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Biology

लिटमस परीक्षण का उपयोग बैक्टीरिया का पता लगाने Colorimetric

Published: September 17, 2016 doi: 10.3791/54546
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 3, 1
1Department of Biochemistry and Biomedical Sciences, McMaster University, 2Department of Chemistry and Chemical Biology, McMaster University, 3Department of Medicine, McMaster University

Protocol

1. अभिकर्मकों और बफ़र की तैयारी

  1. 0.5 एम ethylenediaminetetraacetic एसिड (EDTA)
    1. (DDH 2 हे) एक 2 एल बीकर में, विआयनीकृत-आसुत जल के 800 मिलीलीटर के लिए 186.1 ग्राम EDTA जोड़ें। NaOH के छर्रों का उपयोग कर 8.0 के समाधान के पीएच को समायोजित करें। DDH 2 हे 1.0 एल के अंतिम मात्रा में जोड़ें और 4 डिग्री सेल्सियस पर autoclaving और दुकान के लिए एक autoclavable कांच की बोतल का हल हस्तांतरण।
  2. 10 × Tris-borate EDTA (10x TBE)
    1. एक 4 एल प्लास्टिक बीकर में, सभी घटकों को जब तक हलचल पट्टी का उपयोग 4 एल मिक्स के अंतिम मात्रा को 432 छ Tris आधार, 200 ग्राम बोरिक एसिड, 0.5 एम EDTA (पीएच 8.0) और DDH 2 हे के 80 मिलीलीटर जोड़ने भंग कर रहे हैं। 4 डिग्री सेल्सियस पर autoclaving और दुकान के लिए 1 एल कांच की बोतलों का हल स्थानांतरण।
  3. 10% denaturing polyacrylamide स्टॉक
    1. एफ जब तक समाधान और DDH 2 हे: (1 29) एक 4 एल प्लास्टिक बीकर में, 1681.7 जी यूरिया, 400 मिलीलीटर 10x TBE, 40% एक्रिलामाइड / bisacrylamide के 1 एल जोड़नेinal मात्रा हलचल पट्टी का उपयोग कर जब तक यूरिया भंग कर रहा है 4 एल मिश्रण है। 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 एल एम्बर कांच की बोतलें और स्टोर करने के लिए समाधान स्थानांतरण।
  4. 2x जेल लोड हो रहा बफर (2x GLB)
    1. एक 200 मिलीलीटर कांच बीकर में, 44 ग्राम यूरिया, 8 ग्राम सूक्रोज, 10 मिलीग्राम bromophenol नीले, 10 मिलीग्राम xylene cyanol एफएफ, 10% सोडियम dodecyl सल्फेट के 400 μl, और 10 × TBE के 4 मिलीलीटर जोड़ें। DDH 2 हे 40 मिलीलीटर की एक अंतिम मात्रा में जोड़ें और 50 डिग्री सेल्सियस पर हल्के हीटिंग के साथ घटकों को भंग एक चुंबकीय हलचल पट्टी के साथ मिश्रण है। 1.5 मिलीलीटर microfuge ट्यूबों के लिए स्थानांतरण 1 मिलीलीटर विभाज्य और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर।
      नोट: प्रायर उपयोग किसी ठोस redissolve करने के लिए 90 डिग्री सेल्सियस पर संक्षिप्त हीटिंग की आवश्यकता है।
  5. 1 एम Tris-हाइड्रोक्लोराइड (Tris एचसीएल) (7.5 पीएच)
    1. एक कांच की बोतल में, Tris आधार का 12.1 जी और DDH 2 हे की 70 मिलीलीटर जोड़ने और मिश्रण जब तक ठोस भंग कर रहा है। 1 एम हाइड्रोक्लोरिक एसिड (एचसीएल) का उपयोग 7.5 पीएच को समायोजित करें। DDH 2 हे 100 मिलीलीटर, आटोक्लेव और एसटू के अंतिम मात्रा में जोड़ेफिर से 4 डिग्री सेल्सियस पर
  6. 5 एम सोडियम क्लोराइड (NaCl)
