Protocol
1. Fremstilling af reagenser og buffere
- 0,5 M ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA)
- I et 2 liters bægerglas, tilsættes 186,1 g EDTA til 800 ml deioniseret vand destilleret (Hedeselskabet 2 O). Indstil pH af opløsningen til 8,0 ved anvendelse af NaOH-pellets. Tilføj Hedeselskabet 2 O til et endeligt volumen på 1,0 l, og opløsningen overføres til en autoklaverbar glasflaske for autoklavering og opbevares ved 4 ° C.
- 10 × Tris-borat EDTA (10x TBE)
- I en 4 L plastbæger, tilsættes 432 g Tris-base, 200 g borsyre, 80 ml 0,5 M EDTA (pH 8,0) og Hedeselskabet 2 O til et slutvolumen på 4 L. Mix under anvendelse af en omrører, indtil alle bestanddelene opløses. Opløsningen overføres til 1 L glasflasker for autoklavering og opbevares ved 4 ° C.
- 10% Denaturering Polyacrylamid Stock
- I en 4 L plastbæger, tilsættes 1681,7 g urinstof, 400 ml 10x TBE, 1 I 40% acrylamid / bisacrylamid (29: 1) opløsning og Hedeselskabet 2 O indtil fginal volumen er 4 L. Mix ved hjælp af en omrører, indtil urinstof er opløst. Opløsningen overføres til en L rav glasflasker og opbevares ved 4 ° C.
- 2x Gel Loading Buffer (2x GLB)
- I en 200 ml bægerglas tilsættes 44 g urinstof, 8 g sucrose, 10 mg bromphenolblåt, 10 mg xylencyanol FF, 400 pi 10% natriumdodecylsulfat, og 4 ml 10 x TBE. Tilføj Hedeselskabet 2 O til et endeligt volumen på 40 ml og opløse komponenterne med mild opvarmning til 50 ° C under blanding med en magnetisk omrører. Overfør 1 ml portion til 1,5 ml mikrocentrifugerør og opbevares ved 4 ° C.
BEMÆRK: Før anvendelse kræver kortvarig opvarmning til 90 ° C for at genopløse eventuelle faste stoffer.
- I en 200 ml bægerglas tilsættes 44 g urinstof, 8 g sucrose, 10 mg bromphenolblåt, 10 mg xylencyanol FF, 400 pi 10% natriumdodecylsulfat, og 4 ml 10 x TBE. Tilføj Hedeselskabet 2 O til et endeligt volumen på 40 ml og opløse komponenterne med mild opvarmning til 50 ° C under blanding med en magnetisk omrører. Overfør 1 ml portion til 1,5 ml mikrocentrifugerør og opbevares ved 4 ° C.
- 1 M Tris-hydrochlorid (Tris-HCI) (pH 7,5)
- I en glasflaske, tilsæt 12,1 g Tris-base og 70 ml Hedeselskabet 2 O og bland indtil det faste stof er opløst. PH justeres til 7,5 ved anvendelse af 1 M saltsyre (HCI). Tilføj Hedeselskabet 2 O til et endeligt volumen på 100 ml, autoklav og store ved 4 ° C
- 5 M natriumchlorid (NaCl)
- I en glasflaske, opløses 58,4 g NaCl i 150 ml Hedeselskabet 2 O. Juster lydstyrken til 200 ml med Hedeselskabet 2 O. Opbevares ved 4 ° C.
- DNA Elution Buffer
- I en glasflaske, blandes 2,0 ml 1 M Tris-HCl (pH 7,5), 8,0 ml 5 M NaCl og 0,4 ml 0,5 M EDTA (pH 8,0). Juster lydstyrken til 200 ml med Hedeselskabet 2 O, autoklave og opbevares ved 4 ° C.
- 1 M 4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazinethansulfonsyre (HEPES) (pH 7,4)
- I en glasflaske, opløses 2,38 g HEPES i 80 ml Hedeselskabet 2 O. PH justeres til 7,4 ved anvendelse af 5 N NaOH og tilsæt Hedeselskabet 2 O til et endeligt volumen på 100 ml.
- 1 M magnesiumchlorid (MgCl2)
- I en glasflaske, tilsæt 2,03 g MgCl2 -6H 2 O og rumfanget bringes op på 100 ml med Hedeselskabet 2 O.
- Reaction Buffer (RB)
- I en 50 ml konisk rør, tilsættes 500 pi 1 M Tris-HCI (pH 7,5), 8,8 g NaCl, 50 pi 1 M MgCl2, og 5 pi Tween 20. Tilføj Hedeselskabet 2 O til et slutvolumen på 50 ml. Bland opløsningen og filtreres over i et andet konisk rør ved anvendelse af en sprøjte-drevet filter (0,22 um) og opbevares ved 4 ° C indtil anvendelse.
