Protocol
1. Utarbeidelse av reagenser og buffere
- 0,5 M etylendiamintetraeddiksyre (EDTA)
- I et 2 liters begerglass, tilsett 186,1 g EDTA i 800 ml deionisert-destillert vann (DDH 2 O). Juster pH på løsningen til 8,0 ved hjelp av NaOH-pellets. Legg DDH 2 O til et sluttvolum på 1,0 L og overføre løsningen til en autoklav glassflaske for autoklavering og oppbevares ved 4 ° C.
- 10 × Tris-borat EDTA (10x TBE)
- I et 4 L plastbeger, tilsett 432 g Tris-base, 200 g borsyre, 80 ml 0,5 M EDTA (pH 8,0) og DDH 2 O til et sluttvolum på 4 L. Mix ved hjelp av en rørestav inntil alle komponenter oppløses. Overfør løsningen på en L glassflasker for autoklave og oppbevares ved 4 ° C.
- 10% denaturerende polyakrylamid Stock
- I en 4 L plast beger, legge 1681,7 g urea, 400 ml 10x TBE, en liter 40% akrylamid / bisacrylamide (29: 1) løsning og DDH 2 O til fInal volumet er 4 L. Bland bruke en rørepinne til urea er oppløst. Overfør løsningen på en L amber glassflasker og oppbevar ved 4 ° C.
- 2x Gel Loading Buffer (2x GLB)
- I et 200 ml begerglass, tilsett 44 g urinstoff, 8 g sukrose, 10 mg bromfenolblått, 10 mg xylen cyanol FF, 400 ul 10% natriumdodecylsulfat, og 4 ml 10 x TBE. Legg DDH 2 O til et sluttvolum på 40 ml og oppløse komponentene med mild oppvarming ved 50 ° C under blanding med en magnetisk rørestav. Transfer 1 ml prøve til 1,5 ml mikrofugerør og oppbevares ved 4 ° C.
MERK: Før bruk krever kort oppvarming ved 90 ° C for å oppløse alle faste stoffer.
- I et 200 ml begerglass, tilsett 44 g urinstoff, 8 g sukrose, 10 mg bromfenolblått, 10 mg xylen cyanol FF, 400 ul 10% natriumdodecylsulfat, og 4 ml 10 x TBE. Legg DDH 2 O til et sluttvolum på 40 ml og oppløse komponentene med mild oppvarming ved 50 ° C under blanding med en magnetisk rørestav. Transfer 1 ml prøve til 1,5 ml mikrofugerør og oppbevares ved 4 ° C.
- 1 M Tris-hydroklorid (tris-HCl) (pH 7,5)
- I en glassflaske, tilsett 12,1 g Tris-base og 70 ml DDH 2 O og bland helt til det faste stoffet er oppløst. Juster pH til 7,5 ved anvendelse av 1 M saltsyre (HCl). Legg DDH 2 O til et sluttvolum på 100 ml, og autoklaven store ved 4 ° C
- 5 M natriumklorid (NaCl)
- I en glassflaske, oppløse 58,4 g NaCl i 150 ml DDH 2 O. Juster volumet til 200 ml med DDH 2 O. Oppbevar ved 4 ° C.
- DNA elueringsbuffer
- I en glassflaske, bland 2,0 ml 1 M Tris-HCl (pH 7,5), 8,0 ml 5 M NaCl og 0,4 ml 0,5 M EDTA (pH 8,0). Juster volumet til 200 ml med DDH 2 O, autoklav og oppbevares ved 4 ° C.
- 1 M 4- (2-hydroksyetyl) -1-piperazinetansulfonsyre (HEPES) (pH 7,4)
- I en glassflaske, oppløse 2,38 g av HEPES i 80 ml DDH 2 O. Juster pH til 7,4 ved anvendelse av 5 N NaOH og tilsett DDH 2 O til et sluttvolum på 100 ml.
- 1 M Magnesiumklorid (MgCl2)
- I en glassflaske, tilsett 2,03 g MgCl2 -6H 2 O og bringe volumet til 100 ml med DDH 2 O.
- Reaksjonsbuffer (RB)
- I et 50 ml konisk rør, tilsett 500 ul av 1 M Tris-HCl (pH 7,5), 8,8 g NaCl, 50 ul 1 M MgCl2, og 5 ul Tween 20 Legg DDH 2 O til et sluttvolum 50 ml. Bland løsningen og filtrerer inn i et annet konisk rør ved hjelp av en sprøyte drevet filter (0,22 um) og oppbevares ved 4 ° C inntil bruk.
- I et 50 ml konisk rør, tilsett 5,8 g NaCl, 3 ml 1 M MgCl2, 1.5 g urea, og 40 ml DDH 2 O. Juster pH på løsningen til 5,0 ved bruk av 10 mM HCl. På grunn av at oppløsningen ikke er bufret, justere pH ved bruk av HClforsiktig ved tilsetning av små porsjoner HCl. Legg DDH 2 O til et sluttvolum på 50 ml.
