ± 0.5 | 5.6 ± 0.1 | 55.7 ± 0.9 | 5.2 ± 0.5 | |
Tablo 1:. Amin ve tiol kimyalar kullanılarak doğrudan hücre medya üç fare IgG izotiplerinin üzerinde boncuk markalama Her numune için, 1.0 ml hücre ortamının bir alikosu, sadece amin reaktif AlexaFluor 532 boya ile ilgili-boncuk etiketlenmesi için kullanılmıştır Manyetik Protein G, boncuk (50 ul bulamaç) ve ikinci kısım ile antikorların saflaştırılması için kullanılmıştır. Her iki durumda da antikor geri kazanımlar hesaplanmıştır (metinde anlatıldığı gibi), biretiketleme reaksiyonu sırasında antikor kayıpları belirlemek kıyasla d. Antikor oranı Boya her üç antikorlar için hesaplandı. Bütün reaksiyonlar, üç kopya halinde yapıldı. Nath, N. ve ark uyarlanmıştır. 20
| Manyetik Protein G Boncuk | Manyetik Protein A Boncuk | ||||
| Antikor Kurtarma (mikrogram) | Antikor oranı Boya | Antikor Kurtarma (mikrogram) | Antikor oranı Boya | ||
| 1 | arıtma | 263,7 ± 10.4 | 0 | 269.4 ± 5.1 | 0 |
| 2 | AlexaFluor532 | 182.9 ± 15.3 | 5.377; 0.04 | 189.1 ± 6.9 | 6.9 ± 0.2 |
| 3 | AlexaFluor647 | 192.5 ± 2.9 | 3.3 ± 0.1 | 112.3 ± 11.4 | 3.6 ± 0.2 |
| 4 | floresein | 179,5 ± 5.3 | 6.8 ± 0.1 | 201.5 ± 6.5 | 6.8 ± 0.1 |
Tablo 2:., Üç farklı tiol-reaktif floresan boyalar ile birlikte fare IgG2a On-boncuk markalama Konsantre hücre ortamı örnekleri bu yöntemi göstermek için bu deneyde kullanılan, aynı zamanda da, antikorun farklı bir miktarı için benimsenebilir. Buna ek olarak, konjugasyon reaksiyonları manyetik protein G gibi manyetik Protein G, boncuk (100 ul bulamaç) kullanılarak antikor saflaştırma için kullanılmıştır Hücre ortamı konsantre edildi, 1.0 ml'lik manyetik Protein A kullanılarak bir kısım kullanılarak yapıldı. Diğer üç 1.0 mi tümbölenis etiketlenmiş ve tiol-reaktif AlexaFluor 532, AlexaFluor 647 ve floresein ile saflaştırılmıştır. (Metinde anlatıldığı gibi) ve çeşitli etiketleme etkileri karşılaştırılmıştır antikor geri kazanımlar hesaplanmıştır. Antikor oranı boya da, tüm üç flüoresan boyalar için hesaplandı. Benzer saflaştırma ve markalama Manyetik Protein A boncuk kullanılarak yapıldı. Bütün reaksiyonlar, üç kopya halinde yapıldı. Nath, N. ve ark uyarlanmıştır. '20
| Tampon | Yorumlar / Açıklama |
| Amin konjügasyon tamponu (10 mM sodyum bikarbonat tampon maddesi, pH 8.5) | 1. 0.084 g sodyum bikarbonat 2. deiyonize su içinde çözülür. pH 8.5 ayarlayın. 3. deiyonize su ile 100 ml son ses seviyesini ayarlayın. |
| Tiol konjugasyon tamponu (1 mM EDTA, pH 7, 10 mM fosfat tampon maddesi.0) | 1. 0,0378 g sodyum fosfat, monobazik, monohidrat 2. 0.195 gr sodyum fosfat, dibazik, heptahidrat 3. deiyonize su içinde çözülür. 4. 1.0 mM'lik nihai bir konsantrasyona kadar EDTA ekleyin. 5. pH'ı 7 olarak ayarlamak. 6. deiyonize su ile 100 ml son ses seviyesini ayarlayın. |
| Antikor bağlanma / yıkama tamponu (10 mM fosfat tamponu, pH 7.0) | 1. 0,0378 g sodyum fosfat, monobazik, monohidrat 2. 0.195 gr sodyum fosfat, dibazik, heptahidrat 3. deiyonize su içinde çözülür. pH 7'ye ayarlayın. 4. deiyonize su ile 100 ml son ses seviyesini ayarlayın. |