    1. एक कांच की बोतल में, DDH 2 ओ की 150 मिलीलीटर में सोडियम क्लोराइड का 58.4 ग्राम भंग DDH 2 ओ के साथ 200 मिलीलीटर मात्रा समायोजित करें 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर।
  7. डीएनए क्षालन बफर
    1. एक कांच की बोतल में, 1 एम Tris एचसीएल (7.5 पीएच), 5 एम NaCl के 8.0 मिलीग्राम और 0.5 एम EDTA के 0.4 मिलीलीटर (8.0 पीएच) के 2.0 मिलीलीटर मिश्रण। DDH 2 हे, 4 डिग्री सेल्सियस पर आटोक्लेव और दुकान के साथ 200 मिलीलीटर मात्रा समायोजित करें।
  8. 1 एम 4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazineethanesulfonic एसिड (HEPES) (7.4 पीएच)
    1. एक कांच की बोतल में, DDH 2 ओ के 80 मिलीलीटर में HEPES की 2.38 ग्राम भंग 5 एन NaOH का उपयोग 7.4 पीएच को समायोजित और 100 मिलीलीटर की एक अंतिम मात्रा DDH 2 हे जोड़ें।
  9. 1 एम मैग्नेशियम क्लोराइड (2 MgCl)
    1. एक कांच की बोतल में, 2 MgCl -6H 2 ओ की 2.03 ग्राम जोड़ें और DDH 2 ओ के साथ 100 मिलीलीटर मात्रा लाना
  10. प्रतिक्रिया बफर (आरबी)
      2 MgCl के 0.75 मिलीलीटर, और बीच -20 के 5 μl के 50 μl जोड़ें। DDH 2 हे 50 मिलीलीटर की एक अंतिम मात्रा में जोड़े। समाधान मिश्रण और उपयोग करें जब तक 4 डिग्री सेल्सियस पर एक सिरिंज संचालित फिल्टर (0.22 माइक्रोन) और दुकान का उपयोग कर एक और शंक्वाकार ट्यूब में फिल्टर।
  11. बाध्यकारी बफर (बी बी)
    1. एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में, 1 एम Tris एचसीएल (पीएच 7.5) के 500 μl, NaCl के 8.8 ग्राम, 1 एम 2 MgCl के 50 μl, और बीच 20 का 5 μl जोड़ने DDH 2 हे अंतिम मात्रा में जोड़े 50 मिलीलीटर की। समाधान मिश्रण और उपयोग करें जब तक 4 डिग्री सेल्सियस पर एक सिरिंज संचालित फिल्टर (0.22 माइक्रोन) और दुकान का उपयोग कर एक और शंक्वाकार ट्यूब में फिल्टर।
  12. सब्सट्रेट समाधान (एसएस)
    1. एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में, सोडियम क्लोराइड का 5.8 जी, 2 MgCl 1 एम के 3 मिलीलीटर, 1.5 ग्राम यूरिया, और DDH 2 ओ के 40 मिलीलीटर जोड़ने 10 मिमी एचसीएल का उपयोग 5.0 करने के लिए समाधान के पीएच को समायोजित करें। क्योंकि समाधान बफर नहीं है, एचसीएल का उपयोग पीएच को समायोजितध्यान से छोटे एचसीएल aliquots के अलावा के माध्यम से। DDH 2 हे 50 मिलीलीटर की एक अंतिम मात्रा में जोड़े।
    2. समाधान मिश्रण और उपयोग करें जब तक 4 डिग्री सेल्सियस पर एक सिरिंज संचालित फिल्टर (0.22 माइक्रोन) और दुकान का उपयोग कर एक और शंक्वाकार ट्यूब में फिल्टर।
  13. Luria Bertani (पौंड) शोरबा
    1. एक बीकर में, DDH 2 ओ का 1 एल में 20.0 छ पौंड पाउडर भंग 4 डिग्री सेल्सियस पर एक कांच की बोतल, आटोक्लेव, और स्टोर करने के लिए स्थानांतरण।
  14. 1.5% लेग अगर
    1. एक 250 मिलीलीटर कुप्पी में, 1.5 ग्राम अगर और लेग शोरबा के 100 मिलीलीटर जोड़ें। आटोक्लेव और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर।
  15. अगर प्लेटें
    1. एक माइक्रोवेव में लेग अगर redissolve और समाधान करने के लिए ~ 50 डिग्री सेल्सियस शांत। , पेट्री डिश में समाधान डालो 5 प्लेटें बनाने ~ और उन्हें जमना करने की अनुमति।