- Bland løsningen og filtrerer inn i et annet konisk rør ved hjelp av en sprøyte drevet filter (0,22 um) og oppbevares ved 4 ° C inntil bruk.
- I et begerglass, oppløse 20,0 g pulver i LB 1 liter DDH 2 O. Overføring til en glassflaske, autoklav, og oppbevar ved 4 ° C.
- I en 250 ml kolbe, tilsett 1,5 g agar og 100 ml LB-næringsløsning. Autoklav og oppbevares ved 4 ° C.
- Gjenoppløse LB agar i en mikrobølgeovn og avkjøl løsningen til ~ 50 ° C. Hell løsningen i petriskåler, slik at ~ 5 plater og tillate dem å størkne.
2. Syntese og rensing av E. coli- responsive DNAzyme EC1
- Syntese av EC1 av Mal mediert Enzymatisk hemorroider
- rens commercially syntetiserte oligonukleotider BS1, DE1, og T1 (sekvensene gitt i tabell 1) med 10% denaturerende polyakrylamidgel-elektroforese (dPAGE) i henhold til standard protokoller.
- Forbered en 100 mikrometer lager av BS1, DE1, og T1. Oppbevar ved -20 ° C inntil bruk.
- I et 1,5 ml mikrosentrifugerør, tilsett 38,5 mL av DDH 2 O, 5 mL av DE1, og 5 ul 10 x T4 polynukleotidkinase reaksjonsbuffer levert av enzymet leverandør (500 mM Tris-HCl (pH 7,6), 100 mM MgCl2, 50 mM ditiotreitol (DTT), 1,0 mM spermidin).
- Tilsett 1 pl adenosin trifosfat (ATP) (100 mM). Tilsett 5 enheter T4-polynukleotidkinase (10 U / ul). Bland ved forsiktig pipettering av reaksjonsblandingen.
- Inkuber reaksjonsblandingen ved 37 ° C i 30 min.
- Stans reaksjonen ved oppvarming til 90 ° C i 5 min.
- Legg 118 mL av DDH 2 O, 5 mL av BS1, og 5 mL av T1. Oppvarm reaksjonsblandingen til 90 ° C i 2 min og deretter avkjøles til romtemperatur i løpet av 10 min.
- Tilsett 20 ul 10 x T4 DNA-ligase reaksjonsbuffer levert av enzymet leverandøren (400 mM Tris-HCl (pH 7,8), 100 mM MgCl2, 100 mM DTT, 5 mM ATP). Tilsett 10 enheter T4 DNA-ligase (5 U / ul) og omhyggelig blandes ved pipettering.
- Inkuber ved romtemperatur i 2 timer.
- Tilsett 20 pl av 3 M natriumacetat (NaOAc) (pH 5,2), 500 ul kald 100% etanol. Bland løsningen ved virvling og plasser i røret i en -20 ° C fryser i 30 minutter.
- Sentrifuger mikrosentrifuge ved 20 000 xg i 20 min ved 4 ° C. fjern supernatanten forsiktig ved pipettering.
- Vask pelleten med kald 70% etanol og sentrifuger på nytt ved 20 000 xg i 10 min ved 4 ° C. Igjen fjern supernatanten og tørke pellet under vakuum i 10 min.
- Resuspender DNA med 15 ul DDH 2 O og deretter legge til 15 mL av 2x GLB.
- Vortex kraftig og oppvarm til 90 ° C i2 min. Rens det full-lengde DNA med 10% dPAGE som beskrevet nedenfor.
- Sette opp 10% dPAGE
- Rent to glassplater (en hel plate og en laftet), to 0,75 mm tykke avstandsstykker, og en 12-brønns kam. Lå en glassplate på et flatt underlag med to avstandsstykkene på hver side og hakk plate på toppen. Clip de to platene sammen ved hjelp av de fire klipsene som følger av leverandøren.
- I et 150 ml plastbegerglass, helles 40 ml 10% dPAGE, 40 ul tetrametyletylendiamin (TEMED) og 400 ul 10% ammoniumpersulfat (APS). Bland komponentene og hell løsningen mellom platene sakte.
- Sett kammen og deretter tillate gel å polymerisere i løpet av 10 min. Når gelen er polymerisert, sakte fjerne kammen og skyll brønnene med DDH 2 O.
- Montere platene på gelelektroforese apparat. Bruke en metallplate til å avgi varme som genereres for å hindre overoppheting.
- Hell 1x TBE på topp- og bunnkammerog at brønnene er godt neddykket i bufferen. Skyll brønnene med 1x TBE ved hjelp av en pipette eller sprøyte.
- Sett apparatet til å kjøre på 35 mA og pre-run i 15 minutter før du legger i prøver.
- Eluering av Bundet EC1 fra 10% dPAGE
- Følgende trinn 2.2.6, kjører gelen ved 35 mA inntil nedre fargestoff (bromfenolblå) når bunnen av glassplaten. Dette bør ta ca 1,5 time. Slå av strømmen og fjerne platene fra apparatet.