| Elüsyon tamponu (50 mM glisin tampon, pH 2.7) | 1. 0.188 gr glisin 2. deiyonize su içinde çözülür. HCl ile 2.7 pH ayarlayın. 3. deiyonize su ile 50 ml son ses seviyesini ayarlayın. |
| Nötralizasyon tamponu (2 M Tris tampon, pH 7.5) | 1. 0.472 grTrizma baz 2. 2.54 gr Trizma hidroklorür 3. deiyonize su içinde çözülür. pH 7.5 ayarlayın. 4. deiyonize su ile 10 ml nihai hacim ayarlayın. |
Tablo 3: Tampon kompozisyonlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu çalışmanın amacı, küçük moleküllerin çeşitli, düşük konsantrasyonlarda, hücre ortamı içinde mevcut antikorları etiket için bir yöntem geliştirmektir. Antikor keşif erken safhalarında antikorların çok sayıda olanak sağlayacaktır bir yöntem olup, küçük moleküller ile işaretlenmiş olan bir biyolojik ilgili deneyi kullanılarak taranabilir için. Böyle bir deney, içselleştirme da benzer bağlanma afinitelerine sahip antikorlar arasında değişebilir reseptör aracılı antikor, geliştirilmiş içselleştirme deneyidir. Bu nedenle, geleneksel Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA) tabanlı tarama ek olarak kendi içselleştirme özellikleri için, özellikle antikorları taramak için önemlidir. Erken antikor gelişme aşamasında antikorlar etiket yöntemi için temel gereksinimleri şunlardır: doğrudan hücre ortamından antikorlar etiketlemek için) yeteneği; b) hücre ortamında antikor konsantrasyonu 50 ug / ml olduğunda, örneğin, düşük konsantrasyonlarda mevcut antikorlar etiket kabiliyeti; c)işaretlenmiş antikor ve antikor konsantrasyonu saflığı alt uygulamalar ile uyumlu olmalıdır; d) yöntemi amin ve tiyol tabanlı konjugasyon kimyası ile uyumlu olmalıdır; e) yöntemi, aynı anda birden fazla numune işleme ile uyumlu olması gerekmektedir.
Bu gereksinimleri göz önüne alındığında, biz yüksek kapasiteli manyetik Protein A ve Protein G boncuklar kullanarak bir on-boncuk antikor etiketleme ve saflaştırma yöntemi geliştirdi. Şekil 2'de gösterildiği üzere, taneler, düşük özgül-olmayan bağlanma özelliklerine sahip hidrofilik selüloz bazlı ve oldukça saf bir antikor preparasyonu ile sonuçlanabilir edilmiştir. Boncuk yüksek kapasiteli tanelerin küçük bir miktar etkin medya ve antikorlar arasında antikorları yakalamak anlamına gelir dolayısıyla antikorlar konsantre küçük hacim içinde elüte edilebilir. Tablo 1 'de, sadece 10 ul boncuk 1.0 mi örneklerinden antikorlar (beklenen konsantrasyonları 50-100 ug / ml), bir yakalamak için kullanılan yerleşmişD etiketli antikorlar 200-500 ug / ml arası konsantrasyonlarda 120 ul hacim içinde elüt edilmiştir. Bu konsantrasyonlar, tipik antikor konsantrasyonları 1.0 ug / ml ila 10 ng / ml arasında değişir 15,16 hücre temelli içselleştirme deneyleri ile uyumludur. On-boncuk etiketleme yöntemi amin ve tiol kimyaları ve etiketlenmiş antikorlar (Tablo 1) verimli bir şekilde geri ile elde edilebilir boya için antikor oranları geniş ile uyumludur. Deneyler üç kez yapıldı ve 12 numune önemli ölçüde işleme süresini azaltarak, elle paralel olarak ele alınmıştır. Etiketleme verimi ayrıca, manyetik boncuklar 19,22 kullanan diğer uygulamalarda gösterildiği gibi robot platformlar kullanılarak arttırılabilir.