- I en 50 ml konisk rør, tilsættes 5,8 g NaCl, 3 ml 1 M MgCl2, 1,5 g urinstof, og 40 ml Hedeselskabet 2 O. Indstil pH af opløsningen til 5,0 ved anvendelse af 10 mM HCI. Fordi løsningen ikke er pufret, justering af pH ved anvendelse af HCIforsigtigt gennem tilsætning af små HCI alikvoter. Tilføj Hedeselskabet 2 O til et endeligt volumen på 50 ml.
- Bland opløsningen og filtreres over i et andet konisk rør ved anvendelse af en sprøjte-drevet filter (0,22 um) og opbevares ved 4 ° C indtil anvendelse.
- I et bægerglas opløses 20,0 g LB pulver i 1 liter Hedeselskabet 2 O. Overførsel til en glasflaske, autoklav, og opbevares ved 4 ° C.
- I en 250 ml kolbe, der tilsættes 1,5 g agar og 100 ml LB-bouillon. Autoklave og opbevares ved 4 ° C.
- Genopløse LB-agar i en mikrobølgeovn, og opløsningen afkøles til -50 ° C. Hæld opløsningen i petriskåle, hvilket gør ~ 5 plader og tillade dem at størkne.
2. Syntese og oprensning af E. coliforme lydhør DNAzym EC1
- Syntese af EC1 af Skabelon medieret Enzymatisk Ligation
- rense commercially syntetiserede oligonukleotider BS1, DE1, og T1 (sekvenser er tilvejebragt i tabel 1) med 10% denaturerende polyacrylamidgelelektroforese (dPAGE) ifølge standardprotokoller.
- Forbered en 100 uM bestand af BS1, DE1, og T1. Opbevar ved -20 ° C indtil brug.
- I et 1,5 ml mikrocentrifugerør, tilsættes 38,5 pi Hedeselskabet 2 O, 5 pi DE1 og 5 pi 10x T4-polynukleotidkinase reaktionspuffer leveret af enzym leverandøren (500 mM Tris-HCI (pH 7,6), 100 mM MgCl2, 50 mM dithiothreitol (DTT), 1,0 mM spermidin).
- Tilsæt 1 pi adenosintriphosphat (ATP) (100 mM). Tilsæt 5 enheder T4 polynukleotidkinase (10 U / ul). Bland ved forsigtigt at pipettere reaktionsblandingen.
- Inkubér reaktionen ved 37 ° C i 30 min.
- Stands reaktionen ved opvarmning til 90 ° C i 5 minutter.
- Tilføj 118 pi Hedeselskabet 2 O, 5 pi BS1, og 5 pi T1. Opvarm reaktionsblandingen til 90 ° C i 2 min og afkøl derefter til stuetemperatur i løbet af 10 min.
- Tilsæt 20 pi 10 × T4 DNA-ligase reaktionspuffer billede af enzymet leverandøren (400 mM Tris-HCl (pH 7,8), 100 mM MgCl2, 100 mM DTT, 5 mM ATP). Der tilsættes 10 enheder T4 DNA ligase (5 U / pl) og omhyggeligt blandes ved pipettering.
- Der inkuberes ved stuetemperatur i 2 timer.
- Tilsæt 20 pi 3 M natriumacetat (NaOAc) (pH 5,2), 500 pi kold 100% ethanol. Bland opløsningen ved hvirvelblanding og glasset anbringes i en -20 ° C fryser i 30 minutter.
- Centrifugeres mikrofuge ved 20.000 xg i 20 min ved 4 ° C. Fjern forsigtigt supernatanten ved pipettering.
- Vask pelleten med kold 70% ethanol og centrifugeres igen ved 20.000 xg i 10 min ved 4 ° C. Igen fjern supernatanten og tørre pelleten under vakuum i 10 minutter.
- Resuspender DNA med 15 pi Hedeselskabet 2 O og derefter tilføje 15 pi 2x GLB.
- Vortex kraftigt og opvarmes til 90 ° C i2 min. Oprens fuldlængde DNA'et med 10% dPAGE som beskrevet nedenfor.
- Opstilling 10% dPAGE
- Ren to glasplader (en fuld plade og en kærv), to 0,75 mm tykke afstandsstykker, og en 12-brønds kam. Læg en glasplade på en flad overflade med to afstandsstykker på hver side og det takkede plade på toppen. Klip de to plader sammen ved hjælp af de fire klip, som leverandøren.
- I en 150 ml plastbæger, hæld 40 ml 10% dPAGE, 40 pi tetramethylethylendiamin (TEMED), og 400 pi 10% ammoniumpersulfat (APS). Bland komponenterne og hæld løsning mellem langsomt pladerne.
- Sæt kammen og derefter tillade gelen at polymerisere i løbet af 10 min. Når gelen polymeriseres, langsomt fjerne kam og skyl brøndene med Hedeselskabet 2 O.
- Monter pladerne på gelelektroforese-apparatet. Brug en metalplade til at afgive varme frembragt for at undgå overophedning.
- Hæld 1x TBE på den øverste og nederste kamreog sikre, at brøndene er godt neddykket i bufferen. Skyl brøndene med 1x TBE ved hjælp af en pipette eller sprøjte.