- Legg platene på noen få ark med tørkepapir og forsiktig fjerne avstandsstykkene fra glassplatene. fjerne det øverste glassplaten nøye og pakk gel med plastfolie.
- Vend gel over til fjerne andre glassplate og dekk med plastfolie igjen. Pass på å unngå rynker i plastfolie.
- Visualiser ligert produktet ved hjelp av UV skygging (260 nm), som skal produsere 4 forskjellige DNA-bånd (Fully ligert EC1, DE1, BS1, og T1).
- Sentrifuger gelen løsningen ved 20.000 xg i 5 minutter og omhyggelig overføre 400 ul av supernatanten til en annen 1,5 ml mikrofuge-rør. Unngå å trekke gel stykker under pipettering.
- Til mikrosentrifugerør med det overførte supernatanten legge til 40 ul 3 M NaOAc (pH 5,2), og 1,0 ml av kald 100% etanol. Bland løsningen ved virvling og plasser i røret i en -20 ° C fryser i 30 minutter.
- Sentrifuger mikrosentrifuge ved 20 000 xg i 20 min ved 4 ° C. fjern supernatanten forsiktig ved pipettering.
- Vask pelleten med kald 70% etanol og sentrifuger på nytt ved 20 000 xg i 10 min ved 4 ° C. Nok en gang, fjerner duSupernatanten og tørk pellet under vakuum i 10 min.
- Bestemme konsentrasjonen av EC1 ved å måle UV-absorbans ved 260 nm. Foreta en 10 mM lager og lagre prøven ved -20 ° C inntil bruk.
3. Bøyning av Urease til DNA
- Fremstilling av Succinimidyl-4- (N-maleimidometyl) cykloheksan-1-karboksylat (SMCC) Stock
- Løs opp 1 mg SMCC i 676 mL av DMSO. Vortex og legg på is inntil bruk.
- Utarbeidelse av Urease lager
- Oppløs 1 mg urease i 1 ml av 1 x PBS (uten Mg2 + og Ca2 +). Plasser på is inntil bruk.
MERK: Krystallisert urease er treg til å løse opp og forsiktig blanding er nødvendig for å unngå denaturering.
- Oppløs 1 mg urease i 1 ml av 1 x PBS (uten Mg2 + og Ca2 +). Plasser på is inntil bruk.
- Syntese av Urease-DNA (UrDNA)
- Tilsett 10 ul av 100 pM LD1 til et 2,5 ml mikrosentrifugerør. Legg 140 mL av DDH 2 O, 40 ul 10x PBS, og Vortex.
- Legg 80,5 mL av SMCC stakk, 159,5 mL av DMSO, vortex, og kort sentrifuger ved hjelp av en Borstemmaskin sentrifuge.
- Inkuber ved 37 ° C i 60 min. Unngå kondens under mikrofuge cap.
- Tilsett 200 ul av 1 x PBS, 60 ul 3 M NaOAc (pH 5,2), og 1,5 ml av kald 100% etanol. Bland løsningen ved virvling og inkuberes ved -20 ° C i 30 minutter.
- Sentrifuger løsningen ved 20 000 xg i 20 min ved 4 ° C. Fjern supernatanten og tørke pellet under vakuum. Unngå over-tørking.
- Til den tørkede pellet legge til 400 mL av urease lager og inkuber ved værelsestemperatur i 5 timer.
- Overfør 200 ul av råolje konjugat til en pre-vasket 100k MWCO sentrifugalfilter kolonne. Sentrifuger kolonnen ved 14 000 xg i 5 minutter.
- Overfør de resterende 200 pl konjugat råolje til kolonnen og sentrifuger ved 14 000 xg i 5 minutter. Fjerne kolonnen og plassere den opp-ned i et nytt 2,0 ml mikrosentrifugerør ( "oppsamlingsrør").
- sentrifugeuge oppsamlingsrøret (med den omvendte kolonnen) ved 1000 xg i 2 min. Fjerne samlingen rør og tilsett 30 pl av 1 x PBS til sentrifugal-kolonnen for å vaske membranen for ytterligere utvinning av konjugater.
- Igjen snu kolonnen og plassere tilbake inn i oppsamlingsrøret. Sentrifuger oppsamlingsrøret (med den omvendte kolonnen) ved 1000 xg i 2 min. Fjern og kast kolonnen.
- Oppbevar UrDNA ved 4 ° C inntil bruk.
4. Montering av EC1 og UrDNA på magnetiske kuler
- Bland den magnetiske kuler (MB) lager godt og overfør 100 pl av MB suspensjonen til et 1,5 ml mikrosentrifugerør. Plasser mikrosentrifugerør på et magnetisk stativ holder for isolering av MB.
- Fjern supernatanten ved pipettering og tilsett 150 ul av bindingsbuffer (BB) til røret. Fjerne røret fra holderen og forsiktig trykk på røret for å resuspendere MB til en homogen løsning. Unngå sprut suspensjonen til top av røret eller lokket. Hvis dette skjer, må du bruke en Borstemmaskin sentrifuge å kort spinne rest tilbake til suspensjon.