2. संश्लेषण और ई की शुद्धि coli- उत्तरदायी DNAzyme EC1

  1. खाका मध्यस्थता एंजाइमी Ligation द्वारा EC1 के संश्लेषण
    1. कॉम शुद्धercially संश्लेषित ओलईगोन्युक्लियोटाईड्स BS1, DE1, और T1 10% मानक प्रोटोकॉल के अनुसार denaturing जेल वैद्युतकणसंचलन (dPAGE) से (तालिका 1 में प्रदान दृश्यों)।
    2. BS1, DE1, और T1 की 100 माइक्रोन के शेयर तैयार करें। -20 डिग्री सेल्सियस उपयोग करें जब तक पर स्टोर।
    3. एक 1.5 मिलीलीटर microfuge ट्यूब में, DDH 2 हे की 38.5 μl, DE1 के 5 μl, और 10x टी -4 polynucleotide काइनेज प्रतिक्रिया बफर के 5 μl एंजाइम आपूर्तिकर्ता (500 मिमी Tris एचसीएल (7.6 पीएच), 100 मिमी 2 MgCl द्वारा प्रदान जोड़ने 50 मिमी dithiothreitol (डीटीटी), 1.0 मिमी spermidine)।
    4. adenosine triphosphate (एटीपी) (100 मिमी) के 1 μl जोड़ें। टी -4 polynucleotide काइनेज के 5 इकाइयों (10 यू / μl) जोड़ें। सावधानी से प्रतिक्रिया मिश्रण pipetting द्वारा मिक्स।
    5. 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर प्रतिक्रिया सेते हैं।
    6. 5 मिनट के लिए 90 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करने से प्रतिक्रिया बुझाने।
    7. DDH 2 हे के 118 μl, BS1 के 5 μl, और T1 के 5 μl जोड़ें। 2 मील के लिए 90 डिग्री सेल्सियस के लिए प्रतिक्रिया गर्मीn और फिर 10 मिनट से अधिक कमरे के तापमान को शांत।
    8. 10 × टी -4 डीएनए ligase प्रतिक्रिया एंजाइम आपूर्तिकर्ता द्वारा प्रदान बफर के 20 μl जोड़ें (400 मिमी Tris एचसीएल (7.8 पीएच), 100 मिमी 2 MgCl, 100 मिमी डीटीटी, 5 मिमी एटीपी)। टी -4 डीएनए ligase की 10 इकाइयों (5 यू / μl) जोड़ें और ध्यान से pipetting द्वारा मिश्रण।
    9. 2 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं।
    10. 3 एम सोडियम एसीटेट (NaOAc) (पीएच 5.2) के 20 μl, ठंड 100% इथेनॉल के 500 μl जोड़ें। vortexing द्वारा समाधान मिक्स और 30 मिनट के लिए एक -20 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में ट्यूब जगह।
    11. 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए 20,000 XG पर microfuge अपकेंद्रित्र। ध्यान pipetting द्वारा सतह पर तैरनेवाला हटा दें।
    12. ठंड 70% इथेनॉल और सेंट्रीफ्यूज के साथ गोली 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 20,000 XG पर फिर से धो लें। एक बार फिर सतह पर तैरनेवाला हटाने और 10 मिनट के लिए वैक्यूम के अंतर्गत गोली सूखी।
    13. DDH 2 हे के 15 μl के साथ डीएनए Resuspend और फिर 2x GLB के 15 μl जोड़ें।
    14. सख्ती भंवर और 90 डिग्री सेल्सियस के लिए गर्मी के लिए2 मिनट। नीचे के रूप में वर्णित 10% dPAGE द्वारा पूर्ण लंबाई डीएनए शुद्ध।
  2. 10% dPAGE की स्थापना
    1. स्वच्छ दो गिलास प्लेट (एक पूर्ण प्लेट और एक नोकदार), दो 0.75 मिमी मोटी स्पेसर, और एक 12 अच्छी तरह कंघी। प्रत्येक पक्ष पर दो spacers और शीर्ष पर नोकदार थाली के साथ एक सपाट सतह पर एक गिलास प्लेट निर्धारित करना। दो प्लेटें एक साथ आपूर्तिकर्ता द्वारा प्रदान चार क्लिप का उपयोग क्लिप।
    2. एक 150 मिलीलीटर की प्लास्टिक बीकर में, 10% dPAGE के 40 मिलीलीटर, (TEMED) tetramethylethylenediamine के 40 μl, और 10% अमोनियम persulfate (ए पी) के 400 μl डालना। घटकों का मिश्रण और प्लेटों के बीच धीरे-धीरे समाधान डालना।
    3. कंघी डालें और फिर जेल में 10 मिनट भाजन करने के लिए अनुमति देते हैं। एक बार जेल polymerized है, धीरे-धीरे कंघी को हटाने और DDH 2 ओ के साथ कुओं निकलवाने
    4. जेल वैद्युतकणसंचलन तंत्र पर प्लेटों माउंट। overheating रोकने के लिए उत्पन्न गर्मी नष्ट करने के लिए एक धातु की थाली का प्रयोग करें।
    5. ऊपर और नीचे के कक्षों पर 1x TBE डालोऔर सुनिश्चित करें कि कुओं में अच्छी तरह से बफर में डूबे हुए हैं। एक विंदुक या सिरिंज का उपयोग 1x TBE के साथ कुओं फ्लश।
    6. नमूने लोड करने से पहले 15 मिनट के लिए 35 मा पर चलाने के लिए उपकरण और पूर्व रन सेट करें।
  3. 10% dPAGE से ligated EC1 की क्षालन
    1. कदम 2.2.6 के बाद, नीचे डाई (bromophenol नीला) तक 35 मा पर जेल चला गिलास प्लेट के नीचे तक पहुँचता है। यह लगभग 1.5 घंटे के लिए ले जाना चाहिए। बिजली बंद करें और तंत्र से प्लेटें निकाल दें।
    2. कागज तौलिए के कुछ चादरें पर प्लेटें निर्धारित करना और ध्यान से गिलास प्लेट से spacers हटा दें। ध्यान से शीर्ष गिलास प्लेट हटाने और प्लास्टिक की चादर के साथ जेल लपेटो।
    3. पर जेल फ्लिप दूसरा गिलास प्लेट हटा दें और फिर प्लास्टिक की चादर के साथ कवर करने के लिए। प्लास्टिक की चादर की झुर्रियों से बचने के लिए ध्यान रखना।
    4. यूवी ग्रहण (260 एनएम) है, जो 4 अलग डीएनए बैंड (पूरी तरह से ligated EC1, DE1, BS1, और T1) का उत्पादन होगा उपयोग करके ligated उत्पाद कल्पना।
    5. 5 मिनट के लिए 20,000 XG पर जेल समाधान अपकेंद्रित्र और ध्यान से एक और 1.5 मिलीलीटर microfuge ट्यूब सतह पर तैरनेवाला के 400 μl हस्तांतरण। pipetting दौरान जेल टुकड़े को वापस लेने से बचें।
    6. स्थानांतरित कर सतह पर तैरनेवाला साथ microfuge ट्यूब ठंड 100% इथेनॉल के 1.0 मिलीलीटर 40 3 एम NaOAc (5.2 पीएच) के μl, और जोड़ें। vortexing द्वारा समाधान मिक्स और 30 मिनट के लिए एक -20 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में ट्यूब जगह।
    7. 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए 20,000 XG पर microfuge अपकेंद्रित्र। ध्यान pipetting द्वारा सतह पर तैरनेवाला हटा दें।
    8. ठंड 70% इथेनॉल और सेंट्रीफ्यूज के साथ गोली 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 20,000 XG पर फिर से धो लें। एक बार फिर, हटानेतैरनेवाला और 10 मिनट के लिए वैक्यूम के अंतर्गत गोली सूखी।
    9. 260 एनएम पर यूवी absorbance को मापने के द्वारा EC1 की एकाग्रता का निर्धारण। एक 10 माइक्रोन के शेयर बनाओ और -20 डिग्री सेल्सियस उपयोग करें जब तक नमूना संग्रहीत करते हैं।