daha yüksek bir antikor miktarı ile yapılan deneylerde, antikor kazanımı ve markalama efficie korurken yakalama için kullanılan boncuk miktarını artırarak yerleştirilebilirNCY (Tablo 2). Çeşitli boya antikor konjügatları yapılabilir ki, boya için antikor oranları optimize edilmesi gerekir, bu nedenle bir yöntem, aynı zamanda birden fazla boya ile uyumludur. 2-4 antikor oranı boya 11,12 uygun olduğu tespit edilmiş ve onaylanmıştır ADC'ler durumunda Antikor başına 3.5 ilaçların ortalama 23 bildirilmiştir. on-boncuk çekimi kimyası ile, alt uygulama gereksinimlerine bağlı olarak, antikor başına küçük molekülün optimum sayıda ayarlamak için nispeten kolaydır. Ayrıca, etiketleme için tiol ve amin kimyası, antijen ve reseptör bağlanmasının in vivo stabilite gösterildiği gibi ADC'ler için kritik olan en iyi kimya seçeneği belirlemek için test edilebilir ve antikorun terapötik aktivite çekimi kimyası 24 bağlıdır 25.
İyi antikor etiketleme ve iyileşme elde etmek için bazı temel faktörler vardır. Küçük molekül bir özellikleriAntikor oranı antikor kazanımı ve boya iki kritik sürücü yeniden. bir hidrofobik küçük moleküllü antikor oranı yüksek boya spesifik olmayan boncuk etiketli antikorun yapışmasını ve önemli ölçüde azaltılmış bir antikor kurtarma neden olur. Bazen, boya ve antikor özelliklerine bağlı olarak, biz bir boncuk dolayısıyla diğerinden daha iyi çalışabilir bulundu, optimizasyon sırasında her iki boncuk test yararlı olabilir. Protein A ve Protein G farklı türlerden antikorlar için uygun boncuk seçerken dikkate alınması gereken farklı alt, farklı benzerlikleri 21 var. Örneğin, protein A dolayısıyla Protein G taneler özellikle tavsiye edilir, fare IgG1 düşük afiniteye sahiptir. tiyol kimya, DTT ve TCEP indirgeyici ajanlar eşit derecede iyi çalışır. DTT, ancak bu nedenle tamamen yıkanarak kaldırılmalıdır maleimid reaksiyona müdahale edecek. 2.7 düşük pH, yıkama için tavsiye edilir, ancak 2.2 düşük pH etkin rec için gerekli olabilirBazı durumlarda, Overy. düşük bir pH değerinde denatüre olabilir etiketlenmiş antikorlar için verimli geri kazanımı ve antikor işlevselliği arasında bir denge ampirik bir şekilde tespit edilmesi gerekir. İyi markalama kimyası antikor-antijen bağlanma aktivitesi 11,23 etki edebildiği bilinmektedir, bu nedenle, istenen alt uygulamasını kullanarak etiketlendikten sonra antikor işlevselliği açısından test etmek için kesinlikle gereklidir.
Özetle, biz herhangi bir ön arıtma adımlar olmadan hücre ortamından doğrudan floresan boyalar ile antikorlar etiketlemek için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntem, yüksek kapasiteli manyetik Protein A ve Protein G boncuk güçlendirir ve yüksek konsantrasyonlarda 10,11 de yüksek derecede saflaştırılmış antikorlar gerektiren çözüm odaklı etiketleme yöntemi üzerinde önemli bir gelişmedir. Manyetik boncuk kullanımı manyetik olmayan boncuk tabanlı etiketleme teknikleri 17,18 üzerinde bir avantaj olduğunu kılavuzu yanı sıra otomatik numune taşıma, sağlar. yüksek kapasiteli bea Son olarak, kullanımDS boncuk az miktarlarda mikrogram yüzlerce düşük mikrogram seviyelerinden Antikor etiketleme reaksiyon ölçeği olanak veren ve diğer manyetik boncuk esaslı etiketleme yöntemleri 19 bu yöntem ayırır. Burada sunulan protokol floresan boyalar ile antikor etiketleme tarif etmektedir, ancak yöntemi biyotin, sitotoksik ilaçlar ve muhtemelen enzimler dahil olmak üzere diğer etiketlere uzatılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Magne Protein A Beads | Promega Corporation | G8781 | |
| Magne Protein G Beads | Promega Corporation | G7471 | |
| AlexaFluor 532-SE (Succinimidyl Ester) | Life Technologies | A20001 | |
| AlexaFluor 532-ME (Malemide) | Life Technologies | A10255 | |
| AlexaFluor 647-ME (Maleimide) | Life Technologies | A20347 | |
| Fluorescein-ME (Maleimide) | Life Technologies | F-150 | |
| Magnetic Stand | Promega | Z5332 |
References
- Colwill, K., Graslund, S. Renewable Binder Working Group. A roadmap to generate renewable protein binders to the human proteome. Nat Methods. 8 (7), 551-558 (2011).