- Gjenta trinn 4.2 to ganger til.
- Til denne suspensjon legge 10 mL av 10 mm EC1. Bland forsiktig ved å trykke på røret.
- Inkuber oppløsningen med mild risting i 30 min. Tapp røret hver 2-3 min for å unngå utfelling av MB.
- Sett mikrosentrifugerør tilbake på det magnetiske stativet for å isolere MB og fjern supernatanten ved pipettering. Vask MB tre ganger med 150 ul BB (som beskrevet i trinn 4.2).
- Når vaskingen er fullført, suspendere MB i totalt 150 ul BB. Til denne løsningen, tilsett 15 ul UrDNA og oppvarme oppløsningen til 45 ° C i 2 min. Avkjøl løsningen til romtemperatur og inkuber i 2 timer.
- Sett mikrosentrifugerør tilbake på det magnetiske stativet for å isolere MB og fjern supernatanten ved pipettering.
- Tilsett 100 ul reaksjonsbuffer (RB). Fjern tHan mikrosentrifugerør fra den magnetiske stativet og nøye resuspender MB.
- Vask MB tre ganger ved å gjenta trinn 4.9.
NB: Den vaskede Supernatanten kan raskt testet for å bestemme om uhybridisert UrDNA er fortsatt til stede, noe som kan resultere i en falsk positivt signal. Testen kan gjøres ved å tilsette 10 pl av 50 mM urea og 10 ul av 0,04% fenolrødt til vaskeløsningen. Fortsett å vaske MB inntil vaskeløsningen ikke medfører en fargeendring. Den 100 ul Suspensjonen ble lagret ved 4 ° C inntil bruk.
5. Fremstilling av bakterieceller 20
- Dyrking E. coli fra Stocks
- Plate E. coli K12 (MG1655) på LB agar plater fra en glyserol lager i henhold til en flamme eller i et biologisk sikkerhetskabinett.
- Ved hjelp av en steril pipette, forsiktig trykk på glyserol lager og lett strek på overflaten av en agar-plate for å unngå punktering av LB agar.
- Snu stripeteplate og inkuberes ved 37 ° C i 14 timer.
- Tett plate med Parafilm og oppbevares ved 4 ° C i maksimalt 3 uker.
- Dyrking E. coli for Cell Counting
- I et sterilt 14 ml dyrkningsrør, dispensere 2 ml LB-næringsløsning.
- Ved hjelp av en steril pipette, velge en enkelt koloni fra den stripete agar plate fremstilt i trinn 5.1 og overføre den til den dyrkningsrør.
- Inkuber kulturen ved 37 ° C og riste ved 230 opm i 14 timer.
- Serielt fortynnet bakteriekultur i 10-gangers intervaller.
- For hver fortynnet prøve, jevnt plate fem 100 pl aliquoter på separate LB-agarplater. Snu platene og inkuberes ved 37 ° C i 14 timer.
- Tell cellene i hver prøve for å oppnå den midlere cellekonsentrasjonen av hver fortynning.
MERK: 10 7 celler blir ofte brukt til å sette opp en referanse lakmustest for E. coli som dette nivået av E. coli kan utløse en rask farge change. Imidlertid kan en riktig utført lakmustest oppdage så lavt som 500 celler, som omtalt under resultatene.
- Forbereder E. coli-celler for testing
- For en ønsket cellesuspensjon, overføre 1 ml av dyrket lager til et 1,5 ml mikrosentrifugerør.
- Sentrifuger cellene ved 6000 xg i 10 min ved 4 ° C. Fjern forsiktig supernatanten uten å forstyrre cellepelleten.
- Tilsett 10 ul reaksjonsbuffer for å cellepelleten og resuspender cellene. Sonikere cellesuspensjonen i 5 min. Overfør cellesuspensjonen til en fryser i 5 min.
- Sonikere cellesuspensjonen i ytterligere 5 min.
- Sentrifuger cellesuspensjonen ved 13 000 xg i 10 min ved 4 ° C. Bruk supernatanten for testing (10 ul).
6. lakmustest
- I et 1,5 ml mikrosentrifugerør, forvask er røret ved å tilsette og virvling 100 ul reaksjonsbuffer (RB) i mikrosentrifugerør ogforkaste buffer.
- Overføre 15 ul samlet EC1 (protokoll 4) til den vaskede mikrosentrifugerør.
- Vask de magnetiske kuler ved å plassere mikrosentrifugerør på et magnetisk stativ. Fjern supernatanten ved pipettering. Fjern det mikrosentrifugerør fra stativet, tilsett 100 ul av RB, og nøye resuspender magnetiske kuler.
- Vask MB to ganger ved å gjenta trinn 6.3.
- Sett mikrosentrifugerør tilbake på den magnetiske rack, fjern supernatanten og tilsett 10 mL E. coli prøven forberedt fra trinn 5.3.