3. डीएनए के लिए urease के विकार

  1. Succinimidyl 4- (एन-maleimidomethyl) cyclohexane-1-कार्बोक्सिलेट (SMCC) स्टॉक की तैयारी
    1. DMSO के 676 μl में 1 मिलीग्राम SMCC भंग। भंवर और उपयोग करें जब तक बर्फ पर जगह है।
  2. Urease स्टॉक की तैयारी
    1. 1 × पीबीएस (कोई 2 मिलीग्राम + या सीए 2) के 1 मिलीलीटर में 1 मिलीग्राम urease भंग। बर्फ पर उपयोग करें जब तक रखें।
      नोट: सघन urease भंग करने के लिए धीमी है और सौम्य मिश्रण विकृतीकरण से बचने की जरूरत है।
  3. Urease-डीएनए के संश्लेषण (UrDNA)
    1. एक 2.5 मिलीलीटर microfuge ट्यूब के लिए 100 माइक्रोन के LD1 के 10 μl जोड़ें। DDH 2 हे के 140 μl, 10x पीबीएस के 40 μl, और भंवर जोड़ें।
    2. SMCC एस के 80.5 μl जोड़ेटॉक, एक benchtop सेंट्रीफ्यूज का उपयोग कर DMSO, भंवर, और संक्षेप में सेंट्रीफ्यूज के 159.5 μl।
    3. 60 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं। microfuge टोपी के तहत संघनन से बचें।
    4. ठंड 100% इथेनॉल के 1.5 मिलीलीटर 200 1x पीबीएस के μl, 3 एम NaOAc (5.2 पीएच) के 60 μl, और जोड़ें। vortexing द्वारा समाधान मिश्रण और 30 मिनट के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
    5. 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए 20,000 XG पर समाधान अपकेंद्रित्र। तैरनेवाला निकालें और वैक्यूम के अंतर्गत गोली सूखी। ओवर-सुखाने से बचें।
    6. सूखे गोली urease शेयर के 400 μl जोड़ें और 5 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं।
    7. एक पूर्व धोया 100k MWCO केन्द्रापसारक फिल्टर स्तंभ के लिए कच्चे तेल की साधना के 200 μl स्थानांतरण। 5 मिनट के लिए 14,000 XG पर स्तंभ अपकेंद्रित्र।
    8. 5 मिनट के लिए 14,000 XG पर स्तंभ और सेंट्रीफ्यूज के लिए कच्चे तेल की साधना की शेष 200 μl स्थानांतरण। स्तंभ निकालें और एक नया 2.0 मिलीलीटर microfuge ट्यूब ( "संग्रह ट्यूब") में यह उल्टा जगह है।
    9. Centrifuge संग्रह ट्यूब 2 मिनट के लिए 1,000 XG पर (उल्टे स्तंभ के साथ)। संग्रह ट्यूब निकालें और conjugates की अतिरिक्त वसूली के लिए झिल्ली धोने के लिए केन्द्रापसारक स्तंभ के लिए 1x पीबीएस के 30 μl जोड़ें।
    10. एक बार फिर स्तंभ पलटना और संग्रह ट्यूब में वापस जगह है। 2 मिनट के लिए 1,000 XG पर अपकेंद्रित्र संग्रह ट्यूब (उल्टे स्तंभ के साथ)। निकालें और स्तंभ निपटाने।
    11. उपयोग करें जब तक 4 डिग्री सेल्सियस पर UrDNA स्टोर।

चुंबकीय मोती पर EC1 और UrDNA की 4. विधानसभा

  1. चुंबकीय मनका (एमबी) के शेयर में अच्छी तरह से मिलाएं और एक 1.5 मिलीलीटर microfuge ट्यूब एमबी निलंबन के 100 μl हस्तांतरण। एमबी अलग-थलग करने के लिए एक चुंबकीय रैक धारक पर microfuge ट्यूब रखें।
  2. pipetting द्वारा तैरनेवाला निकालें और ट्यूब के लिए बफर (बी बी) बाध्यकारी के 150 μl जोड़ें। धारक से ट्यूब निकालें और ध्यान से ट्यूब एक सजातीय समाधान के लिए एमबी resuspend करने के लिए नल। टी करने के लिए निलंबन splashing से बचेंट्यूब या टोपी के सेशन। यदि ऐसा होता है, एक benchtop सेंट्रीफ्यूज का उपयोग संक्षेप अवशेषों वापस निलंबन के लिए स्पिन करने के लिए।
  3. दोहराएँ कदम 4.2 दो बार।
  4. इस निलंबन के लिए 10 माइक्रोन EC1 के 10 μl जोड़ें। ध्यान से ट्यूब पर दोहन से मिश्रण।
  5. हल्के झटकों के साथ 30 मिनट के लिए समाधान सेते हैं। ट्यूब हर 2-3 मिनट ठोकर एमबी की वर्षा से बचने के लिए।
  6. microfuge ट्यूब चुंबकीय रैक पर वापस प्लेस एमबी अलग और pipetting द्वारा सतह पर तैरनेवाला हटा दें। बी बी के 150 μl (4.2 कदम के रूप में वर्णित) के साथ एमबी तीन बार धोएं।
  7. एक बार धोने पूरा हो गया है, बी बी के 150 μl के कुल में एमबी निलंबित। इस समाधान करने के लिए, UrDNA के 15 μl जोड़ें और 2 मिनट के लिए 45 डिग्री सेल्सियस का हल गर्मी। कमरे के तापमान का हल कूल और 2 घंटे के लिए सेते हैं।
  8. microfuge ट्यूब चुंबकीय रैक पर वापस प्लेस एमबी अलग और pipetting द्वारा सतह पर तैरनेवाला हटा दें।
  9. प्रतिक्रिया बफर (आरबी) के 100 μl जोड़ें। टी हटायेवह चुंबकीय रैक से ट्यूब microfuge और ध्यान एमबी resuspend।
  10. कदम 4.9 एमबी दोहरा द्वारा तीन बार धोएं।
    नोट: धोया सतह पर तैरनेवाला जल्दी से निर्धारित करने के लिए यदि unhybridized UrDNA अभी भी मौजूद है, जो एक झूठी सकारात्मक संकेत में परिणाम हो सकता है परीक्षण किया जा सकता है। परीक्षा 50 मिमी यूरिया के 10 μl और 0.04% फिनोल के 10 μl धोने के समाधान के लिए लाल जोड़कर किया जा सकता है। एमबी धोने के लिए जब तक धोने समाधान एक रंग बदलने का कारण नहीं है जारी रखें। 100 μl निलंबन उपयोग करें जब तक 4 डिग्री सेल्सियस पर भंडारित किया जाता है।