- Indstil apparatet til at køre ved 35 mA og præ-run i 15 min før isætning af prøver.
- Eluering af Ligeret EC1 fra 10% dPAGE
- Efter trin 2.2.6, køre gelen ved 35 mA indtil den nederste farvestof (bromphenolblåt) når bunden af glaspladen. Dette bør tage ca. 1,5 time. Sluk for strømmen, og fjern pladerne ud af apparatet.
- Læg pladerne på et par ark papir håndklæder og omhyggeligt fjerne afstandsstykker fra glaspladerne. Fjern forsigtigt den øverste glasplade og wrap gelen med plastfolie.
- Vend gel over at fjerne den anden glasplade og dække med plast wrap igen. Sørg for at undgå rynker i plastikfolie.
- Visualiser ligeret produkt ved hjælp af UV-shadowing (260 nm), som vil producere 4 forskellige DNA-bånd (Fuldt ligeret EC1, DE1 BS1 og T1).
- Centrifugeres gelen opløsning ved 20.000 xg i 5 minutter og forsigtigt overføre 400 pi af supernatanten til et andet 1,5 ml mikrofugerør. Undgå at trække gel stykker under pipettering.
- Til mikrofugerøret med den overførte supernatant tilsættes 40 pi 3 M NaOAc (pH 5,2) og 1,0 ml kold 100% ethanol. Bland opløsningen ved hvirvelblanding og glasset anbringes i en -20 ° C fryser i 30 minutter.
- Centrifugeres mikrofuge ved 20.000 xg i 20 min ved 4 ° C. Fjern forsigtigt supernatanten ved pipettering.
- Vask pelleten med kold 70% ethanol og centrifugeres igen ved 20.000 xg i 10 min ved 4 ° C. Igen, skal du fjernesupernatanten og tørre pelleten under vakuum i 10 minutter.
- Bestemme koncentrationen af EC1 ved måling af UV-absorbans ved 260 nm. Foretag en 10 uM materiel og opbevare prøven ved -20 ° C indtil anvendelse.
3. Konjugering af Urease til DNA
- Fremstilling af succinimidyl-4- (N-maleimidomethyl) cyclohexan-1-carboxylat (SMCC) Stock
- Opløs 1 mg SMCC i 676 pi DMSO. Vortex og sted på is indtil brug.
- Udarbejdelse af urease Stock
- Opløs 1 mg urease i 1 ml 1 × PBS (ingen Mg 2+ eller Ca 2+). Anbring på is indtil brug.
BEMÆRK: Krystalliseret urease er langsom at opløse og forsigtig blanding er nødvendig for at undgå denaturering.
- Opløs 1 mg urease i 1 ml 1 × PBS (ingen Mg 2+ eller Ca 2+). Anbring på is indtil brug.
- Syntese af Urease-DNA (UrDNA)
- Tilsæt 10 pi 100 pM LD1 til et 2,5 ml mikrofugerør. Tilføj 140 pi Hedeselskabet 2 O, 40 pi 10x PBS og vortex.
- Tilføj 80,5 pi SMCC stock, 159,5 pi DMSO, vortex, og kort centrifuge ved hjælp af en bordcentrifuge.
- Der inkuberes ved 37 ° C i 60 minutter. Undgå kondensdannelse under mikrofuge cap.
- Tilsæt 200 pi 1x PBS, 60 pi 3 M NaOAc (pH 5,2), og 1,5 ml kold 100% ethanol. Bland opløsningen ved hvirvelblanding og inkuberes ved -20 ° C i 30 minutter.
- Centrifugeres opløsningen ved 20.000 xg i 20 min ved 4 ° C. Fjern supernatanten og tørre pelleten under vakuum. Undgå over-tørring.
- Til den tørrede pellet tilsættes 400 pi urease lager og inkuber ved stuetemperatur i 5 timer.
- Overfør 200 gi rå konjugat til en forvasket 100k MWCO centrifugal filter kolonne. Centrifugeres søjlen ved 14.000 xg i 5 min.
- Overfør de resterende 200 pi af rå konjugat til søjlen og centrifugeres ved 14.000 xg i 5 min. Fjern kolonnen og placere den på hovedet i en ny 2,0 ml mikrocentrifugerør ( "indsamling tube").
- centrifugaluge opsamlingsrøret (med den inverterede kolonne) ved 1000 xg i 2 min. Fjern opsamlingsrøret og tilsættes 30 pi 1x PBS til den centrifugale kolonne for at vaske membranen for yderligere genvinding af konjugater.
- Igen invertere søjlen og placere tilbage i opsamlingsrøret. Centrifugeres opsamlingsrøret (med den inverterede kolonne) ved 1000 xg i 2 min. Fjern og bortskaf kolonnen.
- Opbevar UrDNA ved 4 ° C indtil anvendelse.
4. Montering af EC1 og UrDNA på magnetiske perler
- Bland magnetisk perle (MB) stock godt og overføre 100 pi MB suspensionen til et 1,5 ml mikrofugerør. Placer mikrofugerøret på en magnetisk stativ holder til isolering af MB.