- Bland prøven og magnetiske kuler nøye ved å banke lett på mikrosentrifugerør.
- Inkuber reaksjonsblandingen ved romtemperatur i 1 time.
- Til reaksjon, tilsett 90 mL av DDH 2 O og plasser mikrosentrifugerør på en magnetisk rack.
- Etter ca. 3 min av magnetisk separasjon, nøye overføre 85 ul av supernatanten til et 0,5 ml mikrosentrifugerør. Trekk supernatanten sakte tilunngå å samle noen magnetiske kuler.
- Til den ovennevnte mikrosentrifugerør legge til 15 ul av 0,04% fenolrødt, og 100 ul av substratoppløsning.
- Ta et bilde ved bestemte tidsintervaller for å registrere fargeendring.
MERK: Endringen i pH kan også overvåkes ved hjelp av et pH-meter med en microelectrode. Utgangs-pH-verdien skal være omtrent 5,2-5,5 (oppløsningen er gul). Hvis ikke, kan oppløsningen justeres ved tilsetning av 1 mM acetatbuffer pH 5,0).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Prinsippet for den bakterielle lakmus testen er beskrevet i figur 1. Testen anvender tre viktige materialer:. En RNA-spaltning DNAzyme som aktiveres ved en bestemt bakterie, urease og magnetiske kuler. Den DNAzyme anvendes som molekylgjenkjenningselementet for å oppnå svært spesifikk påvisning av en bakterie av interesse. Urease og magnetiske kuler benyttes for å oppnå signaloverføring av RNA-spaltning aktivitet av DNAzyme. Dette innebærer etableringen av magnetiske kuler som inneholder urease-DNAzyme konjugater. I nærvær av målet bakterie, den DNAzyme spalter dens RNA binding. Denne virkning gir opphav til dissosiasjon av urease fra magnetiske kuler. Den frigjorte urease lett kan skilles fra magnetiske kuler og brukes til å generere en fargeendring i en reporter oppløsning, som inneholder urea og et pH-følsomt fargestoff. Urease hydrolyserer urea til ammoniakk, fulgt av økning av pH-verdien som utløser color forandring av fargestoffet.
Figur 2 viser en bakteriell lakmustest hvor EC1, en E. coli -responsive RNA-spaltning DNAzyme, ble anvendt som DNAzyme, og fenol-rødt ble anvendt som det pH-rapportering fargestoff. EC1 ble tidligere isolert ved vår gruppe fra en tilfeldig sekvens-DNA-området ved hjelp av teknikken for in vitro-seleksjon. 5 Våre tidligere undersøkelser har vist at EC1 er meget spesifikk for E. coli og oppviser minimal aktivitet mot andre bakterier. 5,19 Det er funnet at EC1 er aktivert ved et proteinmolekyl fra E. coli. Selv om identiteten av dette proteinet biomarkør ikke er blitt påvist, antyder den høye spesifisitet erkjennelse at dette proteinet er unik for E. coli. Reporteren oppløsningen blir satt opp til å ha en utgangs-pH på 5,5. Ved denne pH, oppviser fenolrødt en gul farge. Som urease hydrolyserer urea til ammoniakk, basisiteten av reporter solution øker. Dette gjenspeiles av den gradvise endring av farge fra gul til rosa. Dybden av fargeendringen er avhengig av de følgende to parametre, som illustrert i Figur 2: antallet E. coli-celler som anvendes i DNAzyme aktiveringstrinn og tiden som tillates for ureahydrolysetrinnet. Mer E. coli-celler resulterte i sterkere fargeendringer, gjenspeiles ved observasjon av en progressiv gul-til-rosa farge overgang når E. coli-celler ble serielt økt fra 5 til 5 x 10 7 (10-gangers økning hver gang). I mellomtiden, en lengre tid for hydrolyse av urea er tillatt for påvisning av små mengder E. coli-celler (5000 celler i 1 time reaksjonen og 500 celler i to-timers reaksjonstid).
Den pH-forandring av bakterie lakmustest kan også overvåkes ved hjelp av en håndholdt pH-meter og representative resultater er illustrert i figur 3. Det was funnet at tilstedeværelsen av 10 7 E. coli-celler resulterte i gradvis økning av pH-verdien etter 3 enheter i løpet av 10 min. I motsetning til fravær av E. coli-celler ga påvisbare pH-endringer under samme setting.