5. बैक्टीरियल कोशिकाओं 20 की तैयारी

  1. संवर्धन ई स्टॉक्स से कोलाई
    1. प्लेट ई कोलाई K12 (MG1655) एक लौ के तहत या एक जैविक सुरक्षा कैबिनेट में एक ग्लिसरॉल स्टॉक से लेग अगर प्लेटों पर।
    2. एक बाँझ विंदुक टिप का उपयोग करना, धीरे ग्लिसरॉल शेयर और हल्के से लकीर एक अगर प्लेट की सतह को छूने लेग अगर puncturing से बचने के लिए।
    3. धारीवाले उलटेंप्लेट और 14 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
    4. 3 सप्ताह की एक अधिकतम के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर Parafilm के साथ थाली और दुकान सील।
  2. संवर्धन ई सेल गिनती के लिए कोलाई
    1. एक बाँझ 14 मिलीलीटर संस्कृति ट्यूब में, लेग शोरबा के 2 मिलीलीटर बांटना।
    2. एक बाँझ विंदुक टिप का उपयोग करना, परेशान अगर प्लेट 5.1 कदम में तैयार से एक भी कॉलोनी उठाओ और संस्कृति ट्यूब को हस्तांतरण।
    3. 37 डिग्री सेल्सियस पर संस्कृति सेते हैं और 14 घंटे के लिए 230 rpm पर हिला।
    4. क्रमानुसार 10 गुना के अंतराल में जीवाणु संस्कृति पतला।
    5. प्रत्येक पतला नमूना के लिए, समान रूप से अलग लेग अगर प्लेटों पर पाँच 100 μl aliquots थाली। प्लेटों पलटना और 14 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
    6. प्रत्येक कमजोर पड़ने की औसत सेल एकाग्रता प्राप्त करने के लिए प्रत्येक नमूने की कोशिकाओं की गणना।
      नोट: 10 7 कोशिकाओं अक्सर ई के लिए एक संदर्भ अग्निपरीक्षा स्थापित करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं ई के इस स्तर के रूप में कोलाई कोलाई एक त्वरित रंग चान ट्रिगर कर सकते हैंजीई। हालांकि, एक ठीक से मार डाला लिटमस परीक्षण के रूप में परिणाम अनुभाग में चर्चा की, के रूप में कम के रूप में 500 कोशिकाओं का पता लगाने कर सकते हैं।
  3. ई तैयारी परीक्षण के लिए कोलाई कोशिकाओं
    1. एक वांछित सेल निलंबन के लिए, हस्तांतरण एक 1.5 मिलीलीटर microfuge ट्यूब सुसंस्कृत शेयर के 1 मिलीलीटर।
    2. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 6000 XG पर कोशिकाओं अपकेंद्रित्र। ध्यान से सेल गोली परेशान बिना सतह पर तैरनेवाला हटा दें।
    3. सेल गोली प्रतिक्रिया बफर के 10 μl जोड़ें और कोशिकाओं resuspend। 5 मिनट के लिए सेल निलंबन Sonicate। 5 मिनट के लिए एक आइस बॉक्स सेल निलंबन स्थानांतरण।
    4. एक और 5 मिनट के लिए सेल निलंबन Sonicate।
    5. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 13,000 XG पर सेल निलंबन अपकेंद्रित्र। परीक्षण के लिए सतह पर तैरनेवाला (10 μl) का प्रयोग करें।

6. अग्निपरीक्षा

  1. एक 1.5 मिलीलीटर microfuge ट्यूब में, microfuge ट्यूब में जोड़ने और प्रतिक्रिया बफर (आरबी) के 100 μl vortexing द्वारा ट्यूब prewash औरबफर discarding।
  2. स्थानांतरण धोया microfuge ट्यूब के लिए इकट्ठे EC1 (प्रोटोकॉल 4) के 15 μl।
  3. एक चुंबकीय रैक पर microfuge ट्यूब रखकर चुंबकीय मोती धो लें। pipetting द्वारा सतह पर तैरनेवाला निकालें। रैक से microfuge ट्यूब निकालें, आरबी के 100 μl जोड़ने के लिए, और ध्यान से चुंबकीय मोती resuspend।
  4. कदम 6.3 एमबी दोहरा द्वारा दो बार धोएं।
  5. Microfuge ट्यूब वापस चुंबकीय रैक पर रखें, सतह पर तैरनेवाला हटाने और 10 μl ई जोड़ने कोलाई नमूना कदम 5.3 से तैयार किया।
  6. नमूना और चुंबकीय मोती धीरे microfuge ट्यूब पर दोहन द्वारा ध्यान से मिलाएं।
  7. 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर प्रतिक्रिया सेते हैं।
  8. प्रतिक्रिया करने के लिए, DDH 2 हे के 90 μl जोड़ें और एक चुंबकीय रैक पर microfuge ट्यूब जगह है।
  9. बाद चुंबकीय जुदाई का लगभग 3 मिनट, ध्यान से एक 0.5 मिलीलीटर microfuge ट्यूब सतह पर तैरनेवाला के 85 μl हस्तांतरण। धीरे-धीरे सतह पर तैरनेवाला वापस ले लेंकिसी भी चुंबकीय मोती इकट्ठा करने से बचें।
  10. ऊपर microfuge ट्यूब के 0.04% फिनोल लाल 15 μl, और सब्सट्रेट समाधान के 100 μl जोड़ें।
  11. रंग बदलने के रिकॉर्ड करने के लिए विशेष समय के अंतराल पर एक तस्वीर ले लो।
    नोट: पीएच में परिवर्तन भी एक microelectrode के साथ एक पीएच मीटर का उपयोग पर नजर रखी जा सकती है। शुरू पीएच लगभग 5.2-5.5 होना चाहिए (समाधान पीला है)। यदि नहीं, तो समाधान 1 मिमी एसीटेट बफर पीएच 5.0) के अलावा द्वारा समायोजित किया जा सकता है।