- Silverstein, A. M. Labeled antigens and antibodies: the evolution of magic markers and magic bullets. Nat Immunol. 5 (12), 1211-1217 (2004).
- Day, J. J., et al. Chemically modified antibodies as diagnostic imaging agents. Curr Opin Chem Biol. 14 (6), 803-809 (2010).
- Cunningham, R. E. Overview of flow cytometry and fluorescent probes for flow cytometry. Methods Mol Biol. 588, 319-326 (2010).
- Eaton, S. L., et al. A guide to modern quantitative fluorescent western blotting with troubleshooting strategies. J Vis Exp. (93), e52099 (2014).
- Dundas, C. M., Demonte, D., Park, S. Streptavidin-biotin technology: improvements and innovations in chemical and biological applications. Appl Microbiol Biotechnol. 97 (21), 9343-9353 (2013).
- Kraeber-Bodere, F., et al.
- Leal, M., et al. Antibody-drug conjugates: an emerging modality for the treatment of cancer. Ann N Y Acad Sci. 1321, 41-54 (2014).
- Drachman, J. G., Senter, P. D. Antibody-drug conjugates: the chemistry behind empowering antibodies to fight cancer. Hematology Am Soc Hematol Educ Program. 2013, 306-310 (2013).
- Hermanson, G. T. Bioconjugate Techniques. , Academic Press. 380-382 (1996).
- Shrestha, D., Bagosi, A., Szollosi, J., Jenei, A. Comparative study of the three different fluorophore antibody conjugation strategies. Anal Bioanal Chem. 404 (5), 1449-1463 (2012).
- Vira, S., Mekhedov, E., Humphrey, G., Blank, P. S. Fluorescent-labeled antibodies: Balancing functionality and degree of labeling. Anal Biochem. 402 (2), 146-150 (2010).
- Isa, M., et al. High-throughput screening system to identify small molecules that induce internalization and degradation of HER2. ACS Chem Biol. 9 (10), 2237-2241 (2014).
- Liao-Chan, S., et al. Quantitative assessment of antibody internalization with novel monoclonal antibodies against Alexa fluorophores. PLoS One. 10 (4), e0124708 (2015).
- Riedl, T., van Boxtel, E., Bosch, M., Parren, P. W., Gerritsen, A. F. High-Throughput Screening for Internalizing Antibodies by Homogeneous Fluorescence Imaging of a pH-Activated Probe. J Biomol Screen. 21 (1), 12-23 (2016).
- Nath, N., et al. Homogeneous plate based antibody internalization assay using pH sensor fluorescent dye. J Immunol Methods. 431, 11-21 (2016).
- Lundberg, E., Sundberg, M., Graslund, T., Uhlen, M., Svahn, H. A. A novel method for reproducible fluorescent labeling of small amounts of antibodies on solid phase. J Immunol Methods. 322 (1-2), 40-49 (2007).
- Strachan, E., et al.
- Dezfouli, M., et al. Magnetic bead assisted labeling of antibodies at nanogram scale. Proteomics. 14 (1), 14-18 (2014).
- Nath, N., Godat, B., Benink, H., Urh, M. On-bead antibody-small molecule conjugation using high-capacity magnetic beads. J Immunol Methods. 426, 95-103 (2015).
- Lund, L. N., et al. Exploring variation in binding of Protein A and Protein G to immunoglobulin type G by isothermal titration calorimetry. J Mol Recognit. 24 (6), 945-952 (2011).
- Safarik, I., Safarikova, M. Magnetic techniques for the isolation and purification of proteins and peptides. Biomagn Res Technol. 2 (1), 7 (2004).
- Flygare, J. A., Pillow, T. H., Aristoff, P. Antibody-drug conjugates for the treatment of cancer. Chem Biol Drug Des. 81 (1), 113-121 (2013).
- Shen, B. Q., et al. Conjugation site modulates the in vivo stability and therapeutic activity of antibody-drug conjugates. Nat Biotechnol. 30 (2), 184-189 (2012).
- Acchione, M., Kwon, H., Jochheim, C. M., Atkins, W. M. Impact of linker and conjugation chemistry on antigen binding, Fc receptor binding and thermal stability of model antibody-drug conjugates. MAbs. 4 (3), 362-372 (2012).