Figur 1: design prinsipp for bakterie lakmustest (A) Aktivering av en RNA-spalte DNAzyme av en spesifikk biomarkør fra en bakterie av interesse.. I nærvær av biomarkør, RNA-spalte DNAzyme immobilisert på magnetiske kuler kløyver RNA sammenhengen, noe som resulterer i utgivelsen av den merkede urease fra magnetiske kuler til løsning. (B) Tre-trinns analyseprosedyre. Trinn 1: DNAzyme aktivering, som beskrevet i panel A. Trinn 2: Magnetisk separasjon - den frigitte urease er adskilt fra magnetiske kuler. Trinn 3: Urea hydrolyse R12; den frigjorte urease ble tilsatt til en urea-inneholdende reporter oppløsning. Urease hydrolyserer urea til ammoniakk, noe som resulterer i en endring i pH som kan rapporteres ved en pH-sensitive fargestoff. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: lakmustest med E. coli ved hjelp av E. coli -responsive DNAzyme EC1. Representative fargeskiftende resultater med varierende antall E. coli-celler ovenfor hver test-rør. Fenolrødt ble anvendt som det pH-følsomme fargestoff. En test uten E. coli ble brukt som en negativ kontroll. Mer E. Det forventes coli-celler for å bevirke frigjøring av mer urease molekyler, ledsaget by sterkere fargeendringer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Overvåking pH-økningen ved hjelp av et pH-meter for forandring av pH-verdien som følge av 10 7 E.. coli-celler ble overvåket ved hjelp av en bærbar pH-meter. En test uten E. coli ble brukt som en negativ kontroll. Nærvær av 10 7 E. coli-celler i prøveløsningen kan øke basisitet av ~ 3 pH-enheter i 10 min. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Navn | Sekvens (5'-3 ') | Notat |
| BS1 | BTTTT TTTTT TTTAC TCTTC CTAGC FRQGG TTCGA TCAAG A | B: 5'-Biotin; R: adenin ribonukleotid; F: fluorescein-dT; Q: dabcyl-dT |
| DE1 | GATGT GCGTT GTCGA GACCT GCGAC CGGAA CACTA CACTG TGTGG GGATG GATTT CTTTA CAGTT GTGTG TTGAA CGCTG TGTCA AAAAA AAAA | |
| T1 | GACAA CGCAC ATCTC TTGAT CGAAC C | |
| LD1 | XTTTT TTTTT TTTTT TTGAC ACAGC GTTCA A | X: 5'-NH2 |
Tabell 1: Sekvenser av syntetiske oligonukleotider.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Oversettelsen av virkningen av RNA-spaltning aktiviteten av en bakterie-responsive DNAzyme til en lakmus test er gjort mulig ved bruk av urease og magnetisk separasjon, som illustrert i figur 1. Selv om demonstrasjon av den modifiserte lakmus test for bakteriell påvisning er gjøres med en E. coli -avhengig RNA-spaltning DNAzyme, 5,19,20 utforming kan generelt utvides til en hvilken som helst RNA-spalte DNAzyme. Gitt den store tilgjengeligheten av RNA-spalte DNAzymes for ulike analyttene og ulike metoder for å isolere nye RNA-spalte DNAzymes fra tilfeldig sekvens bassenger for nye mål, forventer vi at den modifiserte lakmustest plattformen kan bli utvidet til deteksjon av ulike mål av interesse .
Den lakmustest for E. coli deteksjon kan oppdage 5.000 og 500 celler når de rapporteringsreaksjonstiden er satt til å være en og to timer, henholdsvis. Den populære polymerase kjedereaksjon (PCR) og-sandwich enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) metoder kan oppnå deteksjonsgrenser på ca. 10 4 -10 5 E. coli-celler i lignende testing ganger. 25,26 Dermed tilbyr bakteriell lakmustest sammenlign følsomhet.
Selv om bakteriell lakmustest er lett å gjennomføre og kan produsere levende fargeendringer, kan flere faktorer i betydelig grad påvirke testresultatene. For det første er kvaliteten på urease svært viktig. Vi har brukt urease fra forskjellige kilder, og fant at testresultatene kan variere betydelig. Vi anbefaler bruk av urease fra kilden som er angitt i Materials delen.
Monteringen av DNAzyme / urease / magnetiske kuler trenger spesiell oppmerksomhet. Grundig vasking av magnetiske kuler for å fjerne uhybridisert UrDNA er nødvendig for å hindre falske positive resultater. Forsiktighet må også tas for å unngå opphopning av gjenværende magnetiske kuler på den indre overflate av lid i mikrofugerør, noe som kan være vanskelig å se. Der blir de magnetiske kuler ikke lenger er underkastet magnetisk separasjon og dermed kunne bære noen uhybridisert UrDNA som kan føre til falske positive signaler i reporter reaksjonen. Det er også viktig å unngå at det mikrosentrifugerør på magnetstativ for lengre tid enn 10 minutter i løpet av det magnetiske separasjonstrinn. Perlene kan aggregere eller holde seg til mikrofugerør, noe som kan redusere vaskeeffektiviteten og introdusere batch-til-batch inkonsekvens. Inklusjon av 0,01% Tween-20 i vaskeløsningen kan forbedre batch-til-batch konsistens og bør iverksettes.
De magnetiske kuler belagt med streptavidin, som ble anvendt som anker for å montere DNAzyme-urease-konjugater på de magnetiske kuler. Både streptavidin og urease er proteinmolekyler som kan denaturert under lagring. Vi lagrer vanligvis sammensatte DNAzyme-urease-magnetiske kuler ved 4 ° C i opptil 4 ukerog gjør friske partier regelmessig for å oppnå mer konsistente resultater.