- Fjern supernatanten ved pipettering, og der tilsættes 150 pi bindingspuffer (BB) til røret. Fjern røret fra holderen og forsigtigt trykke røret at opblande MB til en homogen opløsning. Undgå sprøjt suspensionen til top af røret eller hætte. Hvis dette sker, skal du bruge en bordcentrifuge til kortvarigt dreje resten tilbage til suspensionen.
- Gentag trin 4.2 to gange mere.
- Til denne suspension tilsættes 10 pi 10 pM EC1. Bland forsigtigt ved at banke på glasset.
- Inkuber opløsningen med mild rystning i 30 min. Tap røret hver 2-3 min for at undgå udfældning af MB.
- Placer mikrofugerøret tilbage på den magnetiske rack at isolere MB og fjern supernatanten ved pipettering. Vask MB tre gange med 150 pi BB (som beskrevet i trin 4.2).
- Når vaskningen er fuldendt, suspendere MB i alt 150 pi BB. Til denne opløsning tilsættes 15 pi UrDNA og opvarme opløsningen til 45 ° C i 2 min. Opløsningen afkøles til stuetemperatur og inkuberes i 2 timer.
- Placer mikrofugerøret tilbage på den magnetiske rack at isolere MB og fjern supernatanten ved pipettering.
- Tilsæt 100 pi reaktionsbuffer (RB). Fjern than mikrofugerør fra den magnetiske rack og forsigtigt resuspender MB.
- Vask flere MB tre gange ved at gentage trin 4.9.
BEMÆRK: Det vaskede supernatant kan hurtigt testet for at bestemme, om ikke-hybridiseret UrDNA er stadig til stede, hvilket kan resultere i et falsk positivt signal. Testen kan udføres ved at tilsætte 10 pi af 50 mM urea og 10 pi 0,04% phenolrødt til vaskeopløsningen. Vaskningen af MB indtil vaskeopløsningen ikke forårsager en farveændring. Den 100 pi suspension opbevares ved 4 ° C indtil anvendelse.
5. Udarbejdelse af bakterieceller 20
- Dyrkning E. coli fra Stocks
- Plate E. coli K12 (MG1655) på LB agarplader fra en glycerol-lager under en flamme eller i et biologisk sikkerhedsskab.
- Anvendelse af en steril pipettespids, blidt røre glycerolstamme og let streak overfladen af en agarplade at undgå punktering af LB-agar.
- Vend stribedeplade og inkuberes ved 37 ° C i 14 timer.
- Forsegle skiltet med Parafilm og opbevares ved 4 ° C i maksimalt 3 uger.
- Dyrkning E. coli for Cell Counting
- I et sterilt 14 ml kultur rør, dispensere 2 ml LB-bouillon.
- Anvendelse af en steril pipettespids, vælge en enkelt koloni fra stribede agarplade fremstillet i trin 5.1 og overføre den til kulturen røret.
- Inkuber kulturen ved 37 ° C og rystes ved 230 rpm i 14 timer.
- Serielt fortynde bakteriekulturen i 10-fold intervaller.
- For hver fortyndede prøve, jævnt pladen fem 100 pi alikvoter på separate LB-agarplader. Vendes pladerne om og inkuberes ved 37 ° C i 14 timer.
- Tæl cellerne i hver prøve at få den gennemsnitlige cellekoncentration på hver fortynding.
BEMÆRK: 10 7 celler bruges ofte til at oprette en reference lakmusprøve for E. coli som dette niveau af E. coli kan udløse en hurtig farve change. Dog kan en korrekt udført lakmusprøve afsløre så lav som 500 celler, som diskuteret i afsnittet Resultater.
- Forberedelse E. coli celler til test
- For en ønsket cellesuspension, overføres 1 ml dyrket lager til et 1,5 ml mikrofugerør.
- Centrifugeres cellerne ved 6.000 xg i 10 min ved 4 ° C. Fjern forsigtigt supernatanten uden at forstyrre cellepelleten.
- Tilsæt 10 pi reaktionsbuffer til cellepelleten og cellerne resuspenderes. Sonikeres cellesuspensionen i 5 minutter. Overfør cellesuspensionen til en is boks i 5 minutter.
- Sonikeres cellesuspensionen i yderligere 5 min.
- Centrifuger cellesuspensionen ved 13.000 xg i 10 min ved 4 ° C. Brug supernatanten til afprøvning (10 pi).
6. lakmusprøve
- I et 1,5 ml mikrofugerør, forvask røret ved at tilføje og omhvirvling 100 pi reaktionsbuffer (RB) i mikrofugerør ogkassere bufferen.
- Transfer 15 pi samlet EC1 (protokol 4) til den vaskede mikrofugerør.
- Vask de magnetiske perler ved at placere mikrofugerøret på en magnetisk stativ. Fjern supernatanten ved pipettering. Fjern mikrofugerøret fra stativet, tilsættes 100 pi af RB, og omhyggeligt resuspender de magnetiske perler.