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Representative Results

बैक्टीरियल लिटमस परीक्षण के सिद्धांत चित्र 1 में विस्तार से बताया है परीक्षण तीन प्रमुख सामग्री का उपयोग करता। एक शाही सेना cleaving DNAzyme है कि एक विशिष्ट जीवाणु, urease और चुंबकीय मोतियों से सक्रिय है। DNAzyme ब्याज की एक जीवाणु की अत्यधिक विशिष्ट पहचान हासिल करने के लिए आणविक मान्यता तत्व के रूप में प्रयोग किया जाता है। Urease और चुंबकीय मोती DNAzyme की शाही सेना दरार गतिविधि का संकेत पारगमन प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं। यह चुंबकीय मोती है कि urease-DNAzyme conjugates शामिल का निर्माण शामिल है। लक्ष्य जीवाणु की उपस्थिति में, DNAzyme cleaves अपने आरएनए लिंकेज। यह कार्रवाई चुंबकीय मोतियों से urease की हदबंदी को जन्म देता है। जारी की urease आसानी से चुंबकीय मोतियों से अलग कर दिया और एक पत्रकार के समाधान है, जो यूरिया और एक पीएच के प्रति संवेदनशील डाई शामिल है में एक रंग परिवर्तन उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। Urease अमोनिया में यूरिया hydrolyzes, पीएच की वृद्धि हुई है कि सी का घोड़ा के साथडाई की Olor बदलें।

चित्रा 2 एक जीवाणु लिटमस परीक्षण प्रस्तुत करता है जहां EC1, एक ई कोलाई -responsive शाही सेना cleaving DNAzyme, DNAzyme के रूप में इस्तेमाल किया गया था, और फिनोल लाल पीएच-रिपोर्टिंग डाई के रूप में इस्तेमाल किया गया था। EC1 पहले एक डीएनए पूल यादृच्छिक अनुक्रम में इन विट्रो चयन की तकनीक का उपयोग करने से हमारे समूह द्वारा पृथक किया गया। 5 हमारे पिछले अध्ययनों से पता चला है कि EC1 ई के लिए अति विशिष्ट है कोलाई बैक्टीरिया और अन्य की ओर से कम से कम गतिविधि दर्शाती है। 5,19 यह पाया गया है कि EC1 ई से एक प्रोटीन अणु से सक्रिय होता है कोलाई। हालांकि इस प्रोटीन बायोमार्कर की पहचान deciphered नहीं किया गया है, उच्च मान्यता विशिष्टता पता चलता है कि इस प्रोटीन ई के लिए अद्वितीय है कोलाई। संवाददाता समाधान 5.5 की एक प्रारंभिक पीएच है की स्थापना की है। इस पीएच में फिनोल लाल एक पीले रंग को दर्शाती है। urease के रूप में अमोनिया में यूरिया hydrolyzes, संवाददाता सोल के क्षारकतासंविधान बढ़ जाती है। यह पीले रंग से गुलाबी रंग करने के क्रमिक परिवर्तन से परिलक्षित होता है। के रूप में चित्रा 2 से यह साफ रंग बदलने की गहराई, निम्नलिखित दो मापदंडों पर निर्भर है: ई की संख्या कोलाई कोशिकाओं DNAzyme सक्रियण कदम और समय यूरिया हाइड्रोलिसिस कदम के लिए अनुमति में इस्तेमाल किया। अधिक ई कोलाई कोशिकाओं को मजबूत रंग में परिवर्तन के परिणामस्वरूप, एक प्रगतिशील पीले करने वाली गुलाबी रंग संक्रमण जब ई के अवलोकन से परिलक्षित कोलाई कोशिकाओं क्रमानुसार से बढ़ रहे थे 5 5 के लिए 10 x 7 (10 गुना हर बार वृद्धि)। इस बीच, यूरिया हाइड्रोलिसिस के लिए एक लंबे समय के ई की छोटी संख्या का पता लगाने के लिए अनुमति दी कोलाई कोशिकाओं (1 घंटा प्रतिक्रिया में 5,000 कोशिकाओं और 2 घंटे की प्रतिक्रिया में 500 कोशिकाओं)।

बैक्टीरियल अग्निपरीक्षा का पीएच परिवर्तन भी एक हाथ में पीएच मीटर का उपयोग कर नजर रखी जा सकती है और प्रतिनिधि परिणाम चित्रा 3 में सचित्र हैं। यह वारों में पाया गया कि 10 7 ई की उपस्थिति कोलाई कोशिकाओं 10 मिनट के भीतर 3 इकाइयों द्वारा पीएच की क्रमिक वृद्धि हुई। इसके विपरीत, ई का अभाव कोलाई कोशिकाओं को एक ही सेटिंग के तहत पहचाने जाने पीएच परिवर्तन का कारण नहीं था।

आकृति 1
चित्रा 1: बैक्टीरियल लिटमस परीक्षण के डिजाइन सिद्धांत (ए) ब्याज की एक जीवाणु से एक विशिष्ट बायोमार्कर से एक शाही सेना cleaving DNAzyme की सक्रियता।। बायोमार्कर की उपस्थिति में, शाही सेना cleaving DNAzyme चुंबकीय मोती cleaves पर स्थिर आरएनए उठाना, समाधान के लिए चुंबकीय मोतियों से टैग कर urease की रिहाई हो जाती है। (बी) के तीन-कदम परख प्रक्रिया। चरण 1: DNAzyme सक्रियण, पैनल ए चरण 2 में वर्णित के रूप में: चुंबकीय जुदाई - विमोचन urease चुंबकीय मोतियों से अलग किया जाता है। चरण 3: यूरिया हाइड्रोलिसिस आर12; जारी की urease एक यूरिया युक्त संवाददाता समाधान में जोड़ा जाता है। Urease, अमोनिया में यूरिया hydrolyzes पीएच में एक परिवर्तन है कि एक पीएच के प्रति संवेदनशील डाई द्वारा सूचित किया जा सकता है, जिसके परिणामस्वरूप। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2: ई के साथ लिटमस परीक्षण कोलाई ई का उपयोग कर कोलाई -responsive DNAzyme EC1 ई। की संख्या बदलती के साथ प्रतिनिधि रंग बदलने परिणाम प्रत्येक टेस्ट ट्यूब ऊपर प्रदान कोलाई कोशिकाओं। फिनोल लाल पीएच के प्रति संवेदनशील डाई के रूप में इस्तेमाल किया गया था। ई के बिना एक परीक्षण कोलाई एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था। अधिक ई कोलाई कोशिकाओं को और अधिक urease अणुओं की रिहाई के कारण होने की संभावना है, साथ खY मजबूत रंग बदलता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3: पीएच वृद्धि निगरानी एक पीएच मीटर का उपयोग कर पीएच के परिवर्तन 10 7 ई की वजह से। कोलाई कोशिकाओं एक पोर्टेबल पीएच मीटर का उपयोग कर नजर रखी थी। ई के बिना एक परीक्षण कोलाई एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था। 10 7 ई की उपस्थिति परीक्षण समाधान में कोलाई कोशिकाओं 10 मिनट में ~ 3 पीएच इकाइयों द्वारा क्षारकता बढ़ा सकते हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