Care må også tas for å unngå uhell tar magnetiske kuler i den magnetiske separasjonstrinn (trinn 6.9) etter DNAzyme aktivering. Fra vår erfaring, kan celleavfall og andre partikler i oppløsningen reduserer den magnetiske separasjonseffektivitet, og derfor kan noen magnetiske kuler utilsiktet kan tas ut i løpet av pipettering. Dette vil føre til falsk-positive resultater. Det anbefales følgende tiltak for å løse problemet: en lengre tid separasjon (for eksempel 5-10 min), en langsommere frigjøring av trykk på pipetten for å tillate skånsom uttak av supernatanten, og å underkaste supernatanten til en ytterligere runde med magnetisk separasjon .
Til slutt er det viktig å unngå uhell forurensning av reporterstamløsning av urease i løpet av et eksperiment hvor flere prøver blir testet. Gitt den høye reaktiviteten til urease, kan forurensning av denne art føre til falske positive resultater.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | VWR AMRESCO | 0105 | |
| Sodium Hydroxide (NaOH) pellets | BIO BASIC CANADA INC. | SB6789 | |
| Tris-base | VWR AMRESCO | 0497 | |
| Boric acid | AMRESCO | 0588 | |
| Urea | VWR AMRESCO | M123 | |
| 40% acrylamide/bisacrylamide (29:1) solution | BIO BASIC CANADA INC. | A0007 | |
| Sucrose | Bioshop Canada inc. | SUC507 | |
| Bromophenol blue | Bioshop Canada inc. | BRO777 | |
| Xylenecyanol FF | SIGMA-ALDRICH | X-4126 | |
| 10% sodium dodecyl sulfate | Bioshop Canada inc. | SDS001 | |
| Hydrochloric Acid (HCl) | CALEDON LABORATORIES LTD | 6026 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Bioshop Canada inc. | SOD001 | |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Bioshop Canada inc. | HEP001 | |
| Magnesium Chloride (II) hexahydrate | VWR AMRESCO | 0288 | |
| Tween 20 | Bioshop Canada inc. | TW508 | |
| Adenosine Triphospahte (ATP) | AMRESCO | 0220 | |
| Sodium Acetate trihydrate (NaOAc) | SIGMA-ALDRICH | S8625 | |
| Ethanol | Commercial Alcohols | P016EAAN | |
| Tetramethyleneethylenediamine (TEMED) | AMRESCO | 0761 | |
| 10% Ammonium persulfate (APS) | BIO BASIC CANADA INC. | AB0072 | |
| Succinimidyl 4-(N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate (SMCC) | ThermoFisher SCIENTIFIC | 22360 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | CALEDON LABORATORIES | 803540 | |
| Urease | SIGMA-ALDRICH | U0251 | |
| 1x Phosphate Buffered Saline (PBS) | ThermoFisher SCIENTIFIC | 70011-069 | |
| 0.04% Phenol red | SIGMA-ALDRICH | P3532 | |
| 10x T4 polynucleotide kinase reaction buffer | Lucigen | 30061-1 | |
| 10x T4 DNA ligase reaction buffer | Bio Basics Canada | B1122-B | |
| T4 DNA ligase (5 U/μl) | Thermo Fischer Scientific | B1122 | |
| Luria Bertani (LB) Broth | AMRESCO | J106 | |
| Agar | AMRESCO | J637 | |
| T4 polynucleotide kinase (10 U/μl) | Lucigen | 30061-1 | |
| E. coli K12 (MG1655) | ATCC | ATCC700926 | |
| Centrifuge | Beckman Coulter, Inc. | 392187 | |
| Glass plates | CBS scientific | ngp-250nr | |
| 0.75 mm thick spacers | CBS scientific | VGS-0725r | |
| 12-well comb | CBS scientific | VGC-7512 | |
| UV Lamp | UVP | 95-0017-09 | |
| Spectrophotometer (NanoVue) | GE Healthcare | N/A | |
| Metal plate | CBS scientific | CPA165-250 | |
| Vortex | VWR International | 58816-123 | |
| Gel electrophoresis apparatus | CBS scientific | ASG-250 | |
| Petri dishes | VWR International | 25384-342 | |
| 100 kDa MWCO centrifugal filters | EMD Millipore | UFC510024 | |
| Magnetic Bead (BioMag) | Bangs Laboratories Inc | BM568 | |
| Magnetic Seperation Rack | New England BioLabs | S1506S | |
| Microfuge tubes | Sarstedt | 72.69 | |
| Syringe filter (0.22 μm) | VWR International | 28145-501 | |
| 14 ml culture tube | VWR International | 60818-725 | |
| Cell culture incubator | Eppendorf Scientific | M13520000 | |
| Branson Ultrasonic cleaner | Branson | N/A | |
| Camera (Canon Powershot G11) | Canon | N/A | |
| 50 ml conical tube | VWR International | 89004-364 |
References
- Daar, A. S., et al. Top ten biotechnologies for improving health in developing countries. Nat. Genet. 32, 229-232 (2002).