- Vask de flere MB to gange ved at gentage trin 6.3.
- Placer mikrofugerøret tilbage på den magnetiske rack, supernatanten fjernes, og der tilsættes 10 pi E. coli prøve fremstillet fra trin 5.3.
- Bland prøven og magnetiske perler omhyggeligt ved forsigtigt at banke på mikrofugerør.
- Inkubér reaktionen ved stuetemperatur i 1 time.
- Til reaktionsblandingen tilsættes 90 pi Hedeselskabet 2 O og placere mikrofugerøret på en magnetisk stativ.
- Efter ca. 3 min af magnetisk separation, omhyggeligt overføre 85 pi af supernatanten til et 0,5 ml mikrofugerør. Træk supernatanten langsomt tilundgå at indsamle eventuelle magnetiske perler.
- Til ovennævnte mikrofugerør tilføje 15 pi 0,04% phenolrødt og 100 pi substratopløsning.
- Tag et billede med specifikke tidsintervaller at optage farveændring.
BEMÆRK: Ændringen i pH kan også overvåges ved hjælp af et pH-meter med en mikroelektrode. Udgangsmaterialet pH skal være ca. 5,2-5,5 (opløsningen er gul). Hvis ikke, kan opløsningen justeres ved tilsætning af 1 mM acetatpuffer pH 5,0).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Princippet i den bakterielle lakmusprøve er forklaret i figur 1 Testen anvender tre centrale materialer:. En RNA-spaltende DNAzym, der aktiveres af en særlig bakterie, urease og magnetiske perler. Den DNAzym anvendes som molekylær genkendelse element at opnå meget specifik påvisning af en bakterie af interesse. Urease og magnetiske perler bruges til at opnå signaltransduktion af RNA-spaltning aktivitet af DNAzym. Dette indebærer oprettelsen af magnetiske perler, der indeholder urease-DNAzym konjugater. I nærvær af mål-bakterie, den DNAzym spalter dens RNA-binding. Denne handling giver anledning til dissociation af urease fra magnetiske perler. Den frigivne urease let kan adskilles fra magnetiske perler og anvendes til at generere en farveændring i en reporter opløsning, som indeholder urinstof og en pH-følsom farvestof. Urease hydrolyserer urinstof til ammoniak, ledsaget af en stigning i pH, der udløser color ændring af farvestoffet.
Figur 2 viser en bakteriel lakmusprøve hvor EC1, et E. coli-responsivt RNA-spaltende DNAzym, blev anvendt som DNAzym, og phenolrødt blev anvendt som pH-rapportering farvestof. EC1 er tidligere isoleret ved vores gruppe fra en tilfældig sekvens DNA pool under anvendelse af teknikken af in vitro-selektion. 5 Vore tidligere studier har vist, at EC1 er yderst specifik for E. coli og udviser minimal aktivitet over for andre bakterier. 5,19 Det har vist sig, EC1 aktiveres af et proteinmolekyle fra E. coli. Selvom identiteten af dette protein biomarkør ikke er blevet tydet, den høje anerkendelse specificitet antyder, at dette protein er unik for E. coli. Reporter opløsning er indstillet til at have en pH-værdi på 5,5. Ved denne pH, phenolrødt udviser en gul farve. Som urease hydrolyserer urinstof til ammoniak, den basicitet reporter solution stiger. Dette afspejles i den gradvise ændring af farve fra gul til pink. Dybden af farveændring er afhængig af følgende to parametre, som illustreret af figur 2: antallet af E. coli celler, der anvendes i DNAzym aktivering skridt, og fristen for urinstof hydrolyse trin. Mere E. coli celler resulterede i stærkere farveændringer, afspejles ved observation af en progressiv gul-til-pink farve overgang, når E. coli-celler blev serielt hævet fra 5 til 5 x 10 7 (10-gange stigning hver gang). I mellemtiden har en længere tid for urinstof hydrolyse tilladt til påvisning af et mindre antal E. coli-celler (5000 celler i 1 time reaktion og 500 celler i 2-timers reaktionstid).
Den pH-ændring af det bakterielle lakmusprøve kan også overvåges ved anvendelse af en håndholdt pH meter og repræsentative resultater er illustreret i figur 3. Det was fandt, at tilstedeværelsen af 10 7 E. coli-celler resulterede i en gradvis forøgelse af pH ved 3 enheder inden for 10 min. I modsætning hertil fravær af E. coli celler forårsagede ikke påviselige pH-ændringer under samme indstilling.