नाम Sequence (5'-3 ') ध्यान दें
BS1 BTTTT Ttttt TTTAC TCTTC CTAGC FRQGG TTCGA TCAAG एक बी: 5'-बायोटिन; आर: adenine ribonucleotide; एफ: fluorescein-डीटी; क्यू: dabcyl-डीटी
DE1 GATGT GCGTT GTCGA GACCT GCGAC CGGAA CACTA CACTG TGTGG GGATG GATTT CTTTA CAGTT GTGTG TTGAA CGCTG TGTCA AAAAA AAAA
T1 GACAA CGCAC ATCTC TTGAT CGAAC सी
LD1 XTTTT Ttttt Ttttt TTGAC ACAGC GTTCA एक एक्स: 5'-राष्ट्रीय राजमार्ग 2

तालिका 1: सिंथेटिक oligonucleotides के दृश्यों।

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Discussion

एक लिटमस परीक्षण करने के लिए एक जीवाणु-उत्तरदायी DNAzyme की शाही सेना दरार गतिविधि की कार्रवाई के अनुवाद के रूप में चित्रा 1 से यह साफ, urease और चुंबकीय जुदाई के उपयोग के माध्यम से संभव बनाया है। हालांकि बैक्टीरिया का पता लगाने के लिए संशोधित अग्निपरीक्षा का प्रदर्शन है एक ई के साथ किया कोलाई निर्भर शाही सेना cleaving DNAzyme, 5,19,20 डिजाइन आम तौर पर किसी भी शाही सेना cleaving DNAzyme के लिए बढ़ाया जा सकता है। अलग analytes और विभिन्न तरीके के लिए शाही सेना cleaving DNAzymes के महान उपलब्धि नए लक्ष्य के लिए यादृच्छिक अनुक्रम पूल से नई शाही सेना cleaving DNAzymes को अलग करने को देखते हुए, हम उम्मीद करते हैं कि संशोधित लिटमस परीक्षण मंच ब्याज की विभिन्न ठिकानों का पता लगाने के लिए बढ़ाया जा सकता है ।

ई के लिए अग्निपरीक्षा जब रिपोर्टिंग प्रतिक्रिया समय 1 और 2 घंटा, क्रमशः होना तय है कोलाई का पता लगाने के लिए 5,000 और 500 कोशिकाओं का पता लगाने कर सकते हैं। लोकप्रिय पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) औरसैंडविच immunosorbent परख एंजाइम से जुड़ी (एलिसा) तरीकों लगभग 10 4 -10 5 ई का पता लगाने सीमा प्राप्त कर सकते हैं इसी तरह के परीक्षण के समय में कोलाई कोशिकाओं। 25,26 इस प्रकार, बैक्टीरियल अग्निपरीक्षा तुलनीय संवेदनशीलता का पता लगाने प्रदान करता है।

हालांकि बैक्टीरियल अग्निपरीक्षा से बाहर ले जाने के लिए आसान है और जीवंत रंग परिवर्तन का उत्पादन कर सकते हैं, कई कारकों काफी परीक्षण के परिणाम को प्रभावित कर सकते हैं। सबसे पहले, urease की गुणवत्ता बहुत महत्वपूर्ण है। हम विभिन्न स्रोतों से urease इस्तेमाल किया और पाया परीक्षण के परिणाम काफी भिन्न हो सकते है। हम स्रोत सामग्री खंड में निर्दिष्ट से urease के इस्तेमाल की सिफारिश।

DNAzyme / urease / चुंबकीय मोतियों की विधानसभा विशेष ध्यान देने की जरूरत है। चुंबकीय मोतियों की पूरी तरह से धोने unhybridized UrDNA दूर करने के लिए झूठी सकारात्मक परिणाम को रोकने के लिए आवश्यक है। देखभाल भी एल के अंदर सतह पर अवशिष्ट चुंबकीय मोती के संचय से बचने के लिए किए जाने की जरूरतmicrofuge ट्यूब, जो देखने के लिए मुश्किल हो सकता है की आईडी। वहां पहुंचने पर चुंबकीय मोती नहीं रह चुंबकीय जुदाई के अधीन हैं और इस प्रकार, कुछ unhybridized UrDNA कि रिपोर्टर प्रतिक्रिया में झूठी सकारात्मक संकेतों के लिए नेतृत्व कर सकते हैं ले सकता है। यह भी चुंबकीय जुदाई चरण के दौरान अब से 10 मिनट के लिए चुंबकीय रैक पर microfuge ट्यूब छोड़ने से बचने के लिए महत्वपूर्ण है। मोती कुल या microfuge ट्यूब, जो धोने की क्षमता को कम और बैच को बैच विसंगति को पेश हो सकता करने के लिए छड़ी कर सकते हैं। धोने के समाधान में की 0.01% बीच 20 समावेशन बैच को बैच स्थिरता में सुधार कर सकते हैं और लागू किया जाना चाहिए।