- Newman, J. D., Turner, A. P. Home blood glucose biosensors: a commercial perspective. Biosens. Bioelectron. 20, 2435-2453 (2005).
- Turner, A. P.
- Tram, K., Kanda, P., Salena, B. J., Huan, S. Y., Li, Y. F. Translating Bacterial Detection by DNAzymes into a Litmus Test. Angew. Chem. Int. Ed. 53, 12799-12802 (2014).
- Ali, M. M., Aguirre, S. D., Lazim, H., Li, Y. Fluorogenic DNAzyme probes as bacterial indicators. Angew. Chem. Int. Ed. 50, 3751-3754 (2011).
- Schlosser, K., Li, Y. Biologically inspired synthetic enzymes made from DNA. Chem. Biol. 16, 311-322 (2009).
- Tuerk, C., Gold, L. Systematic evolution of ligand by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase. Science. 249, 505-510 (1990).
- Ellington, A. D., Szostak, J. W. In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands. Nature. 346, 818-822 (1990).
- Breaker, R. R.
- Liu, J., Cao, Z., Lu, Y.
- Navani, N. K., Li, Y. Nucleic acid aptamers and enzymes as sensors. Curr. Opin. Chem. Biol. 10, 272-281 (2006).
- Li, J., Lu, Y. A highly sensitive and selective catalytic DNA biosensor for lead ions. J. Am. Chem. Soc. 122, 10466-10467 (2000).
- Liu, J., Lu, Y. A colorimetric lead biosensor using DNAzyme-directed assembly of gold nanoparticles. J. Am. Chem. Soc. 125, 6642-6643 (2003).
- Liu, Z., Mei, S. H. J., Brennan, J. D., Li, Y. Assemblage of signaling DNA enzymes with intriguing metal specificity and pH dependence. J. Am. Chem. Soc. 125, 7539-7545 (2003).
- Liu, J., et al. A catalytic beacon sensor for uranium with parts-per-trillion sensitivity and millionfold selectivity. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104, 2056-2061 (2007).
- Huang, P. J., Vazin, M., Liu, J. In vitro selection of a new lanthanide-dependent DNAzyme for ratiometric sensing lanthanides. Anal. Chem. 86, 9993-9999 (2014).
- Chiuman, W., Li, Y. Simple fluorescent sensors engineered with catalytic DNA 'MgZ' based on a non-classic allosteric design. PLoS One. 2, e1224 (2007).
- Xiang, Y., Lu, Y. Using personal glucose meters and functional DNA sensors to quantify a variety of analytical targets. Nat. Chem. 3, 697-703 (2011).
- Aguirre, S. D., Ali, M. M., Salena, B. J., Li, Y. A sensitive DNA enzyme-based fluorescent assay for bacterial detection. Biomolecules. 3, 563-577 (2013).
- Aguirre, S. D., Ali, M. M., Kanda, P., Li, Y. F. Detection of Bacteria Using Fluorogenic DNAzymes. J. Vis. Exp. (63), e3961 (2012).
- Shen, Z., et al. A catalytic DNA activated by a specific strain of bacterial pathogen. Angew. Chem. Int. Ed. 54, (2015).
- He, S., et al. Highly specific recognition of breast tumors by an RNA-cleaving fluorogenic DNAzyme probe. Anal. Chem. 87, 569-577 (2015).
- Sumner, J. B., Hand, D. B.
- Karplus, P. A., Pearson, M., Hausinger, R. P. 70 Years of crystalline urease: What have we learned. Acc. Chem. Res. 30, 330-337 (1997).
- Omiccioli, E., Amagliani, G., Brandi, G., Magnani, M. A new platform for Real-Time PCR detection of Salmonella spp., Listeria monocytogenes and Escherichia coli O157 in milk. Food Microbiol. 26, 615-622 (2009).
- Cui, S., Schroeder, C. M., Zhang, D. Y., Meng, J. Rapid sample preparation method for PCR-based detection of Escherichia coli O157:H7 in ground beef. J. Appl. Microbiol. 95, 129-134 (2003).
- Ibekwe, A. M., Watt, P. M., Grieve, C. M., Sharma, V. K., Lyons, S. R. Multiplex fluorogenic real-time PCR for detection and quantification of Escherichia coli O157:H7 in dairy wastewater wetlands. Appl. Environ. Microbiol. 68, 4853-4862 (2002).
- Strachan, N. J., Ogden, I. D. A sensitive microsphere coagulation ELISA for Escherichia coli O157:H7 using Russell's viper venom. FEMS Microbiol Lett. 186, 79-84 (2000).
- de Boer, E., Beumer, R. R. Methodology for detection and typing of foodborne microorganisms. Int. J. Food Microbiol. 50, 119-130 (1999).
- Gracias, K. S., McKillip, J. L. A review of conventional detection and enumeration methods for pathogenic bacteria in food. Can. J. Microbiol. 50, 883-890 (2004).