Figur 1: Udformningen princip bakteriel lakmusprøve (A) Aktivering af et RNA-spaltende DNAzym af en særlig biomarkør fra en bakterie af interesse.. I nærvær af biomarkør, RNA-spaltende DNAzym immobiliseret på magnetiske perler spalter RNA-binding, hvilket resulterer i frigivelsen af den mærkede urease fra magnetiske perler til opløsning. (B) Trestings assayproceduren. Trin 1: DNAzym aktivering som beskrevet i panel A. Trin 2: Magnetisk separation - den frigivne urease adskilles fra magnetiske perler. Trin 3: Urea hydrolyse R12; det frigivne urease tilsættes i en urinstof-holdig reporter opløsning. Urease hydrolyserer urinstof til ammoniak, hvilket resulterer i en ændring i pH, som kan indberettes af en pH-følsom farvestof. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: lakmusprøve med E. coli under anvendelse af E. coli-responsivt DNAzym EC1. Repræsentative farve skiftende resultater med varierende antal E. coli celler leveres over hver reagensglas. Phenolrødt blev anvendt som pH-følsomme farvestof. En test uden E. coli blev anvendt som en negativ kontrol. Mere E. forventes coli-celler til at forårsage frigivelse af flere urease molekyler, ledsaget By stærkere farveændringer. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Overvågning pH stigning ved anvendelse af et pH-meter Ændringen af pH forårsaget af 10 7 E.. coli-celler blev overvåget ved anvendelse af en bærbar pH-meter. En test uden E. coli blev anvendt som en negativ kontrol. Tilstedeværelsen af 10 7 E. coli-celler i prøveopløsningen kan øge basicitet ved ~ 3 pH-enheder i 10 min. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Navn | sekvens (5'-3 ') | Note |
| BS1 | BTTTT TTTTT TTTAC TCTTC CTAGC FRQGG TTCGA TCAAG A | B: 5'-Biotin; R: adenin ribonukleotid; F: fluorescein-dT; Q: dabcyl-dT |
| DE1 | GATGT GCGTT GTCGA GACCT GCGAC CGGAA CACTA CACTG TGTGG GGATG GATTT CTTTA CAGTT GTGTG TTGAA CGCTG TGTCA AAAAA AAAA | |
| T1 | GACAA CGCAC ATCTC TTGAT CGAAC C | |
| LD1 | XTTTT TTTTT TTTTT TTGAC ACAGC GTTCA A | X: 5'-NH2 |
Tabel 1: Sekvenser af syntetiske oligonukleotider.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Oversættelsen af virkningen af RNA-spaltning aktivitet af en bakterie-responsive DNAzym til en lakmusprøve er gjort mulig ved hjælp af urease og magnetisk separation, som illustreret af figur 1. Selv om demonstration af den modificerede lakmusprøve for bakteriel detektion er gøres med en E. coli -afhængige RNA-spaltende DNAzym, 5,19,20 designet kan generelt udvides til enhver RNA-spaltende DNAzym. I betragtning af den store tilgængelighed af RNA-spaltende DNAzymer til forskellige analytter og forskellige metoder til at isolere nye RNA-spaltende DNAzymer fra random-sekvens puljer til nye mål, forventer vi, at den modificerede lakmusprøve platform kan udvides til påvisning af forskellige mål af interesse .
Lakmusprøven for E. coli afsløring kan registrere 5.000 og 500 celler, når rapporteringen reaktionstiden er indstillet til at være en og 2 timer, hhv. Den populære polymerase kædereaktion (PCR) ogsandwich enzymbundet immunosorbentassay (ELISA) fremgangsmåder kan opnå detektionsgrænser på ca. 10 4 -10 5 E. coli celler i lignende svære tider. 25,26 således den bakterielle lakmusprøve tilbyder sammenlignelig afsløring følsomhed.
Selvom den bakterielle lakmusprøve er let at udføre og kan producere levende farveændringer kan flere faktorer påvirker testresultater væsentligt. For det første er kvaliteten af urease er meget vigtig. Vi har brugt urease fra forskellige kilder og fandt testresultaterne kan variere betydeligt. Vi anbefaler brug af urease fra kilden er angivet i afsnittet Materialer.
Samlingen af DNAzym / urease / magnetiske perler kræver særlig opmærksomhed. Grundig vask af magnetiske perler for at fjerne uhybridiseret UrDNA er nødvendig for at forhindre falsk-positive resultater. Man skal også tages for at undgå ophobning af resterende magnetiske perler på den indvendige overflade af lid af mikrofugerøret, hvilket kan være vanskeligt at se. Når du er der, er de magnetiske perler ikke længere udsat for magnetisk separation og dermed kunne bære nogle uhybridiseret UrDNA der kan føre til falsk-positive signaler i reporter reaktion. Det er også vigtigt at undgå at efterlade mikrofugerøret på den magnetiske stativ i mere end 10 min under den magnetiske separation trin. Perlerne kan aggregere eller holde sig til mikrofugerøret, hvilket kan reducere vask effektivitet og indføre batch-til-batch inkonsekvens. Inddragelse af 0,01% Tween-20 i vaske- løsning kan forbedre batch-til-batch konsistens og bør gennemføres.
De magnetiske perler er coatet med streptavidin, der blev anvendt som anker for at samle DNAzym-urease konjugater på de magnetiske perler. Både streptavidin og urease er proteinmolekyler, der kan denatureres under opbevaring. Vi gemmer typisk de samlede DNAzym-urease-magnetiske perler ved 4 ° C i op til 4 ugerog gøre friske partier regelmæssigt for at opnå mere ensartede resultater.