चुंबकीय मोती streptavidin, जो लंगर चुंबकीय मोती पर DNAzyme-urease conjugates इकट्ठा करने के लिए के रूप में इस्तेमाल किया गया था के साथ लेपित हैं। दोनों streptavidin और urease प्रोटीन अणुओं है कि भंडारण के दौरान विकृत किया जा सकता है। हम आम तौर पर अप करने के लिए 4 सप्ताह के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर इकट्ठे DNAzyme-urease-चुंबकीय मोती स्टोरऔर अधिक अनुरूप परिणाम प्राप्त करने के लिए नियमित रूप से ताजा बैच बनाने।

देखभाल भी गलती चुंबकीय जुदाई कदम (कदम 6.9) DNAzyme सक्रियण निम्नलिखित में चुंबकीय मोती लेने से बचने के लिए उठाए जाने की जरूरत है। हमारे अनुभव से, सेलुलर मलबे और समाधान में अन्य विविक्त चुंबकीय जुदाई क्षमता को कम कर सकते हैं, और इसलिए, कुछ चुंबकीय मोती अनजाने pipetting दौरान बाहर ले जाया जा सकता है। इस झूठी सकारात्मक परिणामों में परिणाम होगा। एक लंबी जुदाई समय (जैसे 5-10 मिनट), पिपेट पर दबाव की एक धीमी रिहाई सतह पर तैरनेवाला की कोमल वापसी की अनुमति देने के लिए, और चुंबकीय जुदाई का अतिरिक्त दौर के लिए सतह पर तैरनेवाला subjecting: हम समस्या को कम करने के लिए निम्न उपायों की सिफारिश ।

अंत में, यह एक प्रयोग है जहाँ कई नमूने परीक्षण कर रहे हैं के दौरान urease द्वारा संवाददाता स्टॉक समाधान की दुर्घटना संक्रमण से बचने के लिए महत्वपूर्ण है। यू के उच्च जेट देखते हुएrease, इस प्रकार के प्रदूषण को झूठी सकारात्मक परिणाम के लिए नेतृत्व कर सकते हैं।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) VWR AMRESCO 0105
Sodium Hydroxide (NaOH) pellets BIO BASIC CANADA INC. SB6789
Tris-base VWR AMRESCO 0497
Boric acid AMRESCO 0588
Urea VWR AMRESCO M123
40% acrylamide/bisacrylamide (29:1) solution BIO BASIC CANADA INC. A0007
Sucrose Bioshop Canada inc. SUC507
Bromophenol blue Bioshop Canada inc. BRO777
Xylenecyanol FF SIGMA-ALDRICH X-4126
10% sodium dodecyl sulfate Bioshop Canada inc. SDS001
Hydrochloric Acid (HCl) CALEDON LABORATORIES LTD 6026
Sodium Chloride (NaCl) Bioshop Canada inc. SOD001
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) Bioshop Canada inc. HEP001
Magnesium Chloride (II) hexahydrate VWR AMRESCO 0288
Tween 20 Bioshop Canada inc. TW508
Adenosine Triphospahte (ATP) AMRESCO 0220
Sodium Acetate trihydrate (NaOAc) SIGMA-ALDRICH S8625
Ethanol Commercial Alcohols P016EAAN
Tetramethyleneethylenediamine (TEMED) AMRESCO 0761
10% Ammonium persulfate (APS) BIO BASIC CANADA INC. AB0072
Succinimidyl 4-(N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate (SMCC) ThermoFisher SCIENTIFIC 22360
Dimethyl sulfoxide (DMSO) CALEDON LABORATORIES 803540
Urease SIGMA-ALDRICH U0251
1x Phosphate Buffered Saline (PBS) ThermoFisher SCIENTIFIC 70011-069
0.04% Phenol red SIGMA-ALDRICH P3532
10x T4 polynucleotide kinase reaction buffer Lucigen 30061-1
10x T4 DNA ligase reaction buffer Bio Basics Canada B1122-B
T4 DNA ligase (5 U/μl) Thermo Fischer Scientific B1122
Luria Bertani (LB) Broth AMRESCO J106
Agar AMRESCO J637
T4 polynucleotide kinase (10 U/μl) Lucigen 30061-1
E. coli K12 (MG1655) ATCC ATCC700926
Centrifuge Beckman Coulter, Inc. 392187
Glass plates CBS scientific ngp-250nr
0.75 mm thick spacers CBS scientific VGS-0725r
12-well comb CBS scientific VGC-7512
UV Lamp UVP 95-0017-09
Spectrophotometer (NanoVue) GE Healthcare N/A
Metal plate CBS scientific CPA165-250
Vortex VWR International 58816-123
Gel electrophoresis apparatus CBS scientific ASG-250
Petri dishes VWR International 25384-342
100 kDa MWCO centrifugal filters EMD Millipore UFC510024
Magnetic Bead (BioMag) Bangs Laboratories Inc BM568
Magnetic Seperation Rack New England BioLabs S1506S
Microfuge tubes Sarstedt 72.69
Syringe filter (0.22 μm) VWR International 28145-501
14 ml culture tube VWR International 60818-725
Cell culture incubator Eppendorf Scientific M13520000
Branson Ultrasonic cleaner Branson N/A
Camera (Canon Powershot G11) Canon N/A
50 ml conical tube VWR International 89004-364

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References

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सेलुलर जीवविज्ञान अंक 115 बैक्टीरिया का पता लगाने वर्णमिति परख लिटमस परीक्षण Biosensor DNAzyme और
लिटमस परीक्षण का उपयोग बैक्टीरिया का पता लगाने Colorimetric
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Tram, K., Manochehry, S., Feng, Q., Chang, D., Salena, B. J., Li, Y. Colorimetric Detection of Bacteria Using Litmus Test. J. Vis. Exp. (115), e54546, doi:10.3791/54546 (2016).

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