Man skal også tages for at undgå uheld tager magnetiske perler i magnetisk separation trin (trin 6.9) efter DNAzym aktivering. Fra vores erfaring, kan cellerester og andre partikler i opløsningen reducere den magnetiske adskillelse effektiviteten og derfor kan nogle magnetiske perler utilsigtet tages ud under pipettering. Dette vil resultere i falsk-positive resultater. Vi anbefaler følgende foranstaltninger for at afhjælpe problemet: en længere adskillelse tid (såsom 5-10 min), en langsommere frigivelse af pres på pipetten for at tillade blid tilbagetrækning af supernatanten, og underkaste supernatanten til en ekstra runde af magnetisk separation .
Endelig er det vigtigt at undgå ulykker forurening af reporter stamopløsning af urease i løbet af et forsøg, hvor flere prøver testes. I betragtning af den høje reaktivitet af urease, forurening af denne art kan føre til falsk-positive resultater.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | VWR AMRESCO | 0105 | |
| Sodium Hydroxide (NaOH) pellets | BIO BASIC CANADA INC. | SB6789 | |
| Tris-base | VWR AMRESCO | 0497 | |
| Boric acid | AMRESCO | 0588 | |
| Urea | VWR AMRESCO | M123 | |
| 40% acrylamide/bisacrylamide (29:1) solution | BIO BASIC CANADA INC. | A0007 | |
| Sucrose | Bioshop Canada inc. | SUC507 | |
| Bromophenol blue | Bioshop Canada inc. | BRO777 | |
| Xylenecyanol FF | SIGMA-ALDRICH | X-4126 | |
| 10% sodium dodecyl sulfate | Bioshop Canada inc. | SDS001 | |
| Hydrochloric Acid (HCl) | CALEDON LABORATORIES LTD | 6026 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Bioshop Canada inc. | SOD001 | |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Bioshop Canada inc. | HEP001 | |
| Magnesium Chloride (II) hexahydrate | VWR AMRESCO | 0288 | |
| Tween 20 | Bioshop Canada inc. | TW508 | |
| Adenosine Triphospahte (ATP) | AMRESCO | 0220 | |
| Sodium Acetate trihydrate (NaOAc) | SIGMA-ALDRICH | S8625 | |
| Ethanol | Commercial Alcohols | P016EAAN | |
| Tetramethyleneethylenediamine (TEMED) | AMRESCO | 0761 | |
| 10% Ammonium persulfate (APS) | BIO BASIC CANADA INC. | AB0072 | |
| Succinimidyl 4-(N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate (SMCC) | ThermoFisher SCIENTIFIC | 22360 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | CALEDON LABORATORIES | 803540 | |
| Urease | SIGMA-ALDRICH | U0251 | |
| 1x Phosphate Buffered Saline (PBS) | ThermoFisher SCIENTIFIC | 70011-069 | |
| 0.04% Phenol red | SIGMA-ALDRICH | P3532 | |
| 10x T4 polynucleotide kinase reaction buffer | Lucigen | 30061-1 | |
| 10x T4 DNA ligase reaction buffer | Bio Basics Canada | B1122-B | |
| T4 DNA ligase (5 U/μl) | Thermo Fischer Scientific | B1122 | |
| Luria Bertani (LB) Broth | AMRESCO | J106 | |
| Agar | AMRESCO | J637 | |
| T4 polynucleotide kinase (10 U/μl) | Lucigen | 30061-1 | |
| E. coli K12 (MG1655) | ATCC | ATCC700926 | |
| Centrifuge | Beckman Coulter, Inc. | 392187 | |
| Glass plates | CBS scientific | ngp-250nr | |
| 0.75 mm thick spacers | CBS scientific | VGS-0725r | |
| 12-well comb | CBS scientific | VGC-7512 | |
| UV Lamp | UVP | 95-0017-09 | |
| Spectrophotometer (NanoVue) | GE Healthcare | N/A | |
| Metal plate | CBS scientific | CPA165-250 | |
| Vortex | VWR International | 58816-123 | |
| Gel electrophoresis apparatus | CBS scientific | ASG-250 | |
| Petri dishes | VWR International | 25384-342 | |
| 100 kDa MWCO centrifugal filters | EMD Millipore | UFC510024 | |
| Magnetic Bead (BioMag) | Bangs Laboratories Inc | BM568 | |
| Magnetic Seperation Rack | New England BioLabs | S1506S | |
| Microfuge tubes | Sarstedt | 72.69 | |
| Syringe filter (0.22 μm) | VWR International | 28145-501 | |
| 14 ml culture tube | VWR International | 60818-725 | |
| Cell culture incubator | Eppendorf Scientific | M13520000 | |
| Branson Ultrasonic cleaner | Branson | N/A | |
| Camera (Canon Powershot G11) | Canon | N/A | |
| 50 ml conical tube | VWR International | 89004-364 |
References
- Daar, A. S., et al. Top ten biotechnologies for improving health in developing countries. Nat. Genet. 32, 229-232 (2002).
- Newman, J. D., Turner, A. P. Home blood glucose biosensors: a commercial perspective. Biosens. Bioelectron. 20, 2435-2453 (2005).
- Turner, A. P.
- Tram, K., Kanda, P., Salena, B. J., Huan, S. Y., Li, Y. F. Translating Bacterial Detection by DNAzymes into a Litmus Test. Angew. Chem. Int. Ed. 53, 12799-12802 (2014).
- Ali, M. M., Aguirre, S. D., Lazim, H., Li, Y. Fluorogenic DNAzyme probes as bacterial indicators. Angew. Chem. Int. Ed. 50, 3751-3754 (2011).
- Schlosser, K., Li, Y. Biologically inspired synthetic enzymes made from DNA. Chem. Biol. 16, 311-322 (2009).
- Tuerk, C., Gold, L. Systematic evolution of ligand by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase. Science. 249, 505-510 (1990).
- Ellington, A. D., Szostak, J. W. In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands. Nature. 346, 818-822 (1990).
- Breaker, R. R.
- Liu, J., Cao, Z., Lu, Y.
- Navani, N. K., Li, Y. Nucleic acid aptamers and enzymes as sensors. Curr. Opin. Chem. Biol. 10, 272-281 (2006).
- Li, J., Lu, Y. A highly sensitive and selective catalytic DNA biosensor for lead ions. J. Am. Chem. Soc. 122, 10466-10467 (2000).
- Liu, J., Lu, Y. A colorimetric lead biosensor using DNAzyme-directed assembly of gold nanoparticles. J. Am. Chem. Soc. 125, 6642-6643 (2003).
- Liu, Z., Mei, S. H. J., Brennan, J. D., Li, Y. Assemblage of signaling DNA enzymes with intriguing metal specificity and pH dependence. J. Am. Chem. Soc. 125, 7539-7545 (2003).
- Liu, J., et al. A catalytic beacon sensor for uranium with parts-per-trillion sensitivity and millionfold selectivity. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104, 2056-2061 (2007).
- Huang, P. J., Vazin, M., Liu, J. In vitro selection of a new lanthanide-dependent DNAzyme for ratiometric sensing lanthanides. Anal. Chem. 86, 9993-9999 (2014).
- Chiuman, W., Li, Y. Simple fluorescent sensors engineered with catalytic DNA 'MgZ' based on a non-classic allosteric design. PLoS One. 2, e1224 (2007).
- Xiang, Y., Lu, Y. Using personal glucose meters and functional DNA sensors to quantify a variety of analytical targets. Nat. Chem. 3, 697-703 (2011).
- Aguirre, S. D., Ali, M. M., Salena, B. J., Li, Y. A sensitive DNA enzyme-based fluorescent assay for bacterial detection. Biomolecules. 3, 563-577 (2013).
- Aguirre, S. D., Ali, M. M., Kanda, P., Li, Y. F. Detection of Bacteria Using Fluorogenic DNAzymes. J. Vis. Exp. (63), e3961 (2012).
- Shen, Z., et al. A catalytic DNA activated by a specific strain of bacterial pathogen. Angew. Chem. Int. Ed. 54, (2015).
- He, S., et al. Highly specific recognition of breast tumors by an RNA-cleaving fluorogenic DNAzyme probe. Anal. Chem. 87, 569-577 (2015).
- Sumner, J. B., Hand, D. B.
- Karplus, P. A., Pearson, M., Hausinger, R. P. 70 Years of crystalline urease: What have we learned. Acc. Chem. Res. 30, 330-337 (1997).
- Omiccioli, E., Amagliani, G., Brandi, G., Magnani, M. A new platform for Real-Time PCR detection of Salmonella spp., Listeria monocytogenes and Escherichia coli O157 in milk. Food Microbiol. 26, 615-622 (2009).
- Cui, S., Schroeder, C. M., Zhang, D. Y., Meng, J. Rapid sample preparation method for PCR-based detection of Escherichia coli O157:H7 in ground beef. J. Appl. Microbiol. 95, 129-134 (2003).
- Ibekwe, A. M., Watt, P. M., Grieve, C. M., Sharma, V. K., Lyons, S. R. Multiplex fluorogenic real-time PCR for detection and quantification of Escherichia coli O157:H7 in dairy wastewater wetlands. Appl. Environ. Microbiol. 68, 4853-4862 (2002).
- Strachan, N. J., Ogden, I. D. A sensitive microsphere coagulation ELISA for Escherichia coli O157:H7 using Russell's viper venom. FEMS Microbiol Lett. 186, 79-84 (2000).
- de Boer, E., Beumer, R. R. Methodology for detection and typing of foodborne microorganisms. Int. J. Food Microbiol. 50, 119-130 (1999).
- Gracias, K. S., McKillip, J. L. A review of conventional detection and enumeration methods for pathogenic bacteria in food. Can. J. Microbiol. 50, 883-890 (2004).